ANEXOS Anexo 1. Desarrollo del proyecto

CONTROL BIOLÓGICO DE GALLINA CIEGA CON HONGOS Y NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS 1. RESUMEN EJECUTIVO La plaga denominada como gallina ciega, es uno de los principales problemas fitosanitarios en el estado de Guanajuato afectando principalmente cultivos como el maíz y otras hortalizas. EL método tradicional de control de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas químicos, los cuales pueden tener efectos negativos principalmente a nivel ecológico sin son usados de menara irracional, además de que no están siendo eficientes en el control de esta plaga. La búsqueda de alternativas de manejo de esta plaga ha encontrado en los entomopatogenos una alternativa ecológicamente segura y sustentable. A pesar de que existen trabajos de investigación acerca del uso de estos microorganismos para el manejo de esta plaga, los resultados han sido inconsistentes, la principal causa de esto es precisamente la falta de investigación básica acerca de primero entender la relación insecto-entomopatógeno y como esta relación es afectada por factores bióticos y abióticos, ya que muchos trabajos dan el salto de experimentos en laboratorio en donde estiman únicamente virulencia, a experimentos de campo esperando encontrar resultados similares y no siempre es así. Es por esta razón que el objetivo principal de este proyecto fue la de generar datos que puedan permitir un mejor manejo de la gallina ciega mediante entomopatogenos. Para lograr esto se tuvieron diferentes objetivos los cuales iniciaron con ver el efecto del tipo de suelo en la diversidad y abundancia de especies tanto de hongos como de nematodos entomopatógenos así como su variación genética, posteriormente se aislaron entomopatógenos directamente de larvas de gallina ciega y corroborar su patogenicidad en larvas de gallina ciega sanas, también de estos aislamientos se detecto su variación genética. Con estos aislamientos se iniciaron una serie de experimentos para evaluar el efecto de factores bióticos y abióticos en la relación Phyllophaga spp. - entomopatógeno y ver cómo puede modificar esta relación; primeramente se estimo la virulencia de cada uno de estos aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp., posteriormente se evaluó el efecto de varios factores en esta virulencia estimada, se evaluó el efecto de temperatura, genero de gallina ciega, tipo de suelo para finalmente realizar experimentos anivel de invernadero y campo, para evaluar el comportamiento de estos aislamientos en la infección de las larvas de Phyllophaga spp bajo condiciones naturales. Los resultados encontrados hasta el momento indican que la diversidad de entomopatógenos encontrados en los suelos evaluados es muy baja encontrándose únicamente dos especies de hongos entomopatógenos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Se encontraron 126 aislamientos de hongos entomopatógenos pertenecientes a estas dos especies, distribuidas en 12 localidades muestreadas en esta fase. La abundancia relativa de dichos aislamientos fue afectada por el tipo de suelo, ya que se encontraron suelos que favorecen la presencia natural de una especie o la otra, así como hay suelos que no tienen presencia natural de ningún entomopatógeno. La variación genética de estos aislamientos está en proceso de estudio. Se aislaron 22 aislamientos pertenecientes a B. bassiana y M. anisopliae. De estos 22 aislamientos, 8 fueron descartados por la nula producción de conidios por lo que su evaluación fue imposible. Con los aislamientos restantes se evaluó su virulencia hacia larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. donde todos mostraron niveles diferentes de virulencia, de este experimento se puede concluir parcialmente, ya que todavía hay repeticiones en proceso de evaluación, que los aislamientos de B. bassiana mostraron la mayor virulencia comparada con los aislamientos de M. anisopliae, la máxima mortalidad alcanzada en promedio fue de 40%. Un número reducido de aislamientos fue evaluado ahora contra larvas del género Anomala spp., donde los resultados fueron contrastantes, la mayor virulencia la mostraron los aislamientos de M. anisopliae con porcentajes de hasta 100%, los aislamientos de B. bassiana mostraron una mortalidad máxima del 100%, concluyendo que la virulencia de estos aislamientos si es afectada por el género de gallina ciega ya que Anomala fue mucho más susceptible que Phyllophaga. Se tiene un avance parcial en

los demás experimentos ya que algunos están aun en toma de datos y otros en proceso de establecimiento.

2. INTRODUCCION En el estado de Guanajuato, la gallina ciega es uno de los problemas más importantes en cultivos básicos como maíz, frijol y sorgo, por ejemplo en el año de 2002, el CESAVEG reporto una superficie afectada por gallina ciega de 50,000 ha. El método tradicional de manejo de esta plaga ha sido mediante el uso de insecticidas químicos, el cual no ha sido eficiente por la creciente superficie afectada año tras año. El uso de microorganismos entomopatógenos ha sido investigado e implementado en muchos otros insectos con éxito; sin embargo, para el caso de gallina ciega, la investigación es reducida con muy pocos ejemplos a nivel nacional e internacional. La búsqueda de aislamientos asociados a larvas de gallina ciega en algunos estados de la república ha sido realizada mediante búsquedas directas en larvas de gallina ciega y trampeo con larvas de Galleria mellonella en suelo (Berlanga et al., 2000; Hernández Velázquez et al., 2003; Hernández-Velázquez et al., 2005; Díaz Mederos et al., 2002), en todos los casos, la búsqueda se ha quedado únicamente en el reporte de especies y numero de aislamientos encontrados. Por otro lado, también se reporta experimentos de virulencia en laboratorio con diferentes especies de gallina ciega como Phyllophaga crinita (Rodríguez del Bosque et al., 2005), Cyclocephala signaticollis (Beron y Díaz, 2005) y contra complejos de gallina ciega del género Phyllophaga spp (Flores et al., 2002). Así mismo, también se reportan experimentos en campo (Vázquez-García et al., 2003; Pérez-Domínguez et al., 2003; Ruíz-Vega y Aquino-Bolaños, 2002), donde los autores concluyen que los tratamientos realizados con hongos entomopatógenos son los más eficientes, pero al momento de observar los resultados, estos no son del todo claros y en muchos casos el diseño experimental y métodos de evaluación pueden ser muy cuestionables. En ninguno de los trabajos revisados se reportan experimentos detallados que estudien aspectos básicos de la relación gallina ciega – entomopatógeno. Los trabajos realizados estimando virulencia a nivel de laboratorio únicamente reportan datos de virulencia y tiempo letal, pero sin ningún seguimiento a campo; los estudios de campo extrapolan directamente de trabajos en laboratorio a campo sin considerar que esa relación puede ser afectada por diversos factores, bióticos y abióticos, y que lo encontrado en laboratorio puede ser modificado. Se considera que esa es precisamente la razón por la cual la implementación de los hongos u otro entomopatógeno en campo, no ha sido del todo exitoso, ya que muchas de las investigaciones han dado resultados vagos y sin un seguimiento. Es cuestionable también las identificaciones realizadas por algunos autores nacionales de los aislamientos de hongos entomopatógenos con los que trabajan, ya que reportan especies que anteriormente se había reportado solo para Europa y no América, eso pone en evidencia que los métodos de identificación no solo deben ser morfológicos sino corroborados molecularmente. Considerando lo anterior, se propuso este proyecto de investigación cuyos objetivos son precisamente estudiar aspectos básicos de interacción de la relación gallina ciega-entomopatógeno, donde la identificación de los patógenos se realizó tanto morfológica como molecularmente, lo cual además de darnos una identificación mas verídica también nos indica los niveles de variación genética en el estado de Guanajuato, cosa que no se ha hecho en otra parte de la república. Así mismo, además de estudiar la virulencia relativa de los aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp., también se estudio el efecto de factores bióticos y abióticos en esta virulencia relativa lo cual nos indicara el posible efecto que se podría tener en campo, lo cual se confirmara con estudios a nivel de invernadero y campo. La presente investigación tuvo por objetivo general, generar información que conlleve a un mejor manejo de la plaga gallina ciega mediante entomopatógenos. Para esto se comprometieron dos productos con diferentes actividades cada uno:

1. Aislamientos de de entomopatógenos identificados. a. Selección de áreas para la búsqueda de aislamientos nativos. b. Búsqueda de de aislamientos de hongos y nematodos entomopatógenos nativos del estado de Guanajuato. c. Aislamiento de entomopatógenos. d. Identificación morfológica y molecular de los aislamientos. e. Corroboración de patogenicidad de los aislamientos encontrados. 2. Documento con recomendaciones de uso de hongos y nematodos entomopatógenos. a. Estimación de la virulencia de aislamientos hacia larvas de gallina ciega. b. Interacción de la virulencia de los aislamientos con factores bióticos (genero de gallina ciega) y abióticos (tipo de suelo, temperatura y genero de gallina ciega). c. Evaluación de aislamientos a nivel de invernadero. d. Evaluación de aislamientos a nivel de campo.

3. MATERIAL Y METODOS 3.1. Selección de áreas para la búsqueda de aislamientos nativos Para esta fase se realizo una reunión con personal del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de Guanajuato, el día 23 de Julio de 2007. Con base en la experiencia de los encargados de las campañas fitosanitarias y la base de datos desarrollada por personal de CESAVEG, se seleccionaron diferentes sitios de colecta. Estos sitios fueron seleccionados con base en presencia, abundancia y ausencia de poblaciones de gallina ciega, tipo de suelo y tipo de cultivo presente en las localidades seleccionadas. 3.2. Búsqueda de aislamientos de hongos y nematodos entomopatógenos nativos del estado de Guanajuato 3.2.1 Colecta de muestras de suelo con diferentes niveles de infestación de larvas de gallina ciega Durante el periodo del 23 al 27 de Julio, y con ayuda del personal del CESAVEG, se colectaron muestras de suelo de 9 diferentes localidades. De cada localidad se obtuvieron 15 sub-muestras de 500 gr de suelo cada una. Las muestras de suelo se transportaron al laboratorio de Patología de Insectos en donde se conservaron a 5 °C hasta su procesamiento. El procesamiento consistió en buscar organismos entomopatógenos mediante la técnica de trampeo usando larvas de Galleria mellonella, las cuales son criadas en el laboratorio de Patología de Insectos. 3.2.2 Colecta de larvas de gallina ciega de localidades con suelos de diferentes cultivos y niveles de infestación de la plaga Durante el periodo del 17 al 20 de Octubre de 2007 se colectaron larvas de gallina ciega en el estado de Guanajuato en siete localidades en tres diferentes municipios. Las zonas corresponden a dos parcelas de cada municipio. Las larvas se colectaron en hieleras con PEAT MOSS. Estas se transportaron al laboratorio de Patología de Insectos del Colegio de Posgraduados en donde se separaron las larvas por género. Estas larvas se colocaron de manera individual en vasos de plástico con PEAT MOSS humedecido en un cuarto de incubación a 25 ºC por 30 días. 3.3. Aislamiento de entomopatógenos 3.3.1 Muestras de suelo

Para cada zona de muestreo se utilizaron vasos de plástico con tapas. Estos se sometieron a un proceso de desinfección, la cual consistió en sumergir los vasos y tapas en una solución de cloro comercial al 1% con jabón durante 5 minutos, posteriormente tapas y vasos se enjuagaron con agua destilada y se asperjaron con alcohol etílico al 70%. Por cada sub-muestra de suelo se ocuparon 5 vasos con tapa y 3 larvas de G. mellonella. Se colocaron 100 gramos de suelo por cada vaso. Para evitar que las larvas de G. mellonella formaran su capullo, las larvas se sumergieron durante 15 segundos en agua destilada estéril a 56 °C. Una vez hecho lo anterior, las muestras se incubaron a 25°C por 15 días en oscuridad total. Las larvas se revisaron cada 24 horas para detectar signos y síntomas de enfermedad. Las larvas enfermas se aislaron en forma individual y colocaron en cajas de Petri con papel filtro estéril humedecido con agua estéril, y se incubaron a 25°C hasta que se expresara el agente causal de la enfermedad. 3.3.2 Larvas de gallina ciega Los vasos conteniendo larvas individuales de gallina ciega se revisaron cada 7 días para observar la presencia de algún patógeno, se registro el número de larva, la zona y el probable patógeno presente. Las muestras con hongos o nematodos se colocaron en recipientes independientes para extraer los nematodos y para procesar las larvas con hongos. Las larvas con presencia de hongos se procesaron de la siguiente manera. -La larva se limpio con un pincel de residuos de PEAT MOSS. -Una vez limpia se coloco en alcohol al 70% por un minuto -Enseguida se coloco en una solución de hipoclorito de sodio al 5% por cinco minutos -Posteriormente se le dieron dos lavados con una solución estéril de Tween 80 al 0.03 % para quitar el residuo de hipoclorito de sodio -El exceso de humedad se quito mediante absorción usando papel filtro del número 4. -La larva seca se corto por la mitad con un bisturí, se corto una rodaja de la larva. -La rodaja se partió en cinco partes, las cuales se distribuyeron en una caja con medio de ADS -Se selecciono una colonia por caja y se paso a una nueva caja con ADS. Las larvas con presencia de nematodos se procesaron de la siguiente manera: -La larva se limpio de residuos de PEAT MOSS con un pincel. -Posteriormente se dieron lavados con agua destilada estéril. -Cada larva se coloco en una trampa blanca para colectar los juveniles infectivos. -Los nematodos infectivos colectados fueron lavados en formalina al 0.1% y mantenidos en refrigeración hasta su uso. 3.4. Identificación morfológica y molecular de los aislamientos 3.4.1. Identificación morfológica de aislamientos de hongos

Primeramente, se realizaron micro-cultivos para la identificación de a nivel de género. Para esto, en una caja Petri de 90 mm de diámetro conteniendo 15 ml de agar-agua al 1.5% estéril, se coloco un portaobjetos estéril arriba de cual, uno en cada extremo, se colocaron dos circulo de ADS de 1 cm de diámetro. En cada círculo y con la ayuda de un asa bacteriológica se inoculo conidios de cada aislamiento. Finalmente se coloco sobre cada círculo de ADS inoculado, un cubreobjetos estéril y se incubo a 25 ºC durante 7 días o hasta observar esporulación del hongo inoculado en el círculo. Una vez terminado el período de incubación, los cubreobjetos fueron retirados con mucho cuidado del círculo de ADS y colocados sobre una gota de azul de algodón y lactofenol contenido en un portaobjetos. Estas preparaciones se sellaron con barniz de uñas y se examinaron bajo el microscopio compuesto en el objetivo de 40X. Basándose en las características de los diferentes géneros de hongos entomopatógenos descritos por Humber (1997), se determinaron a género cada uno de los aislamientos. Finalmente, se elaboraron preparaciones semi-permanentes colocando 10 μL de una suspensión de 1 X 108 conidios/mL de los diferentes aislamientos sobre un portaobjetos, se cubrieron con un cubre objetos y fueron selladas con barniz de uñas. Las muestras fueron observadas con el objetivo de 40X en un fotomicroscopio III Carl Zeiss conectado a una cámara digital para microscopio PaxCam. A 200 conidios por aislamiento se les tomo una fotografía, la imagen se proceso con el programa Adobe Photoshop 7.0 y se analizo mediante el programa Image Tool 3.0 midiendo el largo y ancho de los conidios. 3.4.2. Identificación molecular de hongos Esta fase se realizo únicamente para los aislamientos provenientes de larvas de gallina ciega infectadas. Se extrajo el DNA de todos los aislamientos mediante el kit para extracción de DNA (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplifico la región ITS de cada uno de los aislamientos mediante los primers universales ITS5 y 4 (White et al., 1990). Posteriormente los productos de PCR se limpiaron mediante el kit de limpieza de QIAquik PCR Purification Kit (QUIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante, finalmente, todos los productos de PCR limpios se mando a la compañía MAGROGEN en Korea para su secuenciación. Las secuencias resultantes se analizaron mediante el programa BIOEDIT para la generación de una secuencia consenso, la cual posteriormente se subió a la página de GENBANK para su comparación y alineación con otras secuencias ahí depositadas y mediante la cual se corroboro la identidad de los aislamientos. 3.4.3. Variación genética de los aislamientos En estos momentos, la variación genética de los asilamientos obtenidos de suelo está bajo estudio. Esto se está realizando mediante la amplificación de microsatélites diseñados con anterioridad por otros investigadores. De encontrarse agrupación o diferencias genéticas significativas, se seleccionaran al menos dos aislamientos de cada grupo y se amplificara la región ITS del RNA ribosomal de cada aislamiento mediante iniciadores universales en reacciones de PCR convencional y se seguirá el mismo procedimiento descrito en la sección 3.3.3. 3.4.4. Identificación morfológica de nematodos Se encontraron aislamientos de nematodos, pero ninguno resulto ser entomopatógeno, basados en resultados de patogenicidad. Debido a esto no se siguió más allá con estos microorganismos, pero se sigue en la búsqueda de aislamientos de estos microorganismos. 3.5. Corroboración de patogenicidad de los aislamientos encontrados Esta fase únicamente se realizo para los aislamientos provenientes de larvas infectadas. El método fue el mismo para todos los aislamientos.

Grupos de 12 larvas del tercer instar fueron expuestas a una suspensión de 1x108 conidios/ml. Las larvas fueron sumergidas por 20 segundos, posteriormente fueron colocadas sobre una toalla de papel para quitar el exceso de humedad. Finalmente cada una de las larvas tratadas fue colocada de manera individual una placa de cultivo de tejidos de 12 orificios, una larva en cada orificio. La mortalidad se revisó cada 5 días durante 35 días. Todo insecto muerto se incubó en una caja Petri estéril de 30 mm de diámetro conteniendo papel filtro humedecido en la base para promover la esporulación y confirmar agente causal de la infección. Todo el bioensayo se incubó a 25 ˚C en total oscuridad. El tratamiento control fueron larvas sumergidas en Tween 80 al 0.03% durante 20 segundos e incubadas de la misma manera descrita anteriormente. 3.6. Virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp De los resultados obtenidos en la sección 3.5, se seleccionaron 7 aislamientos para su evaluación en esta sección, 4 aislamientos de B. bassiana y 3 de M. anisopliae. Siguiendo la misma metodología reportada en la sección anterior se evaluó la virulencia de estos aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp. todo el experimento se incubo durante 35 días a 25 °C en total oscuridad. El experimento se realizo bajo un diseño completamente al azar y todo el experimento se repitió en tres diferentes ocasiones. 3.7. Efecto del género de gallina ciega en la virulencia de los aislamientos seleccionados Con base en los resultados de virulencia (sección 3.6) se seleccionaron 4 aislamientos, 2 de cada especie bajo estudio. Se siguió la misma metodología descrita en la sección 3.5. Se inocularon larvas de Phyllophaga spp y Anomala spp. para comparar susceptibilidad relativa hacia los aislamientos seleccionados. Los métodos de inoculación e incubación asi como de toma de datos son los mismos descritos en la sección 3.5. 3.8. Efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp. Empleando los mismos aislamientos de la sección 3.7., se evaluara el efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos hacia larvas de Phyllophaga spp. Para este experimento se tienen ya las incubadoras listas a las temperaturas seleccionadas que son de 15, 25 y 30 °C. Las larvas a usarse están en fase de observación para confirmar salud de las mismas antes de evaluarse. 3.9. Efecto del tipo de suelo en la virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Para este experimento también se está en espera de los resultados de virulencia, y con los aislamientos seleccionados se procederá a realizar los experimentos en suelos ya seleccionados. Para este experimento, además de las larvas, se requiere de diferentes tipos de suelo para los experimentos. Se avanzó en el análisis de los diferentes tipos de suelos, los cuales se tuvieron que realizar previo a la experimentación con larvas de gallina ciega mediante la metodología que a continuación se describe. 3.9.1 Muestras de suelo Las muestras de suelo fueron colectadas con una pala a una profundidad de 30 cm en 5 localidades de los municipios de Jerecuaro, Valle de Santiago, Penjamo y Comonfort en el estado de Guanajuato. En cada localidad, se tomaron cinco muestras de 3 kg. Las muestras de cada localidad se mezclaron con la mano para obtener una sub-muestra de 1 kg de suelo. Las muestras de suelo se colectaron en Junio del 2009 almacenándose a 4° C y cuatro días después fueron utilizadas para cuantificar la población de microorganismos.

3.9.2. Recuento en placa Muestras de 10 g de suelo de las sub-muestras de cada localidad se utilizaron para cuantificar los microorganismos. En un recipiente con 90 mL de agua destilada estéril se suspendieron 10 g de suelo de cada una de las muestras. Las muestras fueron agitadas durante 18 minutos en un agitador orbital, posteriormente diluciones seriadas fueron hechas. Las diluciones utilizadas para cuantificar bacterias fueron 1-4 – 1-6, 1-2 – 1-4 para actinomicetos y 1-1 – 1-3 para hongos. Una alícuota de 100 µL de cada una de las diluciones fue distribuida con una varilla de vidrio sobre la superficie de medio contenida en una caja de Petri. El medio de cultivo Agar Nutritivo fue para bacterias, PDA con rosa de Bengala para hongos y el Czapeck con pH de 8 para actinomicetos. Por cada dilución se hicieron tres repeticiones. Las placas de agar se incubaron a 28° C. La cuantificación de bacterias se realizo cuatro días después de incubadas las placas, a los cinco días los hongos y los actinomicetos a los 15 días. El número de células de los microorganismo incubados se expreso en unidades formadoras de colonias (UFC). Las UFC por gramo de suelo seco al aire se calculo multiplicando el promedio aritmético del número de colonias/caja por el factor de dilución y dividiendo entre el peso de suelo seco presente en la alícuota. 3.9.3. Determinación de humedad Una muestra de 1 g de la sub-muestra de suelo de cada localidad se calentó en un horno de microondas por 20 min. El peso de suelo seco fue determinado pesando 1 g de suelo secado en horno de microondas. 3.9.4. Determinación de pH Una muestra de 2 g de la sub-muestra de suelo de cada localidad se suspendió en 40 mL de agua destilada. La muestra se agito durante 5 min y se determino el pH con un potenciómetro. 3.10. Evaluación de los aislamientos a nivel de invernadero Este experimento aún no se inicia pero se tiene todo lo necesario para su realización como el invernadero, los vasos para la mantención de las larvas tratadas etc. Se emplearan los mismos 4 aislamientos seleccionados a partir del experimento de virulencia (3.6.) y se evaluaran en larvas de Phyllophaga spp. Se evaluara el efecto de diferentes tipos inoculación (tratamientos) en la sobrevivencia de larvas de gallina ciega del genero Phyllophaga bajo condiciones de temperatura fluctuante. El tipo de suelo que se empleara será aquel que haya dado mejores resultados en los experimentos de laboratorio. Se evaluaran dos tipos de inoculación de los hongos, en la primera el inoculo será homogenizado con el suelo y 24 horas después se introducirán las larvas, y en la segunda, las larvas serán introducidas en el suelo 24 antes de inocular los conidios, los cuales serán depositados en la superficie del suelo contenidos en un volumen determinado de Tween 80 al 0.03% mediante una pipeta serológica. Cada tipo de inoculación tendrá su propio testigo en el cual no se aplicara conidio alguno, con lo que se evaluara 4 tratamientos en total. Cada tratamiento tendrá tres repeticiones y cuatro diferentes fechas de muestreo, uno cada semana durante un mes. Para cada combinación tratamiento/aislamiento/fecha de muestreo, se emplearan 12 larvas de Phyllophaga spp. los cuales estarán contenidos en vasos de plástico de manera individual. El registro de mortalidad se realizara cada semana durante un mes y será de manera destructiva. La humedad de los vasos será mantenida aplicando 5 ml de agua destilada en la superficie del suelo contenida en los vasos cada dos a tres días. Adicionalmente, se registrara la temperatura y humedad del suelo durante el experimento. El diseño experimental será completamente al azar y todo el experimento se repetirá en al menos dos ocasiones. El análisis de los resultados se realizara mediante una regresión logística usando el paquete estadístico Genstat. 3.11. Evaluación de aislamientos a nivel de campo

Para este experimento, se evaluará únicamente dos aislamientos, uno de cada especie. Se seleccionó ya una zona en la comunidad de San Lorenzo, municipio de Jerecuaro. Se evaluará el efecto que tendrán aislamientos de hongos y nematodos en la sobrevivencia de larvas de gallina ciega del genero Phyllophaga spp. bajo condiciones de campo. Se evaluara únicamente dos aislamientos de hongos entomopatógenos, uno de B. bassiana y otro de M. anisopliae. Se evaluara el efecto de las condiciones de campo en los niveles de infección que pudieran lograr los aislamientos. Se evaluara un total de 4 tratamientos, dos tratamientos serán larvas inoculadas con un aislamiento y el tratamiento control donde se inocularán con Tween 80 al 0.03 %. Y los otros dos tratamientos serán con el otro aislamiento. El tipo de experimento será a pequeña escala y con un muestreo destructivo. Se realizarán orificios en el sulo de 20x20x20 cm. Aproximadamente, en estos, se colocarán jaulas hecha de malla de alambre de 5 x5 mm de apertura y se volverán a rellenar con el suelo previamente retirado. Quince larvas, que fueron colectadas con anterioridad y puestas bajo condiciones de laboratorio para confirmar su salud, serán depositadas en la superficie del suelo contenida en las jaulas, estas serán previamente inoculadas con los 4 tratamientos mediante la misma metodología descrita en la sección 3.5. Las larvas que no se hayan enterrado una hora después se retiraran del experimento. El experimento durara dos meses para los cuales se tendrá 48 unidades experimentales para cada combinación tratamiento/aislamiento/fecha de muestreo, dando un total de 48 unidades experimentales. Se muestrearan 12 jaulas cada 15 días, dichas jaulas representarán tres repeticiones de cada tratamiento. En cada muestreo se cuantificara el número de larvas sobrevivientes, y se colectaran larvas muertas, las cuales serán llevadas al laboratorio para confirmar causa de muerte.

4. RESULTADOS 4.1. Selección de áreas para la búsqueda de aislamientos nativos Después de la reunión sostenida con personal del CESAVEG, se seleccionaron 12 zonas de muestreo (Cuadro 1). Cuadro 1. Localidades seleccionadas para la colecta de muestras de suelo. Muestra

Localidad

Municipio

Cultivo

1

-----

Valle de Santiago

Sorgo

2

Jaripeo

Acambaro

Maíz (Riego)

3

Maravatio

Michoacan

Maíz (Temp.)

4

San Lorenzo

Jerecuaro

Baldío

5

Magallanes

Penjamo

Maíz

6

Meza

Penjamo

Baldío

7

Neutla

Comonfort

Maíz

8

Neutla

Comonfort

Baldío

9

Tacubaya

Penjamo

Maíz (Riego)

10

Piedra Parada

Manual Doblado

Maíz (Temp.)

11

Rancho San José

Miguel Hidalgo

Chile

12

Rancho Alvaro Nieto

Comonfort

Sin sembrar

4.2. Búsqueda de aislamientos de hongos y nematodos entomopatógenos nativos del estado de Guanajuato 4.2.1 Colecta de muestras de suelo de localidades con diferentes niveles de infestación de larvas de gallina ciega En total, de las 12 zonas de colecta, se obtuvieron 126 aislamientos, de las cuales 112 son de Beauveria bassiana y 14 de Metarhizium anisopliae. El número de aislamientos por zona de colecta es diferente. Es evidente que el hongo Beauveria bassiana es el de mayor predominancia en las regiones muestreadas comparado con Metarhizium anisopliae. Existen diferencias importantes en la abundancia relativa de aislamientos de las dos especies de hongos entomopatógenos en las diferentes localidades (Fig. 1). Por ejemplo, la mayor población de aislamientos de B. bassiana se encontraron en Meza, municipio de Pénjamo, y la menor población en Villa Diego, municipio de Valle de Santiago.

Figura 1. Diferencias relativas en la abundancia y diversidad de aislamientos de hongos entomopatógenos encontrados en las diferentes localidades del estado de Guanajuato. Ma= Metarhizium anisopliae, Bb= Beauveria bassiana. Esta información resulta muy importante para el estado de Guanajuato, porque da evidencias del tipo de suelo y localidades donde probablemente se logre una mayor eficacia y persistencia de los hongos entomopatógenos para el control de la gallina ciega. Se cuenta ya con los resultados de los análisis físicoquímicos de las diferentes muestras de suelo. Se están llevando a cabo los análisis estadísticos para poder determinar si existe alguna relación entre diversidad y abundancia con el tipo de suelo.

Existen diferencias importantes en la abundancia relativa de aislamientos de las dos especies de hongos entomopatógenos en las diferentes localidades (Fig. 1). Por ejemplo, la mayor población de aislamientos de B. bassiana se encontraron en Meza, municipio de Pénjamo, y la menor población en Villa Diego, municipio de Valle de Santiago. Estas diferencias tan evidentes entre B. bassiana y M. anisopliae señalan a la primera como la especie con mayores posibilidades de sobrevivir en el ambiente. Así mismo, está bajo estudio la estructura genética de las poblaciones de estos aislamientos en cada localidad. Esta estructura genética nos servirá para poder saber más acerca de las estrategias de estos hongos para sobrevivir. Si es una población genéticamente diversa, esto sugiere que no es el mismo aislamiento el que pudiera encontrarse el inicio del periodo que al final, lo genera la hipótesis de que la diversidad poblacional es empleada como estrategia de sobrevivencia. Por otro lado si no existe una diversidad poblacional genética, entonces debe haber aislamientos con ciertos atributos que le permiten sobrevivir bajo ciertos tipos de suelo. Llama la atención la baja persistencia de M. anisopliae. Aunque la baja persistencia de M. anisopliae no es algo nuevo, llama la atención que en una localidad existió un número razonable de aislamientos lo que sugiere que este suelo podría favorecer la persistencia de esta especie de hongo. Desafortunadamente no se cuenta con información derivado de un análisis de suelo para poder corroborar si existe algún factor responsable de esta mayor sobrevivencia. 4.2.2 Colecta de larvas de gallina ciega de localidades con diferentes niveles de infestación de la plaga Se colectaron un total de 385 larvas de gallina ciega. Algunas de las larvas fueron colectadas ya con signos de infección por lo cual no fue posible identificar género. En total, se obtuvieron 20 aislamientos de B. bassiana, 2 de M. anisopliae. Todos los aislamientos obtenidos están purificados, las versiones pluri y monospórica están bajo crio-preservación a -80 ºC.

Figura 2. Diferencias en abundancia relativa de aislamientos tanto de hongos y nematodos provenientes de larvas infectadas de gallina ciega de diferentes localidades del estado de Guanajuato. Ma = Metarhizium anisopliae, Bb = Beauveria bassiana.

Nuevamente se observa que B. bassiana es el hongo más exitoso al haberse encontrado más larvas de gallina ciega infectadas con este hongo comprado con M. anisopliae (Fig 2.) Así mismo, el municipio con el mayor número de aislamientos es Pénjamo, resultado similar al obtenido con los aislamientos provenientes de suelo (Fig. 1). 4.3. Identificación morfológica y molecular de los aislamientos 4.3.1 Identificación morfológica de aislamientos de hongos Todos los aislamientos provenientes de larvas de gallina ciega infectadas y de muestras de suelo están identificados. Todos los aislamientos obtenidos son de la especie Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. 4.3.2 Identificación molecular de hongos La identificación molecular se realizó únicamente para los aislamientos obtenidos de insectos. De acuerdo a las secuencias obtenidas, todos los aislamientos fueron confirmados como B. bassiana y M. anisopliae. 4.4. Corroboración de patogenicidad de los aislamientos encontrados Diferencias significativas se encontraron en los niveles de virulencia de los diferentes aislamientos de B. bassiana y M. anisopliae hacia larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. (Figura 3). De todos los aislamientos evaluados, sobresalen los aislamientos BbGC07 con 45 % de mortalidad, seguido por BbGC15 con 35% y BbGC03 con 33%, todos del género Beauveria. Los análisis se realizaron con base en las mortalidades totales considerando mortalidad por micosis y mortalidad por causas no identificadas. Sin embargo, al observar los niveles de mortalidad confirmada por hongo únicamente, otros aislamientos sobresalen, como por ejemplo BbGC03, BbGC13, BbGC15, MaGC01, BbGC11, BbGC09, BbGC14 y BbGC16 (Fig.3).

Figura 3. Mortalidad de larvas del tercer instar de Phyllophaga spp. despues de 32 días de inoculadas con 12 aislamientos de Beauveria bassiana y 4 de Metarhizium anisopliae.

4.5 Virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Experimento en progreso. 4.6 Efecto del género de gallina ciega en la virulencia de los aislamientos seleccionados Experimento en progreso. 4.7 Efecto de la temperatura en la virulencia de los aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp. Experimento en progreso. 4.8 Efecto del tipo de suelo en la virulencia de aislamientos seleccionados hacia larvas de Phyllophaga spp Para este experimento se tiene ya caracterizado los tipos de suelo que se evaluaran y los resultados se presentan a continuación. En el Cuadro 2 y Figura 4 se presenta las poblaciones microbianas presentes en el suelo muestreado en cinco localidades de Guanajuato. De los tres grupos microbianos evaluados, las bacterias se encontraron en mayor abundancia (Figura 4), comparado con las poblaciones de actinomicetos y hongos. Las bacterias son los primeros colonizadores en la descomposición de la materia orgánica y por su tamaño es comprensible que se encuentren en grandes proporciones. En el suelo pueden encontrarse de 106 a 107 UFC/ g de suelo seco (Alexander, 1980). Cuadro 2. Población de grupos microbianos en suelos del sur de Guanajuato Bacterias Muestras

pH

Actinomicetos

Hongos

UFC / g de suelo seco UFC X 106

UFC X 104

UFC X 104

San Lorenzo, Jerecuaro:Guanajuato

6.2

9.15

2.27

2.27

Puruagua,Jerecuaro: Guanajuato

6.2

6.85

7.97

31.5

Valle de Santiago:Guanajuato

7.7

12.1

79.5

3.51

Penjamo: Guanajuato

6.6

13.1

43.5

25.8

Comonfort: Guanajuato

6.3

40.8

19

7.17

Las poblaciones de actinomicetos en general fueron un poco superiores a las poblaciones de hongos (Figura 3). En el suelo, su proporción es menor que la de las bacterias pero en mayor número que la de los hongos, con rangos estimativos entre 1-5-1-8 por gramo de suelo seco (Gray y Williams, 1971). Las poblaciones de hongos en el suelo coinciden con los reportes de Alexander (1980) quien menciona que en el suelo hay entre 2-4-1-6 propágulos por gramo de suelo seco. En el caso de diversidad de hongos en el suelo, en las muestras monitoreadas se encontró muy poca diversidad.

Los valores de las poblaciones pueden variar mucho entre suelos. Un gramo de suelo agrícola contiene varios millones de bacterias, cientos de miles de propágulos de hongos y decenas de millones de protozoarios y algas (Campbell, 2005). La distribución de las poblaciones de microorganismos en el suelo está determinada por las partículas de las cuales están constituidos los suelos, la cantidad de nutrientes y el pH. Los suelos que monitoreamos tienen poblaciones altas de microorganismos, al parecer el pH no influyo sobre las poblaciones. En general, esto se debe a que las prácticas agrícolas como el arado, encalado, aplicación de fertilizantes, etc, incrementan la actividad microbiana del suelo. Los suelos provenían de suelos arados y preparados para la siembra de maíz probablemente por esa razón se encontró poblaciones altas de microorganismos. Las actividades agrícolas como el arado del suelo incrementan las poblaciones de los microorganismos, porque mezcla la materia orgánica que se encuentra en la superficie con todo el suelo y esto permite que tanto bacterias como actinomicetos y hongos se reproduzcan.

Figura 4. Análisis cuantitativo de las poblaciones microbianas de diferentes suelos muestreados en el sur del estado de Guanajuato.

4.9 Evaluación de los aislamientos a nivel de invernadero Experimento en proceso de establecimiento. 4.10 Evaluación de aislamientos a nivel de campo Experimento en proceso de establecimiento.

5. BIBLIOGRAFIA Alexander, M. 1980. Introducción a la microbiología del suelo. México, Ed. AGT Editor. 491 p. Berlanga-Padilla A, Hernández-Velázquez VM y Nájera-Rincón MB. 2000. Hongos entomopatógenos de “gallina ciega” Phyllophaga spp. (Coleoptera: Melolonthidae) nativos del occidente de México. En: Memorias del XXIII Congreso Nacional de Control Biológico. Torres-Guzmán JC, González-Hernández A, Salas-Araiza MD, Salazar-Solís E y Velasco-Silva JL (eds.). Guanajuato, México. Pp.38-41. Beron CM y Díaz BM. 2005. Pathogenicity of hyphomycetous fungi against Cyclocephala signaticollis. Biocontrol, 50:143-150. Campbell R. 2005. Ecología Microbiana. México, Ed. Limusa. 268 p. Díaz-Mederos P, Nájera-Ríncon MB, Lezama-Gutiérrez R, Rebolledo-Domínguez O y Flores-López HE. 2002. Especies de gallina ciega (Coleoptera: Melolonthidae) asociados al cultivo de maíz, factores agroclimáticos y de manejo, en los altos de Jalisco, México. En: Actas del XXV Congreso Nacional de Control Biológico. Báez-Sañudo R y Juvera-Bracamontes JJ (eds.). Hermosillo, Sonora, México. Pp.190193. Flores AG, De la Rosa W, Rojas JC y Castro AE. 2002. Evaluation of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae (Mitosporic) against species of the “white grub complex” in the South of Mexico. Southwestern Entomol., 27: 73-83. Gray T R y Williams ST. 1971. Soil Microorganisms. Oliver and Boyd, Edimburgo, UK. 235p. Hernández-Velázquez VM, Berlanga-Padilla A y Pérez-Domínguez JF. 2003. Hongos patógenos de gallina ciega Phyllophaga spp. (Coleoptera:Melolonthidae) de Jalisco y Nayarit. En: Memorias del XXVI Congreso Nacional de Control Biológico. Vazquez-García M, Pérez-Domínguez JF, Ibarra-Cortés K, Balpuesta-León CL, Vázquez-Reyes JR, Cervantes-Ríos J e Ibarra-Frias N (eds.).Guadalajara, Jalisco, México.Pp. 276281. Hernández-Velázquez VM, Mendoza-Morales C, Cervantes-Spindola Z, Sánchez-Salinas E y Lina-García L. 2005. Hongos y nematodos entomopatógenos en suelos cultivados con maíz en el estado de Morelos. En: Memorias del XXVIII Congreso Nacional de Control Biológico. Bujanos-Muñis R, Delgado-Castillo JC, Tamayo-Mejía F y Marín-Jarillo A (eds.). San Miguel de Allende Gto. México. Pp 177-179. Humber RA. 1997. Fungi: Identification. In: LA Lacey ed. Manual of Techniques in Insect Pathology. California, USA: Academic Press, Inc.153-185. Pérez-Domínguez JF, Hernández-Velasquez, V y Arreguin-echegaray A. 2003. Efectividad biológica de formulaciones comerciales de Metarhizium anisopliae (Vuill)contra adultos de gallina ciega en maíz de la ciénaga de Chapala, Jalisco. En: Memorias del XXVI Congreso Nacional de Control Biológico. VazquezGarcía M, Pérez-Domínguez JF, Ibarra-Cortés K, Balpuesta-León CL, Vázquez-Reyes JR, Cervantes-Ríos J e Ibarra-Frias N (eds.).Guadalajara, Jalisco, México.Pp. 300-305. Rodríguez del Bosque LA, Silvestre F, Hernández VM, Quiroz H y Throne JE. 2005. Pathogenicity of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana against Phyllophaga crinita and Anomala flavipennis (Coleoptera: Scarabeidae). J. Ent. Sci., 40: 67-73. Ruíz-Vega J y Aquino-Bolaños T. 2002. Recursos para el control integrado de gallina ciega Phyllophaga spp. en maíz de temporal. En: Actas del XXV Congreso Nacional de Control Biológico. Báez-Sañudo R y Juvera-Bracamontes JJ (eds.). Hermosillo, Sonora, México. Pp.211-213.

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