Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA 2º CURSO

TÉCNICAS INSTRUMENTALES EN BIOTECNOLOGÍA LÍPIDOS, AZÚCARES Y GLICOPROTEÍNAS Material docente para el alumno

Curso 2011-12 Laboratorio 3, Facultad de Ciencias, Edificio D

Profesores: Alberto Anel Joaquín Navascués Fermín Lampreave

SESIÓN 1. Introducción teórica: 1) Teoría general de lípidos. 2) Introducción a la cromatografía de gases (ver pdf adjunto titulado “Lípidos”) Práctica: Extracción de lípidos totales por el método de Folch. Materiales y Reactivos a) Material biológico: leche entera y suero fetal bovino b) Cloroformo-Metanol (2:1, v/v) c) KCl 0.88 % (p/v) en agua d) Na2SO4 anhidro e) NaCL 0.15 M, fosfato potásico 0.01 M, pH 7.4 (PBS) f) Tolueno y Hexano g) BHT (2,6-diterbutil-p-cresol) h) Acido n-heptadecanoico (17:0) Procedimiento 1.- Transferir cada una de las muestras (1 ml de leche entera ó 0,5 ml de suero fetal bovino) a tubos con cierre hermético (ver Nota 1) y añadir en cada uno de ellos 6 ml de cloroformo-metanol (2:1, v/v), 0.5 mg de ácido heptadecanoico (17:0), como estándar interno y 50 µ g de BHT como antioxidante. Agitar vigorosamente durante 5 minutos. 2.- Añadir 0.3 volúmenes de KCl 0,88 %. Agitar y centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos. 3.- Recoger la fase clorofórmica en un tubo y añadir sulfato de sodio anhidro para eliminar cualquier traza de agua. 4.- Recoger la fase clorofórmica en un tubo con cierre hermético previamente tarado y evaporar a sequedad en corriente de nitrógeno bajo campana extractora. 5.- Calcular la cantidad de lípidos totales por pesada en balanza de precisión 6.- Disolver el extracto en 300 µl de tolueno (o hexano, según se indique) y guardar las muestras cerradas en atmósfera de nitrógeno a -20°C y en oscuridad hasta su utilización.

Nota 1: Todos los tubos utilizados deben ser de vidrio y estar limpios y secos. Todas las manipulaciones con solventes orgánicos han de hacerse en campana extractora.

SESIÓN 2. Introducción teórica: Breve introducción a la cromatografía en capa fina aplicada a la separación de lípidos (ver pdf adjunto titulado “Lípidos”) Práctica: 1) Cromatografía en capa fina de lípidos totales Materiales y Reactivos a) Extractos lipídicos obtenidos anteriormente. b) Placas de 20 x 20 cm y 0.25 mm de espesor de Silicagel G c) Cubetas cromatográficas d) Solvente: Hexano/éter etílico/ácido acético (70:30:1) e) Revelador: Iodo. f) Soluciones estándar de lípidos al 5% (p/v) en tolueno: ácidos grasos libres, triacilglicéridos, fosfolípidos, colesterol y ésteres de colesterol. Muestra de lípidos totales de hígado de conejo o ternera (20 mg/ml). Procedimiento 1.- Activar las placas inmediatamente antes de su utilización, calentando durante 1 hora a 110°C. 2.- Cubrir 3 lados de la cubeta cromatográfica con papel de filtro. Añadir unos 100 ml del eluyente correspondiente, tapar la cubeta y dejar equilibrar durante unos 15-30 minutos. 3.- Aplicar las muestras problemas (50 µl) y estándares (10-20 µl) en forma de bandas muy finas a intervalos de 1-2 cm. Ayudarse con el marquito y la regleta proporcionados por el profesor. 4.- Introducir la placa en la cubeta, con el lado de las aplicaciones en el fondo, y cerrar herméticamente. 5.- Dejar desarrollar el tiempo necesario hasta que el eluyente llegue aproximadamante a 1-2 cm del borde superior de la placa (1h – 1h 30 min). 6.- Sacar la placa y marcar rápidamente con un lápiz el frente del eluyente. 7.- Secar la placa. 8.- Revelar: Introducir la placa en una cubeta que contenga I2 sublimado y esperar a que se tiñan las bandas correspondientes a los diferentes lípidos. Dibujar el contorno de las bandas rápidamente con un lápiz.

9.- Calcular los Rf de cada una de las manchas obtenidas e identificar los componentes de las muestras problema por comparación con las muestras estándar. 10. Separar, raspando cuidadosamente la placa con una espátula, la fracción de fosfolípidos de las muestras problema y transferir por separado a tubos provistos de cierre. 11. Añadir 3 ml de hexano y 2 ml de agua. Agitar vigorosamente y centrifugar 5 min a 1200 rpm para separar las fases. 12.- Transferir la fase orgánica a tubos limpios y secos y añadir sulfato de sodio anhidro para eliminar cualquier traza de agua. 13.- Recoger la fase orgánica en un tubo con cierre y evaporar a sequedad en corriente de nitrógeno bajo campana extractora. 14.- Disolver en 100 µl de hexano y guardar las muestras cerradas en atmósfera de nitrógeno a -20°C y en oscuridad hasta el día siguiente.

2) Preparación de ésteres metílicos de ácidos grasos Materiales y Reactivos a) Extractos de lípidos totales b) Metanol absoluto anhidro con un 5% (v/v) de H2SO4 concentrado c) NaHCO3 al 5% (p/v) en agua d) Na2SO4 anhidro e) Hexano Procedimiento 1.- Transferir 200 µl de los extractos de lípidos obtenidos en la práctica anterior a un tubo de 15 ml con cierre. 2.- Añadir 5 ml de la mezcla Metanol/H2SO4 recién preparada. 3.- Calentar en estufa a 80°C durante 90 minutos. 4.- Dejar enfriar y añadir 4 ml de hexano y 4 ml de agua. Agitar enérgicamente y centrifugar a 1.500 rpm durante 5 minutos. 5.- Transferir la fase superior orgánica a un tubo con cierre y añadir 2 ml de bicarbonato al 5%. Agitar y centrifugar. 6.- Transferir la fase orgánica a un tubo de vidrio de 15 ml con cierre y añadir sulfato de sodio anhidro. Centrifugar si es necesario. 7.- Recoger la fase orgánica en un tubo y evaporar a sequedad bajo corriente de nitrógeno. Redisolver en 100 ml de hexano y travasar a conos de vidrio.

8.- Guardar las muestras cerradas en atmósfera de nitrógeno a -20°C y en oscuridad hasta su utilización.

3) Cromatografía de gases (los ésteres metílicos serán inyectados por los alumnos o por el profesor al final de la sesión para poder interpretar los cromatrogamas resultantes al día siguiente) Materiales y Reactivos a) Esteres metílicos obtenidos anteriormente y muestras estándar b) Cromatógrafo de gases: equipo Shimadzu GC9A con detector de ionización de llama y columna empaquetada de 2 m de longitud y 3,2 mm de diámetro interno. c) Cromatógrafo de gases: equipo Shimadzu GC14 con detector de ionización de llama y columna capilar de 30 m de longitud y 0,25 mm de diámetro interno. d) Fase estacionaria de ambas columnas: SP 2330 al 10% sobre Chromosorb WAW como soporte (Supelco, USA) e) Gas portador: Helio Procedimiento 1.- Los esteres metílicos disueltos en hexano se inyectan (0,5-1µl) en la columna cromatográfica y se separan en las condiciones siguientes: a) Cromatógrafo Shimadzu GC9A: columna empaquetada de 2 metros - Flujo de gas portador: 30 ml/min. - Temperatura de la columna: isotermo a 185°C - Temperatura del inyector y detector: 250°C b) Cromatógrafo Shimadzu GC14: columna capilar de 30 metros - Flujo de gas portador: 30 ml/min. - Temperatura de la columna: programa de temperatura: Temperatura inicial : 170ºC (14 min), Rampa de temperatura : 20ºC/min, Temperatura final:195ºC (40 min) - Temperatura del inyector y detector: 250°C 2.- Los datos son recogidos por un ordenador y analizados mediante el programa GC-solutions. La cuantificación de los picos se lleva a cabo utilizando como estándar interno el ácido n-heptadecanoico (17:0).

SESIÓN 3. Práctica: 1) Cromatografía en capa fina de fosfolípidos Materiales y Reactivos a) Fosfolípidos extraídos de la Silicagel. b) Placas de 20 x 20 cm y 0.25 mm de espesor de Silicagel G c) Cubetas cromatográficas d) Solvente: Cloroformo/Metanol/Acido acético/Agua (50:30:8:4) e) Revelador: Iodo. f) Soluciones estándar de fosfolípidos al 5% (p/v) en tolueno Procedimiento 1.- Activar las placas inmediatamente antes de su utilización, calentando durante 1 hora a 110°C. 2.- Cubrir 3 lados de la cubeta cromatográfica con papel de filtro. Añadir unos 100 ml del eluyente correspondiente, tapar la cubeta y dejar equilibrar durante unos 15-30 minutos. 3.- Aplicar las muestras problemas (50 µl) y estándares (10-20 µl) en forma de bandas muy finas a intervalos de 1-2 cm. Ayudarse con el marquito y la regleta proporcionados por el profesor. 4.- Introducir la placa en la cubeta, con el lado de las aplicaciones en el fondo, y cerrar herméticamente. 5.- Dejar desarrollar el tiempo necesario hasta que el eluyente llegue aproximadamante a 1-2 cm del borde superior de la placa (1h – 1h 30 min). 6.- Sacar la placa y marcar rápidamente con un lápiz el frente del eluyente. 7.- Secar la placa. 8.- Revelar: Introducir la placa en una cubeta que contenga I2 sublimado y esperar a que se tiñan las bandas correspondientes a los diferentes lípidos. Dibujar el contorno de las bandas rápidamente con un lápiz. 9.- Calcular los Rf de cada una de las manchas obtenidas e identificar los componentes de las muestras problema por comparación con las muestras estándar.

2) Interpretación de los cromatogramas obtenidos Utilizando los cuadros de tiempos de retención relativos al ácido oleico adjuntos, así como la integración de los cromatogramas, realizar las siguientes tareas sobre los cromatogramas obtenidos de las propias muestras, así como de otros de los que aparecen en el pdf adjunto “Lípidos” que el profesor señale: 1) Identificar los picos correspondientes al BHT y al 17:0 2) Identificar y nombrar por la notación científica y por el nombre vulgar a cada ácido graso de los que aparezcan en el análisis 3) Cuantificar la cantidad presente de cada ácido graso en las muestras 4) Calcular el porcentaje de cada ácido graso sobre el total 5) Definir cuáles son los ácidos grasos mayoritarios en cada caso, identificar las diferencias y razonar las posibles razones funcionales de las diferencias observadas.

Cromatógrafo Shimadzu GC9A: columna empaquetada de 2 metros Condiciones: a) Fase estacionaria: SP 2330 b) Gas portador: He (30 ml/min) c) Separación isotérmica: 185ºC TIEMPO DE RETENCIÓN RELATIVO AL ÁCIDO OLEICO (18:1, n-9) Ácido graso

Tiempo retención relativo

12:0

0,16

BHT

0,23

14:0

0,27

14:1, n-7

0,32

16:0

0,48

16:1, n-7

0,56

17:0

0,66

18:0

0,87

18:1, n-9 / 18:1, n-7

1,00

18:2, n-6

1,22

20:0

1,33

18:3, n-6

1,41

18:3, n-3 / 20:1, n-9

1,58

20:2, n-9

1,79

18:4, n-3

1,89

20:2, n-6

2,12

20:3, n-9

2.30

20:3, n-6

2,50

20:4, n-6 / 20:3, n-3

2,80

20:4, n-3

3,20

20:5, n-3

3,60

22:4, n-6

5,20

22:5, n-6

6,10

22:5, n-3

6,60

22:6, n-3

7,20

Cromatógrafo Shimadzu GC14: columna capilar de 30 metros Condiciones: a) Fase estacionaria: SP 2330 b) Gas portador: He (30 ml/min) c) Separación: Programa de temperatura: Tª inicial: 170ºC (14 min), Rampa de tª: 20ºC/min, Tª final:195ºC (40 min) TIEMPO DE RETENCIÓN RELATIVO AL ÁCIDO OLEICO (18:1, n-9) Ácido graso

Tiempo retención relativo

12:0

0,41

BHT

0,49

14:0

0,55

14:1, n-7

0,59

16:0

0,64

16:1, n-7

0,70

17:0

0,75

18:0

0,91

18:1, n-9

1,00

18:1, n-7

1,01

18:2, n-6

1,17

18:3, n-6

1,32

18:3, n-3

1,44

20:2, n-6

1,85

20:3, n-9

1,89

20:3, n-6

2,09

20:4, n-6

2,30

20:3, n-3

2,33

20:4, n-3

2,56

20:5, n-3

2,88

22:4, n-6

3,84

22:5, n-6

3,97

22:5, n-3

4,20

22:6, n-3

4,34

SESIÓN 4. Introducción teórica: 1) Aislamiento de glicoproteínas por cromatografía de afinidad. Las glicoproteínas son proteínas que contienen oligosacáridos unidos covalentemente a determinados residuos de aminoácidos. Muchas proteínas esenciales para el funcionamiento de las células están glicosiladas. Además los cambios en la glicosilación, que pueden estar asociados a infecciones, inflamación, etc, pueden modificar la función de las proteínas. Las lectinas son proteínas de origen no inmune que precipitan las glicoproteínas y aglutinan las células y cuya actividad es inhibida por carbohidratos. Las primeras lectinas estudiadas fueron obtenidas de plantas. Entre ellas destacan la Ricinus communis obtenida de la semilla de ricino y la Concanavalina A (Con A) obtenida de Canavalia ensiformis. Más recientemente se han purificado lectinas de tejidos animales, y la investigación en esta área ha sido extremadamente reveladora sobre las propiedades funcionales de las macromoléculas que contienen carbohidratos.

2) Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony La inmunodifusión doble es una de las técnicas inmunoquímicas más sencillas y que proporciona importante información. Se prepara sobre portas de microscopio un gel tamponado de agarosa de unos 2 mm de espesor en el que se practican en forma de roseta unos pocillos de 3,5 mm de diámetro separados alrededor de 8 mm del pocillo central. En el pocillo central se carga el antisuero y en los periféricos las diferentes muestras a estudiar. Tras incubar entre 12 y 48 horas el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo se detecta por la formación de una línea de inmunoprecipitados entre los pocillos.

Práctica: Cromatografía en Sepharose 4B – Concanavalina A Es un ejemplo de aplicación de la utilidad de las lectinas para el aislamiento de glicoproteínas. La Con A interacciona preferentemente con secuencias que contienen manosa y puede discriminar entre secuencias bi-antenarias con las que interacciona y secuencias tri- o tetra-antenarias, con las que no interacciona. La presencia de

oligosacáridos bi, tri o tetra- antenarios es una forma de heterogeneidad muy común entre los N-glicanos de las glicoproteínas.

Materiales y reactivos. a) Sepharose 4B. b) Concanavalina A. Esta lectina ha sido aislada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de Zaragoza. c) Derivado de Sepharose 4B – Concanavalina A. La insolubilización de la Concanavalina A en Sepharosa 4B para la preparación de la columna de afinidad ha sido preparado en nuestro laboratorio con anterioridad. d) Tampón de cromatografía: 0,05 M Tris-HCl, 1 M NaCl, y 1 mM de cada uno de lo siguientes CaCl2, MgCl2 y MnCl2, pH 7,0 e) Tampón de elución: tampón anterior, que contiene además 0,1 M de α-metil-Dglucósido. Procedimiento 1. Preparación de la columna de Afinidad. Montar en una jeringa de 5 ml una columna de unos 2-3 ml de derivado Sepharose- Con A empaquetado adicionado el derivado sobre 1 ml del tampón de cromatografía. Dejar sedimentar. Abrir la salida de columna con flujo pequeño para que el derivado vaya compactándose. Continuar las adiciones del derivado hasta lograr la altura del lecho deseada. En todo momento mantener un volumen de 1-2 ml de tampón sobre el lecho de la columna para evitar que ésta se seque. 2. Lavar y equilibrar la columna de haciendo pasar por la misma unos 10 ml de tampón de cromatografía. 3. Aplicar a la columna 1 ml de suero de cerdo diluido 1/5 en el tampón de cromatografía. 4. Recoger el eluido de la columna en unos 7-8 tubos eppendorf (alrededor de 1 ml/tubo). Medir la A280 nm de los tubos obtenidos. Estos tubos contendrán las proteínas del suero que no interaccionan con la lectina. Las fracciones correspondientes al pico principal de proteínas serán reunidas en una única fracción, que será etiquetada como “fracción excluida” y guardada en frío. 5. Eluír las glicoproteínas fijadas a la columna con el tampón de elución recogiendo las fracciones de la misma forma que en apartado anterior. Guardar las fracciones reunidas

como “fracción eluida”.

2) Caracterización por inmunodifsuión doble las fracciones separadas Materiales y reactivos. a ) Portas de microscopio con primera capa de agarosa. Para su preparación, disponer los portas sobre una superficie horizontal y cubrir toda su superficie con una solución caliente (50 ºC) de agarosa al 1 % en agua destilada. Dejar es reposo hasta la evaporación completa del agua. b) Agarosa. c) Tampón veronal sódico 0,03 M, acetato sódico 0,03 M, 0,1 M ClNa, pH 7,4. d) Troqueladores. e) Antisueros anti albúmina de cerdo, antisuero anti transferrina de cerdo. Estos reactivos han sido desarrollados en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de Zaragoza. f) Suero de cerdo adulto, “fracción excluida” y “fracción eluida “ de la columna de Sepharose - Con A.

Procedimiento 1. Colocar los portas con primera capa sobre una superficie horizontal. 2. Preparar una solución al 1 % de agarosa en el tampón de veronal. Calentar en un erlenmeyer tapado hasta que empiece a hervir. 3. Dejar enfriar la agarosa hasta unos 45 ºC y extenderla con la ayuda de una pipeta de modo que se forme un gel de 2 mm de espesor. Dejara solidificar a temperatura ambiente. 4. Practicar los pocillos en el gel con la ayuda de un troquelador. Los pocillos se dispondrán en forma de rosetas. 5. Aplicar en el pocillo central y en el resto de los pocillos las soluciones indicadas en la figura. 6 Dejar difundir en una cámara húmeda a temperatura ambiente entre 15 y 24 horas. 7. Al día siguiente, lavar, secar, teñir los geles con azul de Coomassie y decolorar.

SESIÓN 5. Introducción teórica: Análisis de glicanos de glicoproteínas. El análisis de la estructura de los glicanos requiere la utilización de una amplia variedad de técnicas químicas, enzimáticas y físicas. Como un ejemplo de utilización de exoglicosidasas, enzimas muy utilizadas para el estudio de las glicoproteínas, se plantea la hidrólisis de la α 1-glicoproteína ácida de cerdo mediante tratamiento con neuraminidasa.

Práctica: Hidrólisis de ácidos siálicos de glicoproteínas Materiales y reactivos: a) α1- glicoproteína ácida de cerdo. Esta proteína ha sido aislada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de Zaragoza b) Neuraminidasa (EC 3.2.1.18) de Clostridium perfringens. c) Tampón acetato 0,2 M, pH 5,0. d) Filtros para esterilización. Procedimiento: 1. Disponer de una muestra de α1- glicoproteína ácida de cerdo de alrededor de 1 mg/ml. 2. Preparar una solución de neuraminidasa de unos 0,5 mg/ml. 3. Meclar 200 µl de la solución de α 1- glicoproteína ácida de cerdo con 200 µl de la solución de neuraminidasa. 4. Esterilizar la muestra por filtración a través de un filtro de 0,2 µm. 5. Incubar a 37 ºC durante 12-16 horas (esto se realizará el día anterior). 6. Analizar por electroforesis en geles de poliacrilamida-agarosa (6 %) la muestra de α 1glicoproteína ácida de cerdo sin tratar y tratada con neuraminidasa.

SESIÓN 6. Introducción teórica: Teoría general de azúcares. Los glúcidos, azúcares o hidratos de carbono son aldehidos o cetonas polihidroxilados, o productos derivados de ellos por oxidación, reducción, sustitución o polimeración. El primer nombre alude al carácter dulce de la mayoría de los glúcidos simples y el segundo es una generalización del representante más clásico del grupo, es decir el azúcar de caña, o sacarosa. Finalmente, el nombre de hidratos de carbono alude al hecho de que el H y el O tienen en la mayoría de ellos la misma proporción que en el agua Cn (H2O)m. El término hidrato de carbono comprende los monómeros llamados monosacáridos, los pequeños polímeros u oligosacáridos y los grandes polímeros llamados polisacáridos. Los hidratos de carbono pueden estar unidos a muchas proteínas y lípidos, formando las glicoproteínas y los glicolípidos en los que ejercen funciones clave en las interacciones entre las células y otros elementos del entorno celular. Determinación y caracterización de azúcares en una muestra. Los monosacáridos pueden deshidratarse con ácidos minerales fuertes y concentrados para dar lugar a derivados del furfural. Esta propiedad se utiliza con fines analíticos, pues los furfurales reaccionan con compuestos fenólicos, como el α - naftol o la resorcina para dar derivados quinólicos coloreados.

Polisacáridos Los polisacáridos son polímeros de elevada masa molecular derivados por condensación de monosacáridos. Desempeñan funciones de reserva y estructurales. Entre los polisacáridos de reserva destacan la amilosa, amilopectina y el glucógeno. Los dos primeros, mezclados en diversas proporciones, constituyen los almidones vegetales, que son la principal fuente de nutrición glucídica para la humanidad. El glucógeno tiene especial importancia en el reino animal porque garantiza un aporte inmediato de glucosa, de acuerdo con las necesidades metabólicas. La amilosa es un polímero lineal formado por unas 250-300 D-glucosas unidas con enlaces (1α→4). La amilopectina está compuesta por unas 1000 unidades de glucosa, que, además de las uniones (1α→4) contiene uniones (1α→6) de las que parten nuevas

ramas con enlaces (1α→4). Las ramificaciones se presentan cada 25-30 monómeros. El glucógeno tiene una estructura similar, pero las ramificaciones son más frecuentes (aparecen cada 8-12 monómeros). La amilosa presenta en solución acuosa una estructuras secundaria característica de forma helicoidal. Esta estructura secundaria permite que el ión I3- penetre dentro del helicoide originando una coloración azul violácea intensa. La amilopectina y glucógeno dan con el yodo una coloración rojiza.

Práctica: Reacciones de caracterización de azúcares -REACCION DE MOLISCH Materiales y Reactivos a) Soluciones al 0,1% en agua de ribosa, glucosa, fructosa, sacarosa, glucógeno y almidón. b) Solución alcohólica de alfa-naftol al 5%. c) Acido sulfúrico concentrado. Procedimiento 1.- Preparar una dilución 1/4 de las soluciones de azúcares. 2.- Poner en tubos de ensayo 0,5 ml de cada solución de azúcar. Preparar un blanco con 0,5 ml de agua. 3.- Añadir a cada tubo 2 gotas de la solución de alfa-naftol. Mezclar bien. 4.- Con el tubo inclinado dejar resbalar cuidadosamente en cada uno de ellos 1 ml de sulfúrico concentrado de modo que se forme una capa bajo la fase acuosa. Obsérvese el color producido.

-REACCION DE SELIWANOFF Materiales y Reactivos a) Soluciones al 1% en agua de ribosa, glucosa, fructosa, sacarosa y glucógeno. b) Disolver 0,25 g de Resorcinol en 500 ml de HCl 6 N. Procedimiento 1.- Preparar diluciones 1/4 de las soluciones de azúcar.

2.- Poner en tubos de ensayo 0,5 ml de las soluciones de azúcares. Preparar un blanco con 0,5 ml de agua. 2.- Añadir a cada tubo 2 ml de Resorcinol (reactivo b). 3.- Calentar en baño de agua hirviendo. Comparar el tiempo en que aparece el color. Determinación de poder reductor en azúcares. Las aldosas son reductoras, aunque no tanto como los aldehidos, debido a que el grupo aldehido está habitualmente enmascarado por el enlace hemiacetálico. Sin embardo, son capaces de reducir en caliente y en medio alcalino el cobre (II), azul a cobre (I) rojo. -REACCION DE NELSON Materiales y Reactivos a) Soluciones al 0,1% en agua de ribosa, glucosa, fructosa, sacarosa, glucógeno y almidón. b) REACTIVO ALCALINO DE NELSON: Preparar en el momento de usar. Mezclar en la proporción 0,5 ml de reactivo b.1. con 12,5 ml de reactivo b.2 Reactivo b.1.-Disolver 7,5 g de CuSO4.5H20 en 50 ml de agua. Añadir una gota de ácido sulfúrico concentrado. Reactivo b.2.- Disolver 12,5 g de Na2CO3 (anhidro), 12,5 g de tartrato Na/K, 10 g de NaHCO3 y 100 g de Na2SO4 (anhidro) en 500 ml de agua. Procedimiento 1.- Poner en tubos de ensayo 0,5 ml de las soluciones de azúcares. Preparar un blanco con 0,5 ml de agua. 2.- Añadir a cada tubo 1 ml del REACTIVO ALCALINO DE NELSON. 3.- Calentar en baño de agua hirviendo. Observar la formación de color en función del tiempo.

-REACCIÓN DEL ALMIDÓN Y DEL GLUCÓGENO CON YODO Materiales y Reactivos a) Soluciones al 0,1% en agua de ribosa, glucosa, fructosa, sacarosa, almidón y glucógeno. b) I2/IK N/10: Disolver 36 g de IK en 500 ml de agua. Pulverizar iodo y añadir 25,4 g a la disolución anterior, disolviendo el iodo completamente. Completar la disolución hasta 2 litros.

Procedimiento 1.- Disponer en distintos tubos 1 ml de las disoluciones de azúcares. Preparar un blanco con 1 ml de agua. 2.- Añadir una gota del reactivo I2/IK. Observar la aparición de color. 3.- Calentar suavemente en baño de agua y observar la variación del color en función del tiempo. Enfriar rápidamente y observar la reaparición del color anotando el tiempo.

SESIÓN 7

Elaboración, presentación y discusión de resultados obtenidos en las sesiones 1-6. CUESTIONES. LÍPIDOS 1. ¿Que porcentaje de lípidos sobre el peso total había en tu muestra de leche? ¿Y en la de suero? ¿Te parece que hay mucha grasa en la leche? ¿Y mucho colesterol? 2. ¿Porqué hay que trabajar con material de vidrio cuando trabajamos con lípidos? ¿Porqué hay que usar en lo posible atmósfera de nitrógeno? ¿Porqué hay que usar campanas extractoras? 3. ¿Cuál es el lípido mayoritario de la leche? ¿Y el del suero? ¿Y el del extracto de hígado? ¿Cuál es el significando funcional de estas diferencias? 4. ¿Cuál es la diferencia fundamental en los eluyentes que has utilizado para separar los lípidos totales y las clases de fosfolípidos? ¿Y porqué esto explica que separen mejor a unos tipos de lípidos o a otros? 5. ¿En qué muestra se ha visto mejor la separación de los fosfolípidos? ¿Cuál ha sido el fosfolípido mayoritario en cada muestra? 6. Nombra dos ácidos grasos esenciales. Recomienda algún nutriente especialmente rico en cada uno de ellos. 7.

¿Cuál es el ácido graso mayoritario en la leche? ¿Hay muchos ácidos grasos saturados en la leche? ¿Es esto pues nocivo para la salud?

CUESTIONES. AZÚCARES Y GLICOPROTEÍNAS 1. Dé una explicación al hecho de que la α-D manosa sea más estable que la β-Dmanosa, mientras que con la glucosa no ocurre los mismo. 2. La α-D galactopiranosa produce una rotación del plano de la luz polarizada, pero el producto de sus reducción con borohidruro sódico (galactitol) no lo hace. Explique la diferencia. 3. ¿Por que la sacarosa no se considera un azúcar reductor?. 4. Por tratamiento con periodato, una muestra de 200 mg de celulosa liberó 4,12 µmoles de ácido fórmico. (a) ¿Cuál es el PM medio de las moléculas de celulosa?. (b) ¿Cuál es la longitud media de la cadena de una molécula de celulosa?.

BIBLIOGRAFÍA: 1.- En la web: - http://www.lipidlibrary.com - http://www.usm.maine.edu/~newton/TANES/TLCAPP.HTML: (Tutorial sobre TLC (Universidad de Maine, EEUU): - http://www.chromatography-online.org 2.- Lipid Analysis, W.W. Christie, 3rd ed. Vol. 15 in The Oily Press Lipid Library. (2003) ( 2nd ed., 1982*) 3.- Lipid Analysis: A practical approach, R.J. Hamilton and S. Hamilton, IRL Press, Oxford University Press, (1992)* 4.- Separation and analysis of membrane lipid components. J.A. Higgins, En: Biological Membranes. A Practical Approach. JBC Findlay y WH Evans, Editores. IRL Press - Oxford University Press, (1990). 5.- Techniques of lipidology, M.Kates, North-Holland/American Elsevier, 2nd edition (1986) (1 ed. 1982*) 6.- Tesis y tesinas de licenciatura relacionadas con el tema que se han llevado a cabo en el Departamento* 7.- Catálogos comerciales de cromatografía. * * están disponibles en el Departamento