BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 1: BIOSEGURIDAD Y CONTROL DE CALIDAD

1. INTRODUCCION El laboratorio de biología celular y molecular tiene una serie de condiciones especiales relacionadas con el manejo de reactivos, elementos y equipos que pueden influir en la salud del personal así como repercutir en el medio ambiente. Por ende, es importante conocer las normas establecidas, familiarizarse con el uso de cada uno de los materiales de trabajo para evitar cometer errores o sufrir accidentes durante su manipulación. El personal del laboratorio, por lo tanto, está expuesto a una serie de riesgos ocupacionales por agentes físicos, químicos y biológicos, los cuales pueden originar alteraciones en la salud, generalmente prevenibles si se aplican las normas de bioseguridad, que incluyen el manejo correcto de material infeccioso, así como el uso de elementos protectores, y el manejo adecuado de desechos biológicos y reactivos químicos.

2. OBJETIVOS • •

Identificar los riesgos químicos, físicos y biológicos relacionados con el uso de los elementos, reactivos y equipos del laboratorio de biología celular y molecular. Conocer el uso, manejo y desecho de sustancias irritantes, tóxicas, cancerígenas, teratogénicas, entre otras.

3. MARCO TEORICO 3.1 Factor de Riesgo Es una forma sistemática y organizada de identificar, localizar y valorar los factores y / o agentes de riesgo en el contexto laboral.

El término “Seguridad biológica” implica un conjunto de medidas científicoorganizativas y técnicas para proteger al personal, la comunidad y el medio ambiente. 3.1.1. Clasificación general de Factores y Agentes de Riesgo FISICOS: Este tipo de riesgo está determinado por una variedad de agentes: • • • • • • • • •

Mecánico: objeto en movimiento. Térmico: altas o bajas temperaturas. Eléctrico: alto voltaje y conexiones eléctricas. Radiaciones: ionizantes y radioactivas. Incendios. Iluminación. Ruidos o vibraciones: por funcionamiento de equipos. Microclima: condiciones de temperatura de instalación. Presiones anormales.

QUÍMICOS: Al manipular reactivos químicos, es necesario conocer y evaluar sus peligros y determinar la forma apropiada para su manejo seguro. Esta información se obtiene de las etiquetas, hojas de seguridad suministradas por el fabricante u otras fuentes. Las etiquetas del fabricante incluyen el nombre del producto, el pictograma de seguridad, las frases de riesgo entre otras. El etiquetado del puesto de trabajo se emplea cuando el producto es transferido a otro contenedor diferente al original. Allí debe contener el nombre del producto, del fabricante, frases de riesgo y consejos de prudencia. Las hojas de seguridad informan sobre las propiedades físicas, químicas y toxicológicas de una sustancia y los procedimientos recomendados para una manipulación segura, uso de equipos para protección, primeros auxilios, tratamiento de desechos, derrames y otros. La clasificación de las sustancias químicas depende de su peligrosidad, de lo cual se establece que existen: • • • • • •

Tóxicas Muy tóxicas Corrosivas Irritantes Inflamables Extremadamente inflamables

• • • • •

Comburentes (en contacto con otras producen reacción exotérmica) Explosivas Nocivas Peligrosas para el medio ambiente Gaseosos (gases, vapores, aerosoles), sólidos (polvos orgánicos o inorgánicos, humos metálicos), líquidos (rocío, neblinas), compuestos (hidrocarburos).

BIOLÓGICOS: Los riegos biológicos se pueden identificar según: el tipo de material biológico que se manipula, los procedimientos de rutina realizados en el laboratorio, el manejo de desechos biológicos, el aseo y desinfección de las áreas de trabajo, la disponibilidad de implementos de protección personal, los protocolos de reconocimiento, las enfermedades relacionadas con el trabajo, los accidentes e incidentes más comunes como pinchazos, cortaduras e inhalaciones, las enfermedades ocupacionales adquiridas en el laboratorio. Agentes potenciales de lesiones y accidentes: Manipulación → Procedimiento → Transporte → Almacenamiento •

• •

El trabajo en un laboratorio de Biología celular y molecular se lleva a cabo en condiciones especiales que pueden influir en la salud del personal y tener repercusiones negativas para el medio ambiente. La principal característica lo constituye la labor intensiva del factor biológico, específicamente cuando se trabaja con microorganismos, su metabolismo y los tipos reactivos, materiales y equipos comúnmente empleados. El desarrollo de la ingeniería genética, el estudio de enfermedades infecciosas y el manejo de preparados biológicos, necesita de instalaciones en diseño y construcción. Durante la manipulación se puede generar la producción de aerosoles infectivos que contaminen el ambiente laboral o los ensayos que se estén desarrollando.

3.2. Manejo de residuos sólidos Cada laboratorio cuenta con canecas para la eliminación de residuos sólidos: CANECA CON BOLSAS GRISES: material reciclable. • •

Disposición final: reciclaje – comercialización Empaque de plástico, bolsas de polietileno, vidrio no contaminado, cajas de cartón, hojas de papel, periódico, botellas.

CANECA CON BOLSA VERDE: material común, residuos biodegradables.

• •

Disposición final: relleno sanitario Residuos de alimentos, servilletas, barrido, colillas, icopor, papel carbón, jeringa sin agujas.

CANECA CON BOLSA ROJA: material infeccioso, residuos sólidos altamente contaminantes en contacto con residuos tóxicos. • •

Disposición final: cremación Gasas, algodón, guantes de látex y de caucho, material de curación, medios de cultivo y escobillones previa esterilización, frascos plásticos para recolección de muestras, geles como matriz para electroforesis.

GUARDIANES: empleados para la eliminación de agujas, cuchilla, lancetas, ampollas u otros elementos cortos punzantes, nunca se eliminan allí las jeringas. •

Disposición final: incineración.

NOTA: •

• 3.3.

Reactivos como acrilamida son compuestos neurotóxicos que exigen el uso de máscaras y guantes cuando se están preparando los geles. Después de polimerizados no tienen tanto riesgo. Los geles en general se descartan en bolsas rojas. Bromuro de etidio es tóxico, cancerígeno y mutágeno; se debe inactivar antes de su eliminación. ( ver tabla 1) Manejo de residuos líquidos

Las sustancias líquidas utilizadas en el laboratorio deben ser eliminadas de acuerdo al tipo de sustancia. Algunas requieren ser almacenadas en contenedores para su posterior inactivación, otras deben ser tratadas para ser eliminadas (nitrato de plata) y otras pueden ser eliminadas a través del caño sin consecuencias ambientales. Las soluciones para tinción deben ser cuidadosamente descartadas. Los medios de cultivo sólidos que fueron utilizados para crecimiento de microorganismos deben ser esterilizados antes de ser descartados. Así mismo aquellos que se utilizaron para crecimiento de material vegetal aún cuando no contengan hongos, levaduras o bacterias no patógenos. 3.4 Bioseguridad En el laboratorio se refiere al conjunto de medidas preventivas destinadas a mantener la vigilancia para proteger la salud.

Los accidentes que ocurren durante el trabajo en el laboratorio generalmente se deben a descuido, desconocimiento o por no atender las instrucciones establecidas, generando riesgos que pueden afectar la integridad no solo de los trabajadores del laboratorio, sino también de la comunidad y en ocasiones hasta de la familia. REACTIVO

USOS

EFECTOS NOCIVOS Mutagénico y carcinogénico moderadamente Tóxico

MEDIDAS DE PREVENCIÓN Se deben utilizar guantes destinados solo para su uso, tapabocas y mascarilla Usar guantes, máscara adecuada para el manejo de estos, y cámara extractora de gases No ingerir y evitar. la inhalación de grandes cantidades del vapor. 100 ml pueden ser fatales.

Bromuro de Etidio

Colorante para tinción de ácidos nucleicos

Solventes orgánicos

Extracción de ácidos nucleicos; disolventes de tinciones de proteínas

Tóxicos

Isopropanol

Extracción de ácidos nucleicos

EDTA

Inhibidor DNAsas

de

Inflamable y no potable. Excesiva inhalación puede causar tos, cefalea, mareos, depresión mental, nauseas, vómitos, narcosis, anestesia, coma. Irritante

Dietil piro carbonato

Manejo ARN

de

Cancerígeno

Formaldehído

Tinción de ADN con nitrato de plata Electroforesis de proteínas

Acrilamida acrilamida

y

bis

Tóxico

Es un potente neurotóxico, absorbido totalmente por la piel y sus efectos son acumulativos. la poliacrilamida

DISPOSICIÓN DEL DESECHO Inactivación con carbón activado o amberita XAD16, eliminación de desechos sólidos en bolsa roja. Se almacena en frascos oscuros e incinerar.

Eliminarlo diluido en agua

Evitar el contacto con piel y mucosas Evitar el contacto con piel y mucosas Usar en cámara extractora

Eliminarlo diluido en agua

Se debe usar guantes, mascara, tapabocas. Una vez polimeriza, se considera no tóxica

Polimerizar eliminar en bolsa roja

Se almacena en frascos oscuros e incinerar. Se almacena en frascos oscuros e incinerar. y la

una formada considera tóxica Tóxicos

Solventes orgánicos

Extracción de ácidos nucleicos; disolventes de tinciones de proteínas

TRIZOL:

Extracción de ARN

Tóxico

Persulfato de amonio

Electroforesis (Catalizador en la polimerizació n de la acrilamida)

Oxidante

Acido cacodílico

Cuantificació n de ADN

tóxico

Ferrocianuro de potasio en solución

Cuantificació n de ADN

Tóxico

vez se no Usar guantes, máscara adecuada para el manejo de estos, y cámara extractora de gases Si es inhalado o si entra en contacto con la piel, causa quemaduras Mantener lejos de otros reactivos inflamables. Evitar el contacto con la piel Usar guantes y tapabocas Usar guantes y tapabocas

Se almacena en frascos oscuros e incinerar.

Se almacena en frascos oscuros e incinerar.

Se almacena en frascos oscuros e incinerar.

Almacenar botella hasta incineración Almacenar botella hasta incineración

en su en su

TABLA No. 1 ESPECIFICACIONES DE LOS REACTIVOS MÁS USADOS EN EL LABORATORIO MOLECULAR

Existen algunas normas de precaución universal que son necesarias tenerlas presentes en el manejo del laboratorio. •

• • •

Utilizar siempre elementos de barrera adecuados según las necesidades: blusa, guantes, mecheros, tapabocas, mascarillas, cámaras de seguridad, gafas, etc. para evitar contacto de mucosas y piel con aerosoles, gotas y salpicaduras. El lavado de manos es una de las estrategias más sencillas pero de suma importancia; este se debe hacer minuciosa y vigorosamente antes y después de tener contacto con sustancias o algún tipo de muestras. En caso de contacto directo con la piel o los ojos deben enjuagarse inmediatamente con abundante agua Mujeres en estado de embarazo deben conocer y aplicar estrictamente las normas de bioseguridad, para minimizar el riesgo morbimortalidad y/o malformación del feto.

En un laboratorio de Biología celular y molecular o de investigación las precauciones que se deben adoptar:

• • • • • • • •

Conocer las características de toxicidad de los reactivos y manejarlos de acuerdo a recomendaciones de los insertos y/o la ficha técnica respectiva. (ver tabla 1) Es importante conocer la distribución de las diferentes secciones del laboratorio, para evitar posibles riesgos de contaminación de las muestras que produzcan alteraciones en los resultados finales. Utilizar siempre implementos de protección limpios (guantes, careta, tapabocas, blusa de laboratorio) Lavarse las manos antes y después de trabajar en el laboratorio No tocar con las manos enguantadas ojos, nariz u otras mucosas expuestas. Desinfectar el área de trabajo antes y después de cada trabajo utilizando hipoclorito al 1% por 15 minutos, también se puede utilizar alcohol antiséptico. No pipetear ningún reactivo o solución acuosa con la boca. Los reactivos después de su uso, deben quedar perfectamente cerrados. Los materiales de desecho deben descartarse de acuerdo a su naturaleza: inactivados o tratados (ver tabla 1: reactivos y especificaciones en el laboratorio molecular) en las bolsas de basura del color adecuado y canecas dispuestas para tal fin.

3.5 Términos a considerar Carcinógeno: agente que se sabe o sospecha causa cáncer. Mutágeno: Agente que induce mutaciones en el material genético Teratógeno: agente que se sabe o sospecha que ocasiona daño al feto Tóxico: Sustancia que ocasiona daño a la salud, por exposición corta o prolongada, cuando es ingerida, inhalada o absorbida por la piel o mucosas. Corrosivo: agente químico que destruye el tejido o los materiales por contacto directo. 4. Control y Garantía de Calidad Todos los laboratorios deben diseñar un programa de control de calidad de reactivos, equipamiento, metodologías y manuales de procedimiento. La garantía de calidad en el Laboratorio de Biología Celular y Molecular debe tener como objetivo “obtener resultados fiables en un tiempo adecuado, a partir del espécimen correcto y a un precio razonable”, para que esta sea integral se debe basar en un control de calidad tanto interno como externo garantizando la exactitud y precisión de todo procedimiento, además de la aplicación de la normativa sobre Buenas Practicas de Laboratorio .que permitirán que los resultados suministrados al paciente sean confiables.

5. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS • • • • • • • • • • • •

Guantes Tapabocas Pipetas automáticas Tubos para centrífuga Centrífuga, micro centrífuga Termociclador Potenciómetro Balanza analítica Transiluminador de U.V., Analizador de imágenes Cámaras de flujo laminar, cámaras de extracción Congeladores Desionizador

6. PROCEDIMIENTO 6.1 . Normas de bioseguridad: • • • •

Realizar lectura previa a la práctica de las guías y las páginas web relacionadas en el marco teórico. Comparar lo propuesto a nivel virtual con la guía de tal manera que se establezcan similitudes y complementación para el laboratorio de Biologia celular y molecular Hacer uso adecuado de los guantes de látex y tapabocas, seguir lo indicado para su eliminación Reconocer el área física del laboratorio, su distribución, los implementos, equipos y símbolos relacionados con bioseguridad.

6.2 Garantía de Calidad: • •

Se realizará el reconocimiento de los equipos de mayor uso en el laboratorio molecular. Se especificará sobre sus requerimientos y uso de controles

7. POST-LABORATORIO: 1. Consultar acerca de las sustancias más utilizadas como descontaminantes a nivel de un laboratorio de Biología Molecular. 2. Investigar el tipo de Agua que se utiliza en el laboratorio de Biología Molecular y como es su tratamiento (obtención). 3. Consultar sobre el tipo o clasificación de laboratorios y cabinas de flujo laminar de acuerdo a la normas de bioseguridad. 4. Consulte y construya un cuadro con la simbología utilizada en Bioseguridad. Utilice colores.

8. BIBLIOGRAFÍA • Current protocols 2013 on line. • Rodríguez, J. Argote E, Rodríguez O. 2001. Temas de seguridad biológica. Editorial Félix Varela, Ciudad de la Habana, Cuba. • Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, • Álvarez A. Campuzano S. 2003. Manual de tratamiento, manejo, envió, transporte y desecho de muestras biológicas. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá, Colombia. • ISS, Cámara de la Industria farmacéutica. El ABC de la seguridad en el laboratorio. Edición Merck Colombia S.A.

9. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LA PRACTICA

LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD

ANEXO PRACTICA No. 1: LA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

Buena parte de las manipulaciones propias del cultivo in Vitro deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los cultivos. Para disponer de una superficie de trabajo estéril que no ponga en peligro la esterilidad de los cultivos se usan las cámaras de flujo laminar. Una cámara de flujo laminar es un receptáculo en forma generalmente prismática con una única cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la Figura 1. Esquema de una cámara de flujo superficie de trabajo. La laminar horizontal esterilidad de la zona de trabajo se consigue porque se hace circular a través del interior de la cámara una corriente de aire que previamente ha sido microfiltrada para eliminar toda partícula extraña. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cámara de flujo sin pasar previamente por los filtros se procura que la presión interior sea ligeramente superior a la presión exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revés. Según el grado de sofisticación de la cámara, puede disponer de elementos accesorios como son: fuente de luz, lámpara de esterilización por U.V., pilotos indicadores de funcionamiento diversos, contador de horas de funcionamiento, indicador de presión interior, etc. Existen dos tipos de cámaras de flujo laminar según sea la forma en la que se hace circular el aire: cámaras de flujo horizontal y cámaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cámara hasta el frente, de forma que las partículas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo. En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partículas se mueven perpendicularmente a ella.