BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 8: ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA

1. INTRODUCCIÓN Para detectar los productos o fragmentos de ADN obtenidos después de varios de los procedimientos realizados en un laboratorio molecular, como son: extracción de ADN, cortes con enzimas de restricción y amplificación de ADN o ADNc mediante PCR se requiere la utilización de la electroforesis como metodología analítica que permite visualizar estos productos. La electroforesis es un procedimiento en el cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico. Por lo tanto, esta permite que macromoléculas como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos, se muevan hacia el polo positivo o negativo, en función de la carga que posean ((Bula, 1982) y de esta manera se separen por la velocidad de migración bajo la acción de un campo eléctrico. 2. OBJETIVOS • •

Analizar diferentes productos enzimáticos y de PCR obtenidos de la experimentación en el laboratorio molecular. Utilizar la electroforesis de agarosa como método de separación y análisis de ácidos nucleicos

3. MARCO TEORICO Las moléculas de ADN de doble cadena lineal migran a través del gel a una velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases que conforman dicha molécula. Esto permite calcular el tamaño en pares de bases de un ADN con base en la migración electroforética. Un fragmento de ADN lineal de un tamaño dado y en un tiempo definido migra a distancias diferentes a través de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. De esta manera usando geles de diferentes concentraciones, es posible separar un amplio rango de moléculas de ADN. (Tabla No.1)

Tabla No. 1. Rango efectivo de separación de ADN en geles de agarosa Concentración agarosa en el (%p/v) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

de Rango efectivo de separación gel de moléculas de DNA lineal (Kb) 5 – 60 1 – 20 0.8-1.0 0.5 – 7 0.4-6.0 0.2 – 3 0.1 –2

Los ADN circulares súper enrollados (forma I) y circulares con un corte (forma III) migran a través de geles de agarosa con diferentes movilidades. La forma I del ADN es una estructura compacta que hace que la superficie de contacto con la matriz sea menor, lo que hace que la molécula migre una distancia mayor y de manera más rápida que la forma III, en la que la superficie de contacto es mayor. Aplicación de Voltajes La distancia usada para determinar el gradiente de voltaje es la distancia entre los electrodos, no la longitud del gel.

Diagrama de electroforesis

4. PRELABORATORIO 1. ¿En qué consiste una separación electroforética? 2. ¿Qué parámetros pueden variarse para determinar las condiciones óptimas de separación de componentes por electroforesis? 3. ¿Cómo influye el pH de la solución reguladora sobre la migración de los iones a separar por electroforesis? 4. ¿Cómo influye la fuerza iónica de la solución reguladora sobre la migración de los componentes a separar por electroforesis? 5. Comparar los efectos de soluciones reguladoras de fuerza iónica alta y baja con respecto a su capacidad buffer y a la posibilidad de aplicación de voltajes elevados. 6. ¿Por qué aumenta la temperatura del sistema durante el desarrollo electroforético? ¿Qué efectos pueden producir esas variaciones? 7. ¿En qué consisten los medios soporte para electroforesis? ¿Qué propiedades de los medios soporte influyen en la separación electroforética? 8. Explique detalladamente cuales son los buffers utilizados en el corrido electroforético y sus componentes (TAE, TBE). ¿Cuáles son sus propiedades y cuando se utilizan? 9. ¿Qué es el buffer de carga y que propósitos cumple en la electroforesis? 10. ¿Cuáles son los buffer de electroforesis en agarosa más comunes? 5. MATERIALES Y REACTIVOS Reactivos: • • • • • •

Agarosa al 2% Agua desionizada grado I (MQ) estéril (H2O dd) Tampón de electroforesis (TBE 10x = Tris base 10.8 g, ácido bórico 5.5 g EDTA 0.5 M pH 8.0 4 ml completar con agua desionizada a 100 ml) Bromuro de etidio 10mg/ml Tampón de carga (Buffer de carga 6X basado en glicerol= glicerol 50%, EDTA 1 mM pH 8.0, azul de bromofenol 0.25%, xylene cyanole 0.25%) Muestras de DNA diluidas en buffer TE (Tris-HCl 10mM EDTA 1 mM)

Nota: En concentraciones de agarosa entre el 0.5- y 1.4% , el naranja de acridina migra a la misma velocidad que el DNA de doble cadena de un tamaño de 50 pb; el azul de bromofenol (AB) migra a la misma velocidad que el DNA de doble cadena de un tamaño de 300 pares de bases, mientras que el xylene cyanole (XC) migra a una rata similar al DNA de 4 kilo bases (Kb) Materiales Cámara de electroforesis para geles horizontales, fuente de poder, transiluminador de luz ultravioleta (UV), puntas, micro pipetas, tubos Eppendorf, Erlenmeyer,.

6. PROCEDIMIENTO 6.1 Preparación del gel •

Preparar la agarosa al 2% en TBE 1X en un Erlenmeyer que sea de tamaño 2 veces mayor que la cantidad de agarosa a preparar (50 ml). Deje que la agarosa se hidrate y marque el nivel del líquido en el recipiente. Caliente la mezcla hasta que aparezcan burbujas, agite suavemente para resuspender la agarosa aun no disuelta; caliente de nuevo, hasta que se disuelva completamente y reponga el volumen perdido.

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Permita el enfriamiento de la agarosa a una temperatura aproximada de 5060°C, adicione 2.5 µl de bromuro de etidio (EtBr 10 mg/ml) para una concentración final de 0.5 µg/ml (CUIDADO! EL EtBr ES MUTAGENICO, MANEJELO CON GUANTES Y TAPABOCAS).

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Vierta la solución de agarosa en el molde previamente preparado, coloque el peine apropiado para formar los pozos donde será colocada la muestra y deje solidificar. Para una resolución óptima los geles deben tener un grosor entre 5 y 6 mm; los geles demasiado gruesos hacen que las bandas de ADN se visualicen tenues y difusas.

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Una vez solidificada la agarosa (aprox. 30 min.), retire cuidadosamente el peine, introduzca el gel en el aparato de electroforesis y adicione suficiente tampón TBE 0.5% a los compartimentos de la cámara de electroforesis para sumergir el gel entre 3 a 5 mm. Si se adiciona menos tampón, el gel puede secarse durante la corrida electroforética, y si se adiciona mucho tampón, se disminuye la movilidad del ADN, se promueve la distorsión de las bandas y produce calentamiento excesivo del sistema.

6.2 Corrido electroforético •

Prepare las muestras de ADN así: 8 µl de ADN más 2 µl de tampón de carga 2X. De igual manera proceda con el patrón de peso molecular, si este está a una concentración de 100 ng/µL: 3 µl de patrón más 2 µl de tampón de carga 2X y 5ul de agua dde.

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Haga un esquema del gel, localizando cada una de las muestras. La cantidad de ADN que puede ser cargada en un gel depende de varios factores: volumen del pozo; tamaño de los fragmentos que se quieren visualizar (la capacidad del gel disminuye a medida que aumenta el tamaño de los fragmentos); distribución del tamaño de los fragmentos, y gradiente del voltaje (voltajes altos son apropiados para fragmentos 1 Kb). La menor cantidad de ADN que puede ser visualizada confiablemente en un gel coloreado con EtBr es 10ng;

sin embargo, la cantidad de ADN que produce bandas claras y nítidas, es alrededor de 100 ng. •

Conecte la cámara de electroforesis a una fuente de poder y realice el corrido a un gradiente de voltaje de 5-10 V/cm. (La distancia que debe considerarse para determinar el gradiente de voltaje es la distancia entre los electrodos y no la longitud del gel).

Recomendaciones: Si el voltaje es demasiado alto, la banda de ADN se puede convertir en una línea delgada, especialmente para fragmentos > 12-15 Kb; en este caso, se recomienda una electroforesis con un gradiente de voltaje de 1-2V/cm. Cuando el voltaje es demasiado bajo se reduce la movilidad de los fragmentos pequeños de ADN (< que 1kb), lo que hace que las bandas se difundan y pierdan nitidez. No olvide que la electroforesis es en sentido negativo a positivo, por lo que el origen de siembra del gel debe estar cerca al electrodo negativo La electroforesis debe hacerse hasta que la banda de interés haya migrado un 40-60% de la mitad de la longitud del gel. Las bandas del ADN pierden resolución en el tercio inferior del gel debido a que se difunden y dispersan. 6.3 Visualización de las bandas de ADN •

El ADN teñido con bromuro de etidio, es detectado con radiación ultravioleta; a una longitud de onda de 245 nm la luz UV es absorbida directamente por el ADN y transmitida al colorante; a 302 y 306 nm la luz UV es absorbida directamente por el colorante. En ambos casos la energía es re-emitida a una longitud de onda de 590nm, en la región rojo naranja del espectro visible. • Para visualizar las bandas de ADN separadas en el gel, páselo directamente al transiluminador con luz UV. Cuando el gel no tiene incluido el EtBr, es decir cuando no se incluyó durante el proceso de gelificación, se debe teñir durante aproximadamente 20 min. En una solución de 0.5 µg /ml de EtBr en agua desionizada.

¡CUIDADO! LA LUZ UV PRODUCE QUEMADURAS EN LA RETINA Y EN LA PIEL. Evite la exposición directa de los ojos y la piel a la luz UV, ya que se puede producir una quemadura de primer grado. (Se ha asociado con cáncer de piel) •

Los resultados se pueden registrar, tomando una fotografía al gel, con una cámara instantánea, o mediante un sistema computarizado de análisis de imágenes. Calcule el peso molecular mediante el cálculo de una regresión de log 10 de un marcador conocido versus la distancia de migración de cada uno de los fragmentos o mediante comparación con cada una de las bandas del patrón λHindIII.

7. POST-LABORATORIO 1. ¿En qué caso se utiliza la poliacrilamida para separación de ácidos nucleicos? 2. ¿Qué factores afectan la velocidad de migración del ADN en geles de agarosa? 3. ¿Por qué se utiliza Ultravioleta para visualizar el ADN? 4. Entre un ADN lineal, enrollado (con un corte), súper enrollado, ¿cuál migra más rápido y por qué? 5. ¿Cómo funciona el bromuro de etidio en la visualización de ácidos nucleicos? Explique en un diagrama el fundamento exacto de este. Como se cuantifican ácidos nucleicos con bromuro de etidio? 6. ¿Cuáles son los efectos biológicos adversos puede tener el bromuro de etidio? 7. ¿Para qué se usa la electroforesis en campo pulsado y en qué se diferencia de la convencional que usted aprendió en esta práctica?

8. BIBLIOGRAFIA.

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- Almonacid, C Pinilla G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación. 2008 Sambrook, J., Fritschh, and Maniatis, T. Molecular cloning a Laboratory. 2da Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2da edition John Wiley & Sons, 1988 David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J..F. Bassic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. Hames, BD.& Rickwood, D. Gel electroforesis of protein, a practicla approach. IRL. Perss. Oxford. Washington D.C. 1983 Hames, BD.& Rickwood, D. Gel electroforesis of nucleid acids, a practice a approach. IRL. Perss. Oxford. Washington D.C. 1984

9. AUTOEVALUACION NUMERO DE LA PRACTICA

LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD