BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 10: VECTORES DE CLONACIÓN

1. INTRODUCCIÓN Los vectores de clonación en general son capaces de albergar trozos extras de ADN, por lo que se abre la posibilidad de poner una secuencia de ADN determinada. En estas circunstancias el vector, en nuestro caso un plásmido, puede generar resistencia a un determinado antibiótico, haciendo que las células a las cuales se introduzca (transformantes) también sean resistentes a dicho antibiótico. Esta característica es utilizada para seleccionar bacterias que contengan plásmidos frente a otras que no los contengan. Así el plásmido está funcionando como un “vector”: es capaz de llevar el trozo de ADN (que se denomina inserto) manteniéndolo mediante la replicación, ya que posee un origen de replicación.

2. OBJETIVOS • • •

Identificar la función y ventajas del proceso de clonación de ADN a través de vectores. Conocer y diferenciar claramente los diferentes tipos de vectores de clonación y sus usos específicos según el objetivo experimental. Adquirir la habilidad para realizar el proceso de clonación y transformación celular con vectores de clonación.

3. MARCO TEÓRICO El ADN es el material genético que define las propiedades de cualquier ser vivo, y en la medida en que lo alteremos podremos modificar sus características. Teniendo en cuenta esto se han dado grandes avances en la modificación del ADN, ya que se cuenta con amplio número de enzimas de restricción capaces de formar fragmentos de ADN de cualquier organismo y después podemos volver a ligarlo a nuestra voluntad con otras enzimas. A esta metodología se le llama Ingeniería Genética, la cual puede definirse como la manipulación deliberada de genes dentro de especies o entre ellas para realizar un análisis genético o el mejoramiento de cepas. Dentro de esta ciencia encontramos la tecnología de ADN recombinante, la cual incluye un rearreglo in vitro del material genético gracias a la manipulación enzimática, estos rearreglos producen una molécula compuesta

de mínimo dos piezas diferentes de ADN. Estos rearreglos serían insignificantes si no se introducen en un receptor biológico donde se mantengan y multiplique indefinidamente. Para poder realizar este tipo de experimentos se requiere de: 1. ADN de interés o blanco. Fragmento de ADN que queremos analizar y que va a insertarse en el vehículo de clonación. Éste debe ser cortado con la misma endonucleasa de restricción con la que se corta el vector de clonación. 2. Un vehículo de clonación. Son fundamentales ya que el ADN por sí solo no puede replicarse, por tanto se requiere de un segmento de ADN capaz de esta función para lograr la replicación del ADN deseado. Los principales vehículos de clonación son bacteriófagos, virus y plásmidos. Los plásmidos son círculos pequeños de ADN bicatenario, capaces de replicarse en bacterias independientemente del cromosoma bacteriano. Para diseñar un vector debe contarse con los siguientes criterios: . • Deben estar caracterizados con respecto a la localización de los genes, secuencia nucleotídica y sitios de restricción. • Debe propagarse fácilmente en el receptor deseado, con el fin de obtener grandes cantidades de moléculas recombinantes. • Debe contar con un marcador de selección, por ejemplo un gen, que permita distinguir entre las células transformadas de las que no lo han sido. • Debe contar con un marcador genético adicional que pueda inactivarse con la inserción del segmento de ADN, lo cual ayudará igualmente a distinguir las células transformadas y las que no lo son. • El vector debe tener el mayor número posible de sitios de restricción, localizados en uno u otro de los marcadores genéticos; esto con el fin de dar mayor flexibilidad a la clonación de tipos distintos de fragmentos de ADN. 3. Enzima de restricción. Son utilizadas para obtener el fragmento que deseamos clonar mediante el corte en sitios específicos del ADN; igualmente se utilizan para cortar el vehículo de clonación en este caso el plásmido. Muchas de las enzimas de restricción producen cortes en las dos hélices, cuatro pares de bases. Así los fragmentos resultantes del ADN tendrán extremos de hélice sencilla que son complementarios, razón por la cual los extremos del plásmido y del fragmento de ADN pueden solaparse, dando como resultado una molécula recombinante. Son conocidas como tal la EcoR1, Hind III, Sma I, entre otras. 4. Enzima ligasa del ADN. Las moléculas recombinantes solo quedan unidas covalentemente cuando son incubadas en presencia de la enzima DNA ligasa. 5. Una célula huésped, ya sea eucarióticas o procarióticas. Es la célula donde va a introducirse la molécula recombinante para su replicación.

el metabolismo de la lactosa. El gen lacY codifica la B-galactósido permeasa, una proteína de unión a la membrana que se encarga de transportar los Bgalactósidos al interior de la célula. El gen lacA codifica la B-galactósido transacetilasa, la cual transfiere un grupo acetilo del Acetil-CoA a los Bgalactósidos. Los vectores que contienen el gen lacZ son capaces de sintetizar la enzima Bgalactosidasa a pesar de que puede suceder una variación en un pequeño número de aminoácidos del fragmento amino-terminal de la enzima. Las células hospederas para estos vectores por lo general son aquellas que codifican la porción carboxilo-terminal de la B-galactosidasa. A pesar de que ni el fragmento sintetizado por la célula huésped ni el sintetizado por el plásmidos son activos por sí solos, éstos tienen la capacidad de asociarse para formar una proteína enzimáticamente activa, y a esto es lo que se le conoce como acomplementación. Cuando el vector contiene un fragmento de DNA en el sitio de policlonación del gen lacZ, se produce una forma amino-terminal de la B-galactosidasa incapaz de realizar la a-complementación. Para reconocer aquellas células que llevan el plásmido recombinante se induce la síntesis del fragmento amino-terminal de la B-galactosidasa mediante la adición al medio de isopropiltio-B-D-galactósido (IPTG) y se enfrentan las células al sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-Dgalactósido). Si se lleva a cabo la a-complementación las células bacterianas crecerán como colonias azules; si no son capaces de realizar dicha complementación debido a la presencia de ADN foráneo, crecerán como colonias blancas.

PRODUCCIÓN DE INSULINA POR INGENIERÍA GENÉTICA Uno de los ejemplos más claros de la utilidad de la ingeniería genética es la producción de hormonas de interés para el hombre, como lo es la Insulina para los pacientes con diabetes mellitus que son incapaces de producir insulina para la asimilación de la glucosa. Dado que se conoce la secuencia nucleotídica de las cadenas A y B que conforman la insulina, se pudieron diseñar dos fragmentos de DNA sintético que codifican los 21 aminoácidos de la cadena A y los 30 de la cadena B. Estos genes son fácilmente clonables en el vector pBR322, que tiene sitios específicos de corte para las enzimas EcoR1 y BamH1 formando así extremos cohesivos y complementarios a los genes sintéticos. Al insertar las secuencias sintéticas en el plásmido se inactiva el gen de resistencia a la tetraciclina, de esta manera las células transformantes presentan un fenotipo tetraciclina-sensible, y ampicilina-resistente. Debido a que el plásmido híbrido no contiene un promotor adecuado para ser reconocido por la ARN polimerasa para poder transcribirse a ARN mensajero, y

posteriormente ser traducido en proteína, es necesario colocar un fragmento de ADN que contenga un promotor de E. coli antes de la secuencia nucleotídica de los genes sintéticos. Muchas veces cuando las proteínas que desean obtenerse son muy pequeñas son fácilmente degradadas por la E. coli y por tanto no se expresan a pesar de que poseen el plásmido híbrido. Para evitar esto, puede obtenerse una proteína más estable utilizando lo que se conoce como fusión de genes. Este método se realiza uniendo las cadenas A y B de la Insulina con una proteína que la bacteria no reconozca como extraña y por tanto no sea degradada; una de las proteínas más estudiadas es la que produce el operón lacZYA, que se encarga de codificar para la B-galactosidasa, una permeasa un transacetilasa de la lactosa. La enzima EcoR1 reconoce dos sitios en el operón de la lactosa, el primero entre el gen i que es un represor y la región P que es el promotor, y el segundo sitio se encuentra a 3009 pb después del codón de iniciación de la B-galactosidasa. Al obtener este fragmento podemos clonarlo fácilmente en los plásmidos derivados de pBR322 que contienen cada uno la secuencia que codifica para una de las cadenas de la insulina; al realizar la clonación de este fragmento de ADN la orientación que este debe tener es aquella en que el promotor del operón se encuentre en el extremo distal con respecto al ADN de las cadenas de insulina, esto se realiza mediante la caracterización de los plásmidos con las enzimas de restricción. Estas moléculas resultarán en un gen híbrido el cual tienen información para codificar casi toda la B-galactosidasa y para codificar las cadenas de la insulina, ya sea A o B. Al traducir la información del gen se obtendrá una proteína que constará de casi toda la B-galactosidasa y una de las cadenas de la insulina unida a la porción carboxilo-terminal de la B-galactosidasa en dos aminoácidos y hay un residuo de metionina entre las dos secuencias. La proteína híbrida no tiene actividad enzimática sobre la lactosa y es insoluble en agua, contrario a la Bgalactosidasa nativa que es soluble en agua. Para obtener la cadena de la insulina debe extraerse la proteína híbrida de la célula hospedadora y tratarla con bromuro de cianógeno, el cual, corta las proteínas en los residuos de metionina, y como ninguna de las cadenas de la insulina contienen metioninas, éstas no serán cribadas, obteniendo de este modo la cadena completamente libre. Al obtener cada una de las cadenas, se deben purificar y unir entre sí a través de puentes disulfuro, mediante la oxidación regulada de sus derivados sulfonados. Existe la posibilidad de que las cadenas se unan entre sí inespecíficamente, por ello deben seleccionarse solo aquellas moléculas que presenten la estructura tridimensional adecuada, ya que sólo éstas son biológicamente activas.

4. PRELABORATORIO 1. Mencione y explique las características de todos los vectores de clonación utilizados en Biología Molecular. 2. ¿Qué es una célula competente y qué métodos se conocen para obtener células competentes o células transformadas? 3. Realice un diagrama explicando el funcionamiento del reactivo X-gal en el proceso de selección de colonias recombinantes 4. Cuáles son las diferencias entre plásmido, cósmido, fago, YAC, BAC y un vector de expresión. En qué casos es más útil e indicado el uso de cada uno de ellos. 5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS • • • • • • • •

Vector de clonación pGEM Kit de clonación del vector (enzimas ligación, buffer, vector) Células para transformar cepa JM101 (E. coli) 1 vial 3 ml de cultivo liquido Médio LB agar com ampicilina(50ug/ml) Tubos eppendorf de 1,5 ml estériles Baño serológico a 37º C Micropipetas Cubeta de hielo

6. PROCEDIMIENTO 1. • • • • 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9.

Colocar en tubo eppendorf de 1.5 ml: 5 µl de plásmido pGEM 5 µl de buffer de ligación 10 µl de DNA a ligar (producto de PCR) 5 µl de enzima ligasa Incubar esta reacción durante 30 minutos a 37º C en baño serológico. Tomar 100 µl de cepa JM101 de E. coli y colocar en un tubo eppendorf de 1.5 ml. Colocar el tubo a 72º C durante 10 minutos. Adicionar 25µl de la reacción de ligación obtenida con anterioridad. Colocar inmediatamente el tubo en hielo durante 10 minutos. Plaquetear 50 µl de la reacción anterior sobre las placas de medio LB al cual previamente se le ha adicionado 20 µl de ampicilina (50ug/ml), 20 µl de X-gal (40mg/ml). Incubar toda la noche las placas a 37º C. Evidenciar la presencia o no de colonias recombinantes según la coloración obtenida en ellas.

7. POST-LABORATORIO 1. Explique el fundamento de la clonación, empleando vectores comerciales como el pGeM de la casa comercial PROMEGA o de INVITROGENE 2. ¿Cómo se clonan productos de PCR? 3. Un vector de clonación, el cual tiene dentro de su secuencia regiones que le confieren resistencia a la ampicilina y tetraciclina, es cortado con la enzima EcoRI, la cual corta dentro del gen de resistencia a ampicilina. En este vector cortado se introduce en el ADN extraño digerido con EcoRI. Según el procedimiento anterior responda las siguientes preguntas justificando sus respuestas: a. ¿Qué antibiótico debe añadirse al medio de cultivo cuando el vector se introduzca en las bacterias transformadas, para seleccionar las que han incorporado el plásmido de las que no lo han hecho? b. ¿Qué patrón de resistencia deberá seleccionarse para obtener los plásmidos que contengan los insertos de interés clonados? c. ¿Cómo explicaría la presencia de colonias resistentes a ambos antibióticos?

8. BIBLIOGRAFÍA • • • • •

Revista Nature Protocolos Años 2009-2013 Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2nd edition. Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Ochoa, Severo et al. 1986 Bioquímica y Biología Celular: Salvat. Barcelona. David, L.G., Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basics methods in molecular biology. Eislever Science publishing Co. Ind. NY. 1996. Catálogos de PROMEGA casa comercial PROMEGA.

9. AUTOEVALUACION NUMERO DE LA PRACTICA

LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO

FORTALEZAS

DEBILIDADES

SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD

ANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No.10 CONSTRUCCIÓN DE BIBLIOTECAS GENOMICAS Una Biblioteca genómica es una colección de clones de vectores que llevan fragmentos de ADN, diseñada de modo que, mediante un sistema de selección, pueden llegar a separarse los clones de interés. Una Biblioteca de ADN podría ser una colección de fagos que contienen una muestra representativa de fragmentos de un genoma (biblioteca genómica) o una colección de bacterias que contienen plásmidos en los que se ha clonado una muestra significativa de los genes que se transcriben en un determinado tejido. Para obtener una librería debemos tener: • • •

Un sistema eficiente de clonaje de ADN Un sistema de selección de los clones Un sistema para la obtención de una muestra representativa del ADN a estudiar.

Existen diversos tipos de bibliotecas: • • • •

Bibliotecas genómicas: se crean a partir de ADN genómico de una especie que se digiere hasta un tamaño suficientemente pequeño para ser clonado en el vector. La detección se realiza mediante hibridación de sondas. Bibliotecas de cromosomas específicos: se elabora a partir de ADN de determinados cromosomas purificados. La detección se realiza igual a la anterior. Bibliotecas de ADNc: se realizan a partir de ARNm de un tejido particular. La detección se realiza mediante hibridación de sondas. Bibliotecas de expresión: Similar al anterior pero el clonaje se realiza de tal forma que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la proteína codificada por el fragmento de ADN. La selección se realiza detectando la proteína ya sea por anticuerpos, o por su actividad.

BIBLIOTECAS GENÓMICAS Las bibliotecas genómicas requieren de un vector que permita el clonado de fragmentos relativamente grandes de ADN. Por lo general se usan fagos, pero también se emplean BACs. Se aísla ADN genómico de la especie de interés y se realiza una digestión con una enzima de restricción adecuada de manera que genere fragmentos de tamaño adecuado para el vector seleccionado. Muchas veces se utilizan digestiones parciales. Esto además permite que los distintos clones puedan solaparse, permitiendo cubrir la totalidad del genoma.

El ADN digerido se somete a electroforesis, se aíslan los fragmentos del tamaño adecuado, se ligan en el vector y se realiza su amplificación. De esta manera se generan colecciones de colonias de bacterias o de fagos conteniendo un fragmento determinado del genoma. Para seleccionar el que nos interesa, dichas colonias se transfieren a una membrana sobre la que se extrae y desnaturaliza el ADN, que se fija a la misma. Posteriormente la membrana se hibrida con la sonda del gen conocido. Si una secuencia suficientemente similar se encuentra en algún lugar de la membrana se producirá una hibridación que podrá ser detectada mediante autorradiografia, por ejemplo si se trata de sondas marcadas con radioactividad. Se denomina cribado (screening) al proceso de selección de un clon que nos interesa de todos los que forman una librería. Una desventaja de estas Bibliotecas es el gran tamaño de los genomas, por lo que se necesita un amplio número de clones para cubrirlas en su totalidad. Por otra parte, los genes contienen intrones que complican el aislamiento de la región codificante.

BIBLIOTECAS DE ADNc La construcción de una biblioteca de ADNc comienza con la extracción de ARNm de un determinado tejido u órgano. Este ARN se copia a ADN de cadena simple mediante la acción de la Transcriptasa Reversa. El híbrido ADN-ARN es tratado con ARNasaH, que degrada el ARN, y finalmente se realiza la síntesis de la segunda cadena de ADN. Estos fragmentos se introducen en un plásmido (lo más usual) y se transforman bacterias.

BIBLIOTECAS DE EXPRESIÓN Dado que en el caso de los ADNc los fragmentos corresponden a ADNs codificantes, se han diseñado estrategias en las que la selección no se realiza por hibridación sino mediante la producción de proteínas codificadas por el plásmido. En estos casos los vectores se diseñan de tal manera que el ADNc posee una región promotora procariota en 5’ que dirige la síntesis de ARNm que, será traducido a proteína. Así, en principio, las colonias de bacteria producirían la proteína codificada por cada ADNc. La selección puede realizarse mediante anticuerpos. Otra posibilidad es que el cribado se base en algún ensayo biológico. En estos casos se habla de librerías de expresión. BIBLIOTECAS DE SUSTRACCIÓN Cuando no se necesita una biblioteca completa de ADNc sino que contenga ciertos ADNc y no otros. Una biblioteca de sustracción es aquella que contiene ADNc correspondientes a ARNm presentes en un tejido pero no en otro. Por lo tanto, requiere eliminarse los ARNm presentes en ambos tejidos. Se preparan biblioteca de ADNc de ambos tejidos. Se prepara un pool de ADN de cada

biblioteca y la del dador se digiere con un enzima que libere los insertos (EcoRI, por ejemplo) y la sustraída se digiere con AluI o RsaI, generando fragmentos cortos. Se mezclan ambas poniendo la segunda en un exceso de 50 veces. Se calienta y se dejan renaturalizar lentamente. Los fragmentos resultantes se clonan en un plásmido en la diana EcoRI.