CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

DESARROLLO DE TECNOLOGÍAS PARA LA REGENERACIÓN IN VITRO Y TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE MAGUEY (Agave tequilana Weber, var. azul) Tesis que presenta

KARLA KARINA VALENZUELA SÁNCHEZ para obtener el Grado de Doctora en Ciencias en la Especialidad de Biotecnología de Plantas Director de Tesis: Dr. Octavio Paredes López Irapuato, Guanajuato, México Junio 2006

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos en el Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato, bajo la asesoría del Dr. Octavio Paredes López.

DEDICATORIA

A Dios

A mis padres Socorro y Saúl A mis hermanos Nidia y Saúl, A mi novio Toño.

AGRADECIMIENTOS .

Al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Unidad Irapuato del Instituto Politécnico Nacional. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y al Consejo de Ciencia y Tecnología del Estado de Guanajuato por los apoyos recibidos durante la elaboración de este trabajo. Al Dr. Octavio Paredes López por haberme permitido formar parte de su equipo de investigación, por su confianza, apoyo y preciados consejos durante la realización de este doctorado. Al Dr. Andrés Cruz Hernández por formar parte de mi comité de sinodales, por sus provechosas aportaciones a la realización de este trabajo, por su ánimo y constante apoyo. Al Dr. Víctor Olalde Portugal por haber accedido a formar parte de mi comité de sinodales, por su incondicional apoyo para la realización de esta tesis, por sus atinados consejos y por abrirme las puertas de su grupo. A los Drs. Ángel Gabriel Alpuche Solís y Juan T. Frías Hernández por acceder a formar parte de mi comité de sinodales y por los útiles consejos y observaciones en la revisión de este trabajo. A la Dra. Male Valverde por su ayuda en las revisiones de los trabajos, por su ánimo y apoyo. A la M.C. Rosalinda Serrato F. por su paciencia y apoyo imprescindible en la técnica de propagación in vitro. Al Dr. Luís Parra Negrete del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato y al Ing. Manuel Cárdenas del rancho el “El Pachon”, Zapopan, Jal., por proporcionar amablemente las plantas de Agave tequilana. A Raúl Juárez y Teresa García, por su valiosa colaboración en la realización del proyecto y a los estudiantes de verano Fausto Luna, Sue Ureta y Saúl Zañudo, por ese tiempo que fue de gran enseñanza para mi. A la comunidad del CINVESTAV Irapuato por su apoyo y hacer llevadero el tiempo de mi estancia. A mis compañeros del Laboratorio de Biotecnología de Alimentos por su ayuda y por hacer de mi estancia un tiempo agradable y al laboratorio de Bioquímica Ecológica por el tiempo tan grato que conviví con ellos. A mis amigos por tantos momentos inolvidables, gracias por su inigualable amistad y por ser parte importante de mi vida.

CONTENIDO

Página CONTENIDO

i

ÍNDICE DE TABLAS

vi

ÍNDICE DE FIGURAS

viii

ABREVIATURAS

xii

RESUMEN

1

INTRODUCCIÓN

3

REVISIÓN DE LITERATURA

5

A. MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS

5

1. MEJORAMIENTO TRADICIONAL

5

2. MEJORAMIENTO POR INGENIERÍA GENÉTICA

6

a. Cultivo de tejidos vegetales

7

1) Organogénesis

7

2) Embriogénesis somática

9

3) Variación somaclonal

11

b. Transformación genética

12

1) Sistemas biológicos para la transferencia de genes

12

2) Sistemas físicos para la transferencia de genes

13

3) Marcadores de selección y genes reporteros

14

i

Página B. MAGUEY: MODELO DE ESTUDIO

15

7. IMPORTANCIA DEL MAGUEY

16

a. Importancia cultural

16

b. Importancia ecológica

17

c. Importancia económica

18

2. Agave tequilana

18

a. Tequila

19

b. Plagas y enfermedades

21

c. Variabilidad genética

25

8. ANTECEDENTES

DE

MEJORAMIENTO

AGAVES

GENÉTICO

EN

26

OBJETIVOS

28

A. GENERAL

28

B. ESPECÍFICOS

28

MATERIALES Y MÉTODOS

29

A. MATERIALES

29

1. MATERIAL VEGETAL

29

2. VECTORES

29

3. CEPAS BACTERIANAS

29

B. MÉTODOS

34

1. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO IN VITRO

34

2. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA

34

a. Producción de embriones

34

b. Germinación de embriones

34

ii

Página 3. ESTABLECIMIENTO DEL SISTEMA DE REGENERACIÓN MEDIANTE ORGANOGÉNESIS INDIRECTA

36

a. Inducción y mantenimiento del estado de callo

36

b. Producción de brotes

37

c. Enraizamiento y aclimatación

37

4. DETERMINACIÓN SELECTIVOS:

DE

LA

SENSIBILIDAD

KANAMICINA

A

AGENTES

(ANTIBIÓTICO)

Y

FOSFINOTRICINA (HERBICIDA) 5. ENSAYOS

DE

TRANSFORMACIÓN

37 VÍA

Agrobacterium

tumefaciens

42

a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium

42

b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la infección por cepas silvestres de Agrobacterium

42

c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones de transformación

45

1) Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal

45

2) Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con el explante

45

3) Tiempo de cocultivo

45

d. Ensayos de transformación estable 6. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas

46 46 46

b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones de transformación

46

1) Medio osmótico

46 iii

Página 2) Presión

47

3) Distancia

47

4) Concentración de DNA

47

c. Ensayos de transformación estable

47

7. SELECCIÓN DE MATERIAL TRANSFORMADO

47

8. ANÁLISIS HISTOQUÍMICO

48

9. ANÁLISIS MOLECULAR DE MATERIAL TRANSFORMADO

48

a. Extracción de DNA

48

b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

49

c. Análisis tipo Southern blot

50

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

51

A. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO in vitro

51

B. INDUCCIÓN DE EMBRIOGENESIS SÓMATICA

51

1. PRODUCCIÓN DE EMBRIONES

51

2. GERMINACIÓN DE EMBRIONES

51

C. SISTEMA

DE

REGENERACIÓN

VÍA

ORGANOGÉNESIS

INDIRECTA

52

1. INDUCCIÓN Y MANTENIMIENTO DEL ESTADO DE CALLO

52

a. Producción de brotes

59

b. Enraizamiento y aclimatación

64

D. SENSIBILIDAD DE EXPLANTES DE A. tequilana A AGENTES SELECTIVOS

64

1. KANAMICINA (ANTIBIÓTICO)

64

2. FOSFINOTRICINA (HERBICIDA)

67

iv

Página

E. ENSAYOS

DE

TRANSFORMACIÓN

VÍA

Agrobacterium

tumefaciens 1. INCORPORACIÓN

68 DE

PLÁSMIDOS

EN

CEPAS

DE

68

Agrobacterium

2. SUSCEPTIBILIDAD DEL A. tequilana A LA INFECCIÓN DE CEPAS SILVESTRES DE Agrobacterium tumefaciens

73

3. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN

74

F. ENSAYOS DE TRANSFORMACIÓN VÍA BIOBALÍSTICA

82

1. SELECCIÓN DE CONDICIONES DE TRANSFORMACIÓN

82

G. SELECCIÓN DE TRANSFORMANTES

93

H. ANÁLISIS MOLECULARES

97

1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 2. ANÁLISIS TIPO SOUTHERN BLOT

97

CONCLUSIONES

102

PERSPECTIVAS

105

BIBLIOGRAFÍA

106

APÉNDICE

121

v

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Plásmidos

Página utilizados

en

ensayos

de

transformación

vía

Agrobacterium tumefaciens

30

2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante Biobalística

31

3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l)

35

4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes tejidos de Agave tequilana

38

5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave tequilana

39

6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana

41

7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt)

43

8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA)

44

9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes fracciones de meristemo

58

vi

Tabla

Página

10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos de los tratamientos de mantenimiento de callos

65

11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la expresión transitoria del gen gus A

87

12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave tequilana bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de baja presión

88

13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A

89

14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y distancias utilizando el sistema de alta presión

vii

91

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura

Página

1. Esquematización de la anatomía del Agave tequilana

20

2. Producción de tequila en México expresado en millones de litros

22

3. Consumo de miles de toneladas de Agave tequilana en México para la producción de tequila

23

4. Exportación de tequila en México expresado en millones de litros

24

5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación vía Agrobacterium

32

6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación vía biobalística

33

7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes en piñas de plántulas in vitro, utilizados en los experimentos de determinación de tamaño de explante mínimo regenerable

40

8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana a partir de la ropagación de segmentos de la región meristemática de la piña

53

9. Producción de embriones a partir de segmentos de hojas de plántulas in vitro de A. tequilana

54

10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja y piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas

viii

56

Figura

Página

11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de diferentes cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana

57

12. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP

60

13. Crecimiento de callos de A. tequilana, en respuesta a los tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP 14.

Apariencia de callos generados en los tratamientos de mantenimiento de callos

15.

61

62

Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas)

66

16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina

69

17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del herbicida fosfinotricina (ppt), adicionado en el medio (mg/l)

70

18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina (ppt)

71

19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA)

72

20. Amplificación del fragmento del gen nptII presente en los plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens después de la transformación

ix

75

Figura

Página

21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de natural Agrobacterium tumefaciens

76

22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos de daño

79

23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tiempos de exposición con el cultivo bacteriano

80

24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de cocultivo de A. tumefaciens con callos de A. tequilana 25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco (sistema control)

81

86

26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana bombardeados con el sistema de baja presión

90

27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana bombardeados con el sistema de alta presión

92

28. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema baja presión)

95

29. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema de alta presión)

96

30. Amplificación del gen npt II en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección

99

31. Amplificación del gen gus A en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección

100

x

Figura

Página

32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos desarrollados en medio de selección

xi

101

ABREVIATURAS

°C

Grado centígrado

µg

Microgramo

µl

Microlitro

µM

Micromolar

2,4-D

Ácido 2,4-diclorofenoxiacético

ANOVA

Análisis de varianza

BA

Benciladenina

BAP

Bencilaminopurina

C.R.T.

Consejo regulador del tequila

CAM

Metabolismo ácido de crasuláceas

cat

Cloranfenicol acetiltransferasa

CFB

Capacidad de fromación de brotes

cm

Centímetro

cm2

Centímetro cuadrado

CTV

Cultivo de tejidos vegetales

cv

Coeficiente de variación

dms

Diferencias mínimas significativas

DNA

Ácido desoxirribonucleico

DO

Densidad óptica

FD

Factor de dilución

gfp

Proteína verde fluorescente

gus A

β-glucuronidasa

xii

hph

Higromicina fosfotransferasa

hr

Horas

IAA

Ácido 3-Indolacético

IBA

Ácido 3-Indolbutírico

kb

Kilobase

KIN

Cinetina

lux

Luciferasa

l

Litro

M

Molar

mg

Miligramo

min

Minuto

mm

Milímetro

mM

Milimolar

MS

Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962)

MS1

Medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) modificado

NAA

Ácido naftalenacético

nm

Nanómetros

nos

Nopalino sintasa

nptII

Neomicina fosfotransferasa

pb

Pares de bases

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

pH

Potencial de hidrogeno

ppt

Fosfinotricina

psi

Libra por pulgada cuadrada

RAPDs

Amplificación al azar de DNA polimórfico

xiii

T-DNA

DNA de transferencia

TMCA

Tasa de media de crecimiento anual

v

Volumen

X-Gluc

Ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico

xiv

I. RESUMEN Agave tequilana Weber cv. Azul es la especie de agave más cultivada porque es la fuente de carbohidratos y componentes químicos minoritarios para la producción de la bebida alcohólica llamada “tequila”, distintivo de la cultura mexicana. Debido a la forma de cultivar durante años el agave, mediante hijuelos y sin permitir floración, su diversidad genética es muy limitada, lo que ha generado clones más vulnerables a nuevos y más agresivos patógenos, esto tiene como consecuencia la incidencia de enfermedades en grandes áreas geográficas. Tomando en cuenta este problema, en este trabajo se desarrolló un sistema de regeneración vía organogénesis indirecta en Agave tequilana. Segmentos de hoja y tejido meristemático de la cabeza central, también llamada piña, fueron evaluados como fuente de explante. Un tamaño mínimo de explante regenerable con alta capacidad de formación de brotes (19.5 CFB), fue obtenido a partir de un corte transversal en piñas de plántulas in vitro en medio MS1, sin embargo en este medio la brotación se da a la par de la formación de callos sin poder utilizarlos para experimentos de transformación por lo que para el cultivo de callos, la mejor respuesta se encontró utilizando ácido naftalenacético (NAA) como fuente de auxina dando 4.7 de CFB, la cual fue contrastante comparada con el uso de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D). La capacidad de regeneración de los callos fue mantenida por al menos tres meses. Los brotes regenerados fueron enraizados en medio MS1 libre de hormonas y aclimatados en invernadero con un 100% de sobrevivencia. También fueron evaluadas condiciones de transformación genética mediante los sistemas de Agrobacterium tumefaciens y biobalística. Para A. tumefaciens fueron determinadas como condiciones óptimas de transformación: daño con aguja de 13 mm, cultivo bacteriano líquido, 10 min de exposición del tejido con el cultivo bacteriano y 4 días de cocultivo. Para biobalística fueron seleccionadas para la transformación con el sistema de baja presión, 4 h de exposición al medio osmótico, 80 psi de presión y 20 cm de distancia y para alta presión se observó mejor respuesta a 1350 psi y 12 cm de distancia. El material de A. tequilana transformado por biobalística con el plásmido pBI426, fue regenerado en selección y se comprobó su transformación estable

1

mediante análisis tipo PCR y Southern blot con una eficiencia de transformación de 0.6 para el sistema de baja presión y 1.66 para alta presión.

2

II. INTRODUCCIÓN Es indiscutible el papel tan importante que las diferentes especies vegetales han jugado desde siempre en el sustento del género humano, lo que ha llevado al hombre a una constante búsqueda para el mejoramiento de los cultivos por medio de la transferencia de material genético, usando métodos tradicionales y de ingeniería genética. Debido a que el mejoramiento tradicional es un proceso lento y laborioso, la ingeniería genética ha cobrado mayor interés porque ha provisto de alternativas para el mejoramiento de

cultivos a través de la

manipulación de genes propios o exógenos (transformación genética) (Jauhar, 2001). La capacidad de introducir y expresar diversos genes en plantas fue descrita por primera vez en tabaco en 1984, y se ha venido extendiendo en mas de 120 especies en al menos 35 familias, que hasta el 2004 representaba 81

millones

de

hectáreas

concentradas

principalmente

en

América

correspondientes a un 90% del área global (Birch, 1997; Eizaguirre y col., 2006). Los sistemas de transformación más utilizados son: el bombardeo de micropartículas, también llamado biobalística y el mediado por la bacteria Agrobacterium tumefaciens (Finer y col., 1999; Valentine, 2003). El maguey azul (Agave tequilana Weber var. azul) es uno de los agaves más cultivados en México, ya que es el único entre cientos de especies dentro del género que se considera apropiado y autorizado para producir la bebida alcohólica llamada “tequila”.

Esto se debe a sus altas concentraciones de

inulina y a su bajo contenido en fibras, además de otros componentes químicos que contribuyen a darle un peculiar aroma y sabor a esta bebida. Actualmente la industria tequilera presenta diversos problemas, los cuales deben ser tratados de manera inmediata ya que la tendencia en el consumo de tequila continúa a la alza. Entre algunos de los problemas agronómicos del agave se encuentran los siguientes: mejoramiento genético de difícil aplicación, problemas fitosanitarios y diversidad genética limitada (Gil-Vega, 1997). En la bibliografía son escasos los trabajos de mejoramiento genético reportados para el género Agave. Utilizando técnicas de mejoramiento tradicional las cuales son difíciles de aplicar en este tipo de plantas, solo se reporta la obtención del híbrido diploide 11648, producto de una cruza entre A.

3

angustifolia X A. amaniensis y una retrocruza con A. amaniensis. (Robert y col., 1992). En lo que respecta al cultivo de tejidos, se han reportado diferentes trabajos en varias especies del género como Agave victoria-reginae, A. sisalana, A. fourcroydes, A. parrasana y A. cantala (Robert y col., 1987; Binh y col., 1990; Rodríguez-Garay y col., 1996; Nikam, 1997; Santacruz-Ruvalcaba y col., 1999; Hazra y col., 2002; Martínez-Palacios y col., 2003; Nikam y col., 2003), todos ellos enfocados principalmente a la propagación masiva con fines industriales y de conservación, de igual manera Robert y col. (1992) reportan un sistema de regeneración en nuestra especie de interés Agave tequilana. A pesar de existir sistemas de propagación reportados en diferentes especies de agave incluyendo la especie A. tequilana, ninguno de estos fue desarrollado para ser usado en programas de mejoramiento genético, ya sea de forma directa, induciendo variación genética mediante la manipulación del cultivo in vitro o indirecta, como fuente de explante en sistemas de transformación genética. En este sentido solo se reporta la tesis realizada por Santacruz Ruvalcaba en el 2001, donde establece un sistema de transformación mediante biobalística en callos embriogénicos de Agave tequilana. Tomando en cuenta que el cultivo de agave azul presenta grandes problemas, que la industria tequilera demanda alternativas para hacerles frente y que el uso de herramientas de ingeniería genética son una buena opción para el mejoramiento vegetal además de la falta de trabajos realizados con esta finalidad, se planteó el establecer protocolos de transformación genética basándonos en los sistemas de biobalística y/o Agrobacterium tumefaciens, además de desarrollar un sistema de regeneración in vitro vía organogénesis indirecta con cultivo de callos, que sirvió como fuente de explante para el establecimiento de dichos protocolos. Este trabajo sentará las bases para el desarrollo de programas de mejoramiento genético en A. tequilana, además de servir como punto de partida para trabajos similares en otras especies importantes de agave.

4

III. REVISIÓN DE LITERATURA A. Mejoramiento genético de plantas A través de los siglos el hombre ha explotado diferentes especies vegetales con el objetivo de satisfacer varias de sus necesidades básicas (alimentación, vestido, etc.), lo que lo ha llevado a tratar de mejorar los cultivos con el fin de conferirles características que permitan cubrir dichas necesidades. El mejoramiento comúnmente se lograba de forma tradicional, como ejemplo podemos mencionar el caso de la explotación del vigor híbrido en la producción de granos de maíz, de sorgo y de mijo durante el periodo de 1965-1990 en el que la producción tuvo un incremento extraordinario. Actualmente, con la aparición de nuevas herramientas de ingeniería genética, las técnicas del mejoramiento de plantas

se han hecho más sofisticadas facilitando la

introducción de genes foráneos a los cultivos en menor tiempo (Jauhar, 2001). En los últimos 15 años, el desarrollo de nuevas técnicas biotecnológicas de transferencia directa de genes ha añadido nuevas dimensiones a los programas de mejoramiento de plantas, como casos sobresalientes podemos hablar del desarrollo de cultivos con insecticidas en maíz, soya y algodón (resistentes a plagas), papayas resistentes a virus, plantas tolerantes a herbicidas, así como el desarrollo del “golden rice” (arroz que produce vitamina A y hierro), además es importante mencionar que las nuevas tendencias involucran introducción de genes en cloroplastos para incrementar la cantidad de proteína recombinante y evitar el flujo génico. (Tennant y col., 1994; Ye y col., 2000; Jauhar, 2001; Lutz y col., 2001). 1. Mejoramiento tradicional El mejoramiento tradicional de plantas ha sido usado empíricamente durante siglos por el hombre sin conocer las bases genéticas. Dicho mejoramiento consiste en un conjunto de técnicas de selección y cruza de individuos con rasgos deseables para obtener cultivos con mejores características agrícolas. El tiempo necesario para transferir una característica deseable a un cultivo depende de la especie (ciclo de vida), del origen del gen y de la distancia evolutiva entre el cultivo que se desea mejorar (filogenia), por lo que se hace un proceso laborioso y lento. Transferir un gen de interés por métodos

5

tradicionales entre plantas emparentadas podría tomar de 5 a 10 años (hablando de cultivos de ciclo corto), si hablamos de plantas lejanas filogenéticamente podría tardar entre 10 y 15 años o más (si es que es posible), además los probables problemas de fertilidad antes y después de la hibridación son obstáculos considerables (Jauhar, 2001). El mejoramiento tradicional implica combinaciones de información genética a nivel cromosómico, ya sea que se transfiera una parte de algún cromosoma específico, parte del material cromosómico o el grupo de cromosomas completo,

resultando

en

un

enfermedades por ejemplo).

cultivo

superior

(resistente

a

plagas

o

De cualquier modo, la transferencia de

información genética por métodos tradicionales es una transferencia “masiva” por medio de la cual se incorporan genes que no son de interés e incluso genes que resultan indeseables revelando así que es un proceso “vagamente” dirigido (controlado).

2. Mejoramiento por ingeniería genética El desarrollo de técnicas de ingeniería genética permite llevar a cabo procesos de inserción de un gen o genes bien caracterizados dentro de células regenerables

(animal,

vegetal

o

bacteriana)

y

subsecuentemente

la

recuperación de individuos fértiles con dichos genes integrados en el genoma. En el caso específico del mejoramiento de plantas, estas tecnologías pueden conferir nuevas características (resistencia a agentes tóxicos, tolerancia a factores ambientales, resistencia a plagas y enfermedades, etc.), así como ayudar a resolver preguntas de la regulación de la expresión genética (LópezMeyer y col., 1996). Según Birch (1997), los requerimientos esenciales de un sistema de transferencia de genes para poder producir plantas transgénicas son: •

Disponibilidad de un tejido blanco que incluya células competentes para la regeneración de plantas.

•

Un método para introducir DNA en células regenerables.

•

Un procedimiento de selección y regeneración de plantas transformadas con una frecuencia satisfactoria.

6

Para cumplir exitosamente con los requerimientos anteriormente descritos se han

desarrollado

diferentes

herramientas

de

cultivo

de

tejidos,

de

transformación y obviamente de selección, descritas de forma resumida en los siguientes puntos. a. Cultivo de tejidos vegetales El cultivo de tejidos vegetales (CTV), se basa principalmente en que desde cualquiera de las partes que componen una planta (células, tejidos u órganos), mediante una manipulación bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas se puede llegar a la formación de un individuo completo (Núñez-Palenius y Ochoa Alejo, 1999). Este fenómeno de regeneración somática en las plantas reside en la totipotencia que poseen las células que las conforman, es decir, que cualquier célula posee la información genética necesaria para formar un nuevo individuo. Para llegar a establecer un cultivo de tejidos se deben tomar en cuenta los siguientes puntos: el tipo de explante, el medio de cultivo y las condiciones del cultivo propiamente (asepsia, temperatura, fotoperíodo, luz y humedad). Se le llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido vegetal que se usa para la regeneración de la planta.

El medio de cultivo debe

componerse principalmente por elementos minerales (macro y micronutrientes), compuestos orgánicos como vitaminas, fitorreguladores y fuentes de carbono (Sutter, 1996). Los medios de cultivo de uso más común son el MS (Murashige y Skoog, 1962), el LS (Linsmaier y Skoog, 1965) y el B5 (Gamborg y col., 1968); también existen medios de uso específico según el objetivo del cultivo y la vía de regeneración elegida que son modificaciones de los arriba mencionados. Existen dos procesos (vías) de regeneración in vitro: Organogénesis y Embriogénesis somática.

1). Organogénesis La organogénesis se define como el desarrollo de órganos de novo a partir de tejidos meristemáticos o no meristemáticos cultivados in vitro. Esta vía de regeneración consiste en la formación de órganos a partir de primordios producto de una desdiferenciación celular. Las células que fungen como progenitores son estimuladas para que se lleve a cabo de forma acelerada una

7

serie de divisiones celulares que tienen como consecuencia la formación de un meristemoide (Schwarz y Beaty, 1996; Núñez-Palenius y Ochoa-Alejo, 1999). Los meristemoides son caracterizados como agregados de células con características similares a las células meristemáticas y que en un principio cuentan con la plasticidad necesaria para diferenciarse en primordios (brote, raíz) (Schwarz y Beaty, 1996). Se considera que en la propagación in vitro vía organogénesis se presentan dos eventos, el primero consiste en el crecimiento y desarrollo de brotes a partir de los meristemos regenerados, seguido del segundo evento que es la formación de novo de un meristemo radicular. La organogénesis puede ser indirecta o directa, la diferencia entre estos dos eventos radica en la presencia o ausencia respectivamente de un estado de callo (tejido no diferenciado) durante el desarrollo de las diferentes etapas que conforman esta vía de regeneración. La organogénesis indirecta involucra una etapa intermedia de formación de tejido calloso durante el desarrollo de todos los eventos involucrados: Explante

Callo

Meristemoide

La formación de órganos de novo

Órgano (primordio)

vía organogénesis indirecta puede

incrementar la posibilidad de introducir variación en la constitución cromosomal de las células en el estado de callo y de aquí también la posibilidad de variaciones fisiológicas o morfogénicas en los órganos producidos, este tipo de variación ha sido llamada variación somaclonal (Schwarz y Beaty, 1996). La organogénesis directa tiene lugar en el explante original, evitando el paso de callo y llevando a cabo la siguiente secuencia: Explante

Meristemoide

Órgano (primordio)

Debido a que en esta vía no se lleva a cabo la formación de un tejido calloso, las células del explante tienen la capacidad de actuar como precursores directos del nuevo primordio. Tanto en la organogénesis indirecta como en la directa se han definido 4 etapas producidas por la fase de desdiferenciación, éstas son: la competencia, la inducción, la determinación, y finalmente después 8

de determinado el tejido, ocurre la diferenciación hasta la formación del nuevo órgano (Schwarz y Beaty, 1996). La organogénesis es altamente influenciada por fitohormonas, considerándose de manera general que una relación alta de auxinas:citocininas induce este proceso. 2). Embriogénesis somática Desde la primera descripción de embriogénesis somática por Steward (1958) y Reinert (1959), este sistema de regeneración ha sido ampliamente usada como herramienta en el estudio del desarrollo de plantas (Zimmerman, 1993), para la propagación clonal y el desarrollo de tecnologías para el mejoramiento de plantas a través de la genética celular somática y de la transformación genética. Se le llama embriogénesis somática a la capacidad que tienen ciertas células para formar embriones bajo condiciones específicas de cultivo in vitro, y mediante un proceso similar a la embriogénesis cigótica. Esta vía de regeneración es una de las pruebas más notables de la totipotencia celular (Pérez y col., 1999). La embriogénesis somática puede ser dividida en las siguientes etapas: 1. Inducción. Es el proceso de conversión de una célula somática a una célula proembriongénica.

Se considera

que los factores determinantes para que

suceda este proceso son: genotipo, grado de diferenciación de las células del explante, fitohormonas (auxinas) y el aislamiento celular. 2. Histodiferenciación. En esta etapa las masas de células proembriogénicas se diferencian

formando

embriones

somáticos

mediante

una

división

y

diferenciación celular simultáneas. Durante esta etapa los embriones somáticos pasan una serie de estadios intermedios muy similares a los que ocurren en la embriogénesis cigótica. corazón y

En las dicotiledóneas estos estadios son: globular,

torpedo, mientras que en las monocotiledóneas son: globular,

coleoptilar y escutelar.

9

3. Maduración. Es la fase de maduración de un embrión somático para que adquiera la capacidad de germinar, ocurre básicamente una elongación celular sin división. 4. Germinación. Es el proceso de elongación y reactivación metabólica de un embrión somático maduro para convertirse en una plántula. Debido a la naturaleza independiente de los embriones somáticos, esta vía de regeneración in vitro tiene algunas ventajas: •

Se pueden producir grandes cantidades de embriones somáticos.

•

Escalar el sistema de producción en un cultivo en suspensión es relativamente fácil

•

La manipulación de los embriones producidos puede hacerse de forma independiente, pues representan una autonomía con respecto al tejido madre.

•

Es posible inducir la latencia en los embriones somáticos maduros.

•

Pueden ser encapsulados para ser utilizados como semillas sintéticas.

La embriogénesis somática se puede llevar a cabo de dos formas, cuando los embriones somáticos se desarrollan a partir de células individuales dentro de un explante (embriogénesis directa) y cuando la diferenciación de los embriones es precedida por la proliferación de un tejido calloso (embriogénesis indirecta) (Witjaksono, 1997). Para que se lleve a cabo el proceso de embriogénesis directa las células necesitan

solamente

un

determinadas y necesitan

medio

básico,

se

encuentran

previamente

sólo condiciones permisivas para expresar su

capacidad morfogénica, estas células se conocen como predeterminadas. Aunque este proceso no requiere reguladores de crecimiento, la embriogénesis se puede estimular por auxinas que actúan sobre algún tipo de células que están presentes en el explante al tiempo de la selección del tejido; se ha sugerido que estas células están reprimidas in vivo y cuando son extraídas de la planta se liberan de esta inhibición, expresando su potencial morfogénico (Cruz-Hernández, 1998). Durante el primer paso de la embriogénesis somática

10

indirecta es indispensable obtener un tejido calloso o bien una suspensión celular embriogénica a partir de la cual se obtendrá la diferenciación de los embriones somáticos en el segundo paso. Para que se lleve a cabo la inducción se requiere de medios más complejos y es dependiente de la presencia de reguladores de crecimiento en el medio, se sabe que la embriogénesis somática indirecta es inducida normalmente por auxinas (CruzHernández, 1998; Pérez y col., 1999). Los embriones somáticos tienen la capacidad de formar embriones secundarios, a este fenómeno se le llama embriogénesis repetitiva. Para que el proceso

de repetición ocurra es necesario que se suprima el desarrollo

independiente, esto ocurre en presencia de auxinas, originando que los embriones no crezcan o maduren, las células continúan dividiéndose y pueden aumentar de tamaño o dividirse en embriones adicionales (Cruz-Hernández, 1998). Algunos de los factores que pueden influir en el establecimiento de la embriogénesis repetitiva son el nitrógeno inorgánico (amonio y bajas concentraciones de nitrato) y el nitrógeno orgánico (glutamina, prolina). Un sistema de regeneración eficiente y confiable es indudablemente una herramienta imprescindible para llegar a desarrollar sistemas de transformación genética exitosos. 3). Variación somaclonal La investigación en el cultivo de tejidos vegetales y su subsecuente regeneración de plantas y progenie ha revelado la presencia de variaciones genéticas inducidas por el cultivo in vitro (Phillips, y col., 1994). La variación somaclonal es una manifestación de la influencia epigenética o cambios en el genoma de células vegetativas en diferenciación, inducida por las condiciones del cultivo de tejidos (Larkin y col., 1981; Muller y col., 1990). Este tipo de variaciones se presentan como anormalidades citológicas, mutaciones fenotípicas, que pueden ser cualitativas y cuantitativas, y cambios en la secuencia, activación y silenciamiento génico. La variación somaclonal depende principalmente de la fuente del explante, la edad del cultivo, el uso de agentes mutagénicos y de la presión de selección aplicada a los cultivos (Skirvin y col., 1994). Cualquier cambio inducido por las condiciones del cultivo 11

in vitro se espera que generen plantas estables que lleven características de interés heredables, sin embargo, aunque estos cambios al azar no son deseables en los experimentos de transformación genética, en algunas ocasiones pueden producir plantas con ventajas agronómicas (Soniya y col., 2001). b. Transformación genética Para llevar a cabo la introducción de genes foráneos a células mediante manipulación directa se han establecido diferentes sistemas que se han agrupado en dos modalidades, sistemas biológicos y sistemas físicos.

1). Sistemas biológicos para la transferencia de genes Los sistemas biológicos de transformación son los que utilizan algún organismo o material biológico como vector, tales como virus o bacterias. En este tipo de sistemas podemos encontrar los que utilizan virus vegetales y dos basados en bacterias (Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes) (LópezMeyer y col., 1996). El método biológico de transformación más usado es el de Agrobacterium tumefaciens, bacteria Gram negativa presente en suelos, de metabolismo aerobio, fitopatógena causante de la enfermedad llamada “agalla de la corona” que afecta a muchas especies de dicotiledóneas. Esta enfermedad se caracteriza por la formación de tumores en el tejido vegetal atacado; específicamente, el agente responsable de la formación de estos tumores es un megaplásmido presente en la bacteria llamado Ti (140-335 kb). Durante la infección, una pequeña porción del DNA del plásmido Ti (15-30 kb) llamada TDNA, es transferido al núcleo de la célula vegetal donde se inserta por recombinación ilegítima en el DNA nuclear, de esta manera el T-DNA se mantiene estable en el genoma de las células transformadas, y es transferido a la progenie en forma Mendeliana (Hooykaas, 1995; López-Meyer y col., 1996). El T-DNA lleva genes que codifican para varias enzimas involucradas en la síntesis de reguladores de crecimiento como auxinas y citocininas, así como en la síntesis de otros compuestos llamados opinas. Los reguladores de crecimiento generados por la introducción de dichos genes son los causantes

12

del crecimiento desmedido observado en los tumores; mientras que las opinas participan como fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo de la bacteria dentro de la planta (Hooykaas, 1995; López-Meyer y col., 1996). Los genes responsables de la transferencia del T-DNA se encuentran dentro del plásmido Ti y son llamados genes de virulencia (genes vir). Para que Agrobacterium lleve a cabo la infección requiere que el tejido vegetal se encuentre herido ya que los genes vir son inducidos por compuestos fenólicos que se desprenden de las células dañadas. Las únicas regiones del T-DNA que son absolutamente necesarias para la transferencia e integración dentro del genoma de la planta, son

pequeñas secuencias repetidas de 25 pb localizadas en los bordes

(López-Meyer y col., 1996). Dentro de la región conocida como vir o de virulencia se encuentran codificados los genes virA, virB, virC, virD, virE, virG y virH, cada uno de estos genes cumple diferentes funciones involucradas en el proceso de transferencia del T-DNA, por ejemplo virA y virG se encargan de regular de forma positiva la expresión de los otros genes vir, por otro lado virC y virD participan en el procesamiento y síntesis de la copia del T-DNA, mientras que virB y virE están involucrados en la formación de los elementos necesarios para facilitar el movimiento del T-DNA, por último virH posiblemente ayude a la supervivencia de la bacteria en presencia de los compuestos bactericidas y bacteriostáticos. 2). Sistemas físicos para la transferencia se genes Los sistemas de transformación basados en métodos físicos son aquellos que realizan la transferencia de material genético por medio de agentes físicos como presión y electricidad. Dentro de estos métodos podemos encontrar la transformación de protoplastos, la microinyección y el más usado es el basado en el bombardeo de micropartículas (biobalística). El bombardeo de micropartículas o biobalística es un método rápido para liberar DNA dentro de las células de la planta, tanto para ensayos de expresión transitoria como para estudios de transformación estable. El principal beneficio es que tejido vegetal intacto puede servir como blanco, además de que no está limitado por el rango de hospederos, en contraste con otros métodos como transformación de protoplastos y el uso de A. tumefaciens (Finer y col., 1992).

13

La técnica de biobalística se considera como un sistema versátil que ha tenido aplicación en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y ha estimulado el desarrollo de la ingeniería genética. El proceso puede ser definido como la introducción de material genético (DNA purificado) dentro de células y tejidos a través del disparo de microproyectiles a altas velocidades. Este poderoso método de transformación está sujeto a un número de factores limitantes, las consideraciones técnicas incluyen el tipo de pistola (alta o baja presión), el tipo de partícula (oro o tungsteno) y las condiciones experimentales (distancia y presión), además algunos tejidos pueden ser resistentes a la penetración de las partículas debido a una cutícula fuerte, paredes celulares lignificadas o superficies irregulares (Hunold y col., 1994). Después de que las partículas cubiertas de DNA son introducidas existen numerosos factores que influyen en la expresión génica y subsecuentemente la recuperación de plantas transgénicas, estos factores están lógicamente relacionados con la capacidad del tejido para servir como blanco en un proceso de introducción de DNA, resultando en la expresión y eventual integración del DNA foráneo. Para llevar a cabo una transformación exitosa vía bombardeo de partículas, el plásmido (DNA) debe ser cuidadosamente diseñado y seleccionado, además se debe poner especial atención

en la naturaleza,

estado y receptividad de los tejidos blancos (Finer y col., 1999). 3). Marcadores de selección y genes reporteros El DNA plasmídico que se introduce en la célula por eventos de transformación contiene la información necesaria que le permita crecer y seleccionarse en el hospedero (bacteria), genes marcadores y el gen(es) de interés. Los genes marcadores pueden ser de selección y/o reporteros. Un gen está propiamente compuesto por el promotor, región codificante y terminador. Los intrones y las regiones de unión son regiones de DNA adicionales que se usan para potenciar, modular o estabilizar la expresión génica (Finer y col., 1999). Se han diseñado varios marcadores de selección con genes que confieren resistencia a antibióticos o a herbicidas, de tal forma que el uso del agente de selección mata o retarda el desarrollo de las células de los tejidos no transformados. Entre los marcadores destacan aquellos que confieren

14

resistencia a kanamicina (nptII), a cloranfenicol (cat),

a fosfinotricina (bar),

higromicina (hph), por mencionar algunos (Schrott, 1995). Elegir el marcador de selección apropiado es un punto crítico para la recuperación exitosa de tejidos transformados. El marcador de selección simplemente permite que las células transformadas proliferen en presencia de un agente selectivo, mientras que las no transformadas no logran crecer o multiplicarse; la resistencia de estos genes actúa inactivando al agente selectivo o produciendo un tejido insensible al mismo (Finer y col., 1999). Por otro lado, es conveniente contar en nuestra construcción utilizada para transformación, genes reporteros los cuales producen enzimas con actividad detectable y cuantificable en las células transformadas y entre los más usados podemos mencionar: gus A (β-glucuronidasa), nos (nopalina sintetasa), lux (luciferasa) y gfp (proteína verde fluorescente), estos genes reporteros nos permiten determinar si nuestro gen de interés se expresa en un tejido en particular (Jefferson, 1987; Londsdale y col., 1996; Haseloff y col., 1997; CruzHernández, 1998). El gen gus A es ampliamente usado para monitorear no solo la expresión transitoria de un gen, si no también la transformación estable; sin embargo para visualizar la actividad de la enzima, el tejido debe ser sacrificado, sin dejar de mencionar que algunos tejidos pueden presentar actividad tipo GUS de manera constitutiva (Hansch, y col., 1995). El uso de los genes lux y gfp como genes reporteros no requiere la destrucción del tejido para ser visualizada su actividad, sin embargo su empleo se ve limitado por requerir equipos especiales para su visualización y por traslaparse sus ondas de excitación y emisión con la de otros componentes presentes en el tejido (Londsdale y col., 1996; Haseloff y col., 1997). A. Maguey: modelo de estudio Maguey es el nombre usado en México para llamar a algunas de las diferentes especies pertenecientes al género Agave. La gran mayoría de estas plantas son de suma importancia en el ámbito cultural, económico y ecológico en nuestro país.

Uno de los agaves más cultivados en México es el Agave

tequilana Weber var. Azul, es la única de 136 especies dentro del género que se considera apropiada y autorizada para la producción de la bebida alcohólica llamada “tequila” debido a su bajo contenido de fibras y altas concentraciones 15

de inulinas. Por otro lado es la única especia permitida por el Consejo Regulador del Tequila a usarse en la zona de la denominación de origen con fines de producción de Tequila. El género Agave, término griego que quiere decir “admirable”, fue descrito por Carlos Linneo en 1753, pertenece a la familia Agavaceae del orden de las Liliales, clase Monocotiledoneae y división Angiospermae. En la actualidad se le reconocen aproximadamente 136 especies, 26 subespecies, 29 variedades y 7 formas (Gentry, 1982).

Las plantas de este género se adaptan a

condiciones de sequía y sobreviven a la falta de agua y a las temperaturas altas porque son suculentas, tienen estomas hundidos, cutícula gruesa y un ciclo fotosintético CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas), así como por producir raíces superficiales y ramificadas cuando hay lluvias ligeras (Nobel, 1988; Bye, 1994).

1. Importancia del maguey a. Importancia cultural Tomando en cuenta que el agave no es privativo de nuestro país y pese a que la voz “Maguey” la trajeron los colonizadores de las Antillas, esta planta como en ningún otro lugar de la tierra se ha integrado íntimamente al paisaje, como al sentir y vivir de la gente en México (Muriá, 1994). En nuestra región y en diferentes culturas se reconoció al maguey con diferentes nombres: Metl en Náhuatl, Tocamba en Purépecha y Guabla en Otomí. Hablar de agaves es hablar de México y su historia, es remontarse a un pasado prehispánico en el que, gracias a la simbiosis hombre-agave, subsistieron las culturas del altiplano de México en periodos de escasez de agua y alimento (Valenzuela, 1994). El agave se ha aprovechado como papel, vallas, las hojas o pencas como tejas en techumbres, tallos o quiotes como vigas, las fibras de las hojas en hilaturas para tejidos, puntas de las pencas como clavos, punzones y agujas, zumo para licor del cual se hace vino, vinagre, miel, azúcar, algunos de los cuales se les atribuyen propiedades medicinales, además de que fueron usadas en rituales y sacrificios como fermentos bebidos sólo por una élite de sacerdotes y nobles. El uso de los agaves alcanzó su mayor intensidad durante el florecimiento de la cultura Azteca, la cual se conoce por algunos investigadores como la cultura

16

del maguey (Goncalves de Lima, 1956; Gentry, 1982). La importancia de estas plantas los llevó a deidificarlas bajo la representación de la diosa Mayahuel en los códices mexicanos (Goncalves de Lima, 1956). Los habitantes de aquella época consideraban que el maguey era una planta de nutrimento principal. Los agaves se diversificaron por el territorio mexicano gracias a la migración de las etnias, adaptándose a los diferentes ambientes (Gentry, 1982). Con la conquista, la amplia gama de usos se redujo y los fermentos fueron destilados para obtener bebidas alcohólicas llamadas aguardientes vinos de “mezcal” o “mezcales” (Valenzuela, 1994). Desde la colonia hasta el periodo independiente, sobrevivieron por mucho tiempo la obtención de fibras a gran escala con el henequén y el auge de las haciendas pulqueras en el centro de México. En tiempos modernos, las fibras naturales han perdido relevancia al sustituirse con las sintéticas y el mercado del henequén (Agave fourcroydes) se ha reducido, mientras que el desarrollo pulquero no ha crecido y hasta la fecha el uso se encuentra bien delimitado para los estados del centro del país (Valenzuela, 1994). Actualmente la especie más cultivada en México es el Agave tequilana (Weber) var. Azul, la cual se utiliza para la elaboración de uno de los llamados “vinos de mezcal” (Tequila), cuyo desarrollo agroindustrial floreció en los siglos XVII y XVIII continuando hasta nuestros días, tomando cada vez más prestigio internacional lo que lo ha llevado a convertirse en distintivo de nuestro país. b. Importancia ecológica México es uno de los países con mayor diversidad biológica y uno de los principales centros de origen y centros endémicos de muchos grupos de flora y fauna. Se estima que existen 30,000 especies de plantas con flores en México, pertenecientes a 2,410 géneros, con un endemismo de 10% para géneros y 52% para las especies. Entre las familias botánicas que tienen su centro de origen y diversidad en nuestro país se encuentran las agaváceas (FrancoMartínez, 1995). En general, las especies de agave son utilizadas para evitar la pérdida de suelo (en terrazas de cultivo o en zonas de recuperación) por efecto del agua, poseen un sistema radical superficial ampliamente desarrollado que retiene las partículas de suelo. Estas plantas, gracias a las características fisiológicas y 17

anatómicas que las hacen resistentes a condiciones climáticas extremas, pueden usarse contra la desertificación. c. Importancia económica Dentro de la amplia gama de usos que a lo largo de los años se le han atribuido al maguey, sin lugar a duda el ser materia prima en la producción industrial de fibras y de bebidas alcohólicas son los de mayor importancia desde un punto de vista económico. En la producción de fibras, la cual se lleva a cabo a partir de las hojas, las especies más utilizadas son A. fourcroydes (henequén), A. sisalana (sisal) y A. lechuguilla (ixtle) (Robert y col., 1992). A pesar de que esta industria tuvo un fuerte mercado de exportación, este ha ido disminuyendo ya que las fibras naturales han perdido relevancia al sustituirse con las sintéticas (Valenzuela, 1994). Haciendo referencia a la industria de bebidas alcohólicas, varias especies de agave son cultivadas para materia prima, las más importantes son A. atrovirens Karw, A. tequilana Weber, A. potatorum Zucc., A. Salmiana y A. cochlearis Jacobi. La principal característica que se toma en cuenta es la composición de carbohidratos, además de que notablemente poseen altas concentraciones de fructosa y polifructósidos (Madrigal-Lugo y col., 1989). Los diferentes tipos de bebidas que se producen son principalmente aguamiel, pulque, tequila, mezcal y bacanora, el tequila es la que mayor relevancia económica ha cobrado. Otros aspectos del aprovechamiento de los agaves que actualmente están cobrando importancia son, la obtención de saponinas, utilizadas para la elaboración de esteroides y el uso de los carbohidratos (fructanos tipo inulina) por su potencial nutracéutico (Ohtsuki y col., 2004; López y col., 2003). 2. Agave tequilana El Agave tequilana (Figura 1) se distingue por sus hojas largas color azulverdoso, tallos delgados y panículas pesadas-difusas, con flores relativamente largas y con tépalos largos en proporción a su relativo tubo corto (Gentry, 1982). El ciclo de vida de esta planta es de 8 a 10 años de plantación a cosecha y es poliploide con un número básico de cromosomas x = 30.

18

La reproducción del

Agave tequilana se da por tres formas: por semillas

(sexual), por hijuelos del rizoma (asexual) y bulbillos que provienen de la inflorescencia o quiote (asexual).

La vía sexual o sea por semillas, no es

utilizada y pocas veces se observa ya que se suprime la floración en el cultivo para impedir que ésta consuma los carbohidratos de reservas. Además, las semillas del Agave tequilana tienen un bajo porcentaje de germinación, el crecimiento es lento y las plántulas resultantes son muy heterogéneas para el cultivo. Los hijuelos a partir de rizomas son la forma más común de reproducción utilizada en el establecimiento de las plantaciones, ha sido la única forma que se ha practicado por mucho tiempo (200 años o más). La ventaja de este tipo de propagación es la rapidez con la que se obtienen plántulas de buen tamaño y la cantidad de éstas producidas por planta. Por último, la otra vía asexual de reproducción es la de bulbillos, que son hijuelos pequeños que emergen en el quiote junto a las flores no fecundadas que caen posteriormente sin formar frutos, esta vía es poco utilizada ya que el tiempo y costo de producción es mayor (Valenzuela, 1994). a. Tequila El tequila es una bebida alcohólica obtenida a partir de los azúcares del agave tequilero Agave tequilana Weber, variedad azul y de otros azúcares en una proporción del 51 y 49 por ciento, respectivamente. Esta bebida solamente es producida en un territorio protegido por la denominación de origen que comprende todo el estado de Jalisco y algunos municipios de los estados de Guanajuato, Michoacán, Nayarit y Tamaulipas (Valenzuela, 1994). La industria tequilera, considerada la más antigua en la zona occidental del país, promovió lo que sería el primer producto mexicano en ser oficial y legalmente reconocido por su nombre de origen.

La producción tequilera ha conservado una

tendencia en ascenso en el mercado nacional y de exportación, aunque ha presentado altibajos a partir de la década de los ochenta. Del tequila exportado, el 88% va a los Estados Unidos, el 9% se distribuye en países europeos y Canadá y el 3% en el resto del mundo. Según el Consejo Regulador de Tequila de México (2006), la agroindustria mexicana del tequila durante el periodo que comprendió de enero a diciembre de 2005 produjo 71.3

19

Quiote o inflorescencia

Hojas o pencas

A Piña o cabeza central

Hijuelos

B

Rizoma

Figura 1. Esquematización de la anatomía del Agave tequilana. A) Agave tequilana Weber var. Azul; B) Principales partes de una planta de agave.

20

millones de litros de tequila, para lo cual fueron necesarias 250, 000 ton de agave como materia prima, de la cantidad total de tequila producido el 54% fue exportado (C.R.T., 2006) (Figuras 2, 3 y 4). Dentro de las exportaciones mexicanas de la industria de bebidas alcohólicas, el tequila sobresale por su tasa media de crecimiento anual (TMCA) que está por encima de la cerveza, la cual es un producto altamente demandado en el mercado internacional (Monroy-Sánchez, 1999). En las gráficas de producción y exportación de tequila, así como en la de consumo de agaves (Figuras 2, 3 y 4), son notorios los ciclos fluctuantes de la industria tequilera, esto se debe a que se presentan temporadas de escasez y sobreoferta de la materia prima (Agave tequilana) como consecuencia de la mala planeación de los cultivos, así como de problemas de plagas y enfermedades, potenciados por la escasa variabilidad genética presente en el cultivo. Como ejemplo de lo anterior, en la Figura 3 se observa el incremento de los volúmenes de producción de agave en los últimos años debido a la popularidad que alcanzó este cultivo después de los graves problemas de pérdida por enfermedades que se presentaron entre los años de 1995 y 2000. Debido a la moda en el cultivo de Agave tequilana, actualmente se tiene una sobreoferta de agave y se estipula que esto será al menos por los próximos tres años, prediciéndose niveles cercanos a 1.8 millones de toneladas (Dalton, 2005). b. Plagas y enfermedades Uno de los principales problemas agronómicos que afectan al cultivo de A. tequilana y que ha tenido como consecuencias pérdidas millonarias para la industria tequilera es la incidencia de enfermedades, principalmente las causadas por bacterias (Jiménez-Hidalgo y col., 2004). Dentro de los microorganismos que han producido algunas enfermedades difíciles de combatir en el cultivo se encuentran bacterias como Erwinia sp. y Erwinia carotovora y hongos como Fusarium oxysporum, Phythophtora sp., Alternaria sp., Verticillium sp. y Geotrichum sp. (Monroy-Sánchez, 1999). Jiménez-Hidalgo y col., en el 2004 reportaron por primera vez la asociación de la bacteria Erwinia cacticida con los síntomas de la enfermedad de la pudrición

21

80

71.3

70 60 50 40 30

64.6

59.9 50.3 40.8 37.5 31.6 33.3 28

49.7 31.2

18.5

20

51.5

49.1 39.5

37.7

46.9

41.9 44.3

36.7 29

22.2

12.8

10 3.6

56.4

13.1

7.5

9.6

10.2

12.9

47.9

23.4 12.1

0

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

Tequila 100% de agave

Tequila

Total

Figura 2. Producción de tequila en México expresado en millones de litros (Consejo Regulador del Tequila, 2006).

22

300 250 200 150 100 50 0

1995

1996

1997

1998

2000

2001

2002

2003

2004

2005

TEQ. 100%

18.6

40.7

70.1

106.8 149.4

95

56.7

54.5

65.1

65

117.4

TEQUILA

62.5

84.3

91.1

104.7 144.1 100.2

86.6

66.6

100

123.3

TOTAL

81.1

125

161.2 186.1 254.1 239.1 156.9 141.1 131.7

165

240.7

79.3

1999

Figura 3. Consumo de miles de toneladas de Agave tequilana en México para la producción de tequila (Consejo Regulador del Tequila, 2006).

23

50 32.5 27.8 26.1

24

21.2

33 26.4

27.2

34.3

37.9 40

26.4

30 20 10

1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Tequila 100% 0.3

0.5

0.8

1.6

1.8

2.5

2

2.4

3.8

Tequila

20.9 23.5

27

24.5 25.4

30

24.4

24

29.2 29.6 31.1

Total

21.2

27.8 26.1 27.2 32.5 26.4 26.4

24

33

4.7

0

6.8

34.3 37.9

Figura 4. Exportación de tequila en México expresado en millones de litros (Consejo Regulador del Tequila, 2006).

24

blanda de la raíz en Agave tequilana. Entre las principales plagas que afectan al cultivo de podemos

mencionar

Agave

tequilana

al picudo del agave (Scyphophorus acupunctatos),

algodoncillo o piojo harinoso (Planococcus harinoso), y algunas epecies de nemátodos, por mencionar algunos (Rodríguez y col., 2004). En la actualidad las enfermedades en el cultivo de A. tequilana representan grandes pérdidas económicas para México. Esta problemática en la obtención de la materia prima para la producción de tequila, aunada a la mala planeación en el establecimiento de los cultivos, ha creado una crisis en la industria tequilera ya que en la actualidad la demanda de la bebida se ha incrementado en el ámbito nacional como internacional.

c. Variabilidad genética Otro importante problema agronómico que el cultivo del agave azul presenta es que la mayoría de los agaves cultivados son clonas estériles, algunas veces poliploides que raramente producen semillas viables (Robert y col., 1992). A pesar de que la reproducción sexual se da escasamente, en las plantaciones es evitada por los mismos agricultores, ya que cortan las inflorescencias tan pronto empiezan a desarrollarse para impedir que hagan uso de los azúcares almacenados (Robert y col., 1992). Esta situación ha traído como consecuencia la pérdida de variabilidad genética en el cultivo, haciéndolo más susceptible a la proliferación de enfermedades. Debido al largo periodo de desarrollo que la planta presenta, la supresión de la floración en los cultivos y la poca viabilidad de las semillas, hace que las estrategias de mejoramiento genético convencional sean de difícil aplicación (Robert, y col., 1992). Gil-Vega y col. (2001) reportaron que de 40 selecciones de A. tequilana analizadas mediante RAPDs, 39 fueron isogénicas, concluyeron que este bajo nivel de polimorfismo se propone como resultado de la promoción de un genotipo

conservado

durante

muchos

años

bajo

una

propagación

exclusivamente vegetativa. Este problema de erosión genética también está presente en otras especies importantes de agave que han sido manipuladas para su industrialización, como el Agave fourcroydes utilizado en la producción

25

de fibras. En un estudio similar al anterior no se observó variación genética entre tres variedades de esa especie mediante un análisis de isoenzimas (Colunga-GarciaMarín y col., 1999). La industrialización de diferentes especies de agave ha tenido como consecuencia la pérdida de variabilidad genética y de germoplasma (Granich, 2003).

2. Antecedentes de mejoramiento genético en agaves El único reporte que se tiene de mejoramiento genético tradicional en agave es la obtención del híbrido diploide 11648 en Tanzania producto de una cruza entre A. angustifolia X A. amaniensis y una retrocruza con A. amaniensis. El híbrido es un alto productor de fibras en términos de hoja, contenido y calidad de la fibra, desafortunadamente su extremada susceptibilidad a especies de Phytophtora ha evitado su cultivo exitoso (Robert y col., 1992). Existen algunos trabajos de cultivo de tejidos en maguey y en otras agaváceas que se han realizado con el objetivo de propagar masivamente esta planta, tanto para fines de producción industrial (Agave tequilana), como para conservación (Agave victoria-reginae). En lo que respecta a especies de agave de uso ornamental en peligro de extinción, Rodríguez-Garay y colaboradores en 1996 lograron obtener plantas de Agave victoria-reginae a través

de

embriogénesis somática directa de segmentos de hojas en medio MS suplementado con 2,4-D (Rodríguez-Garay y col., 1996). En otro trabajo en esta misma especie se reporta la regeneración vía embriogénesis somática y organogénesis a partir de segmentos de tallo utilizando un medio MS modificado suplementado con los reguladores 2,4-D y BA (Martínez-Palacios y col., 2003) . En Agave parrasana Santacruz-Ruvalcaba y col. (1999) reportaron haber obtenido de manera eficiente plantas propagadas a partir de la proliferación de brotes axilares usando MS con BA. Dentro de las principales especies utilizadas como materia prima para la producción de fibras que son Agave fourcroydes, Agave cantala y Agave sisalana, existen reportes de regeneración vía organogénesis a partir de tejidos de rizoma, hojas, tallos y estolones, utilizando como reguladores de crecimiento NAA, IBA, KIN, BA, IAA y 2,4-D en diferentes combinaciones y concentraciones para cada uno de los

26

casos (Robert y col., 1987; Binh y col., 1990; Nikam, 1997; Hazra y col., 2002). Para la especie Agave sisalana Perr. ex. Engelm Nikam y col., (2003) reportan la regeneración de plantas vía embriogénesis somática a partir de segmentos de tallo de bulbillos tratados con KIN, 2,4-D y BAP. Por último en Agave tequilana Robert y col. (1992) reportaron la propagación vía organogénesis a partir de tallo y hojas en MS modificado (fuentes de nitrógeno) utilizando BAP como regulador de crecimiento. En lo que respecta a trabajos de transformación genética publicados del género Agave, Smith y Hood (1995) sólo reportan la formación de tumores producidos por la inserción del plásmido Ti de A. tumefaciens en Agave salmiana Otto. Santacruz Ruvalcaba (2001) transformó callos embriogénicos de A. tequilana mediante biobalística con el sistema PDS-1000 He® (Pistola de alta presión); bombardeó a 800 psi, con un pretratamiento con manitol 0.2 M + sorbitol 0.2 M y sacarosa al 12% y logró observar la expresión del gen gus A de manera mas constante cuando usó el plásmido pBarGus respecto a otros plásmidos. Con el análisis molecular tipo Southern reportó la integración y expresión del gen bar en siete clonas.

27

IV. OBJETIVOS

A. General

Evaluar diferentes tecnologías para la regeneración in vitro y transformación genética de maguey (Agave tequilana Weber var. Azul).

B. Específicos

Desarrollar un sistema de cultivo de tejidos in vitro para regenerar Agave tequilana. Evaluar condiciones de transformación genética para Agave tequilana mediante biobalística y/o vía Agrobacterium tumefaciens. Obtener y analizar molecularmente materiales transgénicos de Agave tequilana.

28

V. MATERIALES Y MÉTODOS A. Materiales 1. Material vegetal Se utilizaron plantas de Agave tequilana Weber var. Azul de un año de edad, donadas por el Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Guanajuato y por el Rancho “El Pachon”, Zapopan, Jalisco, México.

2. Vectores Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens y mediante bombardeo de partículas (biobalística) se utilizaron diferentes

vectores

cuyas

características

se

encuentran

descritas

y

esquematizadas en la Tabla 1 y 2 y en la Figuras 5 y 6. 3. Cepas bacterianas Las cepas bacterianas que se utilizaron en este estudio fueron las siguientes: •

Cepas de Escherichia coli TOP 10’F que contenían los plásmidos p35SGUS, pBIN m-gfp5-ER, pBI426, pAHC25 y pCATGFP.

•

La cepa ayudadora HB101 también de E. coli, para la cruza triparental.

•

Cepas

LBA4404

de

Agrobacterium

tumefaciens

(competentes

y

conteniendo el plásmido pBI121). La cepa LBA4404 es derivada de la cepa silvestre Ach5, que porta el plásmido pLA4404 (tipo octopina), que es derivado del pTiAch5 (Hooykaas y Schilperoort, 1992). Este plásmido no tiene la región del T-DNA pero contiene la región vir que actúa en trans y es huésped de plásmidos binarios. •

Las cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens, C58, H63 y A281.

29

Tabla 1. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens.

Plásmido

Descripción

Vector binario derivado del BIN19

que contiene las

secuencias repetidas del plásmido pTiT7 para la pBI121

transferencia del T-DNA a células vegetales, el gen

(Bevan, 1984)

nptII de resistencia a kanamicina, así como el gen gus A que codifica para la β-glucuronidasa (GUS), bajo el control del promotor constitutivo 35S del mosaico del virus de la coliflor (CaMV35S).

Derivado del BIN19 que contiene los genes nptII que p35S GUS

confiere resistencia a kanamicina y gus A (GUS)

(Vancanneyt y col., interrumpido por un intron, bajo el control del promotor 1990)

35S.

Vector binario derivado del pB121, el gen reportero pBIN m-gfp5-ER

GUS se encuentra remplazado por el gen m-gfp-ER

(Haseloff y col.,

que codifica para la proteína verde fluorescente.

1997)

30

Tabla 2. Plásmidos utilizados en ensayos de transformación mediante Biobalística.

Plásmido

Descripción Plásmido basado en pUC9 que contiene la información

pBI426

que codifica para la proteína fusionada de GUS-NPTII

(Dalta y col.,

bajo el control de un promotor doble 35S del virus del

1991)

mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador de la nopalino sintetasa (NOS).

pAHC25

Plásmido derivado de pUC8 que contiene el gen de

(Christensen y

selección bar que confiere resistencia a fosfinotricina y

Quail, 1996)

el gen reportero gus A (GUS), bajo el control del promotor constitutivo Ubi-1.

Plásmido derivado de pUC9 que contiene el gen pCATgfp

reportero GFP que codifica para la enzima verde

(Heim y col.,

fluorescente, bajo el control del promotor constitutivo

1995)

35S.

31

A) pBI121

nptII

gusA

35S

NOS T

HindIII PstI XbaI SmaI SphI BamHI

SnaBI

B) p35SGUS

nptII

EcoRI

SnaBI

)

35S

Intron PIV2 (240 pb) NOS T

HindIII PstI XbaI SmaI SphI BamHI

EcoRI

C) pBIN m-gfp5-ER

nptII

35S

M-gfp5-

HindIII PstI XbaI SphI BamHI

NOS T

EcoRI

Figura 5. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens. En los esquemas se muestran los genes reporteros (gus A y gfp), el de resistencia a kanamicina (nptII), así como los promotores y terminadores.

32

D) pBI426

gusA • nptII

35S • 35 S HindIII

NcoI

NOS T

EcoRI

BamHI XbaI

E) pAHC25

gusA

Ubi 1 PstI

XbaI

bar

SmaI EcoRI BamHI

BamHI

NOS T

EcoRI

PstI

F) pCATgfp

nptII

gfp

35S HindIII NcoI

BamHI

NOS T

EcoRI

XbaI

Figura 6. Representación de los plásmidos utilizados en los ensayos de transformación mediante biobalística. En los esquemas se muestran los genes reporteros (gus A y gfp), los de resistencia a agentes selectivos (bar y nptII), así como los promotores y terminadores.

33

B. Métodos 1. Establecimiento del cultivo in vitro El cultivo in vitro

de Agave tequilana se estableció a partir de hijuelos de

plantas de aproximadamente un año de edad. A estos hijuelos se les eliminaron las hojas hasta llegar a la obtención de la “piña”, la cual fue desinfestada mediante lavados consecutivos con detergente comercial. Posteriormente se lavaron con etanol al 70% y finalmente con hipoclorito de sodio comercial (Clorox) al 2.4%, el proceso se llevó a cabo en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. Una vez desinfestadas las piñas se obtuvieron segmentos de la región meristemática utilizando un sacabocados de 8 mm y se colocaron en medio MS1 (Tabla 3) en presencia de cefotaxima. Las condiciones de incubación fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de oscuridad. 2. Inducción de embriogénesis somática a. Producción de embriones Para llevar a cabo la producción de embriones somáticos de Agave tequilana, se usaron como explantes segmentos de hojas de plántulas regeneradas in vitro, fueron colocados en medio MS-L2 (Tabla 3), suplementado con 2,4-D, basándonos

en la metodología descrita para

Agave victoria-reginae

(Rodríguez-Garay, 1996). Las concentraciones que se evaluaron fueron: 0.07, 0.15, 0.3, 0.46 y 0.62 mg/l de 2,4-D.

b. Germinación de embriones Los embriones producidos fueron transferidos a medio de regeneración (1/2 MS sin reguladores de crecimiento) para la germinación, esto se hizo siguiendo el protocolo descrito para Agave victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996).

34

Tabla 3. Composición de medios de cultivo MS1 y MS-L2 en (mg/l).

Componentes del medio

MS1

MS-L2

NH4NO3

825.0

1650.0

KNO3

950.0

1900.0

MgSO4 . 7 H2O

370.0

370.0

CaCl2 . 2H2O

440.0

332.2

KI

0.83

0.83

KH2PO4

170.0

170.0

m-Inositol

100.0

250.0

Sacarosa

30 000.0

ZnSO4 . 7H2O

8.6

8.6

MnSO4 . H2O

27.68

16.9

CuSO4 . 5H2O

0.025

0.025

CoCl2 . 6H2O

0.025

0.025

H3BO3

6.2

6.2

Na2MoO4 . 2H2O

0.25

0.25

FeSO4 . 7H2O

27.8

27.8

Na2EDTA

37.3

37.3

Tiamina . HCl

20

2.0

Ácido nicotínico

-

0.5

Glicina

-

2.0

Piridoxina

-

0.5

2,4-D

0.025

-

BAP

10

-

30 000.0

35

3. Establecimiento del sistema de regeneración mediante organogénesis indirecta a. Inducción y mantenimiento del estado de callo Para seleccionar la fuente de explante óptima para la producción de callos de Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hoja de plántulas de agave enraizadas in vitro y segmentos obtenidos de la región meristemática de plántulas in vitro y de hijuelos. Estos explantes fueron colocados en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) y medio MS1 suplementados con diferentes concentraciones de BAP o zeatina como fuente de citocinina en combinación con 2,4-D como fuente de auxina (Tabla 4 y 5). Las condiciones de incubación fueron: temperatura de 25º C y un fotoperíodo de 18 horas luz por 6 horas de oscuridad. La respuesta de los explantes se evaluó periódicamente hasta completar un mes de exposición al medio (subcultivos cada 15 días) y se determinó el porcentaje de explantes formadores de callo. Después de haber seleccionado la fuente óptima de tejido, se realizó un experimento para determinar el tamaño mínimo del explante. Este experimento se llevó a cabo con diferentes tipos y número de cortes en el explante (Figura 7). Posteriormente, éstos fueron cultivados en las mismas condiciones mencionadas anteriormente, utilizando como tratamiento el de inducción de callo. Para llevar a cabo el mantenimiento de los callos obtenidos, se evaluaron diferentes tratamientos de 2,4-D o ácido naftalenacético NAA, solos o en combinación con BAP (Tabla 6), de igual manera se evaluaron tratamientos utilizando únicamente BAP como regulador. Los callos fueron colocados en medio MS1 con los diferentes tratamientos e incubados en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Se llevó a cabo la evaluación de la respuesta de los callos a los diferentes tratamientos, considerando friabilidad, oxidación, ausencia de brotación y área de crecimiento. Todos los tratamientos se evaluaron durante 1 mes, realizando subcultivos cada 15 días. Los experimentos se realizaron en un diseño completamente al azar con 3 repeticiones por tratamiento. Cada repetición consistió en una caja petri con 10 explantes por caja. Los datos fueron evaluados con un análisis de varianza (ANOVA) con el paquete de diseños experimentos FAUANL versión 2.5 de la

36

Universidad Autónoma de Nuevo León. Las medias de los tratamientos fueron separadas usando la prueba de diferencia mínima significativa (dms) (α = 0.05).

b. Producción de brotes Los callos obtenidos de los diferentes tratamientos fueron colocados en medio MS1 e incubados en las mismas condiciones para llevar a cabo la formación de brotes. Esta capacidad fue evaluada después de un mes, tomando en cuenta el número de brotes producidos por explante y el número total de explantes que presentaban producción de brotes. Estos datos se utilizaron para calcular el índice de capacidad de formación de brotes (CFB) de acuerdo a lo reportado por Martínez-Pulido y col. (1992): CFB = (Número promedio de brotes por explante) X (% de explantes con brotes)/100 c. Enraizamiento y aclimatación Una vez que los brotes producidos alcanzaron una altura de 2 cm aproximadamente, fueron separados y transferidos a medio MS1 sin reguladores para la elongación y producción de raíces. Las plántulas que presentaban un sistema radical completo fueron lavadas para eliminar el agar, transferidas a macetas que contenían suelo estéril y llevadas a invernadero donde se completo su desarrollo.

4. Determinación de la sensibilidad a agentes selectivos: kanamicina (antibiótico) y fosfinotricina (herbicida) Para establecer un sistema de transformación en necesario contar con un sistema de selección confiable que permita asegurar la recuperación de plantas transgénicas, para esto es necesario determinar la sensibilidad intrínseca de los tejidos a los agentes selectivos que se vayan a usar. Por esta razón, se realizaron experimentos en los cuales se expuso el tejido a diferentes concentraciones del antibiótico kanamicina y del herbicida fosfinotricina (Tabla 7); el antibiótico, esterilizado por filtración

fue adicionado al medio de

regeneración (MS1). Se evaluó la tasa de supervivencia de los explantes de forma semanal durante un mes. Con los resultados obtenidos de estos

37

Tabla 4. Evaluación de la inducción del estado de callo en diferentes tejidos de Agave tequilana.

Tratamiento

Medio

BAP

2,4-D

(mg/l)

(mg/l)

1

MS

-

-

2

MS1

-

-

3

MS

2.5

0.025

4

MS

5

0.025

5

MS

10

0.025

6

MS1

2.5

0.025

7

MS1

5

0.025

8

MS1

10

0.025

38

Tabla 5. Evaluación de zeatina como fuente de citocininas en la inducción del estado de callo en segmentos meristematicos de Agave tequilana.

Tratamiento

Zeatina

2,4-D

(mg/l)

(mg/l)

1

-

-

2

1

0.025

3

2

0.025

4

4

0.025

39

A

B

C

Figura 7. Esquematización de los explantes obtenidos a partir de cortes en piñas de plántulas in vitro. Los explantes se utilizaron en los experimentos de determinación de tamaño de explante mínimo regenerable. A) Meristemo completo; B) Corte transversal de meristemo; C) Corte longitudinal de meristemo.

40

Tabla 6. Evaluación del efecto de las auxinas 2,4-D y NAA en el mantenimiento del estado de callo en Agave tequilana.

Tratamiento

BAP

2,4-D

NAA

mg/l

mg/l

mg/l

1

-

-

-

2

10

0.025

-

3

5

0.125

-

4

5

0.25

-

5

5

0.5

-

6

-

0.125

-

7

-

0.25

-

8

-

0.5

-

9

5

-

0.25

10

5

-

0.5

11

5

-

1

12

-

-

0.25

13

-

-

0.5

14

-

-

1

41

experimentos se estableció la dosis letal mínima para la selección de los tejidos una vez transformados. Se llevó a cabo también un experimento para determinar la dosis para seleccionar plantas de agave transformadas mediante exposición al herbicida comercial. Se expusieron las hojas de los agaves a las siguientes concentraciones del herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA) (Tabla 8) y se evaluó el daño en las hojas semanalmente durante un mes. 5. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens a. Transferencia de plásmidos a cepas de Agrobacterium Para realizar los ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens, primero se llevó a cabo la transferencia del DNA plasmídico a la bacteria (cepa LBA4404), los plásmidos que se utilizaron fueron (P35SGUS y pBIN m-gfp5ER) y la transferencia se hizo por medio de una cruza triparental utilizando a la cepa HB101 como proveedora del plásmido ayudador (Shaw, 1994). Otro método que se utilizó para la transformación de Agrobacterium fue el de tratar las células con NaCl y CaCl2, y permitir posteriormente la transferencia del DNA a la bacteria mediante el choque térmico por la congelación con nitrógeno líquido (Chen y col., 1994). Mediante la selección con antibióticos, se obtuvieron las colonias de A. tumefaciens que recibieron cada uno de los plásmidos; la transferencia a Agrobacterium se verificó mediante PCR con primers dirigidos al gen de resistencia al antibiótico kanamicina (nptII). b. Evaluación de la susceptibilidad del A. tequilana a la infección por cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens Con el fin de evaluar la susceptibilidad del agave a la infección natural de Agrobacterium tumefaciens, la cual produce la enfermedad conocida como agalla de la corona, fueron inyectadas plantas de A. tequilana de aproximadamente 2 años de edad crecidas en invernadero con un cultivo bacteriano concentrado de las cepas silvestres de Agrobacterium C58, H63 y A281 de manera individual. Las inyecciones se realizaron en la región del tallo, cercana a las raíces y posteriormente se evaluó la aparición de tumores en dicha región. 42

Tabla 7. Evaluación de la sensibilidad de explantes de Agave tequilana al antibiótico kanamicina y al herbicida fosfinotricina (ppt).

Tratamiento

Kanamicina

Fosfinotricina

mg/l

mg/l

1

-

-

2

25

-

3

50

-

4

100

-

5

200

-

6

-

1

7

-

2

8

-

3

9

-

4

10

-

5

43

Tabla 8. Evaluación de la sensibilidad de plantas de Agave tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).

Tratamiento

% BASTA (v/v)

1

0

2

4

3

8

4

12

5

16

44

c. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones de transformación Para determinar las condiciones óptimas de transformación de los callos de A. tequilana mediante el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, se evaluaron los siguientes parámetros, utilizando los plásmidos descritos anteriormente:

1). Respuesta al tipo de daño en el tejido vegetal Para permitir la interacción entre Agrobacterium tumefaciens y el tejido vegetal es necesario que se produzcan compuestos atrayentes para la bacteria en el tejido herido, por ello es necesario determinar el tipo de daño que permita una buena recuperación del explante. Con este fin, se dañaron callos de agave utilizando bombardeo de micropartículas de tungsteno y agujas de 13 y 32 mm, posteriormente se evaluó el porcentaje de sobrevivencia de los explantes.

2). Tipo de cultivo bacteriano y tiempo de exposición con el explante Para seleccionar el tipo de cultivo y el tiempo de exposición óptimos para llevar a cabo la transformación genética, se expusieron callos de agave a cultivos concentrados sólido y líquido de la bacteria, y se determinó la sobrevivencia. Después de seleccionar el tipo de cultivo adecuado, se expusieron los callos durante diferentes tiempos (0, 5, 10, 20, 30 min) y de igual manera se evaluó el porcentaje de sobrevivencia de los explantes. 3). Tiempo de cocultivo Habiendo seleccionado los parámetros anteriores, se infectaron callos de agave en esas condiciones y se incubaron a diferentes tiempos en cocultivo (0, 1, 2, 3, 4 y 5 días) para que se llevara a cabo la transferencia del plásmido al tejido vegetal. El tiempo de cocultivo óptimo, se seleccionó evaluando la expresión transitoria del gen reportero de acuerdo al plásmido utilizado (gus A o gfp).

45

d. Ensayos de transformación estable Con los parámetros óptimos determinados se llevó a cabo la transformación mediante Agrobacterium tumefaciens. Posterior al cocultivo, los callos transformados fueron colocados en medio MS1 con cefotaxima 500 mg/l, para eliminar la bacteria y después se expusieron al mismo medio pero con la dosis letal determinada del agente de selección correspondiente. De esta forma se permitió solo la sobrevivencia de material transformado. 6. Ensayos de transformación vía biobalística a. Purificación de plásmidos y preparación de partículas Los plásmidos fueron purificados utilizando el método de Birboim (Birboim y Doly, 1979) de lisis alcalina y su integridad fue verificada mediante digestión con enzimas de restricción, lo que se observó al realizar una electroforesis en un gel de agarosa al 1% y teñirlo en bromuro de etidio. Las partículas de tungsteno (M10) utilizadas fueron esterilizadas con alcohol, sonicadas y enjuagadas con agua estéril (ver Apéndice). Se precipitó el DNA de la suspensión mezclándolas con el DNA (plásmido), CaCl2 (2.5 M) y espermidina (100 mM) (Finer y col., 1992). Una vez preparada la suspensión se utilizaron 4μl del precipitado por bombardeo.

b. Evaluación de la expresión transitoria para la selección de condiciones de transformación Para determinar condiciones óptimas de transformación de callos de A. tequilana mediante bombardeo con alta y baja presión se evaluaron los siguientes parámetros

1). Medio osmótico Para determinar el tiempo de exposición al medio osmótico se colocaron los explantes en medio MS1 adicionado con 15% de sorbitol (agente osmótico) y se expusieron a diferentes tiempos previo al bombardeo (4 y 8 horas), posteriormente se llevó a cabo el bombardeo.

46

2). Presión Se utilizaron los sistemas de bombardeo de alta y baja presión. Utilizando el sistema de baja presión, se evaluaron; 60, 80, 100 y 120 psi de presión y de igual manera utilizando el sistema de alta presión,

fueron evaluados las

presiones de 450, 900 y 1350 psi. 3). Distancia En combinación con las presiones también analizaron distancias de 17.5 a 22.5 cm en intervalos de 2.5 cm, para el sistema de baja presión. Para el sistema de alta presión se analizaron distancias de 9 a 15 cm en intervalos de 3 cm. La distancia corresponde a la longitud entre la posición del filtro que contiene las partículas hasta el soporte donde se colocan los explantes. 4). Concentración de DNA Tomando en cuenta que en los protocolos de transformación se recomienda no utilizar una concentración mayor de 1 μg/μl del plásmido, se evaluó el efecto de la concentración del plásmido en la expresión transitoria. Se bombardearon callos con partículas que fueron precipitadas con el plásmido a dos diferentes concentraciones (0.1 μg/μl y 1 μg/μl). El efecto de todos los parámetros anteriormente mencionados fue cuantificado mediante el número de foci que presentaron, como efecto de actividad de βglucuronidasa. c. Ensayos de transformación estable Después de evaluar los diferentes parámetros de transformación y seleccionar las mejores condiciones, se bombardearon callos con las condiciones seleccionadas utilizando ambos sistemas. Los explantes transformados se incubaron en oscuridad durante 48 horas, para permitir la recuperación del tejido, posteriormente fueron sometidos a selección.

7. Selección de material transformado Todos los explantes provenientes de los ensayos de transformación realizados con ambos métodos (Agrobacterium y biobalística), fueron colocados en medio

47

de regeneración MS1 suplementado con la dosis determinada del agente de selección, de esta manera se llevo a cabo una preselección. Los callos que sobrevivieron fueron transferidos a medio con la dosis determinada para una segunda ronda de selección, asegurándonos de esta manera que solo se regeneraba material transformado. 8. Análisis histoquímico Para analizar la expresión del gen gus A en los ensayos de expresión transitoria y en los tejidos que sobrevivieron a los procesos de selección, se llevaron a cabo ensayos histoquímicos basados en el método de Jefferson (1987). Al tejido transformado se le adicionaron 500 μl de regulador de reacción con el sustrato X-gluc (5-bromo-4-cloro-indolil glucurónido), fosfato de potasio (100 mM pH 7.0), EDTA (10 mM pH 8.0), ferricianuro de potasio (0.5 mM) y ferrocianuro de potasio (0.1 mM) (Ver apéndice). El tejido con el regulador se incubó a 37°C en la oscuridad durante una noche. Transcurrido este tiempo se retiró la solución y los tejidos fueron lavados tres veces con una mezcla de metanol-acetona (3:1) para remover posibles pigmentos que pudieran interferir con la visualización del color. Las células transformadas fueron reconocidas fácilmente, por la producción de un precipitado azul que se registró como número de foci.

9. Análisis molecular de material transformado a. Extracción de DNA La extracción del DNA de los materiales seleccionados de agave se llevó a cabo basándonos en el método reportado por Keb-Llanes y col., 2002, el cual se realizó partiendo de 0.3 gramos de tejido fresco. El tejido fue molido y transferido aun tubo con las siguientes soluciones: solución A (CTAB 2%, TrisHCl 100 mM pH8, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, polivinilpirrolidona 4%, ácido ascórbico 0.1% y β-mercaptoetanol 10 mM), solución B (Tris-HCl 100 mM pH 8, EDTA 50 mM, NaCl 100 mM y β-mercaptoetanol 10 mM) y SDS 20%; esta mezcla se incubo a 65°C por 10 min, posteriormente se agrego acetato de potasio (5M) previamente enfriado; se agitó vigorosamente y se centrifugó

48

(15,300 g, por 15 min, 4°C), recuperándose 1 ml de la fase acuosa a la que se le adicionó ½ volumen de isopropanol frió, se mezclo suavemente y se dejo precipitar en hielo por 20 min. Después se centrifugo (9600 g, por 10 min) y se lavó con etanol al 70% (v/v); posteriormente se resuspendió en TE; después el DNA se precipito incubando en hielo por 20 min con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y ½ de volumen de isopropanol frió, posteriormente se centrifugo (9600g por 10 min); se repitió el procedimiento a partir del lavado con etanol al 70%. Finalmente el DNA resuspendió en TE. La integridad del DNA obtenido se analizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, visualizados con bromuro de etidio; la concentración se calculó por densidad óptica a 260 nm utilizando la siguiente fórmula: [DNA] = DO 260 X 50 X FD / 100 [DNA] : Concentración de DNA DO 260 : Densidad óptica leída a 260 nm de longitud de onda FD : Factor de dilución = Volumen total / Volumen de DNA b. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) El análisis de la amplificación del DNA del material seleccionado para determinar la integración de los genes introducidos se llevó a cabo usando oligonucleótidos específicos para el gen gus A y/o nptII (Jefferson y col., 1987; Beck y col., 1982). Los oligonucleótidos fueron los siguientes:

gus A: 5′ AGT GTA CGT ATC ACC GTT TGT GTG AAC 3′ (Sentido) 5′ ATC GCC GCT TTG GAC ATA CCA TCC GTA 3′ (Antisentido)

npt II: 5′ TAT TCG GCT ATG ACT TGG GC 3′ (Sentido) 5′ GCC AAC GCT ATG TCC TGA TA 3′ (Antisentido)

49

Las condiciones de reacción fueron las siguientes:

gus A

nptII

94ºC 4min

94ºC 4min

92 ºC 1min

92 ºC 1min

55 ºC 1.2 min

30 ciclos

57 ºC 1.2 min

72 ºC 1.1 min

72°C 1.1 min

72 ºC 5 min

72 ºC 5 min

35 ciclos

Los productos obtenidos fueron analizados en geles de agarosa al 1% y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio. c. Análisis tipo Southern blot La determinación tanto de la integración como el posible número de copias de los genes introducidos se llevo a cabo mediante un análisis tipo Southern de la siguiente manera: El DNA extraído de los callos seleccionados fue digerido mediante una doble digestión con la enzima EcoRI, la cual corta en uno de los extremos del gen gus A en el plásmido PBI426. El DNA digerido fue calentado a 65 °C por 15 minutos, se enfrió en hielo durante 5 minutos y el producto de la digestión se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se observo

tiñendo

con

bromuro

de

etidio.

Posteriormente

el

gel

fue

desntaturalizado y transferido a una membrana de nylon por capilaridad. El DNA se fijó a la membrana con luz ultravioleta. La hibridación de la membrana se llevo a cabo utilizando como sonda el gen gus A marcado radioactivamente (Sambrook y col., 1989).

50

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A. Establecimiento del cultivo in vitro Se logró establecer un sistema de cultivo in vitro para Agave tequilana a partir del cultivo de segmentos obtenidos de la región meristemática o piña, de hijuelos de agave de aproximadamente un año de edad, en medio MS1. Como respuesta del tejido a la exposición al medio, se obtuvo la producción de brotes con una buena eficiencia (20 a 30 brotes por explante), llegando hasta el establecimiento de las plantas en invernadero. En cuanto al proceso de desinfectación el utilizado fue exitoso, ya que no se observó contaminación en los explantes cultivados. El tiempo total que se necesitó para obtener una plántula de Agave tequilana enraizada in vitro a partir de la desinfestación fue de 3 meses aproximadamente (Figura 8). B. Inducción de embriogenesis somática 1. Producción de embriones Con la finalidad de establecer un sistema de regeneración vía embriognesis en Agave tequilana, se evaluaron segmentos de hojas obtenidas de plantas enraizadas in vitro. Como resultado de la influencia del medio MS-L2 sobre los segmentos, solo se observó el abultamiento del tejido y la aparición de algunas estructuras con apariencia embrionaria (Figura 9 A, B y C). Esto se observó 6 semanas después de colocarlos en el medio. Dichas estructuras se presentaron en un promedio de 3 por explante y aparecieron en 40% de los mismos. A pesar de ser una eficiencia muy baja en cuanto a la producción de este tipo de estructuras, nuestras observaciones nos indicaron la posible producción de embriones similar a la reportada con el mismo sistema en la especie Agave Victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996). 2. Germinación de embriones Al llevar a cabo la transferencia de las estructuras embrionarias al medio de germinación, se observó solo muerte del tejido sin llegar a obtener en ninguna de estas la regeneración de una plántula de Agave tequilana producto de su germinación (Figura 9 D), contrario a lo reportado para la especie Agave victoria-reginae (Rodríguez-Garay, 1996), donde ellos reportan la obtención de

51

plántulas regeneradas a partir de embriones. De manera similar se reporto que a concentraciones más elevadas de 2,4-D en medio MS se obtuvo la regeneración de plantas vía embriogénesis indirecta, mediante el cultivo de segmentos de tallo de plántulas (Martínez-Palacios y col., 2003). Tomando en cuenta lo anterior es importante destacar que siendo el Agave tequilana y Agave victoria-reginae plantas pertenecientes al mismo genero, la respuesta de sus tejidos al medio, componente y condiciones de cultivo es muy diferente. Es importante continuar con estudios que nos permitan desarrollar un sistema de regeneración vía embriogénesis preferentemente indirecta y a partir de tejido meristemático para ser utilizados como fuente de explante en trabajos de transformación debido a la estabilidad genética que este sistema brinda (Williams and Maheswaran, 1986; Isabel y col., 1995). Santacruz-Ruvalcaba (2001), en su tesis doctoral reporta un sistema de transformación utilizando callos embriogénicos, sin embargo, no existen reportes de como esta constituido este sistema. En este sentido a pesar de no haber obtenido la germinación de embriones, nuestros resultados son un primer indicio de la respuesta de este tipo de tejidos para futuras evaluaciones que sean hechas con esa finalidad. C. Sistema de regeneración vía organogénesis indirecta 1. Inducción y mantenimiento del estado de callo Los segmentos de hoja que fueron expuestos a medio MS y MS1 suplementado con las diferentes concentraciones de BAP y 2,4-D no mostraron desarrollo de una estructura de callo. Se observó en cambio un leve crecimiento del tejido; solamente los explantes obtenidos de la cabeza central (piña) y expuestos a medio MS1 suplementado con 10 mg/l de BAP y 0.025 mg/l de 2,4-D tuvieron la capacidad de formar callos en un 100% (Figura 10B). Para obtener mejor respuesta en el tiempo de formación de callo con los explantes obtenidos del tejido meristemático se utilizó zeatina como fuente de citocinina. Se observó la formación de estructuras callosas a diferentes concentraciones de zeatina en combinación con 2,4-D; sin embargo, éstos fueron menos friables y con una apariencia seca y dura en la superficie (Figura 10C). 52

0

12

32

60

(Días)

22 Días

Figura 8. Establecimiento del cultivo in vitro de Agave tequilana. El cultivo in vitro se estableció a partir de la propagación de segmentos de la región meristemática de la piña.

53

A

B

C

D

Figura 9. Ensayo para la producción de embriones somáticos a partir de segmentos de hojas de plántulas in vitro de A. tequilana. A) Inducción del estado embriogénico; B) Producción de estructuras embriogénicas; C) Separación de estructuras; D) Germinación con embriones muertos.

54

Para la determinación del tamaño mínimo regenerable del explante, los segmentos obtenidos a partir de los diferentes cortes de la región meristemática de las plántulas enraizadas in vitro, fueron colocados en medio MS1 de regeneración. Los callos presentaron una apariencia compacta y saludable después de 15 días en incubación (Figura 11). Sin embargo, los explantes obtenidos a partir del corte longitudinal mostraron un alto porcentaje de formación de callo (77.5%), en comparación con los obtenidos a partir de los otros cortes (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006) En un experimento previo se observó que disminuyendo la concentración de citocininas (5 mg/l) y aumentando la de auxinas (0.25 mg/l), hay un crecimiento en los callos sin llevarse a cabo la formación de brotes. Posteriormente, se evaluaron diferentes tratamientos con 2,4-D y NAA, (solos o en combinación con BAP) y se observaron diferentes respuestas en las características de crecimiento y friabilidad. Los callos cultivados en los diferentes tratamientos de mantenimiento lograron mantenerse sin presentar la formación de brotes durante tres meses como mínimo (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). En resultados preliminares se observó que los callos expuestos en medio sin fuente de auxinas, no logran sobrevivir, además se determinó que el tiempo entre la inducción del estado de callo y la transferencia a los distintos tratamientos de mantenimiento fue determinante para el efecto de la preservación de la estructura callosa. Se observó que el tiempo máximo para hacer la transferencia después de la inducción debe ser de 7 días, si es mayor la predeterminación del estado de organogénesis se hace presente en los callos. De manera general, se encontró en los primeros experimentos que una disminución en la concentración de citocininas (BAP) y, como consecuencia un aumento en la concentración de auxinas (2,4-D) da como resultado una mejor respuesta en el crecimiento de los callos. Lo anterior concuerda con lo reportado por

Núñez-Palenius y col. (1999)

quienes indican que para establecer un sistema de regeneración se debe considerar que un incremento en la concentración de auxinas y consecuente decremento en la concentración de citocininas induce la condición de callo en los explantes. En este sentido Robert y col. (1987) obtuvieron un extenso

55

A

B

C

Figura 10. Respuesta a la inducción del estado de callo en tejidos de hoja y piña de A. tequilana, utilizando diferentes fuentes de citocininas. A) Segmentos de hoja; B) Callos (BAP); C) Callos (Zeatina).

56

A

B

C

Figura 11. Formación de callos en explantes obtenidos a partir de diferentes cortes de meristemos de plántulas in vitro de A. tequilana. A) Meristemo completo; B) Corte transversal; C) Corte longitudinal.

57

Tabla 9. Organogénesis en explantes obtenidos a partir de diferentes fracciones de meristemo.

Tipo de corte meristemático

Capacidad de formaci ón de callos (%)

Capacidad de formaci ón brotes (CFB)

Completo

68.6 b

15.9

Transversal

71.5 b

19.5

Longitudinal

77.5 a

7.8

Valores seguidos por la misma letra en cada columna no difieren estadísticamente a p=0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

58

crecimiento de callos en explantes de A. fourcroydes utilizando una relación alta de auxinas/citocininas (2.5 mg/l IBA y 1 mg/l BAP). Los callos crecidos en diferentes concentraciones de auxinas (2,4-D y NAA), solas o en combinación con BAP, mostraron efectos muy contrastantes en cuanto a crecimiento (Figuras 12 y 13). Mientras que los callos crecidos en los tratamientos con 2,4-D tuvieron bajos índices de crecimiento, cuando fueron expuestos a esas mismas concentraciones pero en combinación con BAP, el crecimiento se incrementó en más de un 100% (Figura 12). En términos generales, los callos presentaron una apariencia compacta y un color verde brillante, además se observó poca friabilidad y pequeñas áreas de oxidación (Figura 14A y 14C). En contraste, los tratamientos en los que se utilizó NAA como fuente de auxinas, presentaron altos índices de crecimiento. De manera contraria a los tratamientos con 2,4-D, cuando fueron utilizados en combinación con BAP los niveles decrecieron drásticamente (Figura 12); sin embargo, sólo los callos obtenidos de los tratamientos con NAA presentaron alta friabilidad (Figura 13B y 13D) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). La respuesta contrastante entre las dos auxinas puede explicarse tomando en cuenta que la actividad auxina-citocinina en la división celular puede tener una función antagónica ya que la auxina NAA se une a la enzima reguladora de citocininas, llamada citocinina oxidasa, o bien, puede tener un efecto sinérgico, ya que los niveles de auxinas libres como el 2,4-D son incrementados por la influencia de citocininas (Coenen y Lomax., 1997). Tomando en cuenta las características de friabilidad y crecimiento, los tratamientos con alta concentración de NAA (1.0 mg/l) fueron los que produjeron una mejor respuesta (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). 2.

Producción de brotes

Los callos obtenidos en los tratamientos con zeatina (como fuente de citocininas) no mostraron el desarrollo de órganos (brotes). Sin embargo, cuando se realizó la transferencia de los callos a medio de regeneración MS1 se observó bajo nivel de organogénesis, comparado con los obtenidos en callos inducidos en el mismo medio. En este sentido, Hazra y col. (2002), reportaron que no se obtuvo la formación de brotes en tratamientos con zeatina de callos de Agave sisalana. 59

a

0.6

b

0.5 0.4

c

0.3 0.2

c

d

0.5 2,4-D 0.5 2,4-D/ 5 BAP

0.25 2,4-D 0.25 2,4-D/ 5 BAP

0

0.125 2,4-D/ 5 BAP

0.1

0.125 2,4-D

Area de crecimiento cm 2 Área

a

0.7

Tratamientos mg/l

Figura 12. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los tratamientos con 2,4-D solo y en combinación con BAP. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

60

0.6 0.5 b

0.4 0.3

c cd

0.2

d

d

0.25 NAA/ 5 BAP

0.5 NAA

0.25 NAA/ 5 BAP

0.25 NAA

0

0.1 NAA

0.1 0.5 NAA/ 5 BAP

Área de crecimiento cm2

a

0.7

Tratamientos mg/l

Figura 13. Crecimiento de callos de A. tequilana en respuesta a los tratamientos con NAA solo y en combinación con BAP. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

61

A

B

C

D

Figura 14. Apariencia de callos generados en los tratamientos de mantenimiento de callos. Tratamientos: A) 0.25 mg/l 2,4-D; B) 1 mg/l NAA; C) 5 mg/l BAP y 0.25 mg/l 2,4-D; D) 5 mg/l BAP y 1 mg/l NAA.

62

Los callos obtenidos a partir de las piñas o cabezas centrales (región meristemática) completas y los explantes obtenidos de los diferentes cortes de las mismas mostraron diferencias significativas en su coeficiente de formación de brotes (CFB). Los callos obtenidos a partir de los cortes transversales, presentaron los mayores índices de CFB (19.5), comparados con los provenientes de los cortes longitudinales (Tabla 9). A pesar de que estos últimos fueron los que mostraron los niveles más altos de capacidad de formación de callos (Tabla 9) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). Los callos obtenidos de los tratamientos con NAA y 2,4-D solos o en combinación con BAP mostraron bajos niveles de formación de brotes, comparados con el tratamiento control (callos en medio MS1) (Tabla 10). Es importante mencionar que utilizando el medio MS1 la aparición de brotes es de forma inmediata a la formación del callo, sin permitir manipular dicho estado. Del total de los tratamientos evaluados, los que presentaron mayor nivel de CFB fueron los que utilizaron la más alta concentración de NAA (1.0 mg/l) como único regulador y en la concentración más baja de 2,4-D (0.125 mg/l) combinado con BAP (4.7 y 3.19, respectivamente) (Tabla 10) (ValenzuelaSánchez y col., 2006). Las condiciones de un cultivo de callos pueden favorecer la aparición de cambios genéticos y epigenéticos en los explantes. Este fenómeno puede causar una pérdida progresiva de la capacidad de regeneración (Gómez, 1998). En nuestros resultados se observó que en la mayoría de los casos esta capacidad fue recuperada, mostrando brotes de apariencia y desarrollo normal. A pesar de que los valores de CFB fueron bajos en comparación con el sistema de regeneración usado como control (MS1), son aceptables si consideramos que para llevar a cabo los experimentos de transformación genética el sistema de cultivo de callos no tiene limitación en cuanto a la disponibilidad del explante. Otra alternativa que podría brindar este sistema, es la inducción de variabilidad genética en el cultivo al manipular el estado de callo por tiempos prolongados (Núñez-Palenius y col., 1999). Un sistema de transformación genética exitoso depende particularmente de un eficiente sistema de regeneración (Birch, 1997). En este sentido, el uso de un sistema de regeneración vía organogénesis indirecta, a partir de segmentos meristemáticos y la manipulación del estado de callo es una buena alternativa 63

como

sistema

de

transformación

genética

de

Agave

tequilana.

Las

características celulares como estado de diferenciación y crecimiento de los tejidos meristemáticos y el hecho de poder hacer un cultivo repetitivo de los callos. pueden garantizar la regeneración de plantas de origen unicelular, facilitando así, la posibilidad de una doble selección, lo cual reduciría la frecuencia de plantas quiméras.

3. Enraizamiento y aclimatación Los brotes maduros transferidos a medios MS1 libre de reguladores de crecimiento, mostraron la aparición de las primeras raíces después de diez días y el sistema radical se observó completamente desarrollado a las tres semanas, dando como resultado plántulas con apariencia fuerte y saludable (Figuras 15C, 15D y 15E) (Valenzuela-Sánchez y col., 2006). Las plántulas enraizadas fueron aclimatadas con un 100% de sobrevivencia y se mantuvieron en invernadero para

que

continuaran

su ciclo de desarrollo, y hasta las

últimas observaciones se presentaban aparentemente normales (Figura 15F). Este proceso tomo un total de 5 meses.

D. Sensibilidad de explantes de A. tequilana a agentes selectivos 1. Kanamicina (antibiótico) A los 30 días de exposición al medio de regeneración (MS1) suplementado con las concentraciones del antibiótico kanamicina utilizadas, los callos mostraron diferentes porcentajes de sobrevivencia con respecto a cada una de de estas concentraciones. Los efectos del antibiótico fueron notorios a partir de los primeros 15 días, observándose en los callos los primeros índices de necrosis, así como también interrupción del desarrollo, contrastando con los callos control en los que ya se observaba la aparición de los primeros brotes. Como se observa en la Figura 16, existe una relación inversa entre la concentración del antibiótico en el medio y la sobreviviencia del tejido. A 25 mg/l de kanamicina no se observó un efecto significativo del antibiótico sobrevivió

un

96.7%,

sin

ya

que

embargo, al aumentar la dosis a 50 mg/l, la

sobrevivencia disminuyó drásticamente a un 46%, finalmente con 100 mg/l murió el 91% de los explantes. Tomando en cuenta lo anterior, se seleccionó la

64

Tabla 10. Capacidad de regeneración de callos de A. tequilana obtenidos de los tratamientos de mantenimiento de callos.

Concentración de reguladores

Capacidad de formación de brotes

de crecimiento (mg/l)

(BFC)

BA

2,4-D

0.0

0.0

0.0

0.0

0.25

2.06 cd

0.0

0.5

3.34 bc

0.0

1.0

4.7 b

0.125

0.0

1.85 cde

0.25

0.0

1.05 def

0.5

0.0

0.33 ef

0.0

0.0

--

0.0

0.25

0.15 f

0.0

0.5

0.87 def

0.0

1.0

0.35 ef

0.125

0.0

3.19 bc

0.25

0.0

3.12 c

0.5

0.0

2.08 de

0.025

--

14.5 a

5

10*

NAA --

* Concentración usada en el sistema de propagación con el medio MS1. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms) 65

A

B

C

D

E

F

Figura 15. Regeneración completa de A. tequilana vía organogénesis indirecta a partir de segmentos de tejido meristematico (piñas). A) Obtención del explante inicial; B) Inducción del estado de callo; C) Producción de brotes; D) Separación de brotes; E) Enraizamiento; F) Aclimatación.

66

concentración de 100 mg/l como dosis para llevar a cabo una preselección de los explantes transformados. 200 mg/l podría resultar una dosis tóxica para el tejido al ser utilizada en la primera etapa de selección, tomando esto en cuenta se determinó usarla como un segundo tratamiento selectivo, después de que los explantes se hubieran recuperado al ser expuestos en el medio de regeneración adicionado con una dosis del antibiótico más baja (100 mg/l). Santacruz-Ruvalcaba (2001) utilizó 40 mg/l de kanamicina para seleccionar callos embriogénicos de Agave tequilana, esto demuestra que la respuesta al antibiótico es específica del tipo de tejido incluso dentro de la misma especie. Este contraste resalta la importancia del análisis de sensibilidad del tejido que vaya a ser utilizado en trabajos de transformación genética, ya que la selección es un paso determinante en el desarrollo de este tipo de metodologías (Yang y Christou, 1994). 2. Fosfinotricina (herbicida) Para el primer experimento de las evaluaciones de sensibilidad a fosfinotricina (0, 0.25, 0.5, 1 y 2 mg/l) no se observó efecto alguno ya que los callos mostraron un desarrollo normal llegando hasta la regeneración de plántulas in vitro. En un segundo ensayo se aumentó el rango de concentración del agente, además de forma simultánea se realizó un experimento control utilizando las mismas concentraciones de herbicida en hojas de tabaco para verificar la actividad de éste en el medio. A partir de la primera semana se observaron altos índices de letalidad en las hojas de tabaco, a diferencia de las hojas control donde la apariencia era saludable y el desarrollo fue notorio, corroborándose así, la actividad del herbicida sobre el tejido (Figura 17). De igual manera, al elevar las concentraciones se pudo evaluar el porcentaje de sobrevivencia en los explantes de A. tequilana, observándose en las primeras semanas de exposición de los callos al medio con el herbicida notorios índices de necrosamiento. Sin embargo, a partir de la concentración de 2 mg/l de ppt, la sobrevivencia fue importante (29%), y conforme aumentó la concentración del herbicida esta se vio disminuida hasta llegar a 0 % (4 mg/l de ppt), por lo que se seleccionó esta concentración como dosis letal mínima (Figura 18). Para llevar a cabo una segunda selección en plantas ya adaptadas en invernadero, se utilizó el herbicida ppt en su forma comercial (BASTA), al igual 67

que en los ensayos in vitro, con las primeras dosis utilizadas (0.25, 0.5, 1 y 2 % v/v), no se observó ningún daño en las hojas de las plantas de agave. Se decidió aumentar la dosis hasta 16 % v/v, de esta forma a la primera semana de exposición se pudo observar el necrosamiento en las hojas a partir de la concentración de 4%. Después de transcurrido el mes y de completar la evaluación se determinó que 8% (v/v) era una concentración adecuada para seleccionar plantas de agave trasformadas con el gen bar (confiere resistencia a fosfinotricina) ya que a concentraciones menores el daño en las plantas no era total (Figura 19). Tomando en cuenta que las dosis comerciales recomendadas para el control de malezas se encuentran generalmente por arriba del 1 % v/v del producto, las plantas de agave mostraron ser resistentes a concentraciones del herbicida hasta 4 veces mayores. En contraste con los resultados obtenidos para el antibiótico kanamicina, las dosis determinadas para el herbicida fosfinotricina tanto in vitro como para plantas en invernadero fueron similares a las reportadas por SantacruzRuvalcaba (2001), donde reporta 3 mg/l de ppt para seleccionar callos embriogénicos y 6% v/v de BASTA para plantas en invernadero. Para la selección in vitro utilizando 3 mg/l de ppt se observaron todavía pequeños índices de sobrevivencia (Figura 18), sin embargo se debe tomar en cuenta que en este trabajo se evaluaron callos organogénicos y Santacruz-Ruvalcaba trabajó callos embriogénicos.

E. Ensayos de transformación vía Agrobacterium tumefaciens 1. Incorporación de plásmidos en cepas de Agrobacterium Las cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 transformadas con los plásmidos pBI121,

p35SGUS y pBINGFP mediante congelamiento con N2

líquido crecieron satisfactoriamente en medio de selección, lo que indicó que contenían el plásmido transferido, sin embargo utilizando el método de cruza triparental (Ditta y col., 1980), no fue posible recuperar colonias resistentes, a pesar de ser este un método sencillo y ampliamente utilizado para transferir plásmidos binarios recombinantes a células de A. tumefaciens. Para corroborar la incorporación de los plásmidos en la bacteria, se llevó a cabo un análisis tipo

68

% de sobrevivencia 100

a 100

a 96.7

90 80 70 60

b

50

46

40 30 20

c

10

9.0

0 0

25

50

100

c 1.3 200

Concentración mg de kanamicina mg/l

Figura 16. Sensibilidad de callos de A. tequilana al antibiótico kanamicina. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

69

2.5

0

7.5

5

10

Figura 17. Efecto en hojas de tabaco a diferentes concentraciones del herbicida fosfinotricina (ppt) adicionado en el medio (mg/l).

70

% de sobrevivencia

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

a 100

b 29 c 8 0

2

3

c 0 4

c 0 5

mg/l de PPT mg

Figura 18. Sensibilidad de callos de A. tequilana al herbicida fosfinotricina (ppt). Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

71

% BASTA (V/V)

Plantas evaluadas

1

2

3

4

5

6

7

0

-

-

-

-

-

-

-

4

+

++

+

+

+

++

+

8

+++ ++

+++

+++

+++

+++

+++

12

+++ +++

+++

+++

+++

+++

+++

16

+++ +++

+++

+++

+++

+++

+++

Daño:

- sin daño, + mínimo, ++ abundante, +++ total

Figura 19. Sensibilidad de plantas de A. tequilana al herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA).

72

PCR con oligonucleotidos dirigidos al gen nptII. En el DNA obtenido de las colonias seleccionadas se logró amplificar un fragmento correspondiente al gen nptII, que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, demostrando asi su transformación. En la Figura 20, se observa la banda de 617 pb que corresponde al fragmento del gen nptII presente en las cepas analizadas, las cuales se muestran en los carriles 1 y 2, similar al que se observa en el carril 5 que muestra una banda correspondiente al fragmento de 617 pb amplificado directamente del DNA plasmídico (p35SGUS) utilizado como control positivo, esta banda no se observa en el carril 4 donde se cargó el producto de la amplificación de agua como control negativo. 2. Susceptibilidad del A. tequilana a la infección de cepas silvestres de Agrobacterium tumefaciens La enfermedad de la agalla de la corona producida por la transferencia del TDNA de Agrobacterium a la célula vegetal, es un microcosmos en donde la bacteria puede crecer y durante este proceso ocurren principalmente dos fenómenos, consecuencia de la expresión de los genes presentes en el T-DNA: (a) producción de enzimas que estimulan el crecimiento del tumor, y (b) producción de opinas, que son metabolizables solamente por la bacteria (Valentine, 2003). Para llevar a cabo los ensayos de transformación vía Agrobacterium se evaluó la susceptibilidad de las plantas de agave a la infección por cepas silvestres de la bacteria, como se describió en la metodología. No se observó la formación de agallas como síntoma de la infección de las cepas (Figura 21), posiblemente porque, el agave es una planta monocotiledónea y se ha reportado que este tipo de plantas no son hospederas naturales para A. tumefaciens (Vain y col., 1995; Tzfira y Citovsky, 2002; Gelvin, 2003). La ausencia de formación de tumores en plantas monocotiledóneas puede deberse a que no producen factores fenólicos que activan la expresión de los genes vir en el plásmido Ti, a que no se lleva a cabo la trascripción de los oncogenes o por diferencia en la fisiología de hormonas endógenas comparadas con las presentes en plantas dicotiledóneas (Usami y col., 1987; Smith y Hood, 1995). Sin embargo, De Cleene and De Ley (1976), reportaron la formación de tumores producidos como resultado de la infección con la bacteria A. tumefaciens en la especie Agave salmiana Otto. Con estos 73

resultados no se descartó el uso de Agrobacterium como medio de transformación para la especie tequilana, ya que se han desarrollado exitosos sistemas de transformación, manipulando las condiciones de infección en otros cultivos, a pesar de que estos no presentaron la formación de tumores debido a la infección natural de A. tumefaciens, como ejemplo podemos mencionar maiz, (Ishida y col., 1996), arroz (Chan y col., 1993; Hiei y col., 1994; Dong y col., 1996; Rashid y col., 1996; Toki, 1997), cebada (Tingay y col., 1997) y trigo (Cheng y col., 1997). Otros puntos importantes a considerar en el proceso de infección con Agrobacterium tumefaciens y a los cuales también se le puede atribuir el que no se haya observado la formación de tumores en las plantas de Agave tequilana, son la edad de la planta, su estado fisiológico, así como el proceso de infección y la cepa utilizada, ya que se ha observado la influencia de estos factores en el desarrollo de tumores en plantas dicotiledóneas sensibles a la infección por la bacteria (Hernalsteens y col., 1984; Vain y col., 1995). Finalmente es importante mencionar que el primer paso en el proceso de infección mediado por Agrobacterium, es la fijación de la bacteria a la pared celular de la planta hospedera, el cual se ve también afectado por la edad del tejido, el tipo de células, el estado del ciclo celular, entre otros parámetro fisiológicos (Graves y col., 1988).

3. Selección de condiciones de transformación Para determinar las condiciones óptimas para establecer un sistema de transformación vía Agrobacterium tumefaciens, el primer parámetro evaluado fue el daño en el explante, ya que los azúcares y compuestos fenólicos que son liberados como consecuencia de heridas en el tejido vegetal, además de ser una señal de oportunidad patogénica para la bacteria, también inducen la trascripción de los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia e integración del T-DNA en la célula vegetal (Valentine, 2003). Park y col., (1996) reportan que hiriendo sistemáticamente con aguja hipodérmica un tejido meristemático

de

arroz,

se

favoreció

su

transformación

genética,

probablemente porque se facilitó la penetración de la bacteria en el tejido, se

74

M 1 2

3 4 5

1,018pb 506 pb

617 pb

Figura 20. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen nptII presente en los plásmidos P35SGUS y pBIN m-gfp5-ER en cepas LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens después de la transformación. Carril M) Marcador 1 Kb; 1) LBA4404 con p35SGUS; 2) LBA4404 con pBIN m-gfp5-ER; 4) Control negativo; 5) Control positivo (p35SGUS).

75

A)

B)

D)

C)

E)

Figura 21. Susceptibilidad de plantas de A. tequilana a la infeccion de natural Agrobacterium tumefaciens. A) Infección con C58; B) Infección con H63; C) Infección con A281; D) Infección con LBA4404; E) Ensayo con agua (control -). proporcionó acceso a células susceptibles y la producción de componentes que inducen la expresión de los genes de virulencia. 76

En nuestros estudios, al evaluar los diferentes tipos de daño en callos obtenidos de tejido meristemático y de acuerdo al porcentaje de sobrevivencia, el daño con aguja de 13 mm fue el óptimo para realizar los ensayos de transformación, ya que éste fue el que menos efecto negativo causó a los explantes, ya que presentaron el mayor índice de sobreviencia comparado con los otros dos tratamientos, los cuales no mostraron diferencias significativas al ser comparados entre ellos (Figura 22). Se consideró el parámetro de sobrevivencia para seleccionar un método de daño, ya que además de tomar en cuenta el efecto que tienen las heridas en el tejido al favorecer los fenómenos de transferencia del T-DNA, es importante considerar que un daño excesivo en los callos podría limitar su recuperación y como consecuencia la regeneración de brotes. Otro de los parámetros evaluados fue el tipo de medio de cultivo bacteriano para llevar a cabo la infección, los resultados mostraron que el medio de cultivo sólido fue más agresivo para el tejido, gran porcentaje de los explantes no se pudieron regenerar, esto se atribuye a la densidad bacteriana y a la exposición directa con el tejido. A partir de lo anterior, se decidió utilizar medio líquido de cultivo bacteriano para realizar los ensayos de transformación. Porque de igual forma al evaluar los índices de sobrevivencia de exposición del cultivo bacteriano con el tejido se determinó 10 min como tiempo óptimo (Figura 23). Tomando en cuenta que la concentración celular y el periodo de inoculación son variables claves en la transferencia de genes mediada por Agrobacterium (Birch, 1997), es importante destacar que el uso de tiempos de infección prolongados y densidades bacterianas altas, puede tener efectos adversos en el crecimiento de los callos y su subsecuente regeneración, a pesar de que los niveles de expresión transitoria sean altos, como lo reportaron en arroz Kumria y col., (2001). El

periodo de cocultivo es un parámetro determinante en el proceso de

transformación vía Agrobacterium y difiere dependiendo de la especie. Se ha observado que largos periodos muestran mayor eficiencia en la transferencia del plásmido Ti a la célula vegetal (Kondo y col., 2000). En explantes de un híbrido cítrico (Citrange), los niveles de expresión transitoria del gen gus A se incrementaron conforme se aumento el periodo de cocultivo de 1 a 5 días (Cervera y col., 1998), de manera similar Cao y col., (1998) sugieren que la 77

baja eficiencia de transformación de manzana (James and Dandekar 1991) se debió a un periodo insuficiente de cocultivo, ya que un prolongado periodo de 2 a 4 días incrementó la expresión gus casi 100 veces (De Bond y col, 1994). Haciendo referencia a lo anterior, en transformación genética de ajo se reportó que con 3 o más días de cocultivo se observaron mayores niveles de expresión transitoria comparada con 1 y 2 días respectivamente (Kondo y col., 2000). En este sentido, en nuestros resultados observamos que en callos de A. tequilana los mayores niveles de expresión del gen gus A se encontraron con 4 días de cocultivo del tejido con la bacteria (Figura 24); después de este tiempo no se observó un diferencia notoria en la expresión del gen gus A. Tomando en cuenta lo anterior se decidió seleccionar 4 días como tiempo óptimo de cocultivo, además de los resultados en la expresión transitoria, también se consideró que se ha reportado que resulta más difícil eliminar la bacteria Agrobacterium después de largos periodos de su exposición con el tejido vegetal teniendo como consecuencia un sobrecrecimiento de la bacteria y un decremento en la regeneración de brotes transformados (Cervera y col., 1998; Kondo y col., 2000). En la Figura 24 también se observa una diferencia muy marcada en cuanto a la apariencia y desarrollo de los callos expuestos a los diferentes tiempos de cocultivo, mientras mayor fue el tiempo de cocultivo los callos mostraron una mejor apariencia y un desarrollo más avanzado, algunos incluso iniciando la producción de brotes. Lo anterior puede ser explicado, si tomamos en cuenta que un periodo adecuado de cocultivo pudo permitir una recuperación del tejido después del tratamiento de infección con la bacteria, lo cual hizo menos agresivo el cambio a medio con antibiótico para llevar a cabo la eliminación de la misma. Los resultados anteriores son los primeros reportes de obtención de expresión transitoria del gen gus A en explantes de Agave tequilana mediante su transferencia utilizando como sistema a la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Hasta la fecha no se encuentra reportado en la bibliografía ningún trabajo similar, tomando esto en cuenta es importante destacar que estos resultados sientan las bases para el establecimiento de un sistema de transformación genética para la planta monocotiledónea A. tequilana vía A. tumefaciens.

78

% de sobrevivencia

a 100

10

a 93.3 b 73.3

9 8

b 70

7 6 5 4 3 2 1 0 Control

Aguja 13 mm

Aguja 32 mm

Partículas

Figura 22. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tipos de daño. Valores seguidos con la misma letra, no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

79

% de sobrevivencia

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

a 91.06 b 71.1

b 66.76 c 49

0

5

10

20

c 39

30

Minutos

Figura 23. Sobrevivencia de explantes de A. tequilana a diferentes tiempos de exposición con el cultivo bacteriano. Valores seguidos con la misma letra, no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

80

Explantes Días de cocultivo

1

2

3

4

5

1

-

+

-

+

-

2

-

-

-

+

-

3

+

+

-

++

-

+

++

++

++

-

4 5

++ +++ -

+++ +++

- Sin coloración + Intensidad de coloración

Control

Figura 24. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes tiempo de cocultivo de A. tumefaciens con callos de A. tequilana.

F. Ensayos de transformación vía biobalística

81

1. Selección de condiciones de transformación Previo a los ensayos de transformación en agave se estandarizaron las condiciones de bombardeo con equipos de alta y baja presión, en hojas de tabaco como sistema control. Evaluando el número de foci (manchas o puntos azules) como producto de la expresión transitoria del gen gus A, la cual fue considerada como una unidad de expresión (Hagio y col., 1995) se seleccionaron como condiciones de partida 80 psi y 20 cm de distancia para el sistema de baja presión y 900 psi y 11.5 cm para alta presión. En la Figura 25 se observan de manera abundante y homogénea los puntos azules (foci) sobre las hojas de tabaco como producto de la reacción enzimática llevada a cabo por la enzima β-glucuronidasa, la cual es codificada por el gen gus A. A partir de la última década, las técnicas de biobalística han sido mejoradas y utilizadas de manera tal que podrían ser extrapoladas a cualquier tipo de tejido y especie vegetal (Christou, 1992; Sanford y col., 1993; Takumi y Shimada, 1996; Kim y Minamikawa, 1997). Es indispensable el establecimiento de las condiciones de bombardeo a fin de obtener valores promedio entre células muertas y el menor daño posible, lo cual se ve reflejado en los niveles de expresión del transgen y la consecuente recuperación del plantas transgénicas (Gordon-Kam y col., 1990; Kauch y col., 1995). Tomando como base los resultados observados en los explantes de tabaco, se hicieron evaluaciones de la expresión transitoria del gen gus A utilizando diferentes condiciones de bombardeo, como tiempo de exposición al medio osmótico, presión de bombardeo, distancia y concentración de DNA, lo que permitió obtener los siguientes resultados. Para el medio osmótico, primero se evaluaron diferentes tiempos de exposición del medio con los explantes previo al bombardeo. Se registro el número de explantes que presentaban foci, así como el número de foci en cada explante para cada uno de los tratamientos evaluados. Al llevar a cabo la comparación estadística de los resultados, nos permitió seleccionar 4 horas como tiempo óptimo de exposición, ya que fue el que mostró una diferencia significativa con respecto a los otros tratamientos (Tabla 11). Sin embargo esta diferencia se vio influenciada por la disminución de la concentración del DNA plasmidico utilizado, ya que al variar el tiempo de exposición utilizando 1 µg/µl, no se observó diferencia significativa en cuanto a los niveles de expresión en los dos 82

tratamientos, contrastantemente a lo que se observó cuando se utilizó 0.1 µg/µl (Tabla 11), por esta razón se llevó a cabo una evaluación posterior de la concentración del DNA en los dos plásmidos utilizados. La expresión tanto transitoria como estable se ve mejorada al aplicar un tratamiento osmótico, ya que se reduce el daño celular al prevenir la extrusión del protoplasma de las células bombardeadas y incrementan

las

posibilidades

de

sobrevivencia

de esa manera se celular,

este

estado

plasmolizado debe ser mantenido por algunas horas antes y después del bombardeo para que sea mas efectivo (Vain y col., 1993; Yang y Christou, 1999). Otros de los parámetros evaluados fueron la distancia y la presión, la evaluación se realizó de forma conjunta para ambos sistemas (alta y baja presión). Como se observa en la Tabla 12, al bombardear callos con el sistema de baja presión se observaron diferencias en los índices de expresión transitoria del gen gus A con las diferentes combinaciones de presión y distancia. El mayor número de foci, se observó utilizando 20 cm de distancia combinada con 80 y 90 psi de presión. Tomando en cuenta estos resultados se seleccionaron las condiciones 80 psi de presión y 20 cm como óptimas para la expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana (Tabla 12). Los niveles de expresión transitoria no se incrementaron de manera proporcional al incremento de la presión, esto es similar a lo reportado por Stiff, (1995), de igual manera Santacruz-Ruvalcaba reportan un comportamiento similar en callos embriogénicos de Agave tequilana bombardeados. Si bien altos índices de expresión transitoria no garantiza un alto índice de transformación estable, si establece condiciones a seguir para conseguir este tipo de transformación. Se evaluó el efecto de la concentración del DNA sobre la expresión transitoria en los dos plásmidos pBI426 y pAHC25, y se determinó que la concentración del plásmido, así como el tipo tienen una influencia directa sobre la expresión transitoria del gen gus A en callos de agave. Se observaron diferencias significativas al disminuir la concentración de ambos plásmidos, sin embargo esta diferencia fue más notoria en los ensayos realizados con el plásmido pBI426 al aumentar arriba del doble el número de foci contabilizados (Tabla 83

13). Al comparar todos los tratamientos evaluados se determinó que el nivel más alto de expresión transitoria del gen gus A se observó con el plásmido pAHC25 en 0.1µg/µl de concentración (Tabla 13). Tomando en cuenta lo anterior, es importante cuestionar la influencia de la concentración de DNA del plásmido en la expresión del gen gus A; ya que esta puede estar también influenciada por el tipo de promotor bajo el cual esté regulado el gen reportero y el tamaño del plásmido. En este sentido los índices de expresión transitoria obtenidos con el plásmido pAHC25 fueron ligeramente mayores comparados con el plásmido pBI426, esto se debe probablemente a que en el plásmido pAHC25 el gen gus A esta regulado por un promotor de tipo especifico para monocotiledóneas (Ubi) y el Agave tequilana es una planta perteneciente a este grupo, mientras que el otro plásmido contiene un promotor constitutivo (35S). Al igual que en otros trabajos de transformación genética de monocotiledóneas el uso de promotores específicos para este tipo de plantas ha resultado en mayores niveles de expresión comparados con el uso de promotores constitutivos (Taylor y col., 1993; Sági y col., 1995). SantacruzRuvalcaba (2001), recomiendan la evaluación de promotores específicos para monocotiledóneas con la finalidad de aumentar los niveles de transformación. Los ensayos de expresión transitoria llevados a cabo en el sistema de alta presión, también mostraron diferencias en cuanto a los parámetros de distancia y presión analizados. Los resultados fueron muy variados y en la mayoría de los tratamientos los valores de expresión fueron un poco más bajos comparados con los obtenidos con el sistema de baja presión (Tabla 11, 12, 13 y 14), a diferencia del tratamiento de 1350 psi de presión y 12 cm de distancia el cual mostró valores muy altos de expresión (Tabla 14). En este sentido se seleccionaron tales condiciones como óptimas para llevar a cabo la expresión transitoria en callos de A. tequilana. Esto es diferente a las selecciones determinadas por Santacruz-Ruvalcaba (2001) en la transformación de callos embriogénicos de A. tequilana (800 psi de presión y 7 cm de distancia), quienes reportan la obtención de una media de 5.9 foci por 25 mg de callo. De manera general, comparando los niveles de expresión transitoria obtenidos en este trabajo con trabajos similares reportados para otros cultivos incluyendo otras monocotiledóneas (Oard y col., 1990; Bansal, y col., 1992; Kauch y col., 1995; Sági y col., 1995 y Cruz-Hernández y col., 2000), podrían ser un poco 84

bajos a excepción de los obtenidos a 1350 psi y 12 cm, sin embargo siguen siendo considerables, tomando en cuenta que son los primeros reportes de expresión transitoria en este tipo de plantas, lo cual abre de manera importante la posibilidad de seguir variando condiciones para lograr aumentar estos niveles y de igual manera favorecer la transformación estable. En las Figuras 26 y 27, se observa la expresión gus A en los callos de A. tequilana bombardeados con baja y alta presión respectivamente, es notoria la diferencia entre ambos sistemas en cuanto a la apariencia de los foci. En los bombardeos con el sistema de baja presión los foci, se observan como manchas dispersas

y menos definidas (Figura 26), contrario a los

bombardeados con el sistema de alta presión donde se muestran como puntos pequeños y bien definidos (Figura 27). Lo anterior puede deberse a que la dispersión de las partículas es diferente en ambos sistemas; en el sistema de baja presión no se logra una buena dispersión observándose conglomerados de partículas de tungsteno a diferencia con en el sistema de alta presión, donde el mecanismo permite una dispersión mas homogénea de ellas; esto se corroboro en ensayos de bombardeo hechos sobre papel filtro con ambos sistemas. Es importante mencionar que se llevaron a cabo ensayos de expresión transitoria en los callos de Agave tequilana utilizando el gen gfp como reportero tanto con el sistema de biobalística como vía Agrobacterium tumefaciens, tomando en cuenta la ventaja que tiene el uso del gen gfp de la proteína verde fluorescente como gen reportero, ya que su monitoreo no requiere la destrucción del tejido. Pese a esto los resultados no pudieron ser evaluados en ninguno de los dos sistemas, ya que no se pudo observar la fluorescencia de la proteína producto de la expresión del transgen. El color verde de los callos de A. tequilana es muy intenso lo cual indica el alto contenido de clorofila, tomando esto en cuenta probablemente al incidir la lus uv a los callos, la clorofila presente en el tejido se confundió con la posible fluorescencia de la proteína. Cabe mencionar que no se debe descartar el uso de este gen reportero para trabajos posteriores de transformación en esta especie, ya que seria importante evaluar diferentes tejidos como fuente de explante para este tipo de trabajos, los cuales no interfirieran con el monitoreo de la proteína.

85

Figura 25. Expresión del gen gus A en explantes de tabaco. El tabaco se utilizó como sistema control.

86

Tabla 11. Efectos de la exposición al medio osmótico (sorbitol 15%) en la expresión transitoria del gen gus A. Se utilizó el plásmido pAHC25 (80 psi a 20 cm).

Tiempo de exposición (horas)

Concentración de DNA ( µg/µl)

*Número de explantes GUS positivo

Número de foci promedio por explante

4

1

4

39 b

4

0.1

4.5

59 a

8

1

2.5

33 b

8

0.1

3.5

37 b

* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

87

Tabla 12. Efectos de la distancia y presión en explantes de Agave tequilana bombardeados con el plásmido pAHC25 utilizando el sistema de baja presión. Número de promedio de foci por explante

Distancia (cm)

Presión (psi)

Número de explantes GUS positivo

17.5

80 90 100

5 9 8

20

80 90 100

7 9 1

27 a 12 ab 1d

22.5

80 90 100

9 7 1

9b 8c 2d

12 bc 9b 10 b

* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

88

Tabla 13. Efecto de la concentración de DNA de los plásmidos pAHC25 y pBI426 en la expresión transitoria del gen gus A. Bombardeos a 80 psi de presión y 20 cm de distancia.

Plásmido Concentración de DNA (µg/µl)

Número de explantes GUS positivo

Número promedio de foci por explante

pAHC25

1

4

47 b

pAHC25

0.1

6.5

52 a

pBI426

1

4.6

18 c

pBI426

0.1

3.3

44 b

* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

89

Figura 26. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana bombardeados con el sistema de baja presión.

90

Tabla 14. Expresión transitoria del gen gus A a diferentes presiones y distancias utilizando el sistema de alta presión.

Distancia (cm)

Presión (psi)

Número de explantes GUS positivo

Número de promedio de foci por explante

9

450 900 1350

2 2 4

3 d 7 c 10 b

12

450 900 1350

0 3 8

0e 15 b 106 a

15

450 900 1350

0 2.5 1

0e 8c 6d

* Promedio de 10 explantes por bombardeo con 3 repeticiones. Valores seguidos con la misma letra no difieren estadísticamente a p= 0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).

91

Figura 27. Expresión transitoria del gen gus A en callos de Agave tequilana bombardeados con el sistema de alta presión.

92

G. Selección de transformantes Los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium y biobalística en callos de Agave tequilana se realizaron con las siguientes condiciones seleccionadas a partir de los experimentos de expresión transitoria:

Agrobacterium tumefaciens Daño con aguja de 13 mm, 10 min de exposición con cultivo líquido concentrado de la bacteria (+100 µM de acetocyringona), 4 días de cocultivo y eliminación de la bacteria en medio con 500 mg/l de cefotaxima. Biobalística Tratamiento de 4 horas en medio con 15% de sorbitol previo al bombardeo, 80 psi de presión a una distancia de 20 cm utilizando el sistema de baja presión y 1350 psi de presión y 12 cm de distancia para el sistema de alta presión y 48 horas en oscuridad para la recuperación del tejido. Después de realizar los eventos de transformación los explantes fueron sometidos al sistema de selección correspondiente. En los ensayos de transformación estable vía Agrobacterium, al colocar los callos en medio de regeneración MS1 suplementado con 100 mg/l del antibiótico kanamicina como dosis de preselección, lograron sobrevivir varios explantes, sin embargo al llevar a cabo la segunda ronda de selección (200 mg/l) estos explantes mostraron índices severos de oxidación y no fue posible regenerar ningún material resistente a la selección con el antibiótico. Lo anterior pudo deberse a que no se llevó a cabo una integración de los genes, probablemente el mecanismo de transferencia se realizó en las células superficiales del tejido; tomando en cuenta esto es necesario evaluar otros tratamientos de daño que permitan una difusión más profunda de la bacteria. El hecho de no haber seleccionado materiales de A. tequilana transformados vía Agrobacterium tumefaciens, no descarta la posibilidad de que se llegue a lograr con éxito este proceso, ya que los resultados en cuanto a la expresión transitoria del gen gus A discutidos anteriormente, demuestra al menos la presencia del gen al tejido vegetal mediante este método. En este sentido es importante evaluar en trabajos posteriores variantes en las condiciones de infección y cocultivo, así como otras cepas de Agrobacterium que presenten 93

más

virulencia,

todos

estos

factores

han

demostrado

favorecer

la

transformación genética en otras plantas monocotiledóneas. En los ensayos mediante biobalística (baja presión) se lograron seleccionar callos bombardeados con ambos plásmidos pAHC25 y pBI426, en medio MS1 de regeneración suplementado con 4 mg/ de ppt o 100 mg/l de kanamicina respectivamente. Al llevar a cabo la segunda ronda de selección con ambos agentes, sólo sobrevivieron los callos bombardeados con el plásmido pBI426 (Figura 28), los cuales mostraron una apariencia sana e inicios de brotación durante los subcultivos en presencia de 200 mg/l del antibiótico kanamicina. De un total de 150 callos bombardeados con el plásmido pBI426, se lograron seleccionar solo 12 las cuales fueron designadas como B1 hasta B12, lo que nos da un 8% de eficiencia de transformación en cuanto a

la selección,

utilizando el sistema de baja presión. Con alta presión, también se regeneró material bombardeado con el plásmido pBI426 (Figura 29). De un total de 250 explantes bombardeados se seleccionaron 22 designadas A1 hasta A22, resultando un 8.8% similar a los obtenidos con el sistema de baja presión. En los resultados obtenidos en la selección de material transformado es notorio que los niveles de expresión transitoria no fueron correspondientes a los índices de material seleccionado, ya que al comparar los índices de expresión transitoria entre los plásmidos pAHC25 y pBI426, la expresión fue mas alta utilizando el primero (Tabla 12), probablemente eso de deba a la diferencia en tamaño, ya que la integración solo se logro con el plásmido de menor tamaño (pBI426). Como se ha reportado, la expresión transitoria de un gen es relativamente fácil de producirse, sin embargo la recuperación de transformantes estables se presenta en porcentajes muy bajos (Russell y col., 1992). Tomando en cuenta que el porcentaje de recuperación de callos en el proceso de selección es considerable, esto no es garantía de que se conserve este porcentaje de manera estricta en su evaluación molecular.

94

Figura 28. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema de baja presión).

95

Figura 29. Selección de callos transformados mediante biobalística (Sistema de alta presión).

96

H. Análisis moleculares 1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Los materiales sobrevivientes a la selección, que fueron bombardeados mediante ambos sistemas (baja y alta presión), se analizaron mediante PCR, para corroborar la presencia de los transgenes. En la Figura 30 se observa en los carriles 5 y 6 la amplificación de un fragmento de 617 pb correspondiente al gen nptII, en dos de las muestras seleccionadas como posibles candidatas que fueron transformadas con el plásmido pBI426 mediante biobalística (B3 y B7). De manera similar en la Figura 31, se muestra la amplificación de un fragmento de 1500 pb correspondientes al gen gus A en DNA genómico obtenido de las mismas muestras anteriores (B3 y B7). Las 22 muestras (A1-A22) de DNA genómico obtenidas de los callos transformados con alta presión y que sobrevivieron al sistema de selección durante un mes, también fueron analizadas molecularmente y de estos solo se logro la amplificación del fragmento correspondiente al gen gus A en 7 de las candidatas (A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20). La presencia de estos fragmentos de manera preliminar sugiere que los materiales de donde se obtuvo el DNA es transgénico. Y como se menciono anteriormente los porcentajes de selección no fueron correspondientes a los obtenidos mediante el análisis PCR. Todas las muestras anteriores fueron evaluadas posteriormente mediante un análisis tipo Southern blot para confirmar la integración del gen.

2. Análisis tipo Southern blot Para confirmar la integración del transgen producto de la transformación estable en los callos de Agave tequilana, se realizo un análisis tipo Southern blot en las nueve muestras de DNA genómico que dieron positivo al análisis PCR (B3, B7, A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20). Como se puede observar en la Figura 32 que muestra el autoradiograma obtenido en la hibridación con las muestras, en el carril 2 se observa la señal positiva correspondiente a la hibridación de la sonda (gus A) con el plásmido pBI426 utilizado como control positivo, de manera contraria en el carril 3 no se observa señal de hibridación con el DNA de A. tequilana sin transformar. En los carriles 6, 8, 9 y 10 se

97

observan bandas de diferentes tamaños productos de la hibridación de la sonda con el DNA de las muestras A8, A15, A19 y A20, de manera similar en el carril 11 se observan también señales positivas que corresponden a la muestra B7 (Figura 32). Tomando en cuenta los diferentes tamaños de señales observadas en el autoradiograma se puede estimar la integración de al menos de 1 a 4 copias en las diferentes muestras positivas. Los niveles de expresión del transgen en plantas es generalmente impredecible, esto se debe principalmente al número de copias y/o el sitio de integración, sobre todo plantas transgénicas generadas mediante biobalística las cuales presentan patrones de integración que son generalmente complejos debido al propio mecanismo de integración del sistema sobre el cual no se tiene un control directo (Finnegan y Mc Elroy, 1994; Hansen y Wright, 1999). Los resultados obtenidos en este último análisis nos permite demostrar la integración estable de genes en el genoma nuclear de células de callos organogénicos de Agave tequilana, mediante el uso de biobalística. De manera general con los resultados de la hibridación nos permitió corroborar aquellos obtenidos por PCR, ya que de las 9 muestras analizadas que presentaron amplificación del transgen, en 5 de ellas se confirmo su naturaleza transgénica. Tomando en cuenta el número total de callos bombardeados con cada uno de los sistemas y el número que resultaron positivos en el análisis Southern blot, la eficiencia de transformación para el sistema de baja presión es de 0.6 y para alta presión de 1.66. El uso de la técnica de biobalística para la transferencia de genes en Agave tequilana, nos produjo resultados satisfactorios. Lo que nos confirma la universatilidad de esta técnica en cuanto al rango de hospederos susceptibles de transformación, además de permitir el uso de más de un plásmido, ya que se puede lograr la expresión de múltiples genes (Ellis y col., 1993; Hadi y col., 1996). Cabe resaltar que este trabajo es el primero en llevar a cabo la evaluación de diferentes técnicas de transformación genética en Agave tequilana, lo que establece bases para desarrollar futuras investigaciones con la finalidad de modificar genéticamente este cultivo ya sea para transferirle características especificas o bien para su estudio. 98

1 2

3

4

5 6

650 pb 500 pb

617 pb

Figura 30. Amplificación del fragmento de 617 pb del gen npt II en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles 1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) DNA de A. tequilana sin transformar; 4) Control positivo plásmido pB1426; 5 y 6) Muestras de candidatas B3 y B7 respectivamente.

99

1

2

3 4

5

6

1,650 pb 1,000 pb

1500 pb

Figura 31. Amplificación del fragmento de 1500 pb del gen gus A en materiales de A. tequilana regenerados en medio de selección. Carriles 1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control negativo (agua); 3) Control positivo plásmido pB1426; 4 y 5) Muestras de candidatas B3 y B7 respectivamente; 6) DNA de A. tequilana sin transformar.

100

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

5,000 pb 2,000 pb 1,650 pb

1000 pb

Figura 32. Análisis Southern blot con el gen gus A en el DNA de callos desarrollados en medio de selección. Carriles 1) Marcador de peso molecular de 1Kb; 2) Control positivo (plásmido); 3) Control negativo (DNA de agave sin transformar); Carriles 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) A3, A5, A8, A9, A15, A19 y A20; Carriles 11 y 12) B3 y B7.

101

VII. CONCLUSIONES 1) El tejido meristemático de hijuelos de un año de edad de Agave tequilana fue adecuado para establecer un sistema de cultivo in vitro con capacidad de regeneración. 2) El proceso de transferencia a suelo y aclimatación de plantas de A. tequilana regeradas in vitro fue sencillo y con excelente porcentaje de sobrevivencia. 3) El uso de segmentos de hojas de plántulas de A. tequilana enraizadas in vitro y tratadas con 2,4-D, no permite la producción de embriones con capacidad de germinación. 4) El corte longitudinal del meristemo de plántulas de A. tequilana enraizadas in vitro generó explantes con alta producción de tejido no diferenciado (callo) pero con baja capacidad de formación de brotes (CFB). Opuestamente, el corte transversal, generó poca producción de callo pero con alta capacidad de formación de brotes. 5) El uso de altas concentraciones de auxinas permitió cultivar y propagar in vitro callos organogénicos de A. tequilana con capacidad regenerable; sto brindó una fuente de explantes que puede manipularse para transformación genética. 6) Los mayores índices de capacidad de formación de brotes (CFB) en el mantenimiento del estado de callo los presentaron los tratamientos con NAA solo o 2,4-D con BAP. En los experimentos de transformación, esta propiedad los hizo más adecuados como tejido blanco para asegurar la regeneración de brotes transformados vía organogénesis indirecta.

102

7) El medio de regeneración suplementado con 100 mg/l (preselección) y 200 mg/l (segunda selección) del antibiótico kanamicina o 4 mg/l del herbicida fosfinotricina, permitió seleccionar callos de Agave tequilana transformados con los genes de selección nptII y bar respectivamente. De igual manera el uso de una concentración de 8 % v/v del herbicida fosfinotricina en su forma comercial (BASTA) sobre hojas de plantas de agave, permitirá llevar a cabo una doble selección en plantas transformadas con el gen bar. 8) Tomando en cuenta que las plantas de A. tequilana no mostraron susceptibilidad

a

la

infección

natural

de

cepas

silvestres

de

Agrobacterium tumefaciens, se cuenta con un sistema de expresión transitoria para el gen gus A en este cultivo, sentando de esta manera las bases para el desarrollo de protocolos de transformación mediante esta vía. 9) Se obtuvieron niveles aceptables de expresión transitoria del gen gus A en callos de A. tequilana bombardeados mediante sistemas de alta y baja presión. 10) Los niveles de expresión transitoria del gen (gus A) fueron mayores con el promotor de la ubiquitina de maíz (específico de monocotiledóneas) que con el promotor del virus del mosaico de la coliflor (constitutivo). Sin embargo, la integración de los genes sóo se logró en el segundo caso. 11) Mediante el sistema de biobalística, tanto de alta como de baja presión y usando el plásmido pB1426, se logró obtener material seleccionado al cual mediante análisis moleculares de tipo PCR y Southern blot se confirmó la integración de los transgenes en el genoma vegetal. 12) Las eficiencias de transformación obtenidas mediante biobalística utilizando los sistemas de baja y alta presión fueron 0.6 y 1.66 respectivamente. 103

13) Este es el primer reporte de cultivo de callos organogénicos y de evaluación de diferentes métodos de transformación genética en Agave tequilana.

104

VIII. PERSPECTIVAS Los resultados obtenidos en este estudio dejan abierta la posibilidad para trabajos posteriores que permitan la manipulación genética del agave azul y que en un momento dado puedan favorecer y/o proteger su cultivo. Por un lado, manipulando genes que medien su resistencia a bacterias u hongos que son los principales agentes de enfermedades en este cultivo; ya se han reportado con éxito trabajos similares en otros cultivos. Por otro lado, sería muy conveniente acortar su ciclo de desarrollo ya que el periodo de maduración de esta planta es muy largo; esto quizá podría lograrse con la expresión de genes claves en las rutas metabólicas implicadas en el desarrollo como es la ruta de giberelinas la cual se ha manipulado con éxito acortando el tiempo de crecimiento en algunas especies leñosas. Otro punto clave a considerar es la manipulación del contenido de azúcares que puede realizarse mediante la sobreexpresión de enzimas implicadas en esta ruta. Finalmente el agave podria ser una planta atractiva como productor de compuestos de alto valor (e.g. farmacéutico o nutracéutico) debido a su adaptación a condiciones extremas sobre todo de sequia, tomando en cuenta que uno de los principales problemas que atraviesa la humanidad es la falta de agua. Otra de las ventajas que ofrece el uso de sistemas de transformación, es que permitiría llevar a cabo estudios de la fisiología del agave mediante la generación de mutantes por inserción. Finalmente tomando en cuenta que éste es el primer reporte de transformación de una especie del género Agave, tal información podría servir de base para trabajos similares en otras especies importantes del género en nuestro país como son las especies mezcaleras y pulqueras, entre otras. Es importante no dejar de lado la relevancia que estas plantas han tenido desde los inicios de nuestra cultura y todas las bondades que nos ofrecen, para seguir llevando a cabo estudios que permitan conocer más acerca de ellas y aprovecharlas de manera más eficiente y ecológicamente amigable.

105

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X. APÉNDICE Esterilización de partículas de tungsteno (M10) (Finer y col., 1992) Pesar 20 mg de partículas. Lavar con 200 µl de etanol. Agitar en vórtex por 10 min. Sonicar por 1 min. Centrifugar por 2 min a 1420 x g. Desechar sobrenadante. Lavar con 200 µl de agua desionizada estéril. Agitar en vórtex por 1 min. Centrifugar por 2 min a 1420 x g. Desechar sobrenadante. Realizar tres lavados con agua desionizada estéril. Resuspender las partículas en 200 µl de agua desionizada estéril agitando en vórtex por 1 min.

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Preparación de solución de reacción de β- glucuronidasa Preparar soluciones Stock: Concentración Stock NaPO4 (pH 7)*

Concentración final

1M

100 mM

EDTA (pH 7)

0.5 M

10 mM

K4Fe(CN)6 (fotosensible)

0.5 M

0.5 mM

Triton X-100

10%

0.1%

Esterilizar las soluciones en autoclave.

* Para preparar la solución de fosfatos pH 7, mezclar 57.7 ml de Na2HPO4 1 M más 42.3 ml de NaH2PO4 1M. Llevarlo a un litro con agua desionizada. El resultado es una solución 0.1 M de concentración. La solución final se almacena en congelación (-20°C) hasta que se requiera prepararlo con el X-Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico). Para preparar 50 ml de reactivo: Pesar 25 mg de X-Gluc. Disolver con 500 µl de DMSO. Agitar en vórtex. Adicionar al buffer. Cubrir con aluminio y almacenar en congelación.

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