LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PRODUCCIÓN E INDUSTRIA ANIMAL CÁTEDRA DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA DE LA LECHE

DETERMINACIÓN DE G LÚCIDOS Y P ROTEÍNAS GUÍA PRÁCTICA

M ARACAIBO, NOVIEMBRE 2003

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aplicar las técnicas de análisis para la determinación de glúcidos y proteínas en leche y derivados lácteos. 2. Establecer conclusiones acerca de los resultados del análisis físico químico de la leche. 3. Reconocer diferentes causas en que una muestra de leche puede presentar valores alterados de glúcidos y proteínas.

PARTE I. D ETERMINACIÓN DE G LÚCIDOS

Los glúcidos de la leche están representados casi exclusivamente por lactosa, diholósido reductor 4-(beta-D-galacto-piranosil)-D-glucopiranosa, cuya concentración es de 4,8 % en promedio. Estudios cromatográficos han establecidos la presencia de trazas de otros glúcidos como son la glucosa (7,5 mg/100 mL) y la galactosa (2 mg/100 mL) (JenNess-Patton,1959; Webb et al 1974). Algunos productos lácteos son adicionados de cantidades considerables de sacarosa (leche condensada) o de algunos ingredientes ricos en diversos glúcidos (helados). Las normas COVENIN no establecen límites legales para la concentración de glúcidos en leche, y la determinación de este componente no es una prueba de rutina en los laboratorios de control de calidad de las industrias lácteas. Sin embargo, su análisis cobra importancia en trabajos de investigación sobre caracterización de la leche de determinada especie o raza, o en determinadas situaciones donde se sospecha de adulteraciones complejas de la leche, difíciles de determinar con los análisis rutinarios. Valores anormales de lactosa por lo general se asocia a problemas patológicos del animal o adulteración por adición de agua. La determinación de glúcidos en la leche puede hacerse por numerosos métodos, a continuación se señalan los más importantes.

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Métodos Polarimétricos: están fundamentados en la propiedad que tienen los glúcidos en solución, de rotar el plano de vibración de la luz polarizada, en virtud de ser sustancias ópticamente activas, siendo la magnitud de esa rotación proporcional a su concentración bajo condiciones especiales. La lactosa en la leche puede determinarse por ese método, previa precipitación de las proteínas y la materia grasa (AOAC, 1975; MIF, 1964).

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Métodos Químicos: Se basan en las propiedades reductoras de los glúcidos, debidas a la presencia de funciones aldehídicas o cetónicas libres. Aplicable en el método de Munson-Walker que se estudiará en detalle durante la ejecución de la actividad práctica.

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Métodos Colorimétricos: fundamentados en la transformación del glúcido contenido en la leche en un compuesto coloreado soluble por reacción con ciertos reactivos especiales, y en la comparación visual o fotométrica del color que la muestra adquiere con el color de soluciones patrones del glúcido, a concentración conocida, tratada en idénticas condiciones. Dentro de este grupo se incluye el método del ácido pícrico que se puede aplicar también a la determinación simultánea de lactosa y sacarosa (Perry Doan, 1950, MIF, 1964).

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Métodos Espectro-fotométricos en el Infrarrojo: Se basan en la medición de la absorbancia producida por los grupos-OH en la zona infrarroja del espectro. Encuentra aplicación en el IRMA (Grubb Parsons, Inglaterra) y el analizador de la Technicon (USA.).

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Métodos Cromatográficos: aún cuando estos métodos no son convenientes para exámenes de rutinas, constituyen valiosos medios para trabajos de investigación en virtud de su gran sensibilidad y especificidad.

GLÚCIDOS REDUCTORES . M ÉTODO DE M UNSON Y WALKER El método de Munson y Walker (AOAC, 1975) está basado en la precipitación de sulfato cúprico (CuSO4 ) a partir de una solución cupro-alcalina, por la acción reductora de los glúcidos presentes en la muestra sobre la sal cúprica, en presencia de calor, por tiempo determinado y bajo otras condiciones especiales.

La muestra a analizar (25g de leche, helados, etc.) se diluye con agua (hasta 500 mL) y se trata con solución de CuSO4

y

NaOH para precipitar las proteínas y las grasas.

Esta solución se filtra y un volumen medido del filtrado (50 mL) se trata en caliente con reactivo de Fehling por un tiempo estipulado. El precipitado de Cu2 O formado se filtra al vacío a través de un crisol con capa filtrante de asbesto, previamente tarado, se lava con agua caliente, alcohol y éter para eliminar las impurezas y finalmente se deseca a 100ºC, se enfría y se pesa. A partir del peso de Cu2 0 precipitado, calculado por diferencia, se puede determinar la cantidad equivalente de glúcidos reductor presente en la muestra analizada (2,5 g) expresada en términos de un glúcido en particular (lactosa, glucosa, etc.). Las tablas de Munson y Walker (AOAC, 1975) facilitan esta conversión.

Materiales y Aparatos: ü Kitasato de 250 mL; Soporte de goma para crisoles; Estufa de desecación; Balanza analítica; Crisoles de Gooch.

Reactivos: ü Solución de CuSO4 ; Solución alcalina de Tartrato; Solución de NaOH 0,5 N; Etanol; Éter.

Muestra: ü Leche cruda, leche pasterizada, helados

Procedimiento: 1. Pesar 25 g de la muestra preparada (homogénea) y diluir con 400 mL de agua. Transferir a un balón volumétrico de 500 mL. 2. Adicionar 10 mL de la solución de CuS04 y 8,8 mL de Na0H 0,5 N. Mezclar. La solución debe presentarse aún ácida y contener un exceso de sal cúprica en solución. Diluir con agua hasta la marca. Filtrar a través de papel filtro. 3. En un vaso de precipitado de 250 mL preparar 50 mL de reactivo de Fehling (modificación de Soxhlet), mezclando 25 mL de solución de CuS04 y 25 mL de solución alcalina de tartrato.

4. Con pipeta volumétrica transferir 50 mL del filtrado obtenido en (2) al vaso precipitado conteniendo la solución cupro alcalina. Cubrir el vaso con un vidrio de reloj. 5. Calentar la mezcla al mechero regulando la llama de tal manera que empiece a hervir a los 4 minutos y luego calentar por exactamente 2 minutos después de haberse iniciado la ebullición. 6. Filtrar al vacío la solución, en caliente, a través de un crisol de Gooch con capa filtrante de asbesto, adaptado con un soporte de goma a un kitasato. 7. Lavar el precipitado con agua caliente, luego con 10 mL de etanol y finalmente con 10 mL de éter. 8. Desecar el Cu2 O precipitado, en la estufa a 100ºC durante 30 minutos, enfriar en un desecador y pesar hasta peso constante. 9. El peso del Cu2 O equivalente a los glúcidos reductores obtenidos en 2,5 g de la muestra original, puede convertirse en términos de lactosa utilizando las tablas de la AOAC, 1975. 10. Expresar el resultado en gramos por cientos de lactosa, sin olvidar que en el caso de los helados existen cantidades considerables de otros glúcidos reductores aportados por las frutas.

PARTE II. D ETERMINACIÓN D E PROTEÍNAS

El contenido promedio de proteínas totales en la leche es de 3,4%. En esta fracción se incluyen las caseínas, las cuales por si solas representan un 80% del contenido proteico total (2,7 %), el resto está integrado por las proteínas séricas, que incluyen la βlactoglobulina (0,3%), la α-lactoalbúmina (0,15%), una albúmina similar a la seralbúmina de la sangre, inmunoglobulinas y una fracción de proteínas menores, entre las cuales se incluyen la lactotransferrina, la lactolina y la proteína de la membrana del glóbulo graso. Algunas de estas fracciones proteicas son heterogéneas, estando constituidas por varias proteínas muy relacionadas entre sí, pero que son separables mediante el uso de técnicas físicas como la ultracentrifugación ó químicas como el fraccionamiento con solventes y mas recientemente con técnicas mas específicas como la electroforesis, mediante la cual ha sido posible identificar muchas fracciones dentro del grupo de las caseínas, como lo son la α s1 –caseína, la β-caseína y la κ-caseína (Alaís, 1984). Para la determinación cuantitativa de proteínas pueden emplearse diversos métodos, los mismos pueden clasificarse en los siguientes grupos; §

Métodos Químicos: fundamentados en las técnicas químicas convencionales, entre las cuales se incluyen la determinación del nitrógeno total y los métodos gravimétricos y volumétricos tradicionales.

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Métodos Fotométricos: están fundamentados en la medición del color de soluciones, o de la absorbancia en determinadas regiones del espectro de absorción, aquí se incluyen las técnicas colorimétricas, la s de medición en el ultravioleta o en el infrarrojo, las de fijación de colorantes y algunas técnicas turbidimétricas.

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Métodos Refractométricos: están basadas en el incremento en el índice de refracción de aproximadamente 0,001 por cada gramo de proteína en 100 mL de leche, de este modo utilizando un refractómetro de inmersión o uno tipo Abbe, es posible determinar la concentración proteica.

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Electroforesis: las proteínas pueden separarse por sus diferentes velocidades de migración bajo la influencia de un campo eléctrico, esto se debe al hecho de que

las proteínas presentan cargas eléctricas diferentes dependiendo de la composición aminoacídica de las mismas.

A nivel de plantas receptoras de leche se utilizan comúnmente las técnicas para determinación de proteínas basados en los métodos de fijación de colorantes, como lo es el equipo Pro-Milk MK II, (Foss Electric), e incluso en laboratorios grandes puede encontrarse equipos como el Milko Scan, el cual está basado en la espectrofotometría con rayos infrarrojos, el cual es capaz de captar la absorbancia del enlace peptídico de las proteínas, sin embargo, estos métodos rápidos, requieren de una cuantiosa inversión inicial y además deben ser sujetos a un proceso de calibración que requiere de los métodos químicos convencionales, por lo cual son dependientes de estos. Tomando en cuenta que los métodos químicos son los mas precisos que se conocen y que los mismos son requeridos en cualquier laboratorio lácteo, independientemente del equipamiento que este posea, la determinación de proteínas en la leche se efectuará utilizando un método químico basado en la medición del nitrógeno total, en este caso se aplicara la versión micro de la prueba de Kjeldahl, dado que la misma requiere menor cantidad de reactivos, de la misma forma se utilizará otro método químico basado en la titulación de Sorensen para la estimación directa de la concentración de caseínas en leche, la cual consigue especial utilidad para prever el rendimiento quesero a nivel de fincas o plantas procesadoras.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS EN LECHE. M ÉTODO DE KJELDAHL. En ambas versiones de este método, la materia orgánica es digerida con ácido sulfúrico y el nitrógeno obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada, previa destilación en medio alcalino para descomponer la sal y convertirla en amoníaco, contra una solución ácida valorada (HCl). Determinación de nitrógeno total: existen varios métodos fundamentados en el hecho de que las proteínas contienen, aproximadamente un 16% de nitrógeno, por lo tanto, si se determina el porcentaje total del mismo, puede establecerse según un factor de conversión apropiado (100/16 = 6,25), el porcentaje de proteínas totales presentes en la muestra, en el caso específico de la leche, este factor de conversión es de 6,38, debido a que

las proteínas de la leche presentan una menor relación entre proteínas y nitrógeno total (100/15,65). Es importante resaltar el hecho de que los resultados obtenidos por estos métodos son ligeramente elevados, ya que, no todo el nitrógeno contenido en las muestras forman parte de mo léculas proteicas, existiendo entonces otras no proteicas cuyo nitrógeno afecta los resultados (úrea, creatina, creatinina, adenina, guanina, ácido úrico, etc.), no obstante, la determinación química de nitrógeno constituye el fundamento mas empleado, por su precisión, para la determinación de proteínas, entre ellos encontramos los métodos de Kjeldahl (macro y micro), Nessler y el método gasométrico de Dumas.

M ÉTODO M ICRO KJELDAHL La materia orgánica es digerida por la acción del H2 SO4 concentrado, convirtiéndose en CO2 y H2 O; además reduce el nitrógeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el ácido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reducción del material nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2 SO4 es simultáneamente reducido a SO2 , que se comporta como un fuerte reductor. La digestión de la muestra es la parte mas difícil de la determinación, esta se acelera mediante la adición de catalizadores como el mercurio metálico, el óxido rojo de mercurio (HgO), el sulfato cúprico (CuSO4 ), el selenio, el permanganato de potasio (KmO 4 ) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adicionan a la mezcla con la finalidad de aumentar el punto de ebullición y disminuir entonces el tiempo de digestión. Cuando la totalidad de la materia orgánica ha sido digerida, se libera el amoníaco por descomposición del sulfato de amonio con un álcali fuerte (NaOH) y luego se separa por destilación y recolección en un volumen de ácido bórico, como borato de amonio. El amonio se determina por titulación con solución valorada de HCl 0,02 N en presencia de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo y azul de metileno, el cual en medio ácido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.

Resumen de las reacciones químicas en el método Micro-Kjeldahl Digestión

1) Materia Orgánica + H2 SO4

2) (NH4 ) 2 SO4 + NaOH

3) NH3 + H3 BO3

4) NH4 H2 BO3 + HCl

Destilación

Recolección

Titulación

CO2 + H2 O + SO2 + (NH4 ) 2 SO4

Na2 SO4 + 2NH3 + 2 H2 O

NH4 H2 BO3

NH4 Cl + H3 BO3

Se acostumbra a hacer determinaciones en blanco para corregir cualquier impureza en los reactivos. El contenido proteico de la muestra se calcula aplicando la siguiente fórmula:

%N =

V × N × Pe 10 × a

Luego de calculado el porcentaje de nitrógeno, es necesario calcular el porcentaje de proteínas basándose en este valor y utilizando entonces la siguiente ecuación; %P = %N × 6, 38

Donde: V = mL de HCl gastados en la titulación. N = normalidad de la solución de HCl (0,02 N). E = equivalente del nitrógeno (14). a = gramos de muestra. P = proteína total.

Materiales y Aparatos ü Balones Micro Kjeldahl de 30 mL; Digestor eléctrico micro; Microdestilador al vapor por calentamiento eléctrico con reóstato; Microbureta automática; Perlas de vidrio; Vaselina; Balanza analítica; Equipo individual.

Reactivos ü H2 SO4 libre de nitrógeno ü HgO libre de nitrógeno ü Na2 SO4 pulverizado ü Solución de NaOH-Na2 S2 O3 (60 g NaOH + 5 g Na2 S2 O3 * 5H O /100ml) ü Solución dev ácido bórico al 4%. ü Solución indicadora (2 partes de rojo de metilo al 0,2% + 1 parte de azul de metileno al 0,2%, ambas en solución alcohólica). ü HCl 0,02 N.

Procedimiento 1. Medir con pipeta 0,5 mL de la muestra bien homogeneizada, Transferir a un balón de Kjeldahl para microanálisis (30 mL). Agregar 1,9 g de K2 SO4 , 40 mg de HgO y 2,5 mL de H2 SO4. La técnica de la A.O.A.C. recomienda no pesar mas de 100 mg de materia orgánica seca y el empleo de 2 mL de H2 SO4 para 15 mg de muestra, si la misma pesa mas de 15 mg, se debe agregar 0,1 mL de H2 SO4 por cada exceso de 10 mg de muestra. Adicionar además, algunas perlas de vidrio. 2. Calentar la mezcla en el agitador hasta que el digerido adquiera un aspecto claro y limpio. Enfriar a temperatura ambiente. 3. Disolver el contenido del balón en una pequeña cantidad de agua destilada. Colocar una fina película de vaselina alrededor del borde del balón. 4. Para efectuar la destilación, colocar un vaso de precipitado o erlenmeyer de 100 mL de capacidad, conteniendo 5 mL de solución de ácido bórico al 4% y 2-4 gotas del indicador en el aparato, debajo del refrigerante de modo que la punta de este quede sumergida en el líquido. Seguidamente, transferir el digerido, ya

diluido, con agua destilada, a la cámara interna de destilación, haciendo 5 o 6 lavados sucesivos con porciones de 1-2 mL de agua destilada. A continuación adicionar 8-10 mL de la solución de NaOH-Na2 S2 O3 , lavar ligeramente el embudo con agua destilada y cerrar las llaves de vidrio del aparato. Finalmente, encender el generador de vapor y destilar hasta recoger unos 15 mL. 5. Retirar el destilado y diluirlo con agua destilada hasta 50 mL. Titular directamente con HCl 0,02 N, colocado en una microbureta automática. 6. Calcular el porcentaje de nitrógeno y de proteínas totales en la muestra de leche aplicando la fórmula correspondiente y empleando el factor 6,38.

DETERMINACIÓN DE CASEÍNA EN LECHE. M ÉTODO VOLUMÉTRICO DE TITULACIÓN CON FORMOL DE WALKER Este método se fundamenta en la titulación de Sorensen, en la cual los grupos amino de los aminoácidos constituyentes de las proteínas (-NH2 ), son bloqueados con formaldehído neutralizado, para luego titular los grupos carboxilo (-COOH) con una solución de álcalis valorada. Las reacciones involucradas son las siguientes:

H

H

R – C – COO- + 2 H – C = O

NH3

H

R – C – COO- + H2 O HOH2 C –N – CH2 OH

Al aplicar este método a la leche, 9 mL de la muestra se neutralizan con NaOH 0,1 N hasta el punto de viraje del indicador fenolftaleína y luego de le adiciona formaldehído neutralizado. La acidez que se desarrolla por el bloqueo de los grupos básicos, hace virar de nuevo la fenolftaleína a incolora. Seguidamente se re-titula nuevamente con NaOH hasta la reaparición del color rosa permanente. El porcentaje de caseína de la muestra está dado por el producto de multiplicar el número de mL de NaOH 0,1 N gastados en la segunda

titulación (9 mL de muestra) por el factor 1,63, el cual es empírico y depende del cociente caseína/proteínas séricas y de la técnica empleada. Este método se utiliza para estandarizar la leche que va a procesarse para la obtención de quesos, permitiendo estimar el rendimiento y por lo tanto la masa de queso a procesar.

Reactivos: ü NaOH 0,1N. ü Fenolftaleína al 1% en etanol. ü Solución de formaldehído al 40% neutralizada con NaOH hasta el punto de viraje de la fenolftaleína.

Procedimiento: 1. Transferir 9 mL de la muestra preparada a un vaso de precipitado. Adicionar 1 mL de solución alcohólica de fenolftaleína al 1%. 2. Colocar la solución de NaOH 0,1 N en una bureta de 50 mL y adicionarla a la muestra hasta que aparezca el primer color rosado permanente. 3. Agregar 2 mL de solución de formaldehído. 4. Enrasar la bureta a 50 mL o leer la posición del menisco antes de continuar con la titulación. 5. Titular la muestra de leche hasta que aparezca el primer color rosado nuevamente, en ese momento medir exactamente el número de mL de la solución de NaOH 0,1N empleados en esta segunda titulación. 6. Calcular el porcentaje de caseína en la muestra multiplicando el número de mL de NaOH 0,1 N gastados en la segunda titulación por el factor 1,63.