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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 209 187

51 Int. Cl. : C07C 69/017

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C07C 67/14 C07C 67/08 A61K 7/48 A61K 31/215

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 98939682 .5

86 Fecha de presentación: 15.07.1998

87 Número de publicación de la solicitud: 0998445

87 Fecha de publicación de la solicitud: 10.05.2000

54 Título: Compuestos a base de derivados de resveratrol.

30 Prioridad: 15.07.1997 FR 97 08964

73 Titular/es: Caudalie

9, Villa Aublet 75017 París, FR

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.06.2004

72 Inventor/es: Vercauteren, Joseph;

Castagnino, Chantal y Delaunay, Jean-Claude

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Ruo, Alessandro

ES 2 209 187 T3

16.06.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 209 187 T3 DESCRIPCIÓN Compuestos a base de derivados de resveratrol. 5

La invención se refiere a compuestos a base de derivados de resveratrol que presentan principalmente una gran estabilidad al aire y a la luz. El resveratrol (3, 5, 4’4-trihidroxiestilbeno) existe bajo la forma cis o trans y se presenta en forma de monómero o como oligómero que contiene generalmente de 2 a 4 porciones monómeras.

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En lo que sigue de la descripción y en las reivindicaciones se utilizará el término “ORs” para designar tanto el monómero como los oligómeros. 15

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El estudio de las propiedades del resveratrol ha permitido poner en evidencia actividades biológicas de interés. Se han comunicado así efectos cardiovasculares y anticancerígenos (M. Jang y otros, Science 275, 218-220 (1997)). La utilización práctica de los ORs se hace difícil por el dificultoso acceso, selectivamente, a esos extractos, a partir de las fuentes vegetales que los contienen. También lo es por su inestabilidad, debida a los grupos fenólicos que contienen, y su carácter hidrosoluble, que plantea problemas de miscibilidad con numerosos excipientes utilizados generalmente en terapéutica, cosmética y en el campo alimentario, que presentan por el contrario propiedades liposolubles. Para resolver estos problemas, los inventores han puesto a punto métodos extractivos que conducen a extractos enriquecidos en ORs y han utilizado agrupamientos protectores de las funciones fenólicas, que permiten a la vez conferir una estabilidad satisfactoria al resveratrol monómero y oligómero y hacerles liposolubles, presentando esos agrupamientos la ventaja de ser eliminables in vivo. Por lo tanto, la invención tiene por objeto proporcionar compuestos a base de derivados de monómeros y/o oligómeros de resveratrol cuyos agrupamientos protectores pueden ser fácilmente eliminados para liberar el principio activo cuando se desee. Tiene por objeto también proporcionar un proceso de obtención de esos compuestos, así como de los monómeros y/o oligómeros de partida.

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La invención tiene además por objeto las aplicaciones de esos compuestos en diversos campos, en especial en terapéutica, en cosmética y en el sector agroalimentario. Los compuestos de la invención están caracterizados porque son esencialmente a base de ésteres de resveratrol monómeros y/u oligómeros, teniendo los monómeros por lo menos un grupo éster de fórmula -O-CO-A, y estando formados los oligómeros por porciones monómeras unidas por enlaces carbono-carbono, o éter, y/o por monómeros reticulados por grupos −O − CO − R − CO − O−

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- representando A un radical alquilo de por lo menos dos átomos de carbono, lineal o ramificado, saturado o insaturado, un radical arilo, salvo el radical fenilo en el caso de un compuesto de resveratrol monómero, aralquilo o aralquileno (S. Nonomura y otros. Chem. Abstr., vol. 60, N◦ 4 extracto N◦ 4240c, 1964), y 50

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- representando R un radical alquileno de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 ciclos y/o un radical heterocíclico, y los diastereoisómeros de esas porciones. Estos compuestos pueden conservarse durante un largo período sin alteración, principalmente durante por lo menos 2 años en condiciones normales de conservación (temperatura de 10 a 22◦ C, en un envase que les proteja de la luz, higrometría 40-50%). En un modo de realización de la invención los compuestos son a base de monómeros y/u oligómeros de resveratrol que tienen por lo menos un grupo -O-CO-A.

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En un grupo preferido A representa un radical de ácido graso saturado o insaturado. En el caso de insaturación, los dobles enlaces son con ventaja cis, lo que corresponde al caso más frecuente en los productos naturales. Con productos obtenidos más especialmente por síntesis o semisíntesis, los enlaces son trans.

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Entre los ácidos grasos que convienen para la aplicación de la invención, se citarán los ácidos butírico C4:O; valérico C5:O; hexanoico C6:O; sórbico, C6:2(n-2); láurico C12:O; palmítico C16:O, esteárico C18:0, oleico, C18:1(n-9); linoleico, C18:2 (n-6); linolénico, C18:3(n-6); α linolénico, C18:3(n-3), araquidónico, C20:4(n-3); eicosapentaenoico C20:5(n-3); y docosahexaenoico, C22:6(n-3). 2

ES 2 209 187 T3 Los ácidos grasos en C16 y más son especialmente apropiados para las aplicaciones de cosmética. Estos ácidos grasos se extraen, por ejemplo, de microalgas. 5

En otro grupo preferido, A representa un grupo arilo, salvo, como se ha indicado antes, el radical fenilo en el caso de un compuesto de resveratrol monómero. En otro grupo más, A representa un grupo aralquilo o aralquileno, siendo el grupo alquilo o alquilen más especialmente en C1 a C8, principalmente en C1 a C4. Se citará en especial el grupo bencilo o estirilo.

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En otro modo de realización de la invención, los compuestos son a base de monómeros y/o de oligómeros de resveratrol reticulados por medio de puentes -O-CO-R-CO-O-. En esta estructura R representa un radical alquilen de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 ciclos y/o un radical heterocíclico.

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Ésteres reticulados ventajosos comprenden, como sustituto de R, un radical de un diácido elegido entre los ácidos málico, malónico, glutárico, ftálico, de un cloruro de diácidos, como el dicloruro de tereftalohilo, el dicloruro de sucinilo, el dicloruro de sebacohilo y el dicloruro de adipohilo, un anhídrido o también un isocianato como el diisocianato de tolueno o de hexametileno. De una manera ventajosa, estos compuestos reticulados forman microcápsulas o masas esponjosas. La invención tiene también por objeto un proceso de obtención de los ésteres definidos anteriormente.

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Este proceso está caracterizado porque comprende la reacción de monómeros y/o de oligómeros de resveratrol con, como agentes de acilación, compuestos de fórmula A-CO-O-A1, ó A1-O-CO-R-CO-O-A1, donde - A representa un radical alquilo de por lo menos dos átomos de carbono, lineal o ramificado, saturado o insaturado, un radical arilo, aralquilo o aralquileno, - R representa un radical alquilen de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 cidos y/o un radical heterociclico,

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- A1 representa un átomo de hidrógeno, de halógeno, un radical alcohilo en C1 a C8, o arilo, un grupo -CO-A, o isocianato, no pudiendo representar A y Al un radical fenilo ni un átomo de doro en A-CO-O-A1. Las reacciones de esterificación con ácidos se hacen generalmente a temperatura ambiente, en presencia de un agente de activación. Se citará, por ejemplo, la dicidohexilcarbodiimida (DCC) y el terbutildoroformiato.

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Las esterificaciones con los derivados de ácido se efectúan ventajosamente según la reacción de Schotten Baumann, en medio acuoso alcalino. Estas reacciones conducen a la obtención de compuestos esterificados en forma esponjosa que se aíslan de la mezcla de la reacción y que se purifican para aplicaciones ulteriores previstas. Cuando se utilizan diácidos o sus derivados, se forma una emulsión de tipo (E/H) por dispersión, con agitación, de una solución acuosa alcalina de los monómeros y/u oligómeros de resveratrol en un disolvente orgánico no miscible con agua, después se añade el agente de reticulación A1-O-CO-R-CO-O-A1 en solución en dicho disolvente orgánico no miscible, o, como variante, se forma una emulsión del tipo (H/E) por dispersión, con agitación, de una solución orgánica que contiene dicho agente de reticulación en una solución acuosa de monómeros y/u oligómeros de resveratrol, a la que se añade un agente alcalino en solución acuosa para ajustar el pH de la fase dispersante a 9-11,5 aproximadamente. Se utilizan los agentes emulsionantes a razón del 2 al 15% en peso aproximadamente, con relación al peso de la dispersión, en especial del 3 al 8% aproximadamente. Los agentes apropiados corresponden a los habitualmente utilizados, como los comercializados con la marca Span® (alcoholes hexílicos esterificados) o Tween® (ésteres de ácidos grasos y de sorbitol con óxido de etileno).

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Según las cantidades relativas de las fases acuosas y orgánicas y del emulsionante, se forma una emulsión del tipo H/E o E/H. Se realiza la agitación de manera que se homogeneice rápidamente las soluciones acuosas y orgánicas, por ejemplo utilizando una barra magnética a 500-1000 vueltas/minuto o una hélice a 800-2000 vueltas/minuto. La duración de esta etapa es generalmente del orden de 30 minutos. La reticulación se produce en la superficie de contacto de las gotitas de la emulsión. 3

ES 2 209 187 T3 Se recuperan los ésteres reticulados formados, por ejemplo, por centrifugación. Los productos lavados y secados se presentan en forma de polvo fluido. 5

Los ésteres formados pueden recuperarse también por dilución de la mezcla de reacción con ayuda de uno o varios disolventes, decantación y/o centrifugación, y lavado. La observación al microscopio muestra que las gotitas se presentan en forma de partículas sensiblemente esféricas, de tamaño homogéneo.

10

Su diámetro puede variar de 25 a 300 µm aproximadamente según las condiciones utilizadas para su obtención. En el caso de microcápsulas que contienen principios activos, se añaden estos últimos preferentemente en la fase acuosa u orgánica en la que son solubles.

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Los monómeros y/u oligómeros de resveratrol, ORs en forma abreviada, utilizados en la etapa de esterificación pueden obtenerse a partir de diversas fuentes vegetales. Se citarán las vitáceas, umbelíferas, mirtáceas, dipterocarpáceas, ciperáceas, gnetáceas, leguminosas, gramíneas, seríceas, hemodoráceas, musáceas, poligonáceas, pináceas, cupresáceas, cesalpiniáceas, poáceas y solanáceas.

20

De manera ventajosa se utilizan monómeros y/u oligómeros de resveratrol como los obtenidos por extracción, con ayuda de agua y/o un disolvente orgánico, a partir de escobajos de la vid. El procedimiento de obtención de los monómeros y de los oligómeros de resveratrol, que es utilizado también por la invención, comprende las etapas de:

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- extracción por adición, a escobajos de vid, de agua y/o de disolvente(s) orgánico(s), sometiendo el conjunto a un tratamiento tal como maceración/lixiviación, ultrasonidos o microondas, 30

- deslipidación antes o después de la etapa de extracción con ayuda de un disolvente de tipo éter de petróleo, hexano o cloroformo, - extracción suplementaria del extracto recuperado por un disolvente orgánico del tipo acetato de etilo o éter etílico,

35

- concentración del extracto bruto obtenido y, sí se desea, su liofilización. El porcentaje de resveratrol y de oligómeros en el extracto bruto depende estrechamente de la cepa utilizada y, para una cepa dada, del método de extracción y de los disolventes utilizados.

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45

Según una disposición particularmente interesante, teniendo en cuenta el enriquecimiento en ORs que permite conseguir, se somete el extracto bruto a una etapa de purificación por cromatografía. Una técnica especialmente satisfactoria corresponde a la cromatografía de partición centrífuga (CPC). Esta técnica es descrita principalmente por A.P. FOUCAULT, Ed. Centrifugal Partition Chromatography. Chromatographic Science Series, Marcel Dekker Inc., 1995, 68 o W.D. CONWAY, Ed. Countercurrent Chromatography apparatus theory and applications, VCH Publishers Inc., 1990. La CPC está basada en la partición de los solutos entre dos fases líquidas no miscibles preparadas por mezcla de dos o varios disolventes o soluciones. Una de las dos fases se mantiene estacionaria mediante una fuerza centrífuga.

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Los disolventes, sus proporciones y el caudal elegidos dependen estrechamente a la vez de la estabilidad de la fase estacionaria en el seno de la columna de CPC y de la presión real. Se han obtenido resultados con buen rendimiento con la mezcla hexano/acetato de etilo/etanol/agua con, por ejemplo, proporciones respectivas de 6/48/11/42 ó 4/5/3/3.

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No obstante, es posible también no utilizar hexano o sustituir por lo menos uno de dichos disolventes por un disolvente equivalente con la condición de modificar sus proporciones. 60

Así, el hexano puede ser sustituido por carburos saturados, incluso insaturados, apolares y no miscibles con el agua, como por ejemplo el heptano, el ciclohexano, o también disolventes clorados como el cloroformo. Igualmente, se podrá utilizar en lugar del acetato de etilo, disolventes carbonilados o carboxilados, como la acetona, la metiletilcetona, la metilisobutilcetona, la metilterbutilcetona.

65

También podrán utilizarse otros alcoholes distintos al etanol en la mezcla antes definida, como por ejemplo el metanol, el n-propanol, el propan-2-ol, el n-butanol, el butan-2-ol. El agua puede ser reemplazada, por lo menos en parte, incluso en su totalidad, por acetonitrilo. 4

ES 2 209 187 T3 El experto en la materia elegirá así el disolvente o los disolventes más apropiados según la naturaleza del extracto purificado sometido a la CPC. 5

10

Gracias a la invención, se dispone así de extractos brutos y de fracciones enriquecidas que tienen, como componentes mayoritarios, resveratrol y/u oligómeros de este último, como lo muestran los cromatogramas a los que se hace referencia en los ejemplos. Estos diferentes extractos, tanto brutos como enriquecidos, entran también como tales en el marco de la invención. La utilización de etapas de separaciones suplementarias de CPC permite aislar de esos extractos enriquecidos el resveratrol monómero por una parte y el resveratrol en forma de oligómeros por otra. Estas separaciones pueden efectuarse en las fracciones enriquecidas a partir de un extracto bruto o en el propio extracto bruto utilizando mezclas de disolventes apropiados según las proporciones que convengan para la separación buscada.

15

La obtención de los ORs conforme a la invención permite disponer de productos de gran interés en numerosos campos.

20

La presencia de los grupos ésteres introducidos confiere una estabilidad al aire y a la luz a las estructuras de resveratrol. De manera ventajosa, estos grupos son eliminables únicamente cuando se ponen en las condiciones en que esos compuestos deben actuar, lo que permite explotar las propiedades, en especial antirradicales y antioxidantes del resveratrol, en condiciones óptimas. La inocuidad de los derivados de la invención les hace especialmente interesantes para todas las aplicaciones que implican una administración o un uso por el hombre o los animales.

25

Por lo tanto, la invención tiene por objeto la utilización de los compuestos de ésteres antes definidos para la fabricación de medicamentos. Esos medicamentos pueden contener también otros principios activos, en particular productos de efecto protector frente a reacciones de oxidación. Se citará, por ejemplo, el β caroteno o la vitamina E.

30

Los preparados farmacéuticos fabricados según la invención son utilizables principalmente en tratamientos antitumorales o vasoprotectores. 35

Como formas de administración, se ha recurrido a formas apropiadas para la vía oral, como píldoras, tabletas, cápsulas de gelatina o gotas. Estos preparados contienen con ventaja aproximadamente de 50 a 200 mg de equivalente de composición por unidad de toma, preferentemente de 100 a 150 mg aproximadamente. Se hacen otras formas galénicas para una administración por vía cutánea, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa, en especial de geles, soluciones y otros.

40

Los compuestos de la invención son utilizables también con ventaja para la elaboración de preparados cosméticos.

45

Estos preparados están caracterizados porque contienen también por lo menos un compuesto de la invención en una proporción que permite disponer de una cantidad eficaz de ORs y que comprende en asociación los excipientes que permiten su aplicación. Las propiedades liposolubles conferidas a estos preparados por la presencia de los grupos ésteres permiten incorporarlos fácilmente a los productos utilizados clásicamente en cosmética.

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Los preparados de la invención se presentan en forma de crema, pomada, emulsión, gel, liposomas, loción. Contienen aproximadamente del 0,2 al 5% de producto activo. Los compuestos de la invención son utilizables también en el campo de la alimentación. Las propiedades antirradicales de los ORs que contienen aseguran una mejor conservación de los alimentos.

55

Son utilizables como aditivos para diversos productos tales como bebidas y productos lácteos. Se puede utilizarlos también en forma de pastas, granulados o geles en diversos dulces. 60

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En diferentes aplicaciones los compuestos reticulados de la invención son utilizables además como vectores de principios activos. Éstos son retenidos en la masa esponjosa de los compuestos reticulados o están contenidos en las microcápsulas. Las microcápsulas pueden contener productos activos en terapéutica humana o animal, o utilizables en el campo de la alimentación, en especial en dietética. La encapsulación permite liberarse del carácter liposoluble o hidrosoluble del producto y de diversos inconvenientes 5

ES 2 209 187 T3 que puede presentar para las aplicaciones previstas. Facilita también el acceso a los sitios de actuación y permite administrar principios activos que hasta ahora suscitaban problemas a este respecto y/o protegerlos provisionalmente hasta su llegada al sitio de actuación. 5

La invención se ilustrará a continuación mediante ejemplos de preparación de ésteres de ORs y de utilización para la elaboración de medicamentos y de preparados cosméticos. En estos ejemplos se hace referencia a las figuras 1 a 5 que representan:

10

- las figuras 1 a 4 los perfiles de cromatografía líquida de alta eficacia (CLAE) de extractos de ORs según la invención, - la figura 5 el espectro de RMN 1 H del perhexanoato de resveratrol.

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Ejemplo 1 Extracción de ORs a partir de escobajos de vid Se utilizan los protocolos siguientes:

20

- Extracción por tratamiento con ultrasonidos Se recogen los escobajos de vid correspondientes a una cepa dada y, después de haberlos lavado y secado, se les somete a una etapa de trituración. 25

Se añade a 100 g de escobajos triturados de 400 a 1000 ml, por ejemplo 800 ml, de agua destilada y/o de uno o varios disolventes orgánicos. 30

Se utiliza, por ejemplo: agua; agua/acetona: 3/2 ó 1/1; metanol, etanol; agua/etanol: 1/1; agua/acetato de etilo: 1/1; etanol/acetona: 1/1; agua/etanol/acetona: 2/1/1, 1/2/1 ó 1/1/2. Se somete el conjunto a los ultrasonidos, aplicándolos en general durante aproximadamente de 30 minutos a 3 horas.

35

Se filtra a continuación la mezcla y después se la concentra. Se efectúa una deslipidación antes o después de esta etapa de extracción. A este efecto, se extrae con un disolvente como éter de petróleo, hexano o cloroformo.

40

Este extracto es sometido a su vez a otra etapa de extracción por lo menos. Se utiliza acetato de etilo o éter etílico a razón de 3 a 5 veces 100 ml. A continuación el producto obtenido es concentrado, recobrado por el agua, liofilizado y conservado en forma de polvo. Se dispone así de un extracto bruto de ORs.

45

Se verifica la actividad antirradical y antioxidante de los extractos obtenidos con fines de selección de las condiciones operacionales. 50

55

En la figura 1 se ha representado el cromatograma en CLAE de un extracto de acetato de etilo obtenido, después de un tratamiento de 2 h con ultrasonidos, de 100 g de escobajos triturados (cepa Merlot) en 800 ml de agua/acetona: 3/2 y deslipidación por éter de petróleo. La elución ha sido realizada con A: H2 O/TFA; 100/0,0025 (TFA = ácido trifluoracético) y B: MeOH/TFA 100/0,0025 según el gradiente. min.

A

B

0

100

0

120

0

100

60

- Extracción con tratamiento con microondas (800 a 900 w máximo)

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Como variante, se actúa como se ha indicado antes, pero se sustituye el tratamiento con ultrasonidos por el de microondas.

6

ES 2 209 187 T3 - Extracción por maceración-lixiviación Se procede a una deslipidación, en las condiciones antes dadas, antes o después de la etapa de maceración-lixiviación. 5

En una columna abierta se introducen 100 g de escobajos de vid triturados, preparados como se ha indicado antes, y luego aproximadamente 1 a 2 l de disolvente. 10

Se utilizan mezclas de agua destilada/disolventes orgánicos como por ejemplo la mezcla agua/acetona: 3/2. Se deja la mezcla de escobajos triturados/disolvente durante 10 a 20 h y luego se recupera el extracto que se concentra hasta 100 ml en el caso de un extracto que contenga por lo menos 100 ml de agua, o en seco si se trata de un extracto que contenga exclusivamente uno o varios disolventes orgánicos, siendo recobrado el residuo por 100 ml de agua. Se efectúa una deslipidación antes o después de esta etapa de extracción como se ha descrito anteriormente.

15

El extracto obtenido sufre a continuación una etapa de extracción con acetato de etilo o éter etílico como se ha indicado anteriormente para la preparación de extractos por ultrasonidos o microondas. 20

Los rendimientos en extractos brutos preparados son en general superiores al 0,5% del peso en seco de los escobajos de partida, y pueden alcanzar el 1 al 1,5% según las condiciones de extracción utilizadas y el origen de los escobajos. Ejemplo 2

25

Obtención de fracciones enriquecidas en ORs por CPC La figura 1 muestra el cromatograma de CLAE de un extracto bruto, tal como se obtuvo según el ejemplo 1, que contiene mayoritariamente resveratrol y catequina en proporciones prácticamente equivalentes.

30

Se inyecta en CPC 1 g de este extracto, disuelto en 4 ml de fase estacionaria. Se utiliza un aparato SANKI modelo LLB-M fabricado y comercializado por la empresa Sanki Engineering (Kyoto, Japón).

35

Principales características de este aparato - Velocidad de giro: 0-2000 vueltas/minuto - Capacidad de la columna: 230 ml

40

- Presión máxima: 60 x 105 Pa. - Material del rotor: polifenilenosutfuro (PPS) 45

- Disco de partición: serie de discos - Célula de partición: 2136 - Longitud de las células: 15 mm.

50

Las fases estacionaria y móvil son respectivamente las fases inferior y superior recuperadas después de agitación y decantación de la mezcla de hexano/acetato de etilo/etanol/agua: 6/48/11/42, dada la utilización de la técnica en modo ascendente en este ejemplo. 55

La velocidad de giro se fija en 1100 vueltas/minuto, el caudal en 2 ml/minuto y la presión es de 34 x 105 Pa. En estas condiciones, la fracción enriquecida en resveratrol y oligómeros es recogida rápidamente, ya que los ORs son eluídos en los 30 primeros minutos. La figura 2 representa el cromatograma de CLAE registrado a partir de esta fracción enriquecida en ORs. Se recuperan así 120 mg de ORs, es decir un enriquecimiento del orden de 8.

60

Ejemplo 3 Obtención de resveratrol monómero por una parte y de las formas oligómeras por otra por CPC 65

Se separan en modo ascendente los 120 mg de ORs recuperados en el ejemplo 2, disueltos en 2 ml de fase estacionaria. La fase estacionaria constituye la fase inferior de la mezcla hexano/acetato de etiloletanol/agua 4/5/3/3 y la fase móvil la fase superior de esa misma mezcla. La velocidad de giro es de 1100 vueltas/minuto, el caudal de 2 ml/minuto y la presión de 44 x 105 Pa. En estas condiciones, la fracción enriquecida en resveratrol es recogida después de 150 7

ES 2 209 187 T3 minutos de elución y la enriquecida en oligómeros de resveratrol después de 240 minutos.

5

Los enriquecimientos de las fracciones de resveratrol monómero por un lado (7 mg) y de oligómeros por otro (20,5 mg) son entonces respectivamente del orden de 17 y 6. Se deduce de ello un nuevo enriquecimiento en ORs del orden de 4,5. El enriquecimiento con relación al extracto bruto de partida es así de aproximadamente 36.

10

El análisis en CLAE muestra un porcentaje de resveratrol del orden del 81% (tR = 55,6 min.), es decir 5,7 mg de resveratrol puro, así como los porcentajes en oligómeros de resveratrol del orden de 31% (tR = 48,5 min.) y 53% (tR = 63,8 min.), es decir 17,2 mg de oligómeros purificados. Ejemplo 4

15

20

Aplicando directamente el método descrito en el ejemplo 3 (duración de 4 h) al extracto bruto de partida utilizado en el ejemplo 2, se consigue purificar el resveratrol (8 mg) y los oligómeros de resveratrol (30 mg) de la misma forma. Los resultados obtenidos de los cromatogramas de CLAE son satisfactorios. En efecto, se obtienen dos fracciones, una muy enriquecida en resveratrol (tR = 56,1 min.) con un porcentaje de 74,0, la otra muy enriquecida en oligómeros de resveratrol (tR = 48,9 min. y tR = 64,2 min.) con un porcentaje de 65,6. Ejemplo 5

25

Variante de obtención de fracciones enriquecidas en ORs por CPC como las obtenidas en el ejemplo 1, a partir de un extracto bruto que contiene mayoritariamente resveratrol. La figura 3 representa el cromatograma de CLAE del extracto bruto de ORs antes de su estudio por CPC. Las condiciones de separación son idénticas a las descritas en el ejemplo 2.

30

A partir de 1 g de extracto bruto de partida, se recogen 200 mg de ORs enriquecidos al cabo de 40 minutos, es decir un factor de enriquecimiento igual a 5. El análisis en CLAE de la fracción enriquecida correspondiente muestra un porcentaje de resveratrol. 35

(tR = 54,6 min.) del 88%, es decir 176 mg de resveratrol puro (factor de enriquecimiento del orden de 6). Ejemplo 6 40

El fraccionamiento del mismo extracto bruto de partida (ejemplo 5), según el protocolo experimental utilizado en el ejemplo 3 anterior, permite obtener un mejor enriquecimiento en resveratrol puro. En efecto, el cromatograma de CLAE (figura 4) muestra una pureza del resveratrol así obtenido del 99% (tR = 54,4 min.).

45

Ejemplo 7 Síntesis de perhexanoato de resveratrol 50

Se añade a 15 mg de resveratrol (6,58 x 10−5 moles) en solución en 2,5 ml de piridina, en agitación y gota a gota, 0,09 ml de cloruro de hexanohilo (88 mg; 6,58 x 10−4 moles; 10 eq.). Se agita el medio de reacción a temperatura ambiente, al abrigo del aire (bajo un ligero flujo de nitrógeno) y de la luz, durante 12 horas.

55

Después de concentrar a presión reducida, el residuo es recobrado por 20 ml de cloroformo. A continuación se lava la fase orgánica con dos veces 50 ml de una solución 0,1 M de HCI, dos veces 50 ml de agua destilada, dos veces 50 ml de una solución de Na2 CO3 y luego dos veces 50 ml de agua destilada. 60

Se seca esta fase sobre Na2 SO4 anhidro, se filtra sobre vidrio fritado n◦ 4, se concentra con el evaporador rotativo y se purifica por cromatografía preparadora en capa gruesa de sílice. La figura 5 representa el espectro de RMN 1 H. 65

Los análisis de los espectros de IR, RMN 1 H y 13 C confirman la obtención del éster buscado.

8

ES 2 209 187 T3 Ejemplo 8 Síntesis del perpalmitato de ORs 5

10

Se disuelve un extracto liofilizado de ORs (30 mg; 1,32 x 10−4 moles) preparado según el ejemplo 1 en 5 ml de piridina. Se añade a esta solución gota a gota 0,40 ml de cloruro de palmitohilo (0,36 g; 1,32 x 10−3 moles; 10 eq.-resveratrol). La mezcla en reacción se deja con agitación a 70◦ C bajo un ligero flujo de nitrógeno y al abrigo de la luz, durante 3 horas. Después de concentrar a presión reducida, se trata el residuo como en el ejemplo 7. El producto así obtenido se comprueba por espectrometría.

15

Ejemplo 9 Síntesis del perhexanoato de ORs

20

Se aplica el protocolo descrito en el ejemplo 8 utilizando 200 mg de extracto liofilizado de ORs (8,77 x 10−4 moles) y 1,23 ml de cloruro de hexanohilo (1,18 g; 8,77 x 10−3 moles; 10 eq. -resveratrol). Un análisis por espectrometría de IR y RMN 1 H confirma la obtención del éster buscado. Ejemplo 10

25

Síntesis del perbutirato de ORs Con fuerte agitación se añaden 25 ml de diclorometano a 250 mg de extracto liofilizado de ORs preparado según el ejemplo 1 (1,10 x 10−3 moles), disueltos en 5 ml de agua destilada. 30

Después se añaden 25 ml de una solución acuosa tampón de fosfato ácido de sodio al 5% (pH # 10), 37 mg de sulfato ácido de tetra-butilamonio (1,10 x 10−4 moles; 1/10 eq.-resveratrol) y 0,57 ml de cloruro de butirilo (0,58 g; 5,48 x 10−3 moles; 5 eq.-resveratrol). 35

La mezcla en reacción se deja 45 minutos con fuerte agitación. Al final de la reacción, la fase orgánica se recupera y se lava con dos veces 15 ml de agua destilada, y luego se evapora a presión reducida y se purifica por cromatografía preparadora en capa gruesa de sílice.

40

El producto así obtenido es comprobado por espectrometría. Ejemplo 11 Síntesis del perlaurato de ORs

45

Se añaden a un extracto liofilizado de ORs (250 mg; 1,10 x 10−3 moles), preparado según el ejemplo 1, 1,32 g de ácido láurico (6,58 x 10−3 moles; 6 eq.-resveratrol) en solución en 20 ml de 1,2-dicloroetano. 50

Después se disuelven 1,36 g de diciclocarbodiimida (DCC) (6,58 x 10−3 moles; 6 eq.-resveratrol) en 5 ml de 1,2dicloroetano y se añaden así a la solución antes preparada. Se añade a continuación 97 mg de 4-pirrolidinopirina (6,58 x 10−4 moles; 6/10 eq.-resveratrol) disueltos en 1 ml de 1,2-dicloroetano, La mezcla en reacción se deja con agitación durante 2 horas, a temperatura ambiente, bajo un ligero flujo de nitrógeno y al abrigo de la luz.

55

A continuación la fase orgánica se filtra y se concentra a presión reducida.

60

El residuo es recobrado entonces por 25 ml de hexano. Se filtra la solución hexánica y después se lava con dos veces 50 ml de una solución de sosa 0,1 M, y después con dos veces 50 ml de agua destilada. Se concentra entonces la fase orgánica con el evaporador rotativo. El producto así obtenido es analizado por espectrometría. Ejemplo 12

65

Síntesis del persorbato de ORs Se aplica el protocolo descrito en el ejemplo 11 utilizando 250 mg de extracto liofilizado de ORs (1,10 x 10−3 9

ES 2 209 187 T3 moles) y 0,74 g de ácido sórbico (6,58 x 10−3 moles; 6 eq.-resveratrol) y cloroformo como disolvente orgánico. Ejemplo 13 5

Preparación de microcápsulas de ORs reticuladas por el cloruro de tereftalohilo Se disuelve un extracto liofilizado de ORs (50 mg; 2,19 x 10−4 moles), preparado según el ejemplo 1, en 5 ml de una solución de fosfato ácido de sodio al 5% (pH # 10).

10

Se emulsiona esta solución en 20 ml de una solución clorofórmica al 5% de trioleato de sorbitano (Span 85®) agitando a 3000 vueltas/minuto durante 5 minutos. A continuación se añade a la emulsión el agente reticulante, el cloruro de tereftalohilo (89 mg; 4,39 x 10−4 moles; 2 eq.-resveratrol), en solución en 15 ml de cloroformo.

15

Se mantiene la agitación durante 30 minutos. Al final de la reacción, se centrifuga la mezcla de la reacción. Se recupera la superficie de separación sólida, se vuelve a poner en suspensión en 30 ml de cloroformo y se centrifuga de nuevo. 20

Se repite la operación una vez con cloroformo y dos veces con agua destilada. Se recupera el residuo de centrifugación y se vuelve a poner en suspensión en 5 ml de agua destilada. Las microcápsulas así preparadas se secan por liofilización y se comprueban por microscopía óptica. 25

Ejemplo 14 Preparación de microcápsulas de ORs reticuladas por el cloruro de sebacohilo

30

Se aplica el protocolo descrito en el ejemplo 13 utilizando 50 mg de extracto liofilizado de ORs (2,19 x 104 moles) y 0,09 ml de cloruro de sebacohilo (0,10 g; 4,38 x 10−4 moles; 2 eq.-resveratrol). Ejemplo 15 Preparación de microcápsulas de ORs reticuladas por el cloruro de adipohilo

35

Se aplica el protocolo descrito en el ejemplo 13 utilizando 50 mg de extracto liofilizado de ORs (2,19 x 10−4 moles) y 0,06 ml de cloruro de adipohilo (80 mg; 4,38 x 10−4 moles; 2 eq.-resveratrol). Ejemplo 16 40

Preparación cosmética antisolar Se hace una emulsión antisolar con propiedades contra el envejecimiento cutáneo mezclando un filtro solar con un éster preparado según la invención y excipientes para crema. 45

Ejemplo de formulación

50

55

Neo Heliopan E 1000® (isopropilmetoxicinamato y etildiisopropilcinamato Perlaurato de ORs según el ejemplo 6 Excipientes para crema E/H

3% 3% resto

Composición de los excipientes - Propileno glicol dicaprilatoldicarato + estearalconio hectorito + propileno carbonato (Miglyol 840 gel B®) 20,0%

60

- Bis-digliceril caprilato/capratolisoestearato/hidroxiestearato adipato (Softisan 649®) 5,0% - Isostearil digliceril succinato (Imwitor) 780K® 5,0%

65

- Aceite de parafina 8,0% - Parafina sólida 3,0%

10

ES 2 209 187 T3 - Sulfato de magnesio 2,0% - Agua resto hasta el 100% 5

Ejemplo 17 Preparación de cápsulas de gelatina para utilización en dietética Se mezcla perlaurato de ORs preparado según el ejemplo 11 con selenio y vitamina E;

10

- Perlaurato de ORs: 85 mg (correspondientes a 25 mg de ORs), - Acetato de DL-α-tocoferol: 40 mg, 15

- Selenio: 50 mg Ejemplo 18 Preparación de medicamento venotónico y vasculoprotector

20

Se preparan cápsulas de gelatina a partir de 230 mg de perhexanoato de ORs (correspondientes a 100 mg de ORs), preparados según el ejemplo 9, y de excipientes para una envoltura gastrorresistente, como el acetoftalato de celulosa. Ejemplo 19 25

Preparación de un gel bucal utilizado en radioterapia Se formula la composición siguiente: 30

35

-

Gel de Carbopol® 934 P al 2% Para hidroxibenzoato de metilo sodado Para hidroxibenzoato de propilo sodado Labrafil® Perhexanoato de ORs preparado según el ejemplo 9 (correspondientes a 2,2 g de ORs).

40

45

50

55

60

65

11

89,85 g 0,13 g 0,02 g 5g 5g

ES 2 209 187 T3 REIVINDICACIONES

5

10

1. Compuestos a base de derivados de resveratrol caracterizados porque se trata esencialmente de ésteres de resveratrol, monómeros y/u oligómeros, teniendo los monómeros por lo menos un grupo éster de fórmula -O-COA, y estando formados los oligómeros por porciones monómeras unidas por enlaces carbono-carbono, o éter, y/o de monómeros reticulados por grupos -O-CO-R-CO-O-, - representando A un radical alquilo de por lo menos dos átomos de carbono, lineal o ramificado, saturado o insaturado, un radical arilo, salvo el fenilo en el caso de un compuesto de resveratrol monómero, aralquilo o aralquileno, y - representando R un radical alquileno de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 ciclos y/o un radical heterocíclico, y los diastereoisómeros de esas porciones.

15

20

2. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque son esencialmente a base de ésteres monómeros y/u oligómeros que tienen por lo menos un grupo -O-CO-A. 3. Compuestos según la reivindicación 2, caracterizados porque A representa un radical de ácido grado saturado o insaturado, por ejemplo de ácido butírico; valérico, hexanoico, sórbico, (áurico, palmítico; esteárico, oleico, linoleico; linolénico, α-linolénico, araquidónico, eicosapentaenoico; y docosahexaenoico. 4. Compuestos según la reivindicación 1, caracterizados porque son esencialmente a base de monómeros y/u oligómeros reticulados por intermedio de puentes -CO-R-CO donde R representa un radical alquileno de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 ciclos y/o un radical heterocíclico.

25

5. Compuesto según la reivindicación 4, caracterizado porque R es un radical de un diácido elegido entre los ácidos málico, malónico, glutárico, ftálico, de un cloruro de diácidos, como el dicloruro de tereftalohilo, el dicloruro de succinilo, el dicloruro de sebacohilo y el dicloruro de adipohilo, de un anhídrido, o también de un isocianato como el diisocianato de tolueno o de hexametileno. 30

6. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizados porque se presentan en forma de microcápsulas. 35

7. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizados porque se presentan en forma de masa esponjosa. 8. Proceso de obtención de compuestos a base de derivados de resveratrol, caracterizado porque comprende la reacción de monómeros y/u oligómeros de resveratrol que emplean como agentes de agitación compuestos de fórmula A-CO-O-A1, o A1-O-CO-R-CO-O-A1, donde

40

- A representa un radical alquilo de por lo menos dos átomos de carbono, lineal o ramificado, saturado o insaturado, un radical arilo, aralquilo o aralquileno, 45

- R representa un radical alquileno de 0 a 10 átomos de carbono, saturado o insaturado, y/o un radical arileno que tiene de 1 a 3 ciclos y/o un radical heterocíclico, - A1 representa un átomo de hidrógeno, de halógeno, un radical alcohilo en C1 a C8, o arilo, un grupo -CO-A, o isocianato, no pudiendo representar A y A1 respectivamente un radical fenilo y un átomo de doro en A CO-OA1.

50

9. Proceso según la reivindicación 8, caracterizado porque la esterificación se hace según la reacción de Schotten Baumann, en medio acuoso alcalino. 55

60

10. Proceso según la reivindicación 8 caracterizado porque, cuando se utilizan diácidos o sus derivados, se forma una emulsión de tipo (EM) por dispersión, con agitación, de una solución acuosa alcalina de los monómeros y/u oligómeros de resveratrol en un disolvente orgánico no miscible con agua, después se añade el agente de reticulación, A1-O-CO-R-CO-O-A1 en solución en dicho disolvente orgánico no miscible, o, como variante, se forma una emulsión del tipo (H/E) por dispersión, con agitación, de una solución orgánica que contiene dicho agente de reticulación en una solución acuosa de monómeros y/u oligómeros de resveratrol, al que se añade un agente alcalino en solución acuosa para ajustar el pH de la fase dispersante a 9-11, 5 aproximadamente. 11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque los monómeros y/u oligómeros de resveratrol utilizados son los obtenidos por extracción con ayuda de agua y/o un disolvente orgánico a partir de escobajos de vid.

65

12. Aplicación de los ésteres según una de las reivindicaciones 1 a 7, que contienen, si ha lugar, uno o varios principios activos, en el campo de la cosmética o de la dietética. 12

ES 2 209 187 T3 13. Utilización de los ésteres según una de las reivindicaciones 1 a 7, que contienen, si ha lugar, uno o varios principios activos, para preparar un medicamento. 5

10

15

20

25

30

35

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45

50

55

60

65

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 13

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