Aplicaciones de la biología molecular en hemopatías Dr. Carlos Santamaria Q, MQC, PhD. Jefe. Laboratorio de Diagnóstico Molecular. Hospital Nacional de Niños Director Centro de Diagnóstico Molecular y Estudios Genéticos (CEDIMEG S.A.)

•Serie roja

• Talasemias  y 

•Serie blanca Hematología

• Leucemias: LMA, LLA, LMC. • Linfomas • Otros: SMPc

•Coagulación • Factor II G20210A • Factor V Leyden

BIOLOGÍA MOLECULAR: HEMOPATÍAS MALIGNAS.

DIAGNÓSTICO

HEMOPATÍAS MALIGNAS

PRONÓSTICO

TRATAMIENTO

ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

Análisis disponibles-Microbiología •

Patógenos respiratorios – – – – – –

Anaplasma phagocytophillum Bordetella holmesii Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Chlamydophyla pneumoniae Mycobacterium tuberculosis detección de ARN 16S – Mycoplasma pneumoniae

•

Patógenos tracto digestivo – Patotipos Escherichia coli (EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, DAEC, EAEC) – Yersinia enterocolitica

•

Parásitos/Hongos – Leishmania spp – Sporothrix schenkii

•

Fiebres de origen oscuro – Ehrlichia canis – Ehrlichia chaffeensis – Ehrlichia ewingii – Anaplasma phagocytophilum – Rickettsia spp – Bartonella spp

•

Virulencia-resistencia ATB en S. aureus – Gen de resistencia a meticilina (mecA) – Gen de toxina de síndrome de shock tóxico (stts) – Leucocidina de Panton Valentine (gen PVL) – Toxina exfoliativa A – Toxina exfoliativa B

• Encefalitis virales – – – –

Herpes simplex virus I y II Enterovirus EBV VZV

Análisis disponibles-Onco-hematología •

Leucemia linfoblástica aguda B • – t(1;19)(q23;p13) E2A-PBX1* – t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4* – t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p190* – t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p210* – t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1*

• •

Leucemia mieloblástica aguda – – – –

•

•

– t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p190* – t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL p210* – FIP1L1-PDGFRα – JAK2-V617F Síndrome linfoproliferativos crónicos – t(11,14)(q13;q32) BCL1/JH MCL-1 – t(14,18)(q32;q21)BCL2/JH MBR – t(14,18)(q32;q21)BCL2/JH mcr – (t(8;14)(q24;q32) cMYC-IgH

•

Tumores sólidos

Leucemia linfoblástica aguda T – HOX11- L2 – del(1)(p32;p32) SIL-TAL1*

FLT3-ITD NPM1 (Mutación A y B)* t(8;21)(q22;q22) AML-ETO * inv(16)(p13;q22) CBF-MYH11* •

Leucemia promielocítica aguda – t(15;17)(q22;q21) PML-RAR

Síndrome mieloproliferativos crónicos

– – – –

t(1;13) PAX7-FKHR (RMS alveolar) t(2;13) PAX3-FKHR (RMS alveolar) t(11;22) EWS-FLI1 (Sarcoma de Ewing) t(21;22) EWS-ERG (Sarcoma de Ewing)

Trombofilias – Factor II (Protrombina) G20210A – Factor V Leiden – MTHFR (C677T/A1298C)

Hemopatías serie blanca

Agudas

Crónicas

LMA

LLA

LMA-M0 LMA-M1 LMA-M2 LMA-M3 (LPA) LMA-M4 LMA-M5a LMA-M5b LMA-M6 LMA-M7

LLA-B común LLA-B nula LLA-T

SMPc

LMC P. vera T. esencial MFP

SLPc

LNH-B Manto Folicular Burkitt Otros LNH-B LNH-T LLC M. Múltiple Macroglob…

Hemopatías serie blanca

Agudas

Crónicas

LMA

LLA

LMA-M0 LMA-M1 LMA-M2 LMA-M3 (LPA) LMA-M4 LMA-M5a LMA-M5b LMA-M6 LMA-M7

LLA-B común LLA-B nula LLA-T

SMPc

LMC P. vera T. esencial MFP

SLPc

LNH-B Manto Folicular Burkitt Otros LNH-B LNH-T LLC M. Múltiple Macroglob…

Frotis de sangre periférica NORMAL

LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA

Cariotipo normal

46, XY

t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL Cromosoma 9 Cromosoma 22 p p 5’ 3’ q

Traslocación recíproca

Cromosoma PHILADELPHIA

BCR (q11) BCR/ABL q

ABL (q34) 5’ 3’

ABL/BCR

Cromosoma Philadelphia

46,XY, t(9;22)(q34;q11)

t(9;22)(q34;q11) BCR/ABL

BCR (22q11) 1

2

34 5

b2 b3 11 12 13 14 15 16 9 10

6 78

1718 19 20

cen

tel

m-bcr. ~55 Kb

M-bcr. ~2’9 Kb

p190 (minor)

ABL (9q34) 1 1b

cen

2122 23

21a

-bcr

p210 (major)

a2 32

Breakpoint region ~200 Kb

a3 34

45

56

76 87

8

9

10

11

tel

PCR para BCR/ABL

M-bcr.BCR-ABL p210

b3a2 b2a2

11

12

3015 11

13

3091 12

14

2

3196 3270 227 13 2

ENF 5012 (3173)

3

401

4

~55%

4

~40%

697 3

ENR561 (277)

sonda Primers o cebadores

T A CG A C C T T A G C C T G A CG A G A T G C T GG A A T CGG A C T G C T C

TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG A TT AG CC GT AG CG CA TA TTAC GG CG CA TC GTAG CC GT AC G TT AG CC GT AG CG CA TA TTAC GG CG CA TC GTAG CC GT AC G A ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC TACGACCTTAGCCTGACGAG TACGACCTTAGCCTGACGAG ATGCTGGAATCGGACTGCTC ATGCTGGAATCGGACTGCTC

Biología Molecular

Dr. Cristian Pérez C.

PCR cuantitativa-tiempo real t(9;22)

BCR-ABL Positivo

BCR-ABL Negativo

Efecto biológico del Imatinib

Goldman J, Frontiers in Bioscience 11, 209-220, 2006

Leucemia Mieloide Crónica

O`Brien, N Engl J Med 2003;348:994-1004.

Resistencia a imatinib: mutaciones puntuales (T315I) A

ACT= Thr (T)

B

ATT= Ile (I) T315I

Otros Síndromes Mieloproliferativos crónicos (SMPc)

Trombocitosis esencial Policitemia vera Mielofibrosis

JAK2 V617F • 90% PV • 40-60% TE • 40-60% MFP

JAK2: V617F JAK2 V617F • 90% PV • 40-60% TE • 40-60% MFP

Mori et al, Genet. Mol. Biol.2008: 31, 114-16

Resultados: JAK2

PM

M1

M2

M3

Cneg

C+

Situación en Costa Rica

Laboratorio Diagnóstico Molecular 14000 12000 10000 8000

6000 4000 2000 0

2008

2009

2010

2011

2012

2013

2014

Muestras Hematología Molecular según hospital Muestras Onco-Hematología Molecular 500 400 HNN

300

HSJD

HMEX HCG

200

HMP HSVP

100 0 2008

2009

2010

2011

2012

2013

2014

Muestras Hematología Molecular HNN vs. Otros hospitales 2007

2009

2008

26%

35% HNN

HNN

HNN

OTROS hospitales

OTROS hospitales

OTROS hospitales

65%

74%

2013 15%

HNN OTROS hospitales

85%

Investigaciones en curso • ONCO-HEMATOLOGIA 1. Detección de mutaciones de IKZF y CRLF2 en LLA-B en niños (UCR, St Jude Research Hospital TN, USA).

2. Estudio de incidencia y respuesta a tratamiento en pacientes adultos con LMC (HSJD, HMEX, HCG, HMP). 3. Incidencia de mutaciones de oncogen RET en carcinoma de tiroides (HMEX). 4. Estudios de mutaciones en NALP3 para CAPS (Hospital Clinic Barcelona, España)

Diagnóstico Molecular

Secuenciació n de Sanger Donado por JPS

Secuenciación de nueva generación

Secuenciación Sanger: una secuencia a la vez

Next generation sequencing (NGS): millones de secuencias simultáneas

Mensaje para llevar a casa • El diagnóstico genético y molecular debe considerarse como parte básica del abordaje clínico del paciente. • Nuestro país tiene una oferta incipiente de análisis genético y molecular, pero tiene! • Ante un cuadro de difícil diagnóstico, consulte. Una nueva prueba puede estar disponible!

Colaboradores División Diagnóstico Molecular

DLC. Karol Alfaro DLC Jean Carlo García DLC. Ariana Moya Dr. Andrey Montero Dra. Estela Morera Dra. Valeria Peralta Dr. Cristian Pérez

Dr. Carlos Santamaría