PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE CALIDAD EN BACTERIOLOGIA BOLETIN INFORMATIVO Nro. 2- JUNIO 2011 COMENTARIOS ENCUESTA Nº 41

Cepa 1: Klebsiella pneumoniae Trescientos trece laboratorios de 346 (90,5%) contestaron correctamente la identificación

de

género

y

especie:

Klebsiella

pneumoniae,

resultando

una

concordancia en la identificación levemente inferior a la obtenida con la Cepa 1 de la Encuesta 40. Quince laboratorios (4,3%) informaron género correcto y especie incorrecta (principalmente K. oxytoca y K. ozaenae). Tres laboratorios informaron

Klebsiella spp. y 12 laboratorios informaron género y especie incorrecto: Serratia marcescens (2), Enterobacter cloacae (2), Enterobacter aerogenes (4), Enterobacter agglomerans (1), Enterobacter gergoviae (1), Citrobacter spp. (2). Respecto a la sensibilidad, esta cepa es portadora de una β-lactamasa de espectro extendido (BLEE) de la familia CTX-M a la que se le suma una disminución de la permeabilidad, que le da las características particulares de resistencia a los βlactámicos y resistencia o sensibilidad disminuida a los carbapenemes. Los estudios de biología molecular muestran PCR positiva para el gen ctx-m, y PCR negativa para los genes: imp (MBL), vim (MBL), kpc y oxa 48/163.

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El desafío de la presente cepa era descartar la presencia de carbapenemasa para poder informar correctamente la sensibilidad de los carbapenemes. De acuerdo al algoritmo para la búsqueda fenotípica de carbapenemasas (Anexo I), una cepa con halo de imipenem (IMP) ≤22mm es sospechosa de producir carbapenemasa. Para confirmar la presencia de carbapenemasa se requieren estudios de sinergia utilizando ácido 3-amino-fenil Borónico (APB) (para carbapenemasas tipo KPC y otras enzimas del grupo 2f de K. Bush como Sme, IMI/NMC-A, variantes de GES); o EDTA/SMA (para enzimas del tipo metalo-β-lactamasas -MBL-). Frente a la ausencia de inhibición con APB y EDTA/SMA, dos posibles mecanismos podrían ser responsables de la sensibilidad disminuida a carbapenemes: 

Carbapenemasas de naturaleza oxacilinasas (OXA-48 y OXA-163): OXA-48 se acompaña en general de sensibilidad a cefalosporinas de tercera generación mientras que la variante OXA-163 se caracteriza por presentar resistencia a cefalosporinas de 3ra generación NO INHIBIBLE POR ACIDO CLAVULANICO.



BLEE+impermeabilidad: cursa con resistencia acompañante a cefalosporinas de 3ra generación y en más del 95% de los casos se observa INHIBICION POR ACIDO CLAVULANICO sobre cefotaxima o ceftacidima o cefepima (fenotipo BLEE+).

Si se descarta la presencia de carbapenemasas, los carbapenemes ensayados deben ser informados según fenotipia, es decir, utilizando los puntos de corte vigentes del CLSI. Por lo tanto, en este caso en particular se deberían haber utilizado las tablas M100-S20-U (2010) que definen como resistente (R) halos ≤19mm, intermedio (I) 20-22mm y sensible (S) halos 23mm. Los mismos puntos de corte siguen vigentes en la edición 2011 de esta normativa (M100-S21). IMIPENEM: Esta cepa presentaba CIM a IMP de 2 ug/ml (I) por dilución en agar, 2-4 ug/ml (I-R) por Vitek2, 2-4 ug/ml (I-R) por E-test y 2 ug/ml (I) por MICE. Se consideró como resultado final de CIM a IMP: 2ug/ml (I). Las CIMs fueron de 8 ug/ml (R) para Meropenem (MER) y 64 ug/ml (R) a ertapenem (ERT) por dilución en agar. Con respecto al método de difusión, esta cepa presentó un rango de referencia para IMP

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entre 18 y 24mm, por lo que este carbapenem podría haber sido informado tanto S, I o R. Los otros dos carbapenemes solicitados, MER y ERT, presentaron rangos de referencia dentro de la categoría de Resistente. El 83,9% de los laboratorios obtuvieron halos para IMP dentro del rango de referencia. Respecto de la interpretación, 135/341 (39,6%) laboratorios reportaron la cepa como Sensible a IMP; 66 laboratorios (19,4%) la reportaron con sensibilidad Intermedia y 140 (41%) como Resistente. Tabla 1a Tabla 1a: Cepa 1: Distribución de halos e interpretación de Imipenem. M100- S20U Halo de IMP

Interpretación (No.) No. de Lab: 341 (%)

S

I

R

=23mm

86 (25,2)

76

0

10

135

66

140

(39,6%)

(19,4%)

(41%)

Es llamativa la falta de correlación entre los halos informados (columna en azul) y los halos interpretados (fila en rojo). En esta cepa, los carbapenemes se debían interpretar según fenotipia, por lo tanto se esperaba obtener una concordancia en la interpretación de IMP semejante a la columna azul, con un mayor % de cepas en la categoría I, ya que la cepa presentaba CIM de IMP de 2 ug/ml (I). En negrita se indican el No. de labs. que interpretaron correctamente según los halos de inhibición obtenidos. De los 135 laboratorios que informaron IMP sensible, solo 76 obtuvieron halos de sensibilidad (23mm). Sin embargo, entre los 59 laboratorios restantes, 51 informaron halos entre 20 y 22mm y los 8 restantes informaron halos ≤ 19mm, que deberían haber sido interpretados como intermedio y resistente, respectivamente. Estos resultados podrían sugerir que estos 59 laboratorios utilizaron los puntos de corte para IMP anteriores a la normativa vigente al momento de la encuesta (M100-S20: ≤16mm R, 17-18mm I, 19mm S), en lugar de haber utilizado el documento M100-S20-U enviado el 16 de julio de 2010 (M100-S20: ≤19mm R, 2022mm I, 23mm S). Otra posibilidad es que al descartar la presencia de una

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carbapenemasa hayan informado directamente la cepa como S a IMP, sin haber consultado la CLSI. Resulta especialmente llamativo que de los 140 laboratorios que informaron Resistencia a IMP, solo 40 obtuvieron verdaderamente halos menores o iguales al punto de corte establecido por el CLSI (Resistente ≤19mm), los 100 laboratorios restantes que obtuvieron halos ≥20mm cambiaron erróneamente la interpretación a la categoría de Resistente. Este cambio en la interpretación puede haberse debido al menos a dos posibilidades: 1) Caracterización errónea de la cepa como productora de carbapenemasa: situación poco probable ya que una amplia mayoría de los labs. (74.5%) definió la cepa con fenotipo compatible con BLEE + impermeabilidad. Sin embargo es inexplicable porque 10 labs. que obtuvieron halos > 23mm, informaron R a IMP. En el caso de que estos hubiesen sospechado una carbapenemasa, recordar que hasta el momento son altamente infrecuentes las cepas productoras de carbapenemasas con halos > 23 mm y se debe tener especial atención en la observación correcta de las sinergias con los inhibidores específicos; 2) Los participantes consideraron erróneamente que si la cepa presentaba halo entre 20-22mm y por ende entraba dentro del algoritmo de sospecha de carbapenemasas, se debía informar como R al carbapenem. Finalmente, recordar que cuando se obtienen halos de IMP =< 22 mm en Enterobacterias,

pero

se

descarta

fenotípicamente

la

presencia

de

cualquiera de las carbapenemasas, los carbapenemes se deben informar según CLSI del año en curso. CONFIRMACIÓN DE CEPA NO PRODUCTORA DE CARBAPENEMASA: Como se mencionó previamente esta cepa presentaba PCR positiva para el gen

ctx-m, y PCR negativa para los genes: imp (MBL), vim (MBL), kpc y oxa- 48/163. La caracterización fenotípica de un aislamiento como productor de carbapenemasa debe realizarse teniendo en cuenta no sólo el resultado de los inhibidores sino también debe analizarse el perfil fenotípico de resistencia a TODOS los antibióticos βlactámicos. La cepa presentaba un perfil de sensibilidad disociado para los carbapenemes con escalera fenotípica con halos de IMP> MER> ERT, no presentaba sinergia con APB ni sinergia con EDTA/SMA (ver Figura 1a y 1b, diferencia entre sinergia positiva y negativa con EDTA/SMA), con lo cual queda descartada la presencia de carbapenemasas. Además se observaba sinergia

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entre

las

cefalosporinas

de

tercera

generación

(ceftacidima,

cefotaxima)

y

amoxicilina/clavulánico indicativo de una β-lactamasa de espectro extendido inhibible por ac. clavulánico, por lo que resultaba poco probable la presencia de una oxacilinasa del tipo 163. Todas estas evidencias sugieren la presencia de BLEE + impermeabilidad. La escalera fenotípica de los carbapenemes (halos IMP> MER> ERT) característica de fenotipo de BLEE + impermeabilidad puede observarse también en enterobacterias con carbapenemasa tipo KPC, pero ésta puede ser perfectamente descartada por la ausencia de inhibición con los discos APB. Una aclaración adicional sobre la interpretación de la inhibición por EDTA/SMA: se debe recordar que en presencia de verdadera carbapenemasa del tipo MBL, las sinergias son simétricas sobre ambos carbapenemes y presentan grandes deformaciones de las zonas de inhibición (Figura 1a). La cepa 1 no presentaba este patrón característico. Debemos recordar que el EDTA es un agente lítico y en cepas impermeables puede producir una permeación inespecífica de la membrana, facilitando el ingreso de moléculas que estaba impedido por el déficit de porinas. Esta cooperación inespecífica se traduce en este tipo de sinergias entre los discos de IMP y EDTA/SMA (ver Fig. 1b, efecto túnel). Figura 1a. Enterobacter cloacae, productor de MBL, familia IMP. Sinergia positiva entre el disco de EDTA y los carbapenemes.

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Figura 1b. Ejemplo de Sinergia negativa entre el disco de EDTA y los carbapenemes. Observe la asimetría entre las zonas de inhibición de los carbapenemes y el “Efecto túnel” de una falsa sinergia.

“Efecto túnel” Aprovechamos este informe para recordarles que los métodos microbiológicos (Hodge, Masuda) no están recomendados para las enterobacterias por presentar una alta proporción de falsos positivos. Además, recientemente se han reportado resultados falsos negativos frente a cepas productoras de MBL del tipo NDM-1. En la Figura 1c se puede ver la distribución de las respuestas a la pregunta teórica donde los laboratorios debían inferir el mecanismo de resistencia presente en la Cepa Nº1. La pregunta fue respondida por 334 de 346 labs (96.5%). Figura 1c. Distribución de Respuestas a la pregunta teórica (N=334) 300 250

249

200 150 100 54 50

21

12

10

A

S/R

B

0 C

D

Código de Respuestas: A) La cepa 1 produce una carbapenemasa tipo KPC (ClaseA) B) La cepa 1 no posee mecanismos de resistencia sobre los carbapenemes

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C) La cepa 1 presentaría la asociación de beta-lactamasa de espectro extendido y disminución de la permeabilidad de la membrana externa (RTA. CORRECTA) D) La cepa 1 produce una carbapenemasa tipo metaloenzima (MBL, clase B) S/R: Sin Responder

Observamos que 74,5% de los laboratorios (n: 249) clasificaron correctamente el aislamiento como con fenotipo de BLEE + Impermeabilidad (Respuesta “C”). Sin embargo 21 laboratorios (6,2%) informaron la cepa como productora

de

carbapenemasa tipo KPC y 54 (16,2%) como productora de carbapenemasa tipo MBL. Esta

incorrecta

clasificación

del

aislamiento

como

productor

de

carbapenemasa en el 22,4% de los casos implica una sobreestimación de la resistencia al IMP, la eliminación de este carbapenem como opción de tratamiento y por ultimo la utilización innecesaria de drogas alternativas como tigeciclina, colistin o fosfomicina, que deberían solo considerarse en el tratamiento de microorganismos multirresistentes.

VITEK2: PUNTOS DE CORTE DE IMIPENEM Y MEROPENEM PARA SOSPECHA DE CARBAPENEMASAS EN ENTEROBACTERIAS. Actualmente un amplio número de laboratorios de microbiología clínica realizan

las

pruebas

de

sensibilidad

de

rutina

utilizando

métodos

automatizados. El desempeño de estos métodos para la detección de carbapenemasa permanecía desconocido. En el laboratorio realizamos estudios para evaluar la capacidad de detección de carbapenemasas con métodos automatizados (Phoenix, Vitek 2C), métodos de tiras con gradiente de antibióticos (MICE) y el método de referencia de CIM por dilución en agar. Basados en estos estudios, se estandarizaron estrategias metodológicas que permitieron optimizar cada método para la detección de enzimas tipo KPC y demás carbapenemasas adquiridas (ver Informe Encuesta 40 enviado en octubre 2010). Les hacemos llegar el trabajo -“Can we use imipenem and meropenem Vitek-2 MICs for the detection of suspected KPC and other carbapenemases producers among species of Enterobacteriaceae?” F. Pasteran y col. Journal of Clinical Microbiology, Feb 2011; 49(2):697-701, donde se establecen los puntos

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de corte más apropiados de SOSPECHA de carbapenemasas cuando se utiliza el sistema Vitek2 (ver adjunto). Para este sistema, los indicadores de mejor sensibilidad y especificidad resultaron (independientemente de la especie bacteriana) las cepas con CIM de imipenem >=2.0 µg/ml (coincidente con un resultado de Intermedio o Resistente según el nuevo criterio del CLSI) y a la vez una CIM de meropenem >=1 µg/ml. Las cepas SOSPECHOSAS de producir carbapenemasas con CIM IMP >= 2 ug/ml y MER >= 1 ug/ml deben confirmarse utilizando discos con los inhibidores específicos como APB y EDTA/SMA o mediante la técnica de PCR (ver Figura 2 del trabajo previamente mencionado). Por el contrario, si el aislamiento presenta una de las CIMs por debajo de los puntos de corte propuestos, es decir CIM de imipenem