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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 94110267.5 kFecha de presentaci´on : 01.07.94 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 631 786 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 04.01.95

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54 T´ıtulo: Lys-plasminogeno en la prevenci´ on y tratamiento de la isquemia y las lesiones de reperfusi´ on.

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73 Titular/es: IMMUNO Aktiengesellschaft

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72 Inventor/es: Eibl, Johann;

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74 Agente: Ungr´ıa L´ opez, Javier

30 Prioridad: 02.07.93 US 88033

Industriestrasse 67 A-1221 Wien, AT

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.98

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 119 934 T3

16.10.98

Aviso:

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Pichler, Ludwig y Schwarz, Hans-Peter

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 119 934 T3 DESCRIPCION Antecedentes de la invenci´ on 5

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La apoplej´ıa sigue siendo la tercera causa de muerte m´as com´ un en el mundo industrial, figurando detr´ as de las enfermedades card´ıacas isqu´emicas y el c´ancer. Las apoplej´ıas son responsables de aproximadamente 300.000 muertes anualmente en los Estados Unidos y aproximadamente 11.000 muertes anualmente en Austria. Las apoplej´ıas son asimismo una causa destacada de admisiones hospitalarias e incapacidades de larga duraci´ on. Por consiguiente, el impacto socioecon´omico de la apoplej´ıa y su carga concomitante sobre la sociedad es pr´acticamente inconmensurable. La “apoplej´ıa” es definida por la World Health Organization como un signo cl´ınico de trastorno focal o global de la funci´ on cerebral que se desarrolla r´apidamente con s´ıntomas que duran al menos 24 horas. Las apoplej´ıas tambi´en est´an implicadas en muertes en las que no hay otra causa aparente distinta de un efecto de origen vascular. Las apoplej´ıas est´an causadas t´ıpicamente por bloqueos u oclusiones de los vasos sangu´ıneos hacia el cerebro o dentro del cerebro. Con una oclusi´ on completa, la atrofia de la circulaci´ on cerebral causa el cese de la actividad el´ectrica neuronal en segundos. En unos pocos minutos tras el deterioro del estado de energ´ıa y la homeostasis i´onica, se produce el agotamiento de los fosfatos de alta energ´ıa, el fallo de la bomba de iones de la membrana, el eflujo del potasio celular, el influjo del cloruro de sodio y el agua, y la despolarizaci´on de la membrana. Si la oclusi´ on persiste durante m´ as de cinco a diez minutos, se produce una lesi´ on irreversible. No obstante, con la isquemia incompleta, el resultado es dif´ıcil de evaluar y depende enormemente de la perfusi´ on residual y de la disponibilidad de ox´ıgeno. Tras una oclusi´ on tromb´ otica de un vaso cerebral, la isquemia es raramente total. Normalmente persiste una cierta perfusi´ on residual en el a´rea isqu´emica dependiendo del flujo sangu´ıneo colateral y de la presi´on de perfusi´ on local. El flujo sangu´ıneo cerebral puede compensar las ca´ıdas de la presi´ on sangu´ınea arterial de 90 a 60 mm Hg mediante autorregulaci´ on. Este fen´ omeno implica la dilataci´ on de los vasos resistentes aguas abajo. Por debajo del nivel inferior de autorregulaci´ on (aproximadamente 60 mm Hg), la vasodilataci´ on es inadecuada y el flujo sangu´ıneo cerebral cae. El cerebro, no obstante, tiene reservas de perfusi´ on que pueden compensar la ca´ıda del flujo sangu´ıneo cerebral. Esta reserva existe debido a que en condiciones normales s´ olo aproximadamente el 35 % del ox´ıgeno liberado por la sangre es extra´ıdo. Por lo tanto, puede tener lugar el incremento de la extracci´on de ox´ıgeno, siempre que existan normoxia y normocapnea. Cuando la presi´ on sangu´ınea distal cae por debajo de aproximadamente 30 mm Hg, los dos mecanismos compensadores (autorregulaci´on y reserva de perfusi´ on) son inadecuados para evitar la insuficiencia de la liberaci´on de ox´ıgeno. A medida que el flujo cae por debajo del umbral isqu´emico de 23 ml/100g/minuto, se desarrollan los s´ıntomas de hipoxia en los tejidos. La isquemia grave puede ser letal. Cuando la isquemia es moderada, dar´ a como resultado la “penumbra”. En el contexto neurol´ ogico, la penumbra hace referencia a una zona del tejido cerebral con isquemia moderada y funci´ on neuronal paralizada, que es reversible con la restauraci´on de la perfusi´ on adecuada. La penumbra forma una zona de tejido perfundido colateralmente que rodea un n´ ucleo de isquemia grave en el que se ha producido un infarto. En otras palabras, la penumbra es el ´area de tejido que puede ser salvada, y est´ a esencialmente en un estado entre la vida y la muerte. Cuando un co´ agulo es degradado y el flujo sangu´ıneo hacia la penumbra es restaurado, puede ocurrir un fen´ omeno conocido como lesi´on por reperfusi´on. Las porciones del tejido lesionado en la penumbra pueden ser destruidas o adicionalmente lesionadas por la re-entrada de ox´ıgeno u otras sustancias en el ´area afectada por la isquemia. En vista de este fen´omeno, se determina el grado del da˜ no tisular resultante de la isquemia tanto mediante el tiempo requerido para lograr la apertura del vaso ocluido como mediante una serie de reacciones que siguen como resultado de la reperfusi´ on y la re-entrada de ox´ıgeno al tejido afectado. Aunque un evento isqu´emico puede ocurrir en cualquier parte del sistema vascular, la bifurcaci´ on de la arteria car´ otida y el origen de la arteria car´ otida interna son los sitios m´ as frecuentes para las oclusiones tromb´ oticas de los vasos sangu´ıneos cerebrales, que dan como resultado la isquemia cerebral. Los s´ıntomas de la reducci´on del flujo sangu´ıneo debida a la estenosis o a la trombosis son similares a los causados por las enfermedades de la arteria cerebral media. El flujo a trav´es de la arteria oft´ almica resulta suficientemente afectado a menudo para producir amaurosis fugaz o ceguera monocular transitoria. La estenosis de la arteria car´ otida interna bilateral grave puede producir hipoperfusi´ on hemisf´erica cerebral. Esta se manifiesta con un dolor de cabeza agudo ipsolateral al hemisferio isqu´emico agudamente. Las 2

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oclusiones o el descenso del flujo sangu´ıneo con isquemia resultante de una arteria cerebral anterior distal con respecto a la arteria comunicante anterior producen los s´ıntomas motores y sensoriales corticales en la pierna contralateral y, menos a menudo, en el brazo proximal. Entre otras manifestaciones de las oclusiones o la infraperfusi´ on de la arteria cerebral anterior se incluyen la ataxia de la marcha y algunas veces la incontinencia urinaria debida a la lesi´ on del l´ obulo frontal parasagital. Los trastornos del lenguaje manifestados como una disminuci´ on del habla espont´ anea pueden acompa˜ nar a la depresi´ on generalizada de la actividad psicomotora. La mayor´ıa de las apoplej´ıas isqu´emicas implican porciones o todo el territorio de la arteria cerebral media con ´embolos desde el coraz´ on o las arterias car´ otidas extracraneales en la mayor´ıa de los casos. Los ´embolos pueden ocluir el tallo principal de la arteria cerebral media, pero m´ as frecuentemente producen la oclusi´on distal de la rama o bien superior o bien inferior. Las oclusiones de la rama superior causan debilidad y p´erdida sensorial que son m´ as grandes en la cara y el brazo. Las oclusiones de la arteria cerebral posterior distal hacia sus ramas penetrantes causan una p´erdida contralateral completa de la visi´ on. La dificultad en la lectura (dislexia) y en la realizaci´ on de c´alculos (discalculia) pueden seguir a la isquemia de la arteria cerebral posterior dominante. La oclusi´ on proximal de la arteria cerebral posterior causa la isquemia de las ramas que penetran en las estructuras cal´ amicas y l´ımbicas. Los resultados cl´ınicos son trastornos hemisensensitivos que pueden cambiar cr´ onicamente a dolor rebelde del sitio defectuoso (dolor tal´ amico).

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Un evento significativo en la isquemia cerebral es conocido como ataque isqu´emico transitorio (“TIA” por Transient Isquemic Attack). Un TIA se define como un d´eficit neurol´ ogico con una duraci´ on de menos de 24 horas. El TIA es un signo importante de un desarrollo isqu´emico que puede conducir a un infarto cerebral. En la actualidad, no existe un tratamiento ideal para el TIA, y no hay pautas generalmente aceptadas en cuanto a si se deben llevar a cabo procedimientos m´edicos o quir´ urgicos para reducir la incidencia de la apoplej´ıa en sujetos con TIA. La etiolog´ıa del TIA implica eventos hemodin´amicos y mecanismos tromboemb´olicos. Debido a que la mayor parte de los TIA se resuelven en una hora, un d´eficit que se prolongue durante m´ as tiempo es a menudo clasificado como presunta apoplej´ıa y se asocia, por consiguiente, con la lesi´on cerebral permanente. Por lo tanto, se utilizan los esc´aner de cerebro tomogr´ aficos computerizados para investigar el infarto cerebral en a´reas afectadas por TIA que se prolonguen durante m´as de unas horas. En resumen, la distinci´ on cl´ınica relevante entre un TIA y una apoplej´ıa es si la isquemia ha causado una lesi´on cerebral, que es t´ıpicamente clasificada como infarto o necrosis isqu´emica. Los sujetos con signos cl´ınicos de deterioro podr´ıan tener una apoplej´ıa en evoluci´on o ser clasificados por tener una apoplej´ıa progresiva. En este grupo cl´ınico, la propagaci´ on del co´ agulo es posiblemente un importante factor en el progreso de la enfermedad. Existen una mir´ıada de otras enfermedades causadas por o asociadas con la isquemia. La isquemia vertebro-basilar es el resultado de la oclusi´on de la arteria vertebral. La oclusi´ on de la arteria vertebral y la interferencia con el flujo a trav´es de la arteria cerebelar inferior posterior ipsolateral causan el s´ındrome medular lateral, que tiene una sintomatolog´ıa que incluye, v´ertigo, na´ useas, nistagmo por v´ omitos, ataxia ipsolateral y s´ındrome ipsolateral de Herner. La isquemia vertebrobasilar a menudo produce lesiones multifocales dispersadas en ambos lados del tallo del cerebro a lo largo de una considerable longitud. Excepto el infarto cerebral y el s´ındrome medular lateral, los s´ındromes cl´ınicos de lesiones discretas son rara vez observados en forma pura. La isquemia vertebro-basilar se manifiesta con diversas combinaciones de s´ıntomas tales como desvanecimiento, normalmente v´ertigo, diplop´ıa, debilidad facial, ataxia y signos de los fasc´ıculos largos. Una oclusi´on de la arteria basilar produce d´eficits masivos. Uno de estos d´eficits es conocido como el “estado encerrado”. En estas condiciones, la par´ alisis de los limbos y la mayor´ıa de los m´ usculos bulbares deja al sujeto s´ olo capaz de comunicarse moviendo los ojos o los p´ arpados en un tipo de c´ odigo. La oclusi´on del a´pex basilar o parte superior del basilar es causada normalmente por ´embolos que se alojan en la uni´ on entre la arteria basilar y las dos arterias cerebrales posteriores. Este estado produce una reducci´on inicial de la excitaci´on seguida de ceguera y amnesia debido a una interrupci´ on del flujo en las arterias cerebrales posteriores as´ı como anomal´ıas de la mirada vertical y la reactividad pupilar debidas a la lesi´on tegmental. La oclusi´on venosa puede causar lesi´on masiva y muerte. Esta enfermedad es menos com´ un que la enfermedad vascular cerebral arterial. Como con la apoplej´ıa isqu´emica, el principal mecanismo de lesi´on cerebral es la reducci´on del flujo sangu´ıneo capilar, en este caso debida a un incremento de la resistencia de salida desde las venas bloqueadas. La retrotransmisi´on de alta presi´ on en el lecho capilar normalmente 3

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da como resultado la r´ apida hinchaz´ on en el cerebro a partir de un edema y el infarto hemorr´ agico en la sustancia blanca subcortical. La forma m´ as peligrosa de enfermedad venosa se origina cuando se ocluye el seno sagital superior. La oclusi´on venosa ocurre asociada con alteraciones de la coagulaci´on, a menudo en el per´ıodo purpural, o en sujetos con c´ anceres diseminados o enfermedades contagiosas. Si no se inicia la terapia anticoagulante, la oclusi´ on del seno sagital superior tiene una tasa de mortalidad del 25 al 40 %. Una isquemia cerebral disfusa breve puede causar un s´ıncope sin ninguna secuela permanente. Una isquemia difusa prolongada en otros o´rganos tiene consecuencias devastadoras. La causa m´as com´ un es una asistolia card´ıaca u otras insuficiencias pulmonares, incluyendo el infarto. La disecci´on a´ ortica y la hipoxia global o el envenenamiento por mon´ oxido de carbono pueden causar cuadros similares. La hipoxia/isquemia difusa mata t´ıpicamente las neuronas en el hipocampo, las c´elulas de Purkinje cerebelares, las capas estriadas o corticales. Cl´ınicamente, tal hipoxia/isquemia difusa da como resultado p´erdida de conocimiento y coma, seguido en muchos casos por un estado vegetativo cr´onico. Si el sujeto no recobra la consciencia en unos pocos d´ıas, la prognosis del retorno de las funciones cerebrales independientes se vuelve muy escasa. El s´ındrome de hiperviscosidad es otra enfermedad relacionada con el flujo sangu´ıneo y la isquemia. El flujo sangu´ıneo cerebral est´ a inversamente relacionado con la viscosidad sangu´ınea. La u ´ ltima es directamente proporcional al n´ umero de gl´ obulos rojos y blancos en circulaci´on, el estado de agregaci´ on, el n´ umero de plaquetas y la concentraci´ on de prote´ınas en plasma. El flujo sangu´ıneo es inversamente proporcional a la deformabilidad de los eritrocitos y a la velocidad de la sangre (velocidad de cizalla). Los sujetos con s´ındrome de hiperviscosidad pueden presentar o bien disfunci´ on neurol´ ogica focal o bien signos o s´ıntomas difusos o multifocales incluyendo dolor de cabeza, alteraciones visuales, deterioro o crisis cognitivas.

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Existen numerosas sustancias implicadas en la formaci´on de co´ agulos y en la lisis. El plasmin´ogeno, tambi´en conocido como glu-plasmin´ogeno, y la plasmina son dos de las principales sustancias implicadas en la lisis. 30

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El plasmin´ogeno es una prote´ına, compuesta por 791 amino´ acidos, que circula en el plasma humano a una concentraci´ on de aproximadamente 200 µg/ml. El plasmin´ ogeno es la forma zim´ogeno de la enzima fibrinol´ıtica, plasmina, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es responsable en ´ultimo lugar de la degradaci´ on de los co´agulos de sangre. Para la mayor parte, la proteolisis de la fibrina est´ a mediada por la generaci´on de plasmina dentro de un co´ agulo de fibrina a partir del plasmin´ ogeno atrapado en el co´agulo. Fredenburgh & Nesheim, J. Biol. Chem. 267: 26150-56 (1.992). El plasmin´ ogeno tiene cinco dominios bisagra en su regi´ on amino-terminal de la cadena pesada que muestran sitios de uni´ on a la lisina para el reconocimiento de restos lisina en la fibrina. La conversi´on plasmin´ ogeno-plasmina, tanto dentro del co´ agulo como en su superficie, est´a facilitada por la afinidad del activador del plasmin´ ogeno de los tejidos (“t-PA”) para la fibrina, que da como resultado una activaci´ on del plasmin´ ogeno inducida por t-PA dependiente de la fibrina. Fredenburgh, loc. cit. Una vez iniciada, la fibrinolisis da como resultado numerosas reacciones de retroalimentaci´ on positivas. Por ejemplo, la escisi´ on catalizada por plasmina de la fibrina genera restos lisina carboxi terminales, que a su vez proporcionan sitios de uni´ on adicionales tanto para t-PA como para el plasmin´ ogeno. Esto tambi´en facilita la conversi´on catalizada por plasmina de glu-plasmin´ogeno en lys-plasmin´ ogeno mediante una escisi´on espec´ıfica, que es una etapa de pre-activaci´on. Shih & Hajjar, P.S.E.B.M. 202: 258-64 (1.993). En la literatura, el t´ermino “lys-plasmin´ ogeno” hace referencia a formas de plasmin´ogeno donde el amino´acido N-terminal es lisina, valina o metionina. Nieuwenhuizen et al., Eur. J. Biochem. 174: 163-69 (1.988). La actividad de conversi´ on refleja una reacci´ on de retroalimentaci´on positiva, debido a que el lys-plasmin´ogeno es un sustrato considerablemente mejor que el glu-plasmin´ ogeno tanto para t-PA como para la uroquinasa, que puede estar causada por la afinidad intensificada de lys-plasmin´ ogeno por la fibrina. La proporci´ on de Kcat/Km para la activaci´on catalizada por t-PA de lys-plasmin´ ogeno excede la del glu-plasmin´ ogeno en aproximadamente un factor de diez. Fredenburgh, loc. cit.

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Se ha demostrado previamente que la fibrinolisis est´ a acelerada por la adici´ on de lys-plasmin´ ogeno as, cuando se compar´ o la utilizaci´on de lys-plasmin´ ogeno ex´ogeno con la utiin vivo e in vitro. Adem´ lizaci´on de glu-plasmin´ ogeno ex´ogeno en experimentos similares, 0,08 µmoles de lys-plasmin´ ogeno produc´ıan el mismo grado de intensificaci´on de la fibrinolisis que 0,67 µmoles de glu-plasmin´ ogeno. Por lo tanto, si bien ambas formas de plasmin´ ogeno acortan el tiempo de fibrinolisis, el lys-plasmin´ ogeno es aproximadamente ocho veces m´ as potente en este aspecto que el glu-plasmin´ogeno. Ver Fredenburgh, supra. 4

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Se ha demostrado previamente que el t-PA y la plasmina disminuyen la quimiotaxis de los neutr´ ofilos y liberan los radicales super´ oxido y la leucotrina B4. Se ha indicado que los efectos cumulativos de t-PA y plasmina sobre las funciones de los neutr´ofilos pueden relacionarse con la eficacia global de t-PA en las alteraciones tromb´oticas. (Life Sciences, Vol. 45, p. 1665-1669). Los estudios previos de lys-plasmin´ ogeno no han implicado esta prote´ına para su utilizaci´on en el tratamiento de la lesi´ on por reperfusi´ on. El tratamiento convencional para la lesi´ on por reperfusi´ on es la Flunarizina, que s´ olo es eficaz cuando se administra profil´ acticamente.

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Compendio de la invenci´ on Por lo tanto un objeto de la presente invenci´ on es proporcionar un m´etodo para tratar la lesi´ on por reperfusi´on hacia el tejido. 15

Tambi´en es un objeto de la presente invenci´on proporcionar un m´etodo para tratar la isquemia, el infarto o el edema cerebral.

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Asimismo otro objeto de la presente invenci´on es proporcionar un m´etodo para mejorar la microcirculaci´on. Otro objeto m´ as de la presente invenci´ on es proporcionar un m´etodo para tratar la lesi´ on por reperfusi´ on que sigue a los eventos isqu´emicos.

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Otro objeto m´ as de la presente invenci´ on es proporcionar un m´etodo para tratar la lesi´ on por reperfusi´ on que sigue a los eventos isqu´emicos administrando una composici´on farmac´eutica que comprende lys-plasmin´ogeno. La composici´on para su utilizaci´on en este m´etodo puede comprender adicionalmente activadores del plasmin´ ogeno tales como el activador de plasmin´ogeno de tipo tejido, los activadores de tipo uroquinasa, pro-uroquinasa, los activadores de tipo estreptoquinasa y la plasmina.

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Un objeto adicional de la presente invenci´ on es tratar la lesi´on por isquemia y reperfusi´ on resultante de los procedimientos quir´ urgicos, incluyendo los trasplantes.

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Seg´ un otro aspecto de la presente invenci´on, se proporciona un tratamiento para la lesi´ on por isquemia y reperfusi´on resultante de los procedimientos quir´ urgicos, incluyendo los trasplantes. Este tratamiento supone administrar lys-plasmin´ ogeno a pacientes que han sufrido o sufrir´ an procedimientos quir´ urgicos. En el caso de los trasplantes, la administraci´ on de tales prote´ınas al tejido u o´rgano receptor protege el tejido u o´rgano que est´ a siendo trasplantado, as´ı como los tejidos u ´organos que rodean el a´rea quir´ urgica del receptor. Del mismo modo, la administraci´ on de tales prote´ınas al tejido u o´rgano donador protege el tejido u o´rgano a trasplantar as´ı como los tejidos y ´organos que rodean el a´rea quir´ urgica del donador. Otros objetos, caracter´ısticas y ventajas de la presente invenci´on se har´ an evidentes a partir de la descripci´on y las figuras siguientes.

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Breve Descripci´ on de las Figuras La Figura 1 expone el sistema de puntuaci´ on utilizado para la evaluaci´ on de los efectos neurol´ ogicos.

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La Figura 2 es un resumen de los datos experimentales que emplean un modelo de rata para evaluar los beneficios terap´euticos del lys-plasmin´ogeno en comparaci´ on con un control. La Figura 3 es una representaci´ on gr´ afica de los datos de un experimento controlado que eval´ ua el efecto de lys-plasmin´ogeno sobre el contenido h´ umedo del cerebro (edema) de ratas con isquemia inducida. “A” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 500 U/kg de lys-plasmin´ogeno i.v. con reperfusi´ on sangu´ınea; “B” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de soluci´on salina isot´onica i.v. con reperfusi´on sangu´ınea; y “C” son ratas que han sufrido una operaci´ on simulada que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´ onica i.v. (∆AB p < 0,001; ∆BC: p < 0,01; ∆AC: p < 0,05). La Figura 4 es una representaci´on gr´ afica de los datos de un experimento que eval´ ua el efecto de tamp´ on sobre el contenido h´ umedo del cerebro (edema) de ratas con isquemia inducida que sirve como control adicional del experimento de la Figura 3. “A” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de tamp´ on i.v. con reperfusi´ on sangu´ınea (n=7); “B” son 5

ES 2 119 934 T3 ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´onica i.v. con reperfusi´ on sangu´ınea (n=7); y “C” son ratas que han sufrido una operaci´ on simulada que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´ onica i.v. (n=8) (∆ AB n.s.; ∆BC: p < 0,01; ∆AC: p < 0,01). 5

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La Figura 5 es una representaci´ on gr´ afica de los datos de un experimento controlado que eval´ ua el efecto de lys-plasmin´ ogeno sobre los d´eficits neurol´ ogicos de ratas con isquemia inducida. La puntuaci´ on total se basa en clasificaciones individuales para el estado de consciencia, marcha, tono muscular y comportamiento (media de 3 d´ıas por animal). La m´axima puntuaci´ on es 54 (n = 10 por grupo). “A” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 500 U/kg de lys-plasmin´ogeno i.v. con reperfusi´ on sangu´ınea; “B” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de soluci´on salina isot´onica i.v. con reperfusi´on sangu´ınea; y “C” son ratas que han sufrido una operaci´ on simulada que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´ onica i.v. (∆AB p < 0,001; ∆BC: p < 0,001; ∆AC: p = 0,05). La Figura 6 es una representaci´on gr´ afica de los datos de un experimento que eval´ ua el efecto de tamp´ on sobre los d´eficits neurol´ ogicos de ratas con isquemia inducida, que sirve como control adicional del experimento de la Figura 5. La puntuaci´ on total se basa en las clasificaciones individuales para el estado de consciencia, marcha, tono muscular y comportamiento (media de 3 d´ıas por animal). La m´axima puntuaci´ on es 54 (n = 6 por grupo). “A” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de tamp´ on i.v. con reperfusi´ on sangu´ınea; “B” son ratas con isquemia inducida quir´ urgicamente que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´ onica i.v. con reperfusi´on sangu´ınea; y “C” son ratas que han sufrido una operaci´ on simulada que reciben 1,0 ml/kg de soluci´ on salina isot´ onica i.v. (∆AB n.s.; ∆BC: p < 0,01; ∆AC: p < 0,01).

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Descripci´ on Detallada de las Realizaciones Preferidas

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La presente invenci´on permite el tratamiento de los eventos isqu´emicos, incluyendo la isquemia cerebral, y la lesi´ on por reperfusi´ on asociada con los eventos isqu´emicos. Adicionalmente, la presente invenci´on permite el tratamiento de los eventos isqu´emicos de una manera que evita o minimiza los efectos adversos asociados con los tratamientos convencionales, tales como la lesi´on por reperfusi´on. El t´ermino “tratamiento” en sus diferentes formas gramaticales hace referencia a prevenir, aliviar, minimizar o curar los males u otros estados adversos.

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Se ha descubierto que la plasmina y las prote´ınas formadoras de plasmina, una categor´ıa que incluye el lys-plasmin´ogeno, un zim´ ogeno pre-activado de la plasmina, pueden ser utilizadas, seg´ un la presente invenci´on, para atenuar o evitar la lesi´ on por reperfusi´on posterior al evento isqu´emico. Este efecto beneficioso puede ser obtenido incluso cuando ya ha comenzado la reperfusi´ on. El propio lys-plasmin´ ogeno puede ser empleado como tratamiento. Todas las formas de lysplasmin´ ogeno son consideradas adecuadas para su utilizaci´ on con esta invenci´on con tal que conserven la capacidad de causar los beneficios descritos antes. Tambi´en son adecuados para su uso conforme a la presente invenci´on los fragmentos de lys-plasmin´ ogeno y las variantes de lys-plasmin´ogeno, tales como los an´ alogos, derivados, mute´ınas y mim´eticos de la mol´ecula natural, que conserven la capacidad de causar los beneficios descritos antes.

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Los fragmentos de lys-plasmin´ ogeno hacen referencia a porciones de la secuencia de amino´ acidos del polip´eptido lys-plasmin´ogeno. Estos fragmentos pueden ser generados directamente a partir del propio lys-plasmin´ogeno mediante escisi´on qu´ımica, mediante digesti´ on con enzimas proteol´ıticas, o mediante combinaciones de las mismas. Adicionalmente, tales fragmentos pueden ser creados mediante t´ecnicas de recombinaci´on empleando m´etodos de clonaci´on de ADNc o gen´ omico. Adem´as, tambi´en existen m´etodos para sintetizar polip´eptidos directamente a partir de restos amino´ acido. Las variantes de lysplasmin´ ogeno pueden ser producidas mediante estos y otros m´etodos. Se pueden emplear t´ecnicas de mutag´enesis dirigida a un sitio espec´ıfico y a una regi´ on. Ver Current Protocols in Molecular Biology vol. 1, ch. 8 (Ausubel et al. eds., J. Wiley & Sons 1.989 & Supp. 1.990-93); Protein Engineering (Oxender & Fox eds., A. Liss, Inc. 1.987). Adem´ as, se pueden emplear para la mutag´enesis t´ecnicas de rastreo del ligador y mediadas por PCR. Ver PCR Technology (Erlich ed., Stockton Press 1.989); Current Protocols in Molecular Biology, vols. 1 & 2, supra. Se pueden producir compuestos no pept´ıdicos que imiten la uni´ on y la funci´ on de un p´eptido (“mim´eticos”) mediante la propuesta esbozada en Saragovi et al., Science 253:792-95 (1.991). La secuenciaci´on de prote´ınas, la estructura y las propuestas de modelos a utilizar con cualquiera de las t´ecnicas anteriores se describen en Protein Engineering, loc. cit. y Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1 & 2, supra.

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Una vez obtenido el fragmento o variante deseado de lys-plasmin´ ogeno, se pueden emplear las t´ecnicas descritas aqu´ı para determinar si el fragmento o variante es eficaz para las terapias anteriores, tales como tratamiento de la lesi´ on por reperfusi´ on y, si lo es, identificar un intervalo de dosificaci´ on apropiado. El modelo de apoplej´ıa en ratas descrito en el ejemplo siguiente es un modo simple y rentable de llevar a cabo este ensayo in vivo. La presente invenci´on tambi´en contempla la utilizaci´on de progenitores de lys-plasmin´ogeno, esto es, precursores de lys-plasmin´ogeno as´ı como sustancias que act´ uan sobre un precursor de lysplasmin´ ogeno para generar lys-plasmin´ogeno. Es ilustrativo de los progenitores de lys-plasmin´ ogeno el glu-plasmin´ogeno, que es escindido por una proteasa adecuada para generar lys-plasmin´ ogeno. Una sustancia que efect´ ua dicha escisi´on proteol´ıtica es la plasmina, cuya utilizaci´ on cae dentro del alcance de esta invenci´on como se ha establecido antes. Este modelo de apoplej´ıa en ratas descrito m´as abajo tambi´en es u ´ til para evaluar la eficacia de los progenitores del lys-plasmin´ ogeno. El lys-plasmin´ogeno puede ser obtenido mediante escisi´ on proteol´ıtica del glu-plasmin´ ogeno para separar las secuencias de amino´acidos del glu-plasmin´ ogeno. Los m´etodos para producir el lys-plasmin´ ogeno se describen con m´ as detalle en la Solicitud Europea 0.353.218. Ver tambi´en Neuwenhuizen, supra. Un ejemplo presentado m´ as abajo demuestra un efecto previamente desconocido del lys-plasmin´ ogeno que implica su eficacia, y la de las variantes y progenitores del lys-plasmin´ ogeno as´ı como la plasmina y las prote´ınas formadoras de plasmina, en el tratamiento de la lesi´on por reperfusi´on. Hasta ahora, solo se sab´ıa que el lys-plasmin´ogeno funcionaba en la fibrinolisis. No se esperaba que la plasmina o cualquier prote´ına formadora de plasmina, tal como el lys-plasmin´ ogeno, fuera susceptible de superar la barrera hematoencef´ alica, lo que se presum´ıa que era necesario para ser eficaz en el sitio del evento isqu´emico cerebral. Tambi´en existen otros usos para el lys-plasmin´ogeno. El lys-plasmin´ ogeno es provechoso en el tratamiento de sujetos tras una atrofia card´ıaca. La administraci´ on de lys-plasmin´ ogeno puede evitar el perjuicio isqu´emico de las c´elulas neurales. El lys-plasmin´ ogeno tambi´en puede ser utilizado en el tratamiento de la isquemia corporal total (choque), la isquemia de los intestinos y las extremidades inferiores y para la conservaci´on de o´rganos para el trasplante previniendo la isquemia. Entre los m´etodos de administraci´on se incluyen los utilizados para tratamientos de lisis de co´ agulos, t´ıpicamente por rutas intravenosas. La dosis de lys-plasmin´ogeno a emplear en esta invenci´on se deber´ a basar en el peso del sujeto y se deber´a administrar a una dosis de aproximadamente 10 a 1.000 unidades caseinol´ıticas (“UC”)/kg. Preferiblemente, la dosis deber´ a ser de aproximadamente 100 a 600 UC/kg, y m´ as preferiblemente la dosis deber´a ser de aproximadamente 500 UC/kg. El lys-plasmin´ ogeno puede ser administrado durante la reperfusi´ on sangu´ınea, lo que tendr´ıa lugar cuando el lys-plasmin´ ogeno sea administrado junto con los tratamientos de lisis de co´agulos convencionales tales como t-pa. Adicionalmente, el efecto beneficioso del lys-plasmin´ogeno puede ser obtenido todav´ıa cuando se administra una vez que la reperfusi´ on ya ha comenzado. Preferiblemente, el lys-plasmin´ogeno deber´a ser administrado antes o aproximadamente 30 minutos despu´es de que haya comenzado la reperfusi´on. Las variantes y los progenitores del lys-plasmin´ogeno deber´ an ser administrados en dosis que produzcan el mismo efecto que los intervalos de dosificaci´ on discutidos antes.

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Un tratamiento seg´ un la presente invenci´ on puede ser efectuado ventajosamente a trav´es de la administraci´on de las sustancias descritas antes en forma de composiciones inyectables. Una composici´on t´ıpica para tal prop´ osito comprende un portador farmac´euticamente aceptable. Una composici´on ejemplar en este contexto es el tamp´on veh´ıculo del lys-plasmin´ ogeno (9 g/L de NaCl, 1 g/l de citrato de Na3 ·2H2 O, 3 g/l de L-lisina, 6 g/l de NaH2 PO4 ·2H2 O y 40.000 KIU/l de aprotonina). Entre los portadores farmac´euticamente aceptables en este contexto se incluyen otras soluciones acuosas, excipientes no t´ oxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares, como se describe en Remington’s Pharmaceutical ags. 1405-1412 y 1461-1487 (1.975) y en The Nactional Sciences, 15a¯ Ed. Easton: Mack Publishing Co. p´ Ed. Washington: American Pharmaceutical Association (1.975) cuyos contenidos Formulary XIV., 14a ¯ se incorporan aqu´ı como referencia. Los ejemplos de los disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales y los ´esteres org´anicos inyectables tales como el oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen el agua, las soluciones alcoh´ olicas/acuosas, las soluciones salinas, los veh´ıculos parenterales tales como el cloruro de sodio, la dextrosa de Ringer, etc. Entre los veh´ıculos intravenosos se incluyen los reponedores de fluidos y nutrientes. Entre los conservantes se incluyen los antimicrobianos, los antioxidantes, los agentes quelantes y los gases inertes. El pH y la concentraci´on exacta de los diferentes componentes de la composici´on de aglutinaci´ on se ajustan seg´ un las artes rutinarias en la t´ecnica. Ver Goodman and Ggilma’s the Pharmacological Basis for Therapeutics (7a¯ ed.). 7

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Ejemplo 1 Efecto del lys-plasmin´ ogeno sobre las Secuelas de la Isquemia Cerebral en Ratas 5

En esta serie experimental, se evaluaron los efectos del lys-plasmin´ ogeno sobre las secuelas de la isquemia inducida experimentalmente en ratas. Se emplearon dos planteamientos diferentes para valorar las consecuencias neurol´ogicas de la isquemia. La isquemia fue inducida en ratas como se describe m´as abajo. 10

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Primero, se anestesian ratas Sprague-Dawley (peso 300-400 g) con 350 mg/kg de hidrato de cloral i.p., y despu´es se insert´ o un cat´eter en la vena yugular. Se separaron cinco mililitros de sangre a trav´es del cat´eter yugular (100 UI heparina en la jeringa) con el fin de reducir la presi´ on sangu´ınea arterial media a 50 mm Hg. Las arterias car´otidas preparadas se exponen y se pinzan simult´ aneamente a la recogida de sangre. Las pinzas se separan al cabo de un per´ıodo de 30 minutos, y la sangre separada es reinfundida R ) a las heridas. Los animales permanecen bajo (reperfusi´on). Se aplica un sellador de fibrina (Tisseel la anestesia durante un total de 24 horas (23,5 horas despu´es de la reperfusi´ on). Despu´es de recobrar la consciencia, cada animal experimenta uno de los siguientes procedimientos: Valoraci´ on del edema cerebral: Los animales se mantienen a temperaturas corporales constantes durante un total de 24 horas, se sacrifican con ´eter y se separan los cerebros. La valoraci´ on del edema cerebral se realiz´ o utilizando modificaciones de los m´etodos publicados para otras especies. Oh & Betz, Stroke 22: 915-21 (1.991).

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El contenido en humedad, que es un excelente par´ ametro para valorar el edema del cerebro inducido por isquemia/reperfusi´ on, se determina como sigue: Se pesan ambos hemisferios, se secan durante 17 horas a 200◦C, y se vuelven a pesar. El contenido en humedad se calcula como el porcentaje de peso h´ umedo total seg´ un la siguiente f´ormula: 30

Peso h´ umedo - Peso seco x 100 Peso h´ umedo Valoraci´ on de los d´eficits neurol´ ogicos:

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Se valoraron los d´eficits neurol´ ogicos de los animales el primer, el segundo y el tercer d´ıa despu´es de la operaci´ on. Wauquier et al., Neuropharmacology 28: 837-46 (1.989). Se evaluaron el estado de consciencia, la marcha, el tono muscular, el comportamiento sobre una escalera encima de la cabeza inclinada 45◦ , y el comportamiento sobre un disco rotatorio montado verticalmente en base al sistema de valoraci´ on mostrado en la Figura 1. Se calcula una puntuaci´ on cumulativa para los tres d´ıas (puntuaci´ on m´ axima = 54). Se administr´ o lys-plasmin´ ogeno (IMMUNO AG) intravenosamente por medio de un cat´eter o bien en la yugular o bien en la vena de la cola. Estas administraciones se realizaron en concentraciones crecientes en diferentes puntos en el tiempo. Los animales isqu´emicos tratados con soluci´on salina isot´ onica serv´ıan como controles positivos, mientras los animales sometidos a una operaci´on simulada y tratados con soluci´on salina isot´ onica serv´ıan como controles negativos. El tamp´ on para lys-plasmin´ ogeno descrito antes fue sometido a ensayo utilizando cada uno de estos procedimientos en experimentos separados. En la Figura 2 se exponen un resumen de las dosis, la agenda de administraci´on, los procedimientos experimentales y los resultados. Los resultados para 500 UC/kg de lys-plasmin´ ogeno (y el tamp´ on empleado como control) se muestran en las Figuras 3 y 4 para el edema y en las Figuras 5 y 6 para los d´eficits neurol´ ogicos. Los valores significativos se basaron en los test de la t para el edema y en el test de Kruskal-Wallis suponiendo una distribuci´ on chi cuadrado para los d´eficits neurol´ ogicos. Una dosis de 500 UC/kg de lys-plasmin´ ogeno mostraba un efecto protector significativo sobre la secuencia de la isquemia cerebral inducida experimentalmente en ratas. La agenda de administraci´ on no jugaba un papel esencial. Notablemente, el lys-plasmin´ ogeno todav´ıa ejerc´ıa un efecto protector incluso cuando se administraba 30 minutos despu´es del inicio de la reperfusi´ on. Esto contrasta con los resultados obtenidos para la medida terap´eutica patr´ on, flunarizina, que es un antagonista del calcio utilizado en la pr´ actica cl´ınica. La flunarizina (0,63 mg/kg suministrada intravenosamente) era eficaz cuando se 8

ES 2 119 934 T3 administraba en la sangre reperfundida, pero no ten´ıa efecto cuando se administraba 30 minutos despu´es de la reperfusi´ on (datos no mostrados).

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El lys-plasmin´ogeno (500 UC/kg) era capaz de revertir los efectos de la isquemia cerebral como se ha valorado en base al edema cerebral y a los d´eficits neurol´ ogicos en un modelo de isquemia experimental en rata. El tamp´ on utilizado en la preparaci´ on del lys-plasmin´ ogeno no ten´ıa efecto. En contraste con una medida terap´eutica patr´ on (flunarizina), el lys-plasmin´ ogeno era eficaz incluso cuando se administraba 30 minutos despu´es de la reperfusi´ on. Ejemplo 2 Efecto del Lys-plasmin´ ogeno sobre Procedimientos Quir´ urgicos

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Los procedimientos quir´ urgicos implican t´ıpicamente el cese del flujo sangu´ıneo hacia ciertos ´organos o tejidos, lo que normalmente se hace mediante pinzado. Este cese de flujo sangu´ıneo hacia el ´organo o tejido afectado causa un estado isqu´emico a desarrollarse en el ´organo o tejido, lo que con posterioridad conduce a una lesi´ on por reperfusi´ on una vez que el flujo sangu´ıneo es restaurado. Este estado isqu´emico y la posterior lesi´ on por reperfusi´on es particularmente problem´ atico en procedimientos quir´ urgicos que implican el trasplante de ´organos o tejidos a receptores.

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Los trasplantes implican un per´ıodo prolongado de pinzado del o´rgano o tejido a ser trasplantado, especialmente cuando se utilizan ´organos o tejidos de donadores al´ ogenos o xen´ ogenos. Este pinzado causa un cese del flujo sangu´ıneo en el ´organo o tejido, que est´ a seguido de la separaci´on del o´rgano o tejido del donador. El pinzado y la separaci´ on causan una isquemia en el o´rgano o tejido a trasplantar. La restauraci´on del flujo sangu´ıneo hacia el ´organo trasplantado durante la realizaci´ on del procedimiento causar´ a una lesi´on por reperfusi´on que ocurrir´ a en el ´organo o tejido as´ı como en los ´organos y tejidos circundantes del receptor. En situaciones como los trasplantes de ri˜ no´n donde el donador a menudo est´ a y permanece vivo, el ´area corporal del donador que rodea el ri˜ no´n separado deber´ a ser protegida contra la isquemia y la lesi´on por reperfusi´ on.

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Seg´ un la presente invenci´ on, los estados isqu´emicos y la posterior lesi´on por reperfusi´ on causados por los procedimientos quir´ urgicos pueden ser prevenidos o tratados con prote´ınas que tienen el efecto del lys-plasmin´ogeno o de los progenitores del lys-plasmin´ ogeno. Tales prote´ınas pueden incluso tener un impacto beneficioso sobre los ´organos o tejidos trasplantados del donador, as´ı como sobre los o´rganos y tejidos circundantes del donador y el receptor. La administraci´ on de prote´ınas que tienen el efecto del lys-plasmin´ogeno o de los progenitores del lys-plasmin´ ogeno permite que los ´organos y tejidos toleren per´ıodos prolongados de isquemia as´ı como la tensi´on fisiol´ ogica causada por la reperfusi´ on. El perjuicio de o´rganos y tejidos puede ser reducido o prevenido mediante la administraci´ on de prote´ınas que tengan el efecto del lys-plasmin´ogeno o de los progenitores del lys-plasmin´ ogeno antes de que comience el procedimiento quir´ urgico. En el caso de los trasplantes, las prote´ınas de la presente invenci´on pueden ser administradas al donador antes de la separaci´ on del o´rgano o tejido. El donador puede ser tratado sist´emicamente o localmente en una arteria que abastece al ´organo o tejido antes de la separaci´ on de ese ´organo o tejido. Del mismo modo, un receptor de un o´rgano o tejido puede ser tratado antes del trasplante con el fin de proteger los o´rganos y el tejido que rodean el a´rea del trasplante as´ı como el ´organo o tejido a colocar en el receptor. Las prote´ınas que tienen el efecto del lys-plasmin´ogeno o de los progenitores del lys-plasmin´ogeno tambi´en pueden ser administradas durante o despu´es de la reperfusi´on. Preferiblemente, el lys-plasmin´ogeno se administra para tratar la lesi´ on por reperfusi´ on. La dosis eficaz de lys-plasmin´ogeno a administrar sist´emicamente oscilar´a entre 10 y 1.000 UC/kg. Preferiblemente, la dosis deber´a ser de aproximadamente 100 a 600 UC/kg, y m´ as preferiblemente la dosificaci´on deber´ a ser de aproximadamente 500 UC/kg. Cuando se utilicen administraciones locales, la dosis deber´ a ser calculada para que se aproxime a las dosis sist´emicas descritas antes en el ´area a tratar.

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Se debe entender que la descripci´on, las figuras y los ejemplos espec´ıficos, si bien indican las realizaciones preferidas de la invenci´on, se dan a modo de ilustraci´ on y no se pretende limitar la presente invenci´on. 60

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ES 2 119 934 T3 REIVINDICACIONES

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1. La utilizaci´on de lys-plasmin´ ogeno para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de la lesi´ on por reperfusi´on administrando dicha composici´ on farmac´eutica a un sujeto en riesgo. 2. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, para el tratamiento de la isquemia y la lesi´ on por reperfusi´ on concomitante, la lesi´on por reperfusi´ on posterior a un evento isqu´emico, el perjuicio de los tejidos posterior a la reperfusi´ on y el perjuicio cerebral posterior a la reperfusi´ on.

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3. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, para la mejora de la microcirculaci´ on y el tratamiento de la lesi´on por reperfusi´on administrando dicha composici´ on farmac´eutica a un sujeto en riesgo por una microcirculaci´on defectuosa. 4. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, administrando dicha composici´on farmac´eutica a un sujeto, donde dicho sujeto es susceptible de lesi´ on por reperfusi´ on. 5. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 4, donde dicho sujeto est´ a teniendo o ha tenido una apoplej´ıa.

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6. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 4, donde dicho sujeto est´ a teniendo o ha tenido un infarto. 7. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 4, donde dicho sujeto est´ a sufriendo o ha sufrido una operaci´on.

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8. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, administrando dicha composici´on farmac´eutica a un sujeto que ha contra´ıdo dicha lesi´on. 9. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, administrando dicha composici´on farmac´eutica a un sujeto que padece isquemia o infarto.

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10. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 9, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra a un sujeto que padece isquemia cerebral. 11. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 9, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra a un sujeto que padece apoplej´ıas isqu´emicas transitorias. 12. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 9, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra a un sujeto que sufre una operaci´ on.

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13. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, administrando dicha composici´on farmac´eutica a un paciente quir´ urgico. 14. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 13, donde dicha etapa de administraci´ on se realiza antes, durante, o despu´es de que dicho paciente sufra la operaci´on.

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15. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 13, donde dicho paciente quir´ urgico recibe un tejido u o´rgano trasplantado. 16. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, para el tratamiento de la lesi´ on por reperfusi´on en un donador de tejido u o´rgano administrando dicha composici´ on farmac´eutica a un donador de dicho tejido u o´rgano a trasplantar. 17. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, para el tratamiento de un donador de tejido u o´rgano administrando dicha composici´ on farmac´eutica a un donador de dicho tejido u o´rgano a donar.

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18. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 17, donde dicha prote´ına se administra sist´emicamente a dicho donador. 19. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 17, donde dicha prote´ına se administra localmente a dicho donador. 20. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 1, donde dicha composici´ on farmac´eutica contiene de 10 a 1.000 UC (unidades caseinol´ıticas) de dicho lys-plasmin´ ogeno por kg del sujeto. 10

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21. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 20, donde dicha composici´ on farmac´eutica contiene de 100 a 600 UC de dicho lys-plasmin´ ogeno por kg del sujeto. 5

22. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 21, donde dicha composici´ on farmac´eutica contiene 500 UC de dicho lys-plasmin´ogeno por kg del sujeto. 23. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 20, 21 o 22, donde dicha composici´on farmac´eutica se administra antes, durante o aproximadamente en los 30 minutos siguientes al comienzo de la reperfusi´ on.

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24. La utilizaci´ on de plasmina y lys-plasmin´ogeno para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento de la lesi´on por reperfusi´ on administrando dicha composici´ on farmac´eutica a un sujeto en riesgo. 15

25. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 24, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra a un sujeto en riesgo de isquemia cerebral. 26. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 24, para el tratamiento de la lesi´ on por reperfusi´on debida a un evento isqu´emico o infarto.

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27. La utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 26, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra a un sujeto en riesgo de ataques isqu´emicos transitorios.

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28. La utilizaci´ on seg´ un la reivindicaci´ on 27, donde dicha composici´ on farmac´eutica se administra antes, durante, aproximadamente en los 30 minutos siguientes al evento isqu´emico o al infarto. 29. La utilizaci´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha prote´ına est´a derivada del plasma o producida mediante t´ecnicas de recombinaci´on.

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30. La utilizaci´on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha prote´ına est´a tratada para inactivar virus. 31. La utilizaci´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composici´on farmac´eutica comprende adicionalmente un activador del plasmin´ ogeno.

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32. La utilizaci´on seg´ un reivindicaci´ on 31, donde dicho activador del plasmin´ ogeno se selecciona del grupo formado por el activador del plasmin´ ogeno de tipo tejido, el activador de tipo uroquinasa, la prouroquinasa y el activador de tipo estreptoquinasa. 40

33. La utilizaci´ on seg´ un cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composici´on farmac´eutica comprende adicionalmente un portador farmac´euticamente aceptable.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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Fig. 1 Sistema de puntuaci´ on para la evaluaci´ on de d´eficits neurol´ ogicos Descripci´on

Puntuaci´ on

Estado de consciencia

normal inquieto ap´ atico aturdido accesos

0 1 2 3 4

Marcha

normal patas tensas dando vueltas hipomotilidad incapaz de sostenerse

0 1 2 3 4

Escalera sobre la cabeza (45◦ ):

trepa cuelga durante 5 segundos y levanta las patas traseras cuelga durante 5 segundos cuelga < de 5 segundos sin reflejo

0

Disco rotatorio vertical:

Tono muscular:

1 2 3 4

soporta rotaci´ on de 180◦ durante > 5 segundos soporta rotaci´ on de 180◦ durante < de 5 segundos se mantiene encima solo hasta 90◦ no se mantiene en absoluto

2 3

normal d´ebil

0 1

0 1

Puntuaci´ on total:

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Muerte (excepto debido a operaci´ on)

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Fig. 2 Resumen de la Evaluaci´ on de Lys-Plasmin´ ogeno Intravenoso y Tamp´ on Utilizando el “Modelo de Apoplej´ıa” en Ratas Dosis de Sustancia/kg

Agenda de Administraci´ on

Procedimiento (n animales)

Resultados

Lys-plasmin´ogeno 200 UC

Con reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=9 o 10 animales cada uno)

Tendencia al efecto protector, no significativo∗

Lys-plasmin´ogeno 250 UC

15 minutos antes de empezar la isquemia

Edema (3 grupos, n=15 0 17 cada uno)

Sin efecto

Lys-plasmin´ogeno 500 UC

antes de empezar la isquemia y con reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=1,5 cada uno)

Efecto protector significativo

An´ alogo tamp´ on 500 UC

antes de empezar la isquemia y con reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=6 cada uno)

Sin efecto

Lys-plasmin´ogeno 500 UC

Con reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=6 cada uno)

Efecto protector significativo (ver Fig. 3)

An´ alogo tamp´ on 500 UC

Con reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=7 u 8 cada uno)

Sin efecto (ver Fig. 4)

Lys-plasmin´ogeno 500 UC

Con reperfusi´on sangu´ınea

D´eficits neurol´ ogicos (3 grupos, n=10 cada uno)

Efecto protector significativo (ver Fig. 5)

An´ alogo tamp´ on 500 UC

Con reperfusi´on sangu´ınea

D´eficits neurol´ ogicos (3 grupos, n=6 cada uno)

Sin efecto (ver Fig. 6)

Lys-plasmin´ogeno 500 UC

30 minutos despu´es de la reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=8 o 9 cada uno)

Efecto protector significativo

Lys-plasmin´ogeno 500 UC

60 minutos despu´es de la reperfusi´on sangu´ınea

Edema (3 grupos, n=5 o 6 cada uno)

Sin efecto

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