Fisiología Vegetal ambiental Curso 2009-10

ESTRÉS NUTRICIONAL DE LAS PLANTAS

El texto que a continuación se expone, estuvo realizado por los alumno de la asignatura de Fisiología Vegetal Ambiental del curso 20098-09, Núñez Daza, Pastora MaríaGalván Rubio, CristinaMartínez Aguado, PabloMiralles Durán, Alejandro. Aunque no participo de algunas de las afirmaciones vertidas, el texto, en general, configura una buena forma de adentrarse en la fisiología del estrés en vegetales. No obstante, recomiendo encarecidamente la lectura de la bibliografía complementaria para superar la asignatura. Alfonso de Cires Segura Septiembre 2009

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ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN

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2. SUELOS ÁCIDOS 2.1. CONCEPTOS GENERALES 2.2. TOXICIDAD DEL ALUMINIO GENERALIDADES MECANISMOS DE LA TOXICIDAD ÁPICES RADICULARES MECANISMOS MOLECULARES DE LA TOCIXIDAD ALTERACIONES NUTRITIVAS PROVOCADAS POR EL ALUMINIO ENMIENDAS MECANISMOS DE RESISTENCIA A LA TOXICIDAD CUESTIONARIO BLOQUE 2

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3. SUELOS BÁSICOS 3.1 GENERALIDADES: DEFICIENCIA Y TOXICIDADES 3.2 TIPOS DE PLANTAS 3.3 EL CALCIO COMO MACRONUTRIENTE 3.4 TOXICIDAD POR CALCIO TIPOS DE PLANTAS 3.5 SOLUBILIZACIÓN DEL HIERRO ¿CÓMO ADQUIEREN LAS PLANTAS EL HIERRO DEL SUELO? ESTRATEGIAS PARA ADQUIRIR EL HIERRO ESTRATEGIA DE REDUCCIÓN QUÍMICA O QUELACIÓN CLONACIÓN DE GENES DE LA ADQUISICIÓN DE HIERRO LIBERACIÓN DE FITOSIDERÓFOROS DE UNIÓN A HIERRO EN GRAMÍNEAS AVANCES RECIENTES ASPECTOS MOLECULARES DE LA ADQUISICIÓN DE HIERRO CUESTIONARIO BLOQUE 3

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4. SUELOS OLIGOTRÓFICOS 4.1 GENERALIDADES 4.2 TIPOS DE PLANTAS QUE COLONIZAN ESTE ECOSISTEMA 4.3 DEFICIENCIA GENERAL DE NUTRIENTES OLIGOTROFÍA OBTENCIÓN DE NUTRIENTES POR LAS PLANTAS 4.4 ESTRATEGIAS PARA AUMENTAR LA EFICIENCIA NUTRICIONAL 4.5 ADAPTACIONES A SUELOS OLIGOTRÓFICOS PLANTAS PARÁSITAS MICORRIZAS: HONGOS SIMBIONTES DE PLANTAS VASCULARES

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LOS EPIFITOS PLANTAS CARNIVORAS CUESTIONARIO BLOQUE 4 5. SUELOS CON METALES PESADOS 5.1 INTRODUCCIÓN 5.2 ORIGEN DE LOS METALES PESADOS EN EL SUELO 5.3 PROCESOS QUE DETERMINAN LA DINÁMICA DE LOS METALES PESADOS EN EL SUELO LIXIVIACIÓN VOLATILIZACIÓN ABSORCIÓN POR ORGANISMOS . PROCESOS METABÓLICOS PRECIPITACIÓN COMPLEJACIÓN ADSORCIÓN ADSORCIÓN A MINERALES DE LA ARCILLA ADSORCIÓN A LA MATERIA ORGÁNICA ADSORCIÓN A COMPLEJOS ORGANOMINERALES 5.4 IMPORTANCIA DEL ESTRÉS POR METALES PESADOS 5.5 CONCENTRACIONES TÓXICAS CRÍTICAS, DISPONIBILIDAD Y BIOACUMULACIÓN DE LOS METALES. RELACIÓN PLANTA-SUELO PATRONES DE ACUMULACIÓN EN PLANTA MECANISMOS DE ABSORCIÓN Y TRANSPORTE 5.6 EFECTOS DELETÉREOS CRECIMIENTO FOTOSÍNTESIS ESTOMAS ENZIMAS ESTRÉS HÍDRICO INFLUENCIA DE CATIONES 5.7 MECANISMOS DE DEFENSA FITOQUELATINAS Y METALOTEÍNAS GLUTATIÓN 5.8-RESPUESTAS DE LAS PLANTAS A LA TOXICIDAD DE LOS METALES PESADOS SÍNTOMAS VISIBLES RESPUESTAS A NIVEL METABÓLICO Y CELULAR MECANISMOS DE RESISTENCIA 5.9 FITORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR METALES PESADOS 5.10-CONCLUSIONES CUESTIONARIO BLOQUE 5 BIBLIOGRAFÍA

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1. INTRODUCCIÓN La biodiversidad hace que los requerimientos nutricionales en las plantas sean diferentes, sobreviviendo algunas especies en condiciones adversas, debido a una adaptación genética a su habitat e incluso variedades de una misma especie presentan diferencias en la absorción, translocación, acumulación y uso de los nutrientes (Otani y Ae, 1996). Estas diferencias pueden ser aprovechadas ventajosamente en el mejoramiento de plantas teniendo en cuenta su crecimiento en condiciones específicas de fertilidad y su adaptación a la presencia de factores fitotóxicos (Fageria et al., 1996; Bahia Filho et al., 1997). Idealmente, las plantas más eficientes en el aprovechamiento de nutrientes son aquéllas que, bajo determinadas condiciones nutricionales, normales o adversas, consiguen absorber, translocar, acumular y utilizar mejor el nutriente para la producción de grano y/o materia seca o verde (Barriga y Marambio, 1995; Clarke et al., 1990). La disponibilidad de nutrientes (carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, etc.) es una parte fundamental del ambiente de las plantas y que determinada por el agua el modo decisivo de muchos aspectos de la estructura, composición y funcionamiento de la vegetación. La absorción de los nutrientes está vehiculada por el agua. Esta disponibilidad es muy variable con valores máximos para el N casi 300 veces mayores a los mínimos, si se comparan desiertos y bosques tropicales ricos. Es precisamente el N el nutriente que se necesita en mayor cantidad y también es el más frecuente limitante junto al fósforo. Los nutrientes deben estar disueltos en el agua del suelo, y desde allí pueden ser absorbidos directamente por la planta, pero ésta es una fracción mínima del total. Una fracción algo mayor está absorbida en los coloides (arcillas y sustancias húmicas), y para extraerla la planta debe intercambiar iones (liberando H+ y HCO3- ) con la superficie de los coloides del suelo. Pero la mayor parte de los nutrientes se halla formando parte de las sustancias orgánicas o de minerales no solubles. Las raíces excretan hidrogeniones, aumentando su capacidad reductora, y compuestos orgánicos ligeros que forman quelatos solubles con los nutrientes, con lo éstos pueden ser absorbidos por las raíces. El transporte de iones a través de las membranas celulares puede ser pasivo, a favor de un gradiente de concentración, pero a veces es activo, contra gradiente, lo que exige inversión de energía (aumentando la respiración). Estos iones, hasta cierto punto, pueden ser tomados selectivamente (se toman más cationes que aniones) y, en algunos casos, pueden ser acumulados en reservas. Tras atravesar las células de la raíz, los iones llegan al xilema y entran en el flujo transpiratorio, que los llevará hacia el resto de la planta. DEFINICIÓN DE ESTRÉS EN VEGETALES El concepto original de estrés general en organismos vivos desarrollado por Hans Selye (1936, 1956) puede resumirse en las siguientes frases: “Todos los agentes pueden actuar como agentes estresantes, produciendo tanto estrés como acción específica” y “Existen respuestas específicas de cada agente estresante y respuestas inespecíficas”. Levitt (1980) definió el estrés como “Cualquier factor ambiental potencialmente desfavorable para los organismos vivos”. El ecofisiólogo vegetal Larcher (1987) describió el estrés en vegetales como “un estado en el que las crecientes demandas hechas a una planta conducen a una desestabilización de funciones, seguida

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por la normalización y por una resistencia mejorada”. Además, “si los límites de la tolerancia son excedidos y se sobrepasa la capacidad adaptativa, el resultado puede ser el daño permanente o incluso la muerte”. Lichtenthaler (1998) indicó que el estrés en los vegetales es “cualquier condición desfavorable para el crecimiento y desarrollo de los vegetales” y también subrayó que en la mayor parte de los casos “las plantas pueden recuperarse cuando desaparecen los agentes estresantes”.

EU-ESTRÉS Y DIS-ESTRÉS El concepto de estrés en vegetales se extendió, diferenciando entre eu-estrés y dis-estrés, en el que el primero tiene carácter positivo, activador, mientras que el segundo es un estrés severo que causa daño (Lichtenthaler, 1998): Eu-estrés es un estrés suave y estimulante que activa el metabolismo celular e incrementa la actividad fisiológica de la planta. Es un elemento positivo y una fuerza impulsora del crecimiento vegetal. Dis-estrés es cualquier condición desfavorable sea de alta intensidad o de alta duración que afecta negativamente al metabolismo vegetal, al crecimiento y al desarrollo. El dis-estrés sobrecarga los mecanismos que permiten hacer frente al estrés y los mecanismos de resistencia de los vegetales, causando daño y, eventualmente, la muerte. En contraste con el dis-estrés, el eu-estrés no causa ningún efecto de daño ni siquiera a largo plazo. Tal estrés suave y estimulante es favorable para la planta. El concepto eu-estrés/dis-estrés pone el énfasis en que “el estrés es un asunto que es dependiente de la dosis”. A concentraciones bajas un agente estresante, por ejemplo un herbicida, puede estimular el metabolismo vegetal y el crecimiento, tal y como ha sido observado en el caso de varios herbicidas y reguladores de crecimiento ()Lichtenthaler, 1996). Sin embargo, a concentraciones de 10 a 100 veces mayores los mismos xenobióticos causarán daño al vegetal e inducirán senescencia temprana, finalmente conducente a la muerte si no se elimina el agente estresante. Tales dosis altas del agente estresante capaces de producir daño son negativas para la fisiología y el desarrollo de las plantas, y por lo tanto representan claramente estrés en el sentido de un dis-estrés. Dentro de este concepto, el estrés real se muestra cuando se excede un determinado umbral del agente estresante, a partir del cuál ya no es posible la compensación que la planta pueda realizar mediante aclimataciones, adaptaciones fisiológicas o mecanismos para sobreponerse al estrés. Cuando este umbral de tolerancia al estrés o de resistencia al estrés se sobrepesa, un fuerte estrés de corta duración puede inducir sustancialmente el mismo daño que un estrés más suave de larga duración. La aplicabilidad de las relaciones dosis del agente estresante-respuesta de estrés parece ser obvia en la mayoría de los agentes estresantes. La transición entre eu y dis-estrés es fluida. La posición relativa del umbral de tolerancia depende no sólo de la especie, sino también del tipo de agente estresante aplicado y de la predisposición de la planta, esto es, de la condición de crecimiento y la vitalidad antes de que el agente estresante comience a actuar. Los vegetales también difieren en sus capacidades para sobreponerse al estrés. Esto puede ilustrarse con el ejemplo de la aplicación de herbicidas en cosechas agrícolas para la eliminación de

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malas hierbas. Muchas cosechas, incluyendo plantas transgénicas especialmente construidas al efecto, poseen la capacidad para detoxificar determinados herbicidas, por ejemplo mediante la introducción de un grupo hidroxilo en el anillo aromático de un herbicida que es entonces glicosilado formándose un compuesto inactivo que ya no puede ligarse a su proteína diana. Esta capacidad de detoxificación usualmente no está presente en las malas hierbas que se desea controlar, de manera que son eventualmente eliminadas. Consecuentemente, las mala hierbas poseen una tolerancia mucho menor al estrés que las plantas de cosecha como el trigo o el maíz, que poseen el mecanismo de detoxificación del herbicida. La habilidad para detoxificar representa un mecanismo típico para sobreponerse al estrés. LAS DISTINTAS FASES INDUCIDAS POR EL ESTRÉS Modificando el concepto general de estrés de Hans Selye, en las respuestas de los vegetales pueden distinguirse tres fases (Larcher, 1987) a las cuáles Lichtenthaler (1988, 1996) añadió una cuarta, la fase de regeneración. Antes de la exposición al estrés las plantas poseen unos niveles estándar fisiológicos que se pueden considerar óptimos dentro de los límites impuestos por el crecimiento, la luz y la disponibilidad de nutrientes de la localidad. Los agentes estresantes o los eventos complejos de agentes estresantes inducirán los siguientes fases de respuesta en los vegetales, que son seguidas por la fase de regeneración tras la eliminación del agente o agentes estresantes: 1.-Fase de respuesta: Reacción de alarma (comienzo del estrés) -desviación frente a la norma funcional -disminución de la vitalidad -los procesos catabólicos sobrepasan a los anabólicos 2.-Fase de restitución: Estadio de resistencia -procesos de adaptación -procesos de reparación -endurecimiento (reactivación) 3.-Fase final: Estadio de agotamiento (estrés de larga duración) -intensidad excesiva del estrés -sobrecarga e la capacidad adaptativa -daño crónico o muerto 4.-Fase de regeneración: Regeneración parcial o plena de las funciones fisiológicas cuando desaparece el agente estresante y el daño previo no alcanzó niveles demasiado altos. Al principio del estrés (fase1) los vegetales responden con una disminución en una o varias funciones fisiológicas, tales como la capacidad o rendimiento fotosintético, transporte o acumulación de metabolitos o absorción y transporte de iones, todo ello a menudo acompañado por un incremento respiratorio. Debido a esta disminución en varias actividades celulares catabólicas, los vegetales se desvían de sus estándares fisiológicos y su vitalidad desminuye. Ocurrirá rápidamente daño agudo en aquellas plantas que posean mecanismos limitados de tolerancia al estrés o carezcan completamente de dichos mecanismos, por lo que estas plantas poseerán un mínimo de resistencia bajo (Figura 1.1). Durante esta fase de alarma los vegetales activarán sus

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mecanismos para sobreponerse al estrés, esto es, sufrirán rápidas aclimataciones de las tasas metabólicas, activarán procesos de reparación además de adaptaciones metabólicas y morfológicas a más largo plazo. Esto recibe también el nombre de síndrome general de alarma, que aquí denominaremos en lo sucesivo mediante sus siglas en inglés –GASademás de llamarse aclimatación general o síndrome de adaptación general. La síntesis de novo de proteínas de estrés y metabolitos de estrés, los procesos de reparación y las adaptaciones no sólo conducirán a una restitución de las funciones fisiológicas previas (fase 2), sino que también inducirán un endurecimiento de las plantas estableciendo nuevos estándares fisiológicos, lo que significa un nuevo estadio óptimo fisiológico bajo las nuevas condiciones ambientales. Esta etapa corresponde al máximo de resistencia del vegetal (Figura 1.1). La fase de agotamiento aparece tras una situación de estrés a largo plazo o cuando hay una sobrecarga de los mecanismos que permiten sobreponerse al estrés por haberse superado el umbral de dosis-respuesta. En esta fase se pierden progresivamente capacidades fisiológicas y vitalidad. Esto causa daños y, finalmente, la muerte celular. Sin embargo, cuando los agentes estresantes son eliminados antes de que predominen los procesos de senescencia, las plantas se regenerarán, desplazándose a nuevos estándares fisiológicos (fase de regeneración). Dependiendo del momento y el estado de agotamiento en el que desaparecen los agentes estresantes, se definen unos u otros nuevos estándares fisiológicos que serán alcanzados por la planta (en esta fase 4) entre

los valores mínimo y máximo de resistencia (Figura 1.1). Figura 1.1 El concepto general de estrés en las plantas mostrando las diferentes fases secuenciales y las respuestas inducidas en las plantas por la exposición a varios tipos de estrés. Las plantas que crecen en una determinada condición fisiológica estándar responderán y harán frente a los agentes estresantes con una fase de alarma, una de resistencia, una de agotamiento y eventualmente existirá también una fase de regeneración cuando el estrés haya dejado de ser tan severo. Tras la desaparición del o los agentes estresantes pueden alcanzarse nuevos estándares fisiológicos dependiendo del momento de eliminación del agente estresante y de la duración e intensidad del estrés. Un estrés demasiado fuerte o largo que no pueda compensarse mediante adaptaciones o mecanismos de respuesta al estrés causará la muerte celular.

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Las plantas reajustan continuamente sus estándares fisiológicos en relación con factores tanto internos como externos. Cambios endógenos en el programa de desarrollo vegetal controlados genéticamente se asocian siempre con cambios en el programa de actividad fisiológica y resultan en nuevos estándares fisiológicos. Asimismo, inmediatamente aparecerán nuevos eventos de estrés inducido por cambios climáticos o ambientales, lo que requerirá una nueva reorientación del estándar fisiológico de la planta hasta un nuevo óptimo ajustado a las limitaciones marcadas. El estrés y la tensión son sucesos rutinarios en la vida de una planta. L existencia de estrés y tensión continuados no significan, sin embargo, que exista necesariamente daño alguno. Si la intensidad y la duración de los agentes estresantes no son demasiado alta o larga, las plantas se ajustarán ellas mismas dentro del rango impuesto por los mínimos y máximos de resistencia (Figura 1.1). En tales casos las plantas estarán bajo tensión, pero no habrá síntomas detectables de daño. Si se quiere tomar contramedidas contra el estrés y la tensión para evitar el daño potencial y para garantizar un crecimiento óptimo y elevada cosecha en plantas cultivadas, no se debería esperar hasta que los síntomas de daño se hagan visibles, sino que habrá que responder mucho antes. Y esto requiere la detección precoz del estrés y de la tensión, por ejemplo mediante la nueva técnica de análisis de imágenes de fluorescencia de alta resolución. RESTRICCIONES DEL ESTRÉS Y AGENTES ESTRESANTES Existen muchos sucesos de estrés y una multitud de agentes estresantes actúan a lo largo del ciclo de vida de los vegetales. Los diferentes tipos de agentes estresantes que actúan en las plantas terrestres pueden clasificarse como naturales o antropogénicos. Los factores estresantes naturales pueden dividirse en bióticos y abióticos tal y como muestra la figura 1.2.

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Figura 1.2 Esquema de la ruta de percepción y transducción de la señal de estrés inducida por un agente estresante y que conduce a la respuesta metabólica, cambios en la expresión génica y respuestas inducidas por el estrés. Los agentes estresantes pueden clasificarse en naturales (abióticos y bióticos) y antropogénicos.

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2. SUELOS ÁCIDOS 2.1. CONCEPTOS GENERALES La acidez del suelo limita el crecimiento de las plantas en muchas partes del mundo. En suelos minerales ácidos las mayores limitaciones para el crecimiento de las plantas son los siguientes: - Incremento en la concentración de H+: toxicidad por H+. - Incremento en la concentración de aluminio: toxicidad por aluminio. - Aumento en la concentración de manganeso: toxicidad por manganeso. - Disminución en la concentración de cationes que son macronutrientes: magnesio, calcio (y potasio), disminuyen. - Disminuye la solubilidad del fósforo y molibdeno: deficiencia en fósforo y molibdeno. - Inhibición del crecimiento de la raíz y la captación de agua: deficiencia nutricional, estrés hídrico, aumento del lixiviado de nutrientes. La importancia relativa de estas limitaciones dependen de las especies y características genotípicas de cada una, el tipo de suelo y horizonte, roca madre, valor del pH, concentración y especies de aluminio, estructura y aireación del suelo, y clima. Los niveles de nitrógeno en los suelos minerales ácidos son generalmente bajos. La toxicidad por aluminio y las deficiencias de calcio y magnesio se dan en más de un 70% de los suelos ácidos de América tropical, y casi todos estos suelos son deficientes en fósforo o tienen una elevada capacidad de fijación del mísmo (Sánchez and Salinas, 1981). La acidez del subsuelo es un factor potencial de la limitación del crecimiento en muchas áreas de USA (Foy et al., 1974) y en los trópicos (Van Raij, 1991). Los suelos forestales en muchas regiones del mundo son ácidos. Hace pocos años la preocupación ha aumentado por el incremento de la acidificación de los suelos forestales por emisiones atmosféricas de SO2 y óxidos de nitrógeno (“lluvia ácida”) como causantes de daños en los bosques particularmente en Europa y América del Norte. Se piensa que se ha producido un aumento de la solubilidad del aluminio y éste ha producido un decremento en la concentración y captación de nutrientes, particularmente el magnesio, y así deficiencias en magnesio (Zoettl and Huettl, 1986; Kaupenjohann et al., 1987; Liu and Huettl, 1991), y un incremento en la deficiencia de calcio y magnesio porque el elevado nitrógeno atmosférico accede a las partículas (Schulze, 1989; Aber et al., 1989). Rangos de pH habituales: - Suelos regiones húmedas: ligeramente ácidos a neutros (5-7). - Suelos regiones secas: alta concentración carbonatos e iones alcalinos: 8-9 a 10. - Zonas pantanosas, zonas mineras de piritas: suelos extremos: pHCO3H-+ H+ CO32- + H+ Se pueden producir ácidos en los suelos debido a la hidratación y disociación de CO2, formación de ácidos orgánicos, reducción de sulfide a ácido sulfurico y nitrificación del amonio. - Inducción mediada por la nutrición de las plantas. - Absorción cationes (NH4+ o N2) >>>> absorción aniones. - De origen antrópico: - lluvia ácida (nítrico, sulfúrico). - fertilizantes ácidos (sulfato amónico). La planta también puede inducir acidez cuando hay un exceso de cationes sobre aniones. CAPACIDAD TAMPONANTE DEL SUELO: La caracterización de un suelo debe incluir la determinación de las variaciones estacionales y espaciales de pH. ASPECTOS MÁS NEGATIVOS DE LA ACIDEZ DEL SUELO: - Procesos de formación y evolución del suelo: - Interferencias en su evolución físico-química (Edafología). - Actividad biológica del suelo: - Distribución y actividad microorganismos (Microbiología). - Disminución del crecimiento de las plantas:

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- Excesivo gasto de energía a nivel celular para la extrusión de protones y mantener el pH citoplasmático entre 6-7. - Disponibilidad de los diferentes nutrientes: - Deficiencias: PO43-, Ca2+, Mg2+, K+, MoO2- Toxicidad: Al3+, Fe2+ o Mn2+ 2.2. TOXICIDAD DEL ALUMINIO GENERALIDADES CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DEL ALUMINIO El aluminio es un elemento sólido en condiciones normales, de color blanco plateado, dúctil, y muy maleable. Cristaliza en forma cúbica. Lo podemos encontrar libre o combinado en la naturaleza. Es un metal trivalente, pertenece al grupo III A del tercer periodo de la tabla periódica y tiene un peso atómico de 25.98 y un número atómico de 13. Debido a su baja densidad (2.699 g·cm-3 a 20”C), no se incluye en el grupo de metales pesados. Su baja electronegatividad hace que sea un potente reductor, capaz de reducir a un gran número de óxidos metálicos además del agua, el CO2 y el CO. (Martín, 1988). La química del aluminio es bastante compleja. Debido a su alta carga iónica y su pequeño radio atómico, es capaz de reaccionar con otros metales que se encuentran en el suelo en forma soluble, y se han descrito una larga variedad de quelaciones y reacciones de hidrólisis. ESPECIACIÓN DEL ALUMINIO EN SOLUCIÓN ACUOSA El aluminio se encuentra en forma de Al (III) altamente hidratado en solución acuosa. Las soluciones acuosas de las sales de aluminio son ácidas debido a la hidrólisis del Al. Este ión de poco volumen y mucha carga, ejerce un fuerte campo eléctrico que atrae a los electrones, alejándolos de las moléculas de agua vecinas que se convierten en dadoras de protones (Martín, 1988). Es un ión altamente hidratado que se comporta como un metal duro con una considerable afinidad por bases fuertes y grupos cargados negativamente (RO- > C6H5O>> -COO-). Esta afinidad, que se da en grupos bien conocidos como efectivos agentes quelantes para el Al (III) y otros metales trivalentes (Fe3+, Ga3+, In3+), se pueden clasificar por orden decreciente según su afinidad al aluminio como glicoles, catecoles, hidroxiácidos alifáticos e hidroxiácidos aromáticos. Otros agentes quelantes para este tipo de metales trivalentes y que contiene estos grupos son el ácido cítrico, tartárico, glucónico, etc. Una importante consideración para definir a estos efectivos ligandos donadores es la competencia con hidrogeniones en solución acuosa, ya que sufren constantes protonaciones. Se considera, pues, que los más efectivos son los compuestos que contienen grupos hidroxil o fenil. También se han descrito compuestos inorgánicos capaces de quelar el aluminio como los grupos fluorhidríco y sufato.

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En general, y a pesar de que las formas queladas del aluminio se han considerado como formas no tóxicas para el aluminio, no existe un acuerdo unánime sobre este punto. QUÍMICA DEL ALUMINIO Y PH La fuerte tendencia del aluminio a formar formas hidrolíticas y la elevada insolubilidad del Al(OH)3, presentan grandes interferencias para medir las constantes de estabilidad de los complejos de Al(III). El aluminio es un elemento anfótero que puede actuar como catión Al(H2O)3+ en medio ácido y como anión en medio básico. El punto de pH al cual se da la variación es 5. Cuando el pH es inferior a 5 el ión se encuentra mayoritariamente en forma de complejo hexahidrato octaédrico. Cuando disminuye el pH las cargas de protones van disminuyendo y las cargas positivas del aluminio fuerzan la hidrólisis de las moléculas de H2O. En estudios en los que se determina la forma de aluminio predominante a cada valor de pH se observa que cuando se encuentra en un medio muy ácido, el aluminio se presenta en forma iónica (Al3+), o bien en forma de monómero, Al(OH)2+ y Al (OH)2+. A valores entre 3.5-5.0 aumentan mucho los polímeros de hidróxidos de aluminio llegando a una concentración máxima. Cuando el pH ya es superior a 5, tanto las formas monoméricas como los polímeros de hidróxido disminuyen mucho e incrementan los niveles de hidróxidos de aluminio altamente básicos que son muy insolubles y precipitan fácilmente por lo que son muy poco disponibles para la planta y, por tanto, no tienen mucho efecto sobre ésta.

Figura 2.1 Hexahidrato de aluminio. Las reacciones que encontramos son las siguientes: Al3+ + H2O

Al(OH) 2+ + H+

Al(OH) 2+ + H2O

Al(OH) 2+ + H+

Al(OH) 2+ + 2H2O

Al(OH)42- + 2H+

A pH neutro el aluminio se encuentra en la forma insoluble Al (OH)3 (gibsita).

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Según Wagatsuma y Kiyuda (1987), las formas iónicas polimerizadas son las mejor absorbidas por las plantas. Plantas tratadas con polímeros de aluminio presentaron los síntomas típicos de toxicidad por aluminio, mientras que en los tratamientos con aluminio en forma monomérica y Al2(SO4)3, no se reconoció ningún síntoma característico de la toxicidad por aluminio. La toxicidad por aluminio difiere marcadamente con la forma química de aluminio con la que trabajemos. La toxicidad más acusada por Al se ha visto que se produce a valores de pH bajos, donde predominan las formas poliméricas de hidróxidos de aluminio. De todas formas, el margen de pH donde podemos detectar la máxima toxicidad por aluminio depende tanto de la especie con la que trabajemos como con la variedad empleada. EL ALUMINIO Y LA IMPORTANCIA DE SU ESTUDIO El aluminio es un mineral abundante que representa alrededor del 8% de la corteza terrestre (figura 2.2). El químico danés Hans Christian Oersted aisló el aluminio por primera vez en 1825, por medio de un proceso químico que utilizaba una amalgama de potasio y cloruro de aluminio. Entre 1827 y 1845, el químico alemán Friedrich Wöhler mejoró el proceso de Oersted utilizando potasio metálico y cloruro de aluminio. Wöhler fue el primero en medir la densidad del aluminio y demostrar su ligereza, y en la exposición de París de 1855 exhibió el aluminio puro (Massot et al. 1991).

Figura 2.2. El aluminio es el tercer elemento más abundante en la corteza terrestre. Ya en 1918, este metal se había relacionado con diferentes procesos patológicos importantes, tanto en el hombre como en otros grupos de animales (Haung, 1984). El aluminio ha sido implicado en numerosos estudios como agente neurotóxico, provocando la degeneración de fibrillas nerviosas, lo cual ha sido observado en zonas del cerebro donde la concentración de aluminio era muy elevada. También se ha relacionado al Al con enfermedades como el Alzheimer y Parkinson (Crapper McLachlan, 1986).

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También a principios de siglo se comenzó a estudiar el aluminio en relación a su fitotoxicidad. El estudio de esta relación, últimamente ha cobrado gran importancia debido a dos importantes razones: en primer lugar porque diversos metales, entre ellos el aluminio, se han descrito como fuertes limitadores del crecimiento de las plantas provocando, por tanto, fuertes pérdidas económicas (Foy et al., 1978, Poscherieder et al., 1992), y en segundo lugar, porque los vegetales como productores primarios son la vía de entrada a la cadena alimentaría para el hombre, tanto directamente como a través de la carne de los herbívoros que éste consume. El aluminio, considerado ya uno de los más fuertes reductores del crecimiento vegetal en suelos ácidos (Foy et al., 1978), incrementa mucho su disponibilidad en zonas de pH por debajo de 5, o bien en suelos orgánicos con un pH próximo a 7 (Hargrove, 1986). Así, el pH del suelo es uno de los factores más importantes que determinan la disponibilidad del metal. Ciertas estimaciones indican que un 40% del terreno cultivable del planeta y quizás un 70% del suelo utilizado para la producción de alimentos, son zonas ácidas y, por tanto, sujetas a la toxicidad por este metal (Haung, 1984). En zonas ácidas, el aluminio es uno de los factores más importantes que determinan las especies de plantas y su distribución. Existen zonas del planeta que presentan de forma natural un pH ácido como las zonas tropicales y subtropicales. En nuestro país correspondería a las regiones del norte de la península. Esta situación se puede ver agravada por la manipulación antropogénica, como el uso de fertilizantes y acidificantes o la utilización de fuentes de energía fósil como el carbón y petróleo que liberan una gran cantidad de NOx y SO2, los cuales, en presencia de sustancias oxidantes, dan lugar a ácido sulfúrico (H2SO4) y ácido nítrico (HNO3). Estos dos ácidos determinan la acidificación tanto del agua (el pH del agua de lluvia en equilibrio con el CO2 del aire se halla alrededor de 5.8), como del suelo. Como consecuencia hay una mayor disponibilidad para la planta de aluminio y otros metales que pueden resultar tóxicos. Una de las expresiones de esta acidificación es la muerte de los bosques provocada por la llamada lluvia ácida que aqueja a grandes extensiones básicamente de coníferas de Estados Unidos, Canadá y Europa. Estudios realizados por Mohnen en diferentes zonas de los Estados Unidos arrojan unos valores de pH de la lluvia alrededor de 3.6 (Monhen, 1988). Actualmente hay datos experimentales que indican una mayor complejidad del fenómeno, causado probablemente por una acción conjunta de contaminación atmosférica, acidez de la lluvia y factores climatológicos (Poschenrieder y Barceló, 1985). Añadido a los problemas anteriormente expuestos, hay que tener en cuenta que al mismo tiempo que aumenta la disponibilidad de ciertos elementos al disminuir el pH, disminuye la de otros que son esenciales para el desarrollo de la planta, como pueden ser Mg y Ca (Poscherieder et al., 1992). En la naturaleza, el aluminio se encuentra solamente en forma oxidada. En solución acuosa el ión hidroliza las moléculas de agua formando hidróxidos. Generalmente el aluminio se encuentra en forma de aluminosilicatos y conforme el pH del suelo disminuye se solubiliza. A pH ácido aumenta la concentración de aluminio porque se libera desde los compuestos quelantes que lo tenían secuestrado, o por hidrólisis. La concentración de aluminio en suelos minerales es generalmente muy inferior a 1 mg l-1 (~37 μM) a valores de pH superiores a 5.5, pero aumenta bruscamente

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a un pH inferior. La forma Al3+ es la más abundante a pH ácido puesto que se trata de la forma soluble (figura 2.3). La fitotoxicidad del aluminio se caracteriza por una rápida inhibición de la elongación de la raíz, y como consecuencia un decremento en la captación de nutrientes y agua por parte de la planta. La toxicidad del aluminio ha sido reconocida como el factor limitante más importante de la productividad de plantas en suelos ácidos.

Figura 2.3 Forma más abundante del aluminio a pH ácido. La fitotoxicidad de Al involucra un efecto deletéreo directo del ión aluminio en el crecimiento de las plantas y una reducción de la disponibilidad de fosfato del suelo, causado por la precipitación de fosfato del aluminio (Lindsay, 1979). Sin embargo, para disminuir los problemas de fitotoxicidad a Al y la consiguiente reducción en la productividad del cultivo, el mejoramiento genético se considera como alternativa, buscando tolerancia a mayores niveles de Al en el suelo. Existe amplia evidencia en la literatura de la variabilidad genética ínter e intraespecifica de tolerancia a Al. Diferencias en rendimientos y adquisición de nutrientes se han relacionado con el desarrollo radical, translocación y producción de biomasa, por unidad de nutriente absorbido (Baligar et al., 1997). Cultivares con altas relaciones de eficiencia de utilización de nutrientes, cultivados en suelos ácidos, podrían tener una ventaja en la adaptación al déficit mineral de los suelos ácidos, de forma de ser utilizados en el mejoramiento genético y obtener cultivares más eficientes en adquisición de nutrientes obteniéndose elevados rendimientos. En algunas especies, la tolerancia a aluminio se relaciona con una mayor eficiencia de utilización de P (Crush, 1995, Goedert et al., 1997, Milán et al., 1990). El principal interés en el aluminio por tanto, viene dado por la capacidad de algunas especies de plantas (acumuladoras) de tolerar elevadas cantidades de aluminio en sus tejidos, y los efectos tóxicos en el crecimiento de la planta por altas concentraciones de aluminio en el suelo o soluciones de nutrientes. No existen pruebas contundentes de que el aluminio sea un elemento mineral esencial para las especies acumuladoras. Sin embargo, hay muchos informes sobre los efectos beneficiosos de las bajas concentraciones de aluminio en el suelo o soluciones nutritivas para el crecimiento de las plantas [para revisiones ver Bollard (1983) y Foy (1983)]. Las concentraciones de aluminio a las que se ha observado estimulación del crecimiento varían entre 71.4 μM y 185 μM en remolacha, maíz y algunas leguminosas tropicales. En la planta del té, la cual es una de las más aluminio tolerantes especies de

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cosecha, señalan una estimulación del crecimiento a concentraciones de aluminio tan altas como 1000 μM (Matsumoto et al., 1976) o incluso 6400 μM (Konishi et al., 1985). Estudios con elevadas concentraciones de aluminio son particularmente difíciles de interpretar ya que casi todo el aluminio añadido se pierde presumiblemente por precipitación (con fosfato) u ocurre una polimerización y acomplejamiento. Un problema muy general en muchos estudios sobre el efecto de las bajas concentraciones de aluminio en el crecimiento de las plantas, es la contaminación de la solución nutritiva con aluminio. Normalmente, las raíces de las plantas que crecen en soluciones nutritivas con supuestos niveles cero de aluminio, contienen 50-100 mg de aluminio por kilogramo de materia seca (Bollard, 1983). En los experimentos, por tanto, hay que tomar especial cuidado por mantener la contaminación lo más baja posible. La naturaleza de los efectos beneficiosos del aluminio en el crecimiento de las plantas, especialmente para las no acumuladoras, no está claro, pero hay evidencias substanciales de que a menudo se trata de un efecto secundario, generado para aliviar la toxicidad causada por otros elementos minerales como fósforo y cobre (Asher, 1991). Como se ha demostrado para plantas de trigo (Kinraide, 1993) que presentan toxicidad por protones a bajo pH, la actividad del aluminio es un factor importante para el alivio de esa toxicidad y mejora del crecimiento de la raíz. En resumen, bajas concentraciones de aluminio pueden tener efectos beneficiosos para el crecimiento bajo condiciones concretas, y este efecto beneficioso probablemente sea un fenómeno más generalizado en plantas con gran tolerancia al aluminio, y gran capacidad para la captación del mismo (acumuladores). Sin embargo, en las plantas no acumuladoras, los efectos negativos del aluminio en el crecimiento en suelos con bajo pH siempre ocurren. MECANISMOS DE LA TOXICIDAD Para entender la toxicidad por aluminio sobre los vegetales, es necesario elucidar su localización tanto a nivel de tejido como a nivel celular, lo cual constituye una de las mayores controversias y dificultades encontradas en la mayoría de las investigaciones llevadas a cabo sobre este tema. Existen numerosos lugares de acción potenciales del aluminio, cuya identificación ayudaría a la selección de genotipos con mayor resistencia a este metal. En general, se acepta que el aluminio se acumula en los ápices de las raíces, incluyendo la caliptra y las zonas meristemáticas y de elongación, como han mostrado estudios realizados por diversos autores (Delhaize et al. 1993, Sasaki et al. 1997), aplicando técnicas de tinción con hematoxilina en diferentes variedades de trigo. A partir de estos estudios se ha observado una característica acumulación de aluminio en la epidermis y en las células externas del córtex. El aluminio como catión polivalente en condiciones ácidas tiene la capacidad para unirse fuertemente a las cargas negativas de la capa de Donnan. Usando espectrometría de masas, Lazoft et al. (1996) demostraron que el aluminio se acumula preferentemente en las células de la capa externa de la raíz, con una rápida absorción en los primeros 30 minutos seguida de una disminución del radio de absorción. Tras 18 horas de tratamiento, el aluminio se podía observar también en las capas más internas de la raíz siempre en una concentración menor.

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El inicial y más evidente síntoma de la toxicidad por aluminio es la rápida inhibición de la elongación radicular, que puede ocurrir minutos después de la exposición del aluminio a las raíces. La figura 2.4 muestra dos cultivares de trigo, uno aluminio tolerante (Atlas), y otro aluminio sensible (Scout) creciendo en una solución CaSO4 ácida a una elevada concentración de aluminio. Una fototoxicidad severa por aluminio reduce y daña el sistema radical, lo cual que hace susceptible a la planta al estrés hídrico y deficiencias nutricionales. Los efectos por la exposición al aluminio como el bloqueo de canales de calcio y potasio, pueden causar deficiencias minerales a largo plazo.

Figura 2.4. Daños en el sistema radical de la cepa sensible (Scout) al aluminio respecto a la resistente (Atlas). Los efectos tóxicos del aluminio tienen lugar generalmente en la membrana plasmática o en el exterior de la misma. Estos efectos se deben en parte a la inhibición de la obtención de calcio y magnesio por el bloqueo de canales de membrana plasmáticos. Los síntomas de la toxicidad son muy similares a cuando existe deficiencia de otros iones en la planta. Éstos podría deberse a que el aluminio compita con los iones por los mismos lugares de unión en las paredes celulares (algunos cationes), bien por precipitación en forma de complejos alumínicos (con fosfato), o la inhibición de la elongación radical, con lo cual se reduce la capacidad absortiva de la planta. La toxicidad por aluminio además provoca una deficiencia de boro, pero la razón no está clara. ALUMINIO EN EL APOPLASTO

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Información acerca de la distribución subcelular del aluminio en las puntas de las raíces nos ayudaría a establecer la relativa importancia del simplasto y el apoplasto en la toxicidad y en su compartimentación en la resistencia o tolerancia a este metal. Debido a la rapidez con que el aluminio produce la disminución del crecimiento radicular, muchos autores han definido el apoplasto como primer punto de ataque del metal y han determinado que entre un 30 y un 90 % del total del aluminio es absorbido y se emplaza en el apoplasto. El hecho de que la inhibición se produzca en minutos junto con la hipótesis de que el aluminio penetra en la célula muy lentamente ha llevado a la teoría de que el catión se acumula tanto en la pared como en la membrana celular. El grado con el que el aluminio se une depende de la capacidad de intercambio catiónico (C.I.C.) de la raíz, resultante de las cargas negativas de las pectinas, proteínas y fosfolípidos de la pared celular y de la membrana plasmática. Estas cargas crean un gradiente de potencial eléctrico que determina la unión y la distribución iónica en el apoplasto. Plantas con poca electronegatividad (poca presencia de cargas negativas en su superficie) suelen ser más resistentes. Varios estudios muestran como una baja C.I.C. en la raíz caracteriza a plantas adaptadas a suelos con elevada cantidad de aluminio (Blamey et al. 1990). Sin embargo no parece que haya variación en la concentración de aluminio en la parte aérea entre las plantas sensibles y las tolerantes debido a esta diferencia de C.I.C. (Kennedy et. al. 1986). Sin embargo, los mecanismos de acción del aluminio todavía no han sido todavía claramente definidos. Las principales dificultades encontradas en este propósito son la baja sensibilidad de las técnicas disponibles para la detección del metal y la difícil separación del aluminio simplástico y apoplástico para su análisis (Barceló y Poscherieder, 2002). PARED CELULAR Muchas investigaciones han descrito cómo la mayor parte del aluminio se encuentra en el apoplasto. (Rengel, 1996). Sin embargo, las técnicas para determinar la absorción de aluminio y la cantidad de aluminio en el simplasto son todavía muy limitadas. El conocimiento relacionado con la dinámica de la pared celular de las células en crecimiento todavía es bastante limitado, al igual que los mecanismos de interacción de los componentes de la pared celular y el aluminio, de manera que la síntesis de la pared celular y la toxicidad por aluminio solo puede ser especulada. Diferentes estudios de Rengel en 1996 indican que más del 95% del aluminio asociado la las raíces de las plantas se encuentra en la pared celular y que el aluminio es el responsable del rápido e irreversible desplazamiento del calcio de la pared. Observaciones ultraestructurales llevadas a cabo por Vázquez et al. (1999) muestran que en plantas de maíz tratadas con Al se produce un engrosamiento de la pared celular y una alteración en los cationes tanto a nivel apoplástico como simplástico durante las primeras 4 horas de exposición al metal en la variedad tolerante C525 M. Este engrosamiento de la pared celular puede ser debido a un desplazamiento de los iones de calcio de la misma. El aluminio es un gran competidor del calcio, ya que tiene preferencia por donantes de electrones que contienen O2. Las paredes celulares contienen una gran variedad de lugares cargados negativamente, de los cuales el más importante es el ácido galacturónico que forma cadenas lineales altamente ramificadas dando lugar a las

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pectinas. Los principales polisacáridos pécticos son: homogalacturonano, ramnogalacturonano I y II y arabinogalactano. El homogalacturonano forma un gel rígido e insoluble en presencia de calcio. Es posible entonces que el aluminio con una mayor capacidad de unión a las pectinas que el calcio se una produciendo un aumento en la rigidez de la pared impidiendo la expansión celular. Estudios realizados al respecto con plantas de maíz demuestran que células con mayor cantidad de pectinas presentan una mayor sensibilidad al aluminio (Schmohl et al. 2000). La unión del aluminio a otros constituyentes de la membrana como enzimas, extensinas o xiloglucanos probablemente no afecte a las propiedades físicas de la pared pero sí a su funcionalidad. Existen evidencias de que la modificación de la carga iónica de la membrana afecta a la absorción de otros cationes (Rengel, 1990) y aniones (Nichol et al., 1993). Es posible también que el aluminio afecte la extrusión de microfibrillas de celulosa debido al aumento de la rigidez de la membrana plasmática evitando el movimiento de las proteínas relacionadas con este proceso de extrusión, o quizás interactuando con las microfibrillas directamente. La acumulación de aluminio en la pared varia dependiendo de la fuente de aluminio suministrada, no varia con el pH de la solución y el tiempo de saturación depende de la especie. En estudios llevados a cabo por Taylor et al. (2000) con Chara corallina, la pared celular muestra saturación al cabo de tres horas. Esta saturación había sido definida en la mayoría de los casos como de 30 minutos (Mc Donalds- Stephens et al. 1995), de manera que la interacción de este metal con la pared celular puede que incluya algo más que un simple intercambio pasivo de cationes. MEMBRANA PLASMÁTICA El aluminio no solo afecta rápidamente a la pared celular, sino también a las características de la membrana plasmática. Dada la dificultad para la desorción de cationes polivalentes de la pared celular, se espera que el transporte del aluminio a través de la membrana plasmática sea lento y que aquella actúe como barrera de la entrada del metal al simplasto. Muchos de los primeros trabajos (Wagatsuma et al., 1987) señalaban que sólo tras una exposición prolongada al aluminio, Éste penetraba a través de la membrana plasmática, actuando de esta manera como barrera a la entrada del metal al citosol. Sin embargo recientes estudios han probado que esta sugerencia no es del todo correcta y han demostrado la presencia de aluminio en el citosol en periodos cortos de tiempo (Lazoft et. al. 1994). En pocos minutos, el aluminio induce la inhibición del crecimiento radicular a la vez que la absorción de potasio (y también de NO3-) (Horst et al. 1992). Otras investigaciones (Kochian et al., 1991b), han señalado cómo en plantas expuestas a tratamientos con aluminio el flujo de los cationes (Ca2+, NH4+ y K+) se reduce y el flujo de los aniones (NO3- y PO43-) aumenta, explicando esta modificación a través de un mecanismo dónde el aluminio se uniría a los fosfolípidos de membrana formando una capa cargada positivamente que impediría o dificultaría el transporte de los cationes y facilitaría el de los aniones. Estas divergencias en los estudios, aunque no aclararían esta distorsión en los flujos iónicos, señalan una vez más las alteraciones producidas por el aluminio en la membrana. Una de las primeras consecuencias identificada en la toxicidad por aluminio, fue la reducción en la absorción de calcio (Rengel, 1992). El calcio actúa como mensajero

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secundario en la transducción de señales desde el medio exterior que rodea la planta a elementos del metabolismo de ésta (Triwavas y Gilroy, 1991) y se encuentra implicado sobretodo en la expansión celular. Diversos estudios han demostrado cómo el aluminio puede bloquear los canales de calcio en la membrana plasmática evitando la entrada de calcio al simplasma (Piñeros et al., 1995). Otro indicador muy sensible de la interacción del aluminio con la membrana es la inducción de la síntesis de 1,3 β-glucano (callosa). La formación de callosa es una respuesta de la planta a cualquier tipo de estrés, incluyendo el mecánico, biofísico, químico y biológico, capaz de afectar a la integridad o funcionalidad de la membrana plasmática (Schreiner, 1992; Stone, 1984). El aluminio puede unirse a la carga negativa de las cabezas de fosfolípidos, al enlace fosfodiéster de la fosfatidil serina o bien a las proteínas de membrana como la calmodulina. La carga negativa de la membrana, debida a la presencia de fosfolípidos, ha hecho que esta estructura haya sido descrita por gran número de autores como el primer punto de ataque del aluminio, así como de otros metales (Haung, 1984). Zhao et al. (1987) encontraron que el aluminio se unía a la membrana plasmática e incrementaba la permeabilidad de las células de la raíz de Quercus rubra a la urea, metil-urea y etil-urea y disminuía la permeabilidad a los lípidos y el agua. Esto sugiere que el aluminio aumenta la compactación de los fosfolípidos de membrana. La consecuencia de un aumento en la rigidez de la membrana puede afectar al metabolismo, tanto en el simplasto como en el apoplasto. Con respecto al apoplasto se ha especulado que en células de mamíferos la toxicidad por aluminio es causada por un aumento en la peroxidación de los lípidos, causado directamente por el empaquetamiento de éstos (Oteiza, 1994). Diversos estudios han demostrado que el aluminio aumenta la fusión liposomal en comparación con otros cationes, como, por ejemplo, el calcio (Oteiza, 1994). El aluminio puede unirse fuertemente a las proteínas asociadas de membrana. Sin embargo, estudios llevados a cabo no han podido demostrar que esto tengo un efecto negativo en la conformación de la proteína o en su funcionalidad (Jones & Kochian, 1995). Sin embargo, el aluminio puede afectar a la membrana de una manera muy específica, ya que como mostraron Gunsé et. al., (2000), los enzimas responsables de la síntesis del etileno (acido 1-aminociclopropano1-carboxilico sintasa y ácido 1aminociclopropano-1 carboxilico oxidasa, (ACC sintasa y ACC oxidasa respectivamente) localizadas en la membrana no fueron afectadas (al menos funcionalmente) en dos variedades de maíz, una sensible y otra tolerante, después de un tratamiento con aluminio. De estos resultados no podemos concluir que el aluminio no afecte a la membrana, pero sí podemos afirmar que al menos no interacciona en la zona donde se encuentran estos enzimas, ya que no se encontró variación en la producción de etileno. ÁPICES RADICULARES La inhibición inducida por aluminio del crecimiento radical es el componente más importante de la fitotoxicidad por aluminio, y las investigaciones recientes se centran en el mismo. Se ha descubierto que la inhibición esta causada solamente por las interacciones del aluminio con el ápice radical. La importancia de éste descubrimiento

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es que los mecanismos de resistencia del aluminio deben actuar en el ápice de la raíz para proteger ésta región de los efectos tóxicos del aluminio. Los síntomas de toxicidad por aluminio incluyen la inhibición de la captación de calcio. La división celular también se inhibe; la mitosis parece detenerse en la fase S de la replicación del DNA. La inhibición de la elongación radicular en la punta de la raíz se debe a interferencias con la formación de las paredes celulares, disminuyendo la elasticidad de la pared celular a través de cruzamientos con pectina (Rengel 1992b). No se sabe con certeza si éste es un efecto directo del aluminio o se debe a la entrada del mísmo en el simplasto donde puede interferir con los procesos envueltos en la formación de la pared celular. Recientes descubrimientos sugieren que el aluminio puede interferir con la vía de señalización-transducción (Jones & Kochian 1996). Debido a la inhibición de la elongación celular, las células de la raíz se vuelven más cortas y anchas. Como resultado, la elongación de la raíz se ve perjudicada y las raíces tienen una apariencia rechoncha (figura 4) y una longitud de raíz específica baja cuando crecen en presencia de aluminio (Delhaize & Ryan 1995). Cuando la mayor parte de las raíces son expuestas al Al, pero las puntas de las raíces se encuentran en una solución sin aluminio, el crecimiento de la planta no se ve afectado por el Al. Por otro lado, cuando solo las puntas de raíces están expuestas al aluminio, los síntomas tóxicos son claramente visibles, confirmando que los ápices radiculares son el primer lugar de la toxicidad por aluminio (Kochian 1995). Parte del aluminio es captado rápidamente en el simplasto también, posiblemente, vía canales que captan magnesio o hierro, o por la vía endocítica (Kochian 1995). En el citosol, con un pH neutro, no permanece mucho tiempo soluble, pero se une a proteínas y compuestos que contienen fosfato; también se ha demostrado que se une al DNA. El aluminio puede reemplazar calcio y/o magnesio en lugares que éstos tienen una función vital en la activación de enzimas; interfiere con la calmodulina (el mayor componente en las vías de transducción de señales en plantas) el citoesqueleto es particularmente dañado. Muchos de estos efectos ocurren después de la rápida (1 o 2 horas) inhibición de la elongación de la raíz. Éstos no son por tanto la causa principal en la inhibición del crecimiento de la planta (Kochian 1995).

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Figura 2.5. Aspecto rechoncho de las células del ápice radical afectadas aluminio.

por el

La inhibición del aluminio para la captación de calcio y magnesio disminuye la concentración de esos cationes en la célula, causando síntomas de deficiencia por calcio y magnesio. El calcio se requiere durante la división celular para la formación del huso e iniciar la transición metafase/anafase. De ahí que la presencia del aluminio impida la división celular y desarrollo de la raíz (Rengel 1992b). La interferencia en la captación de magnesio causa síntomas de deficiencia por magnesio (i.e., hojas cloróticas con punteaduras marrones) y raíces descoloridas y rechonchas (Tan et al. 1993). MECANISMOS MOLECULARES DE LA TOCIXIDAD TRANSPORTE DEL ALUMINIO La falta de marcadores radiactivos de aluminio y pruebas de fluorescencia es una de las principales razones que dificultan el estudio del transporte del aluminio al interior celular. Además, parece que una gran fracción de este aluminio permanece en el apoplasto, lo que dificulta la medición de la aparente pequeña cantidad de catión que penetra. Por esta razón, parece que la mayoría de estudios llevados a cabo a este respecto se encuentran sobreestimados al no existir un mecanismo de desorción del aluminio apoplástico 100% eficiente. Se cree que la absorción de aluminio es típicamente bifásica con una rápida absorción no linear seguida de una fase linear más lenta (Zhang & Taylor, 1989). Aunque esta interpretación linear sugiere un transporte a través de la membrana, otros estudios han demostrado que esta fase puede incluir aluminio no intercambiable unido a la pared celular y que la modificación de ciertas condiciones experimentales puede minimizar la contribución de aluminio unido a la pared celular a esta fase linear de absorción (Archambault et al., 1996).

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Las pruebas disponibles actualmente sugieren que el transporte del aluminio es un proceso lento. Evidencias de que el aluminio cruza la membrana plasmática se extraen de estudios como los realizados con Chara corallina por Taylor et al. (2000) en los que hallaron que, tras una larga exposición al metal (5-7 días), las concentraciones de aluminio en el interior celular eran del rango de 5-70 µM. En estos estudios en los que se extrae la pared celular por microcirugía evitando mediciones ambiguas del metal, se encuentra que el transporte a través de la membrana se produce tras solo 30 minutos de exposición y además éste no es afectado por los modelos predichos de aluminio en solución dependientes del pH, de manera que la absorción del metal podría estar relacionada con transportadores ligados a la concentración de protones. Sin embargo, el mecanismo por el que el aluminio cruza la membrana no ha sido todavía identificado. Las rutas por las que el aluminio penetra son totalmente especuladas, pero merece la pena su consideración. Debido a la gran carga negativa en el interior de la membrana, es también posible que el transporte se produzca por mecanismos de gradiente de potencial electroquímico. Sin embargo, debido a la fuerte interacción del aluminio con los lípidos de membrana es probable que este transporte sea muy bajo. Haung (1985) señaló tres vías de entrada al aluminio: • Por simple permeabilidad a través de la membrana. • A través de estructuras lipídicas micelares inducidas por el propio aluminio. • A través de transportadores unidos a fosfolípidos de la membrana o a otros agentes quelantes. Respecto a este último punto, en animales ha sido especulado que el aluminio penetra por el sistema de transporte del hierro. Aunque es poco probable en dicotiledóneas donde el hierro es absorbido en forma Fe2+ (Kochian, 1991), es posible que esto suceda en plantas monocotiledóneas donde el hierro se absorbe en forma de complejo Fe3+-sideróforo. Se produce una liberación por parte de la planta de fitosideróforos (aminoácidos no proteinógenos), los cuales forman complejos muy estables con el hierro. Como segundo componente de esta estrategia hay un transportador constitutivo de la membrana y muy específico, el cual transfiere el Fe (II) unido a los fitosideróforos al citoplasma. En plantas dicotiledóneas este transportador no existe; sin embargo, en situaciones de deficiencia de hierro, hay una respuesta en la que aumenta la actividad de una reductasa en la membrana plasmática de las células de la rizodermis. La actividad de esta reductasa es estimulada por un pH bajo provocada por los protones bombeados por una ATP-asa de la misma membrana y reduce la forma de Fe (III) a Fe (II). El Fe (III) se une a agentes quelantes secretados por células de la raíz antes de ser reducido. Existe un transportador en la membrana para este hierro reducido. Así, en ambos casos se podría pensar en un transporte del aluminio muy parecido a estos dos casos. Sin embargo, ciertos estudios han puesto de manifiesto que la absorción de aluminio no requiere energía como en el caso del hierro (Wagatsuma, 1983, Taylor, 2000). El flujo de aluminio a través de una bomba específica es poco probable debido a la elevada concentración de protones en el exterior y la poca actividad de Al3+ en el citoplasma. La posibilidad de que el transporte se produzca a través de los canales de calcio es plausible ya que el aluminio inhibe la absorción de calcio bloqueando el canal (Huang, et al., 1992). Liu et al. 2000), demuestran como el aluminio penetra al interior de células guarda de Arabidopsis a través de los canales de calcio. También se ha sugerido la penetración del aluminio a través de los canales de

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magnesio, ya que también su transporte al interior celular es inhibido debido al similar diámetro de ambos cationes (MacDiarmaid and Gardner, 1996). TRANSLOCACIÓN DEL ALUMINIO DENTRO DE LA PLANTA Es interesante observar cómo en diferentes plantas acumuladoras de aluminio existen diferentes complejos de aluminio para la translocación de éste en el xilema. Diferentes muestras de xilema de diferentes plantas acumuladoras han sido analizadas para examinar las diferentes formas de translocación del aluminio. Así, se ha visto como la translocación en plantas de té se hace en forma de Al-F. Watanabe et.al. (2001) muestran cómo la translocación desde la raíz a la parte aérea en plantas de Melastoma malabathricum se realizaba en forma de Al-citrato (1:1) en plantas cuyas semillas crecieron en soluciones de aluminio y en forma de Al-malato en plantas cuyas semillas no habían crecido en soluciones de aluminio. Esto sugiere que M. malabathricum aumenta la síntesis de citrato en presencia de aluminio, formado un complejo Al-citrato cuya estabilidad es superior al complejo Al-malato. Estudios realizados con Fagopyrum esculentum, muestran cómo también la forma de translocación del aluminio es en forma de citrato principalmente y la aplicación de aluminio no afecta a la concentración de citrato y malato en el apoplasto (Ma, et al., 1997). ALTERACIONES DEL ALUMINIO EN EL SIMPLASTO Después de las investigaciones que han mostrado que la acumulación de Al en el simplasto de las células de la punta de la raíz se produce sólo 30 minutos después de iniciado el tratamiento (Lazoft et al., 1994, 1996b), las cuestiones se centran en los lugares donde actúa el aluminio. Incluso en variedades resistentes a la toxicidad por aluminio, se encuentra acumulación de éste a nivel vacuolar (Vazquez, 1999). Ernst (1998) establece la compartimentación como principal medida para la tolerancia de las plantas. Por tanto, hay que tener en cuenta que quizás los efectos producidos no sean solamente debidos a mecanismos desencadenados por toxicidad en el apoplasto, sino también en el simplasto o una mezcla de ambos. Una vez el aluminio ha cruzado la membrana plasmática se produce un cambio muy marcado en las condiciones químicas; entre estas, la más importante es la diferencia de pH, de 4.5 en el apoplasto a 7.0 en el citoplasma. Estudios realizados con modelos de especiación química señalan que el catión en ausencia de ligandos orgánicos a este pH precipitaría en su mayoría en forma de Al(OH)3 o en forma de fosfatos de aluminio, de manera que el aluminio libre (Al3+) en el citoplasma se encontraría en un rango de concentración del orden de 10-12 molar (Martin, 1992). Debido a la elevada concentración de componentes orgánicos en el simplasma, se calcula que la mayoría del aluminio se encuentra acomplejado con moléculas orgánicas. Ohman y Martin (1994), en estudios basados en modelos de equilibrio químico, han determinado que el citrato sería la molécula que mayoritariamente quelaría el aluminio. Sin embargo, una proporción pequeña pero potencialmente significativa se uniría a ligandos orgánicos que contienen fósforo como el ATP, GTP, etc. y solutos con múltiples grupos carboxílicos como péptidos, proteínas, etc. Es poco probable que estos complejos sean citotóxicos; sin embargo, permitirían el transporte libre del metal en la célula y en la planta hasta su unión a otros ligandos orgánicos más afines (Jones et al., 1995).

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ALTERACIONES EN LA TRANSMISIÓN DE SEÑALES (FOSFATIDIL INOSITOL TRIFOSFATO) Uno de los lugares definidos con más afinidad sería el lípido fosfatidil inositoldifosfato (PIP2) que se encuentra en la membrana plasmática y esta relacionado con la transducción de señales y en la regulación del citoesqueleto. Parece que el aluminio posee una capacidad de unión a este enzima muy superior al calcio y mayor que a los ácidos orgánicos (Kochian, 1995). A pesar de que esta señal origina una cascada de mensajeros secundarios (Ca2+, IP3), se cree que el lugar donde interfiere el aluminio sería en el primer paso en la formación de IP3. Además, se muestra cómo el aluminio puede afectar la funcionalidad del enzima fosfolipasa C, sustituyendo al calcio en los lugares de unión a dicho enzima. El aluminio actuaría activando el metabolismo del inositol fosfato (Lee, 1991), por lo que el aumento de calcio en el citoplasma descrito por varios estudios podría ser causa de esta activación y consecuente liberación de calcio desde la vacuola. ALTERACIONES EN EL CITOESQUELETO Otro de los síntomas visibles de la toxicidad del aluminio sería la distorsión del patrón de extensión celular, sugiriendo que la regulación del citoesqueleto puede ser uno de los lugares de ataque del aluminio, ya que la formación de actina en plantas es regulada por la profilina y la concentración de ésta depende de su unión a la PIP2. Sin embargo, no está claro que el hecho de la unión del aluminio a la PIP2 provoque un trastorno en la dinámica de la actina (Darnowsky et al. 1996). Otros estudios realizados por Grabsky et al en 1995, han mostrado cómo el aluminio provoca una rápida y dramática rigidificación de la red de actina. Estos autores especularon que esta rigidificación podría deberse a una unión del aluminio al ADP o al ATP, a su interferencia con la F-actina o a su interacción con la profilina, como ya habían señalado anteriores estudios. Estudios recientes (Frantzios et al., 2000) han demostrado cómo tratamientos con aluminio en plantas de Triticum turgidum L provocan una alteración en la estructura y una disfuncionalidad en los procesos mitóticos y en el aparato citocinético, principalmente alterando los procesos de formación y destrucción de los microtúbulos. Según estos mismos autores los daños producidos por el metal a este nivel serían los siguientes: 1. Produciría un retraso en la despolimerización de los microtúbulos en todas las fases del ciclo celular. 2. Alteraría la capacidad de los microtúbulos para formar sistemas bipolares durante la mitosis. 3. Afectaría a los microtúbulos en la separación de cromosomas durante la metafase. 4. Trastornaría la polimerización de tubulina, ya que se observa una formación atípica de microtúbulos en la exposición de las plantas al aluminio. Todos estos fenómenos se observaron en todos los diferentes tratamientos con aluminio. Los tres primeros se observaron tras periodos cortos de exposición, sin embargo el último se observó solo en células sometidas a tratamientos de una duración de 4 horas o más.

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Los principales efectos por los que el aluminio puede producir estas alteraciones en la estructura y funcionalidad de los microtúbulos son: - Inhibición de la actividad de la calmodulina: el aluminio posee una capacidad de unión a la calmodulina tres veces superior al calcio, lo cual provocaría un cambio conformacional de la proteína que inhibiría su capacidad para activar otras enzimas (Siegel y Haug, 1983). - Inhibición de la señal del fosfatidil inositol trifosfato (Kochian, 1995). - Alteración de la homeostasis del calcio (Rengel, 1996). Teniendo en cuenta que la concentración de aluminio en el simplasto no sería muy elevada, los efectos a corto plazo de este catión no tendrían por qué esperarse en el simplasto y podrían por tanto originarse ya en el apoplasto, donde el aluminio se une y acumula con gran rapidez. La cada vez más evidente existencia de un continuo pared celular-membrana plasmática-citoesqueleto en las células de las plantas sugiere que estos efectos adversos en el citoesqueleto podrían ya originarse desde el exterior celular (Horst et al, 1999). ALTERACIONES EN LA FUNCIONALIDAD DEL CALCIO El calcio actúa como mensajero secundario en la transducción de diferentes señales desde el medio exterior que rodea la célula a elementos del metabolismo de la misma, siendo estas señales iniciadas por el inositol trifosfato (Trewavas y Gilroy, 1991). Aunque ya se ha señalado cómo el aluminio trastorna la homeostasis del calcio bloqueando los canales desde el exterior de la célula, se argumenta también que una vez en el citoplasma es capaz de bloquear estos mismos canales internamente. Se cree que la distorsión de la homeostasis del calcio es uno de los primeros síntomas de la toxicidad por aluminio. Una disminución de la concentración de calcio citosólico tras un tratamiento con aluminio fue manifestado en 1998 por Jones et. al. en células tabaco. Sin embargo, estudios más recientes como los llevados a cabo por Ma et al. (2002) mediante microscopía confocal muestran un aumento en las concentraciones de calcio en el citosol de células radiculares de Secale cerale a medida que aumentan las concentraciones de tratamientos con aluminio. Las concentraciones de calcio eran mayores en plantas intactas que en protoplastos al ser sometidos a igual tratamiento, lo cual podría deberse a una interacción de diferentes especies catiónicas de aluminio con la pared celular. Una relación semejante había sido ya señalada en investigaciones llevadas a cabo por Zhang et al. (1999) con plantas de trigo. De cualquier manera, el aumento o disminución del calcio citosólico podría alterar los procesos metabólicos dependientes de calcio, los cuales están directa o indirectamente relacionados con la regulación de la división celular y la elongación (Delhaize et al. 1995). La actividad del calcio es muy elevada en el simplasma ya que la mayoría de los suelos (a excepción de los extremadamente ácidos) contiene alta cantidad de este elemento. Para introducirlo al interior de la célula existe una ATP-asa (Evans et al. 1990). También se encuentran canales en la bicapa lipídica que dan lugar a un transporte pasivo hacia el interior de ésta. La distorsión de los niveles de calcio puede explicar muchos síntomas observados por toxicidad del aluminio (Rengel y Zhang, 2003), ya que el calcio está implicado en muchos procesos, puesto que actúa como

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mensajero secundario juntamente con la calmodulina activando y desactivando ciertos enzimas. La calmodulina es un polipéptido de 17 KDa y cuatro puntos de unión con el calcio y la unión del calcio a la proteína es necesaria para su actividad, ya que determina su conformación. Se calcula que el aluminio tiene una afinidad diez veces mayor que el calcio en cuanto a la unión con la calmodulina (Larkin, 1987) y parece que disminuye un 30% la región α-hélice (Siegel y Haung, 1983). Según ciertos estudios en los que todavía se señala la lenta penetración del aluminio en la célula (Rengel, 1992), u otros estudios en los que se señala que la concetración del aluminio una vez transportado al interior celular no sería suficientemente alta (Martin, 1992), la idea de que la toxicidad del aluminio se dé por esta vía se encuentra en controversia y no se consideraría como causa primaria de toxicidad (Jones et al. 1997), ya que además habría que tener en cuenta otros componentes que también podrían unirse al aluminio como son el citrato y grupos fosfato. Otros autores, trabajando en los efectos del aluminio sobre la germinación de granos de polen y su reversión con quelantes (Ma et al 1999, 2000), consideran que existe calmodulina apoplástica extracelular implicada en la transducción de señales al interior de la célula que podría resultar afectada por la presencia de Al en solución. También el calcio se relaciona con procesos mitóticos, citocinesis y crecimiento polar. Uno de los efectos más estudiados del aluminio es que el cese del crecimiento radicular coincide con la desaparición de figuras mitóticas. La replicación de DNA ocurre durante la fase S del ciclo celular y va seguida de la mitosis. Si bloqueamos esta primera fase no se da la segunda. La proteína relacionada con esta dependencia es la p34cdc2 (Broek et al., 1991). Esta proteína es activada por desfosforilación de los residuos de fosfotirosina y fosfotreonina. Este proceso de activación es muy probable que requiera un incremento del calcio citosólico (Marmé, 1989), por lo tanto, esta distorsión en la replicación celular puede ser uno de los efectos indirectos de la interferencia del aluminio en la homeostasis del calcio. Estos estudios fueron realizados suponiendo que en las primeras etapas el aluminio no se encuentra en el interior celular, sin embargo, si tenemos en cuenta los últimos resultados sobre este efecto, cabría la posibilidad de que esta proteína fuese, también, afectada directamente por el aluminio. También la falta de calcio puede provocar problemas en la formación del huso durante la profase y en la necesaria despolimerización de los microtúbulos en la metafase o principio de la anafase para la separación de las cromátidas (Wolniak, 1988). FORMACIÓN DE CALOSA Un aumento en el calcio citosólico sería un prerrequisito para la formación de callosa (1,3, β-glucano), cuya producción puede relacionarse a cualquier tipo de estrés al que la planta esté sometida, ya sea físico, químico, bioquímico o biológico (Kauss, 1985). La formación de este β-glucano es muy sensible al estrés producido por aluminio y, al igual que la disminución del crecimiento radicular, se ha considerado uno de los parámetros que determinan la sensibilidad de las respuestas de las plantas a los diferentes tratamientos por aluminio, siendo su formación proporcional al grado de estrés al que ésta se halle sometida (Llugany et al., 1994, Massot et al., 1999). Horst (1995) apuntó la acumulación de callosa en plantas de soja en tratamientos tan bajos de aluminio como de 5µM, después de tan solo 10 minutos de tratamiento.

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La callosa es sintetizada por una (1-3) β-D-glucano sintasa localizada en la membrana plasmática y activada por iones calcio. Uno de los prerrequisitos para la inducción de la formación de callosa es un aumento en la concentración de calcio citosólico, lo cual podría deberse a la liberación de calcio de los lugares de unión a la pared celular producida por la sustitución de aluminio. Sin embargo, el calcio puede no ser la única señal que active la producción de callosa y una alteración en la estructura de la membrana plasmática podría ser también importante (Jacob, 1985). Ya que la callosa es liberada por la membrana plasmática al apoplasto, se encuentran aposiciones alrededor de los plasmodesmos en la pared celular de las plantas tratadas con aluminio, lo cual ha sido considerado como una especie de sello que impediría la entrada de agua y el transporte a través de los plasmodesmos (Yim et al. 1998). Este hecho ha sido considerado también como un mecanismo de defensa de la planta frente al proceso de pérdida de pared celular (Eklund et al. 1990). EFECTO SOBRE EL ADN A pesar del hecho de que la acumulación del aluminio en vacuolas o la quelación puedan ser factores que determinen cierta tolerancia al aluminio, no todo el aluminio es eficientemente detoxificado, por tanto, puede interferir con elementos celulares como el ADN. Se ha demostrado que el aluminio inhibe la división celular y se asocia al ADN en diferentes plantas (Aimi et al., 1964, Morimura et al. 1978). Una de las razones más plausibles por las que el aluminio se uniría al núcleo celular sería que éste es uno de los órganos celulares con mayor carga negativa debido a los grupos fosfatos que contiene, por lo que el aluminio podría ser transportado al núcleo celular a través de sus poros (Naora et. al. 1961) Se ha observado que en plantas tratadas con Al, el número de células en mitosis disminuye a las dos horas de tratamiento, es muy bajo a las 4 horas (Tepper et al., 1989) y se reduce significativamente a las 5 horas (Horst et al., 1983) o a las 6 horas de exposición al aluminio (Clarkson 1965). El aluminio tiene capacidad de unirse al DNA tanto in vivo como in vitro. Algunos autores afirman que el aluminio se une a la cromatina disminuyendo su actividad. El 73% del aluminio encontrado en el núcleo se encontraba unido a la cromatina, y de este 73% se halló que el 94% de este catión se encontraba unido al DNA. Esta preferencia del aluminio por el DNA frente al resto de proteínas asociadas al material genético fue demostrado también in vitro (Matsumoto y Morimura, 1977). A partir de investigaciones posteriores de estos mismos autores (Matsumoto y Morimura, 1978), se dedujo que el aluminio se unía al ácido ADN a través del grupo fosfato de forma similar a otros cationes como Mg, Ca y Mn. El aluminio puede unirse también a otros ácidos nucleicos como el ARN ribosómico y el transferente, aunque con menos afinidad (Matsumoto y Hirasawa, 1976). Esta unión del aluminio al ADN puede provocar cambios estructurales que dificulten la expresión celular, ya que ésta se encuentra regulada por varios factores incluyendo la estructura de la cromatina. En algunos estudios se ha detectado ya acumulación de aluminio tras solo 5 minutos de exposición (Bennet et al., 1985), lo que corrobora el hecho que señalan ciertos estudios en referencia a una rápida capacidad para penetrar en la célula.

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A pesar de esta capacidad de unión no se sabe con certeza si es esto lo que inhibe la división celular. Sampson et al. (1965) encontraron replicación del ADN incluso 48 horas después de haberse iniciado el tratamiento en Hordeum vulgare, a pesar de que el número de figuras mitóticas se había reducido a cero a las 24 horas de exposición. Además, Wallace y Anderson (1984) vieron que se producía antes la inhibición del crecimiento radicular que inhibición de la replicación del ADN, sugiriendo que la interferencia con el ADN no sería la causa por la que se inhibe, al menos al principio, la elongación de la raíz. Por tanto, parece que lo que mejor explicaría la interferencia en la división celular sería la influencia que ejerce el aluminio sobre la homeostasis del calcio, ya que éste, como se ha comentado anteriormente, influye sobre la proteína P34cdc2 y sobre la anafase. ALTERACIONES NUTRITIVAS PROVOCADAS POR EL ALUMINIO Uno de los efectos mas conocidos del aluminio es el desorden nutritivo que provoca. La toxicidad por aluminio normalmente disminuye la concentración de ciertos elementos en las plantas. La disminución de la absorción catiónica puede ser correlacionada con la inhibición del crecimiento radicular, ya que sobre todo cationes como el K+ cuya acumulación contribuye a la expansión celular ven afectada su absorción en presencia de Al. Sin embargo, esta interferencia depende de la especie estudiada como del genotipo. Así, parece ser que mientras los contenidos de N, K, Mg, Fe y Mn permanecen casi inalterados, el contenido en P y Ca es altamente afectado en los tratamientos con aluminio. Estudios con plantas hiperacumuladoras de aluminio revelan que la acumulación de aluminio en las hojas restringe la acumulación de otros elementos minerales en las hojas, lo cual sugiere que plantas que acumulan aluminio han desarrollado mecanismos eficientes para usar bajas concentraciones de otros elementos esenciales para crecer en suelos ácidos (Osaka, 1998). No solo la absorción de de calcio parece que es alterada, sino también su translocación en el interior de la planta (Huang et al., 1992). INTERACCIÓN AL - CA. Como se ha señalado anteriormente uno de los primeros síntomas definidos en la toxicidad por aluminio es el producido debido a los procesos, tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática, por los que el metal bloquea la entrada de calcio. Es bien conocido el efecto antagonista del calcio en la toxicidad por aluminio. Una elevada cantidad de Ca evita la entrada de éste en la raíz y la inhibición del crecimiento radicular (Matsumoto et. Al. 1996). El calcio actúa también de manera antagónica en cuanto a la permeabilidad de la membrana. La controversia acerca de si el aluminio aumenta o disminuye la concentración de calcio intracelular se refleja en la disparidad de los estudios realizados y sus resultados, indicando algunos una disminución de éste a través del bloqueo de los canales (Rengel, 1992) y otros un aumento de la concentración citosólica del catión (Ma, 2002). De ésta manera, la toxicidad por aluminio respecto al calcio no se

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produciría a través del bloqueo de los canales. Debido a la baja correlación existente entre la inhibición del crecimiento radicular y la reducción del influjo de calcio en Arabidopsis encontrada por Schofield et al. (1998), se concluyó que la toxicidad por aluminio no era causada por una limitación en la disponibilidad de calcio. A través de diferentes estudios llevados a cabo por los mismos autores tampoco se apoya la hipótesis de que el aluminio desplaza al calcio en los lugares de unión de éste en el citoplasma, por lo que el posible desplazamiento del calcio y substitución de éste por aluminio en la pared celular puede ser suficiente para producir alteraciones en el normal desarrollo celular. INTERACCIÓN AL - K. El potasio es el único catión monovalente esencial para las plantas. Aunque la mayoría de las plantas requieren cantidades relativamente elevadas de potasio, ningún metabolito vegetal que requiera este elemento ha sido aislado. Debido a que no se cree necesaria una cantidad tan elevada tan solo para un papel catalítico, se ha sugerido por diversos investigadores la necesidad del potasio para mantener un ambiente iónico apropiado y para preservar la estructura celular tridimensional necesaria. Parece que también está implicado en el transporte a través del floema. (Barceló et al., 2003). En cuanto a la absorción de K, Lance y Pearson (1969) observaron que disminuía la absorción de este elemento en plantas de algodón, lo cual ha sido corroborado por investigaciones llevadas a cabo en arroz por Foy et al. (1978). Sin embargo, experimentos realizados por Lee en 1971 demuestran el efecto contrario. En estudios realizados en Zea mays en 1985 por Cumming et al. (1986), parece que se encuentra más afectado el transporte de K que su absorción. La inhibición ocurre rápidamente y puede ser parcialmente reversible una vez se retira el tratamiento de aluminio (Schroeder, 1994), apoyando la hipótesis de un bloqueo exterior por parte del aluminio de los canales de potasio. Estudios más recientes (Liu et al. 2001) siguen apuntando la inhibición de la absorción de potasio por parte del aluminio en células guarda de Arabidopsis., a través de un bloqueo interno. Estos estudios demuestran que la inhibición de la absorción de potasio es proporcional a la concentración de aluminio aplicada; así, una concentración de 10 µM de aluminio inhibe aproximadamente el 50% de la absorción de potasio y una concentración de 50 µM inhibiría la absorción de potasio por célula en un 79%. Parece, además, que esta inhibición de los canales de potasio estudiados no es externa y que se produce una vez el aluminio ha penetrado al interior de la célula, sugiriendo que ciertos componentes, ya sean de la membrana plasmática o del citosol, son requeridos para esta acción del aluminio. Esta interacción sería específica, ya que, a pesar de que el aluminio sea capaz de unirse a un gran número de moléculas en la membrana plasmática, se comprobó que este efecto era específico al estudiar otros cationes como el La3+ o el Gd3+ produciéndose efectos muy diferentes a los obtenidos con los tratamientos con aluminio. Sin embargo, existen también estudios (Malkanthi et al., 1985) en cultivos de cebada en los que se produce una estimulación en la absorción de potasio en las raíces al ser tratadas las plantas con 200 µM de aluminio. INTERACCIÓN AL - FE.

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El hierro funciona como componente estructural (citocromo oxidasa, catalasa, peroxidasa y ferredoxina) y cofactor enzimático en las plantas. Aproximadamente el 75% del hierro celular se encuentra en los cloroplastos y el Fe es esencial también para la síntesis de clorofila (Barceló et al., 2003). El tratamiento de las raíces de las plantas con aluminio reduce la concentración de hierro y produce síntomas típicos de clorosis (Otsuka, 1969). Dichos síntomas fueron aliviados con la adición de elevadas concentraciones de hierro a la solución. Como se menciona anteriormente, la absorción de hierro se caracteriza por estar constituida por dos estrategias (I y II). La I, característica de la mayoría de las dicotiledóneas y no gramíneas y la II, típica tan solo de gramíneas. Esta última requiere la exudación de fitosideróforos. Con respecto a esto Chang et al. (1998) encontraron que la biosíntesis de éstos y la exudación podían ser inhibidas por tratamientos con aluminio en plantas de trigo. Sin embargo, la solubilización del hierro y su absorción no eran alteradas. Además, esta inhibición se producía a altas concentraciones de aluminio (20 µM) y tras 24 horas de tratamiento, de manera que no parece que sea el aluminio el que directamente bloquee el transporte de hierro al interior celular y sea más una consecuencia secundaria de los efectos producidos por éste.

INTERACCIÓN AL - P. La forma en la que el fósforo se encuentra en el suelo depende del pH de éste; así, se favorece la absorción de éste elemento cuando las condiciones son ácidas, encontrándose entonces mayoritariamente en forma H2PO4-. El fosfato no necesita ser reducido en el interior de la célula para ser incorporado a compuestos orgánicos. Forma parte de los ácidos nucleicos, adenosín-fosfatos (AMP, ADP, ATP) y piridín nucleótidos (NADP) por lo que participa en las reacciones energéticas, procesos anabólicos y transferencia de características hereditarias. Su deficiencia provoca severas alteraciones del metabolismo y por tanto del desarrollo vegetal (Marschner, 1986, Barceló, 2003). Uno de los síntomas observados en las plantas expuestas a tratamientos con aluminio es una pigmentación más oscura, un verde más intenso que Lee y Pritchard (1984) relacionaron con una deficiencia de fósforo. Los niveles de fósforo interno varían bastante en función de la especie estudiada. En ciertas variedades de trigo y tomate la tolerancia al aluminio coincide con la habilidad para tolerar bajos niveles de P en la solución nutritiva. Lee y Pitchard (1984), observaron disminuciones significativas en el contenido en fósforo en todos los órganos estudiados de Trifolium repens. En general, en el rango de pH entre 4.5 y 7, se observa una fuerte interacción entre Al y P, incrementándose así la cantidad de fósforo inmovilizado en la raíz y disminuyendo el fósforo disponible en la parte aérea, donde se dan los mencionados síntomas por deficiencia de P. El aluminio concentra la cantidad de fósforo en la raíz y lo diminuye en la parte aérea (Cuming et al., 1986). En estudios más recientes acerca de la distorsión de los niveles de fósforo, las indicaciones sobre el comportamiento de éste siguen siendo las mismas. Así, Façanha et

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al. (2002), estudiando plantas de maíz los efectos producidos por los fluoruros de aluminio (supuestamente ligeramente menos tóxicos que el AlCl3) en la absorción de fosfato, indican que aquéllos promueven una disminución de la absorción y este efecto es antagonizado aumentando la concentración de fosfato. Esto sugiere un lugar de unión común para los fosfatos y los fluoruros de aluminio en un transportador de alta afinidad por el fosfato. A su vez, se ensayó la inhibición de la ATP-asa de la membrana plasmática por parte de los fluoruros de aluminio, observándose que estos complejos también inhibían gran parte de su acción, necesaria para la adquisición de fósforo, ya que éste es absorbido por la planta a través de un proceso cotransporte con requerimiento de energía generada por un gradiente de protones creado por esta H+ATP-asa. Estudiando plantas hiperacumuladoras, sin embargo, se ha señalado ciertos efectos beneficiosos del aluminio sobre el aumento del crecimiento de la planta. Esta mejora en el crecimiento fue acompañada por un aumento de las concentraciones de fósforo en los tejidos (Osaki et al., 1997). ENMIENDAS Los síntomas tóxicos generados por el aluminio pueden disminuirse por una adición extra de magnesio o calcio. La adición de fosfato también tiene un efecto positivo, ya que precipita con el aluminio dentro o fuera de las raíces. Hay algunas evidencias de que los síntomas tóxicos son aliviados por magnesio en monocotiledóneas, en las cuales el calcio tiene un efecto muy pequeño y sin embargo, tiene un fuerte efecto en dicotiledóneas (figura 2.6). Un hecho interesante es que el requerimiento de calcio para las dicotiledóneas es alto. La capacidad de algunas masas de ácidos orgánicos de elevado peso molecular como el ácido húmico o el ácido fúlvico de retener al aluminio es bien conocida. Estas sustancias forman complejos estables con el aluminio que el citrato o el malato, que son excretados por las raíces de algunas plantas resistentes al aluminio. Los ácidos fúlvicos y humídicos son constituyentes normales del humus, turba, y restos de hojas, que pueden ser añadidos para aliviar los efectos tóxicos del Al.

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Figura 2.6. Reducción de efectos tóxicos (monocotiledóneas) y calcio (enmonocotiledóneas).

del

aluminio

por

magnesio

Algunos de los síntomas de la toxicidad por aluminio (como la inhibición de la elongación de la raíz) de Cucurbita pepo (squash) que crece en una solución nutritiva son aliviados por la adición de boro (Lenoble et al. 1996a) La incorporación del boro en un subsuelo ácido con elevada cantidad de aluminio promueve el crecimiento de la raíz en profundidad y el crecimiento total radical en Medicago sativa (alfalfa) (lenoble et al. 1996b).

Figura 2.7. Distintos ácidos que intervienen en el mecanismo de resistencia a aluminio.

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MECANISMOS DE RESISTENCIA A LA TOXICIDAD TOLERANCIA AL ALUMINIO Las respuestas del sistema radicular y en general, de toda la planta, frente a la toxicidad por aluminio, varia considerablemente dependiendo de la especie e incluso dependiendo de la variedad que estemos estudiando (Barceló y Poschenrieder, 2002). La respuesta de las plantas frente a cualquier estrés se divide en estrategias de evitación y estrategias de tolerancia, lo cual es aplicable también al estrés por aluminio. Entre los mecanismos de evitación se encuentran: Exclusión de moléculas de bajo peso molecular para la quelación del aluminio apoplástico. - Modificación del pH rizosférico. - Unión del aluminio a la pared celular. Disminución de la permeabilidad de la membrana a la penetración de aluminio. - Unión del aluminio al mucílago asociado al ápice de la raíz. Entre los mecanismos de tolerancia: -

La quelación del aluminio con moléculas orgánicas en el interior celular Unión del aluminio a proteínas en el citoplasma Compartimentación celular del aluminio.

Hasta el momento no existen estudios que apoyen la mayoría de estos mecanismos y han sido principalmente especulados. Debido a que la inhibición del crecimiento radicular es uno de los primeros efectos observados en la toxicidad por aluminio, este factor se viene usando ampliamente como indicador de la tolerancia al metal (Howeler y Cadavid, 1976; Baligar et al., 1990), aunque los mecanismos mediante los que sucede esto no son todavía bien conocidos. Teniendo en cuenta este factor se han clasificado diferentes variedades de maíz según su tolerancia (Llugany et al., 1995). Otro factor que también se tiene en cuenta es la acumulación de callosa, que es casi directamente proporcional a la cantidad de aluminio (Zhang et al., 1994, Massot et al., 1999). GENÉTICA DE LA RESISTENCIA AL ALUMINIO La mayoría de los estudios sobre la resistencia al aluminio se han centrado en los últimos años en el estudio de variedades de trigo debido a la creciente demanda de los agricultores de variedades con mejorada resistencia a la toxicidad por aluminio (Carver, 1995). Es en trigo dónde se ha observado que las variedades moderadamente tolerantes al aluminio deben su resistencia a unos pocos genes y que las variedades que presentan una mayor tolerancia al aluminio, como en la variedad Atlas 66, la resistencia parece estar controlada por un conjunto complejo de genes. El amplio rango de tolerancia al aluminio que presentan las diferentes variedades de trigo ha permitido el estudio de la

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variabilidad de genes involucrados en los diferentes mecanismo de resistencia (Carver, 1995). La tolerancia al aluminio está genéticamente controlada, al menos parcialmente, por lo que es posible el desarrollo de variedades con una elevada tolerancia al aluminio utilizando técnicas de manipulación citogenéticas. Por esta razón es importante el estudio de cuáles son los cromosomas implicados en estos mecanismos. Se han localizado algunos de los genes que intervienen en los mecanismos de tolerancia. Así, Anion (1984), describió que en la variedad de trigo “Chinese Spring”, con una tolerancia media al aluminio, los genes implicados se encontraban en los brazos de los cromosomas 6AL, 7AS, 2DL, 3DL, 4Dl, y 4DB y en el cromosoma 7D. Sin embargo, los procesos fisiológicos que controlan estos genes son todavía desconocidos. Estudios recientes llevados a cabo por Ma (2000), con diferentes líneas de triticale (híbrido sintético de trigo y centeno), demostraron que el brazo corto del cromosoma 3R era el portador de genes relacionados con la exclusión de citrato y malato. En estudios realizados con diferentes líneas, (ST22, en la que se sustituyeron estos genes y ST2 donde no se había dado ninguna sustitución) se observó como la inhibición del crecimiento radicular era mayor en ST22 al igual que se producía una menor liberación de ácidos orgánicos, directamente implicados con la tolerancia a la toxicidad por aluminio. También se comprobó la especificidad de estos genes estudiando el efecto de otros metales. CAMBIO DEL PH RIZOSFÉRICO Uno de los mecanismos sugeridos por los que la planta parece defenderse frente a los efectos tóxicos del aluminio es la inducción de un aumento del pH en la rizosfera, ya que la solubilidad del catión es fuertemente dependiente del pH de la solución. De esta manera, si se aumenta el pH se disminuye la solubilidad del aluminio y por tanto se reducen los efectos. Existen muchos reportes que señalan una clara correlación entre el aumento de pH producido en la rizosfera y la tolerancia. Blamey, en 1983, encontró que un aumento en el pH de 4.2 a 4.6 disminuía en un 26 % la solubilidad del aluminio. Diferencias en la tolerancia de dos variedades de Arabidopsis basada únicamente en este hecho fue descrita por Degenhardt et al. (1998). Sin embargo, existen otros estudios en los que no se puede establecer una correlación tan clara entre el cambio de pH y la tolerancia (Miyasaka et al., 1986). Es probable que las plantas mantengan zonas de diferente pH en la zona del mucílago y que no sea detectado. MUCÍLAGO El meristemo y la parte del ápice de la raíz, que parecen ser los sitios primarios del ataque del Al, están recubiertos por una capa de mucílago de un grosor de 50 µm a 1 mm. El mucílago consiste en grandes moléculas de peso molecular igual o superior a 2x106 Da. En su composición forman una mezcla compleja en la que predominan los hidratos de carbono. Abundantes azúcares son la glucosa, galactosa y arabinosa. y en menor cantidad, y característicos del mucílago, se hallan los ácidos urónicos. Entre las diferentes funciones que se atribuyen al mucílago, están la de crear un nicho protegido

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para multiplicación de las bacterias y para la acumulación de exudados solubles de la raíz, y su participación en la transferencia de nutrientes a las raíces, ya que las cargas negativas podrían jugar un papel en el intercambio catiónico directo entre las micelas del suelo y las raíces. Estas mismas cargas negativas son las que podrían proteger la raíz frente al aluminio, excluyéndolo y manteniéndolo en el apoplasto. Así, en estudios llevados a cabo por Horst et al. en 1982, cuando el mucílago se retiraba periódicamente de la raíz el crecimiento radicular se inhibía considerablemente frente a tratamientos con aluminio, lo que señala su carácter protector contra la toxicidad por aluminio. Sin embargo, como han mostrado tinciones con hematoxilina, no parece que el mucílago se una al aluminio, si no que se difundiría muy lentamente a través de este, además de la presencia de ácidos orgánicos en el mismo, quelarían al metal antes de que llegara a la superficie celular (Henderson et. al, 1991).

CAPACIDAD DE INTERCAMBIO CATIÓNICO (CIC) La unión de aluminio en el apoplasto parece ser debida a la presencia de cargas negativas en este último. Plantas con poca electronegatividad, medida en forma de CIC, (poca presencia de cargas negativas en su superficie) suelen ser más resistentes. Varios estudios muestran como una baja CIC en la raíz caracteriza a plantas adatadas a suelos con elevada cantidad de aluminio (Blamey et al., 1990). La unión del aluminio a la membrana plasmática es uno de los mayores factores de toxicidad por aluminio. Esta capacidad de unión de la membrana plasmática al aluminio es debida a la presencia de grupos fosfato y carboxilo cargados negativamente. Sin embargo, no parece que en la parte aérea haya variación en la concentración de Al entre las plantas sensibles y las tolerantes debido a esta diferencia en su CIC. Kennedy et al. (1986), encontraron que variedades de algodón que presentaban una CIC más baja que otras variedades, acumulaban más aluminio. Parece que existe una cierta influencia de este factor y la tolerancia al aluminio, pero todavía no se ha establecido una relación clara. Sin embargo, estudios de medidas de la negatividad de las superficies celulares de diferentes plantas con diferente tolerancia al aluminio, llevados a cabo por Wagatsuma et al. (1995), encontraron que las plantas más tolerantes poseen un potencial de membrana más negativo que las más tolerantes. Si este mecanismo se establece como mecanismo de tolerancia, una diferencia en la composición lipídica de las membranas celulares de las diferentes plantas con diferente tolerancia debería ser encontrada. Sin embargo, en estudios realizados con Triticum aestivum no se encuentra una diferencia en la composición lipídica entre plantas tolerantes y sensibles (Zhang et al., 1997). Esto puede ser debido a que el pH de la raíz puede variar enormemente de una zona a otra y, además, varía según el estado de desarrollo de ésta. (Grauer, 1992). La unión de zonas no sensibles en el apoplasto se ha propuesto como un sistema de resistencia a los metales pesados (Turner, 1970). Poco es conocido sobre estas zonas respecto al aluminio, tanto a nivel de la pared celular como a nivel de la membrana que pueden determinar diferencias en la tolerancia. COMPARTIMENTACIÓN

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El aislamiento del aluminio en lugares donde la planta no es sensible a sus efectos se ha considerado también un mecanismo de tolerancia. Es común que el aluminio se haya localizado en muchas células epidérmicas de la hoja en especies hiperacumuladoras. En estas células no se realiza la fotosíntesis y se corresponde con el lugar donde se acumulan otros metales (Zn, Ni) en plantas acumuladoras (Küpper et al. 1999). Watanabe (1998) observó aluminio monomérico en el interior de las hojas de Melastoma malabathricum, sugiriendo en su estudio que el aluminio se encontraba en los lugares ácidos de la célula como la vacuola. También Cuenca (1991) indicó por análisis de rayos X que el aluminio alcanzaba las vacuolas y los cloroplastos en Richeria grandis, otra especie hiperacumuladora. EXUDACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS Todas las investigaciones acerca de la toxicidad por aluminio señalan que éste debe interactuar con la punta de la raíz para producir los primeros efectos de disminución del crecimiento. Ryan y colaboradores (1993), mostraron como en trigo y en maíz se inhibía su crecimiento radicular al ser expuestos a concentraciones tóxicas de aluminio en los primeros 5mm de la raíz. En estudios realizados comparando variedades de trigo resistentes y tolerantes al aluminio se encontró que las variedades más sensibles acumulaban mucha más cantidad de aluminio en la raíz que las variedades más tolerantes frente a un mismo tratamiento con aluminio, mientras que no se encontraba ninguna diferencia en la zona de maduración de la raíz (Rincón et al., 1992). Centrándose en este punto, se ha llevado a cabo una gran cantidad de investigaciones, proporcionando evidencias de uno de los aparentemente más importantes mecanismos de resistencia al aluminio: la exudación de moléculas de bajo peso molecular al apoplasto (Barceló y Poschenrieder, 2002). El aluminio es muy tóxico para las plantas y se une, como hemos indicado antes, a la membrana plasmática, a la pared celular, y al ADN u otros componentes intracelulares una vez está en el citoplasma. Dentro de los mecanismos que la planta desarrolla para evitar este estrés, la reducción de su acción tóxica mediante la quelación de este ión con diferentes compuestos en el apoplasto de la raíz, es uno de ellos. Las diferentes moléculas exudadas a la rizósfera protegerían las partes sensibles de la raíz quelando el ión tóxico de aluminio (Al3+) formando complejos no tóxicos para la planta. Sin embargo, este mecanismo, no solo se desarrolla en el apoplasto, pues la planta también puede quelar el aluminio intracelularmente para evitar que éste se una a componentes vitales celulares. Uno de los principales candidatos a la quelación del aluminio son los ácidos orgánicos, que la planta sintetiza en gran cantidad en la fotosíntesis. El primer ejemplo de sustancia quelante para el aluminio fue determinado por Miyasaka et al. (1998) trabajando con plantas de judía sometidas a estrés por aluminio. En este caso las raíces de las variedades más tolerantes al estrés liberaban 70 veces más citrato que en ausencia de aluminio; por el contrario, las más sensibles solo liberaban 10 veces más citrato en presencia de aluminio que las controles.

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El papel de los ácidos orgánicos en la tolerancia por aluminio ha sido ampliamente estudiado. Así, se han reportado también estudios con trigo, en los que se ha demostrado que variedades más tolerantes exudan hasta 5 o 10 veces más malato que las más sensibles (Delhaize et al., 1993). En estos mismos estudios se estableció que la exudación de malato era específica para el aluminio y que además se producía en la parte terminal de la raíz (entre los 5 y 10 mm desde el ápice). Ryan et al. (1995), trabajando con más de 36 variedades de trigo con diferente tolerancia al aluminio, encontraron una clara correlación entre la liberación de malato y la tolerancia al metal. Se ha señalado, que esta estimulación por parte del aluminio no produce, en general, una estimulación de la formación de novo de malato, ya que no se encuentra diferencia en la actividad en la fosfoenol piruvato carboxilasa y en la NADP-malato deshidrogenasa entre las variedades más tolerantes y las más sensibles (Ryan et al. 1995), de manera que parece que la característica determinante para la tolerancia al aluminio parece ser más la capacidad de exudación que la formación de malato.

Figura 2.8. Excreción de malato desde las raíces de plantas Al-resistentes. Una implicación de los canales aniónicos ha sido sugerida por diversos autores. Los canales aniónicos descritos en la membrana plasmática de células de diferentes plantas, están relacionados con importantes procesos, entre ellos, la regulación de la turgencia celular, el movimiento de los estomas, la adquisición de nutrientes, y el control del potencial de membrana. El malato se encuentra en forma de anión divalente en el citoplasma y el movimiento de malato fuera de la célula se produciría a través de un proceso pasivo debido a la elevada diferencia de potencial negativo a través de la membrana. Delhaize et al. (1995) propusieron el eflujo de malato a través de un canal aniónico en la membrana plasmática que era estimulado por la presencia de aluminio. Se sugirieron distintos modelos funcionales del canal: - El aluminio interactúa directamente con una proteína del canal causando un cambio en la conformación aumentando la obertura y conductancia del canal. - El aluminio interactúa con la membrana misma o con un receptor específico produciendo una activación del canal a través de una serie de mensajeros secundarios. - El aluminio penetra en el citoplasma produciendo una estimulación desde el citoplasma a través de un mensajero secundario o uniéndose a una proteína del canal desde el interior. Varios inhibidores de los canales iónicos producían también una inhibición de la exudación de malato implicando el hecho de que esta exudación se producía a través de los canales iónicos en las zonas apicales de la raíces de plantas tolerantes de trigo (Ryan et al., 1995).

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Parece ser, además, que esta estimulación de la exudación de malato es acompañada también por una estimulación de un eflujo de iónes potasio. El aluminio parece que bloquea parcialmente el canal de entrada de potasio, regulando así el cambio en el potencial de membrana producido por la exudación de ácidos orgánicos (Gassmann et al. 1994). El potasio produce una despolarización de la membrana similar a la que producirían tratamientos con aluminio, sin embargo, no se produce una exudación de malato, por lo que este hecho puede ser parte del proceso, pero no ser suficiente para la estimulación de la exudación del ácido (Papernik et al. 1997). La exudación de malato parece típica en plantas de trigo; sin embargo, parece característica la exudación de citrato en plantas de maíz, pero no es exclusivo de éstas. La exclusión de ácido cítrico por parte de la especie tolerante Cassia tora también se ha observado en tratamientos con 50 µM de AlCl3 durante las primeras 4 horas de tratamiento, lo que sugiere la actuación de unos mecanismos de inducción (Ma et al., 1997b). Otro de los ácidos orgánicos encontrados en los mecanismos de tolerancia desarrollados por las plantas frente al aluminio es el Oxálico. En plantas de trigo con alta tolerancia al aluminio se encontró una rápida exudación de ácido oxálico tras su exposición a tratamientos con AlCl3. Esta exclusión, al igual que en estudios anteriores, se producía en los últimos 10 mm de la raíz (Zheng et al. 1998). Sin embargo, ciertos autores han señalado la exudación de ácidos orgánicos como una parte integrada a un mecanismo mucho más amplio de tolerancia a la toxicidad por aluminio. No está claro si las cantidades de ácidos orgánicos liberados por las plantas sería un mecanismo adecuado para la clasificación de los diferentes genotipos en cuanto a la mayor o menor tolerancia al aluminio. Además, un mecanismo constitutivo de exudación de ácidos orgánicos supondría un gasto energético muy elevado para la planta. No existe tampoco un patrón general en términos de cantidad, duración y especie exudada por la planta ni una explicación o evidencia clara de la estimulación o la forma en que el aluminio desencadenaría este proceso. Sin embargo, merecería la pena considerar este mecanismo como parte importante de la resistencia de las plantas frente a este estrés y evaluar la importancia que tendría dentro de cada especie o variedad, determinando si, en ciertos casos, puede llegar a ser totalmente determinante y factor condicionante para la supervivencia de la planta en condiciones de elevada disponibilidad del metal.

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Figura 2.9. Salida de malato y potasio de la célula por acción de Al3+.

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3. SUELOS BÁSICOS 3.1 GENERALIDADES: DEFICIENCIA Y TOXICIDADES Los suelos alcalinos son aquellos que presentan un pH por encima de 7,2 y se dividen en: - Suelos ligeramente alcalinos: Los que tienen un pH entre 7,2 y 7,5. - Suelos alcalinos: Los que tienen un pH entre 7,5 y 8,5. - Suelos muy alcalinos: Los que tienen un pH entre 8,5 y 9,5. - Suelos extremadamente alcalinos: Los que tienen un pH superior a 9,5. Los suelos alcalinos son muy comunes en climas áridos y semiáridos, ocupan más del 30% de la superficie de la Tierra (Chen and Barak, 1982). Su contenido en CaCO3 en el horizonte superior varía de un porcentaje hasta 95% y presentan una rápida mineralización del nitrógeno orgánico. Los principales suelos alcalinos son las Rendzinas, las cuales se muestran en suelos con alto contenido en materia orgánica cubriendo el material calcáreo. Éstos son los que presentan un pH aproximadamente entre 7 y 8, presentan déficit de Fe, Zn, Mn y Cu (y P), déficit hídrico e impedimentos mecánicos. El pH de suelos calcáreos es determinado por la presencia de CaCO3, el cual está presente en los suelos con rango de pH que va de 7,5 a 8,5.(Tabla 3.1). Cuando el pH es mayor que 8 (entre 8 y 9 normalmente), el Solonetzs es la unidad predominante en el suelo. Los Solonetzs o suelos sódicos (álcali) están caracterizados por una proporción de la adsorción (SAR) de la matriz del suelo mayor que 15, y ellos a menudo contienen carbonato sódico. Presentan toxicidad por Na, K+, Ca+2, Mg+2, Mo, (Fósforo y Nitrógeno), deficiencia en Zn, Fe, P (y Ca, H, Hg), pobre aireación, déficit hídrico, e impedimentos mecánicos. Los suelos sódicos normalmente están en asociación con los suelos salinos (Solonchaks), y los sódico-salinos son más abundantes que los suelos puramente sódicos. En el contexto de coacciones en el crecimiento de la planta ello es necesario, sin embargo, para hacer una clara distinción entre salinidad y modicidad. Los suelos salinos no son necesariamente alcalinos, y el crecimiento de la planta en suelos salinos es afectado principalmente por los altos niveles de cloruro de sodio (toxicidad iónica, desequilibrio iónico) y el daño en el balance hídrico. Los suelos sódicos, por otra parte, son alcalinos y el crecimiento de la planta es perjudicado principalmente por un alto pH, alto bicarbonato, y a menudo pobre aireación.

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Tabla 3.1 Abundancia relativa de suelos alcalinos y coacciçon principal sobre el crecimiento de las plantas en estos suelos La mayor coacción nutricional en suelos calcáreos difiere de aquellos en suelos sódicos (Tabla 3.1). Las diferencias están directamente relacionadas con otros factores químicos del suelo como la concentración de bicarbonato o factores físicos del suelo. En suelos sódicos con condiciones físicas pobres en proporción a la pobre aireación son las mejores coacciones y a menudo están relacionados con la toxicidad de sodio y boro. El nitrógeno es un factor limitante del crecimiento para muchas especies de cosecha (otras que leguminosas) que están creciendo en suelos alcalinos. Más del 90% del nitrógeno del suelo es orgánicamente atado al nitrógeno (humus) el cual llega a estar disponible para la planta después de la mineralización por los microorganismos del suelo. En ambos la cantidad total de nitrógeno del suelo y su disponibilidad para las plantas están además estrechamente relacionadas al contenido en materia orgánica del suelo y las condiciones de mineralización (humedad del suelo, temperatura, aireación). El pH del suelo es sólo de menor importancia para el nivel y volumen de nitrógeno en suelos alcalinos. Con respecto a la corrección de estos suelos, el objetivo es reemplazar los carbonatos alcalinos (Na2 CO3) responsables de la alcalinidad, por sales como los sulfatos que son fácilmente lavables del perfil. Existen 3 tipos de enmiendas que se pueden utilizar: 1) sales solubles de calcio, 2) ácidos o formadores de ácidos y 3) sales de calcio de baja solubilidad. La efectividad de cada mejorador depende de ciertas condiciones de los suelos, en especial el contenido de carbonatos de calcio y magnesio. Una vez decidido qué mejorador es el indicado, decisión que debe tomar el técnico, es necesario calcular las cantidades del mismo que se requieren aplicar para corregir el pH a valores que mejoren las características del suelo. Para ello existen varios métodos. Las sustancias que pueden utilizarse como correctores son: CaCl2 (Cloruro de calcio), CaSO4, yeso, azufre, ácido sulfúrico, sulfato ferroso, sulfato de aluminio, polisulfuro de calcio y otros productos regionales como pueden ser conchilla marina molida, espumas azucareras. FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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Figura 3.1Influencia del pH del suelo en la formación del suelo, movilización y disponibilidad de nutrientes minerales, y en las condiciones de vida en el suelo. El ancho de las bandas indica la intensidad del proceso o la disponibilidad de los nutrientes. (After Truog, from Schroeder 1969)

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Figura 3.2 La disponibilidad de un número de iones en el suelo respecto al pH del suelo

3.2 TIPOS DE PLANTAS Los suelos difieren mucho en su pH y en su concentración en Ca, particularmente en suelos no cultivados. Durante la evolución especies de plantas se han adaptado a esas variaciones de pH y a las condiciones de Ca. Por esta razón existen grandes diferencias entre especies de plantas e incluso entre variedades de una única especie en cuanto a la tolerancia que presentan. En función de ésto, las especies de

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plantas pueden ser divididas en calcícolas y calcífugas. Las calcícolas son típicas de la flora observada en suelos calcáreos, es decir, aquellos que presentan un pH básico. Estas plantas no son resistentes a la toxicidad por Al en suelos ácidos, tienen capacidad para solubilizar Fe (y fosfatos) y también son resistentes a altas concentraciones de Ca+2, mostrando un crecimiento normal o estimulado. Sin embargo, las calcífugas crecen en suelos silíceos y arenosos, suelos ácidos pobres en Ca+2. Es decir, estas plantas evitan suelos calcáreos, presentan alta resistencia al Al y Mn y no tienen capacidad para solubilizar hierro en suelos calizos (en suelos muy básicos se da la clorosis férrica). En la tabla 3.2 se diferencian estrechamente especies según su área de distribución (especies vicario).El intento de descubrir las causas subyacentes de este sorprendente grado de dependencia de hábitat en la distribución de las plantas fue una de las tareas más tempranas realizadas por los ecologistas que analizan las plantas.

Tabla 3.2 La principal diferencia entre los suelos calcáreos y los suelos deficientes en cal es que los primeros contienen muchas más cantidades de Ca+2 y HCO3-, esto significa que los suelos calcáreos son taponados hacia un pH más alto que otros suelos, y muestran una relación débilmente alcalina. Otra diferencia es que los suelos calcáreos son normalmente más permeables al agua y por tanto más cálidos y secos que los suelos silíceos. El nitrógeno es mineralizado más rápidamente en suelos calcáreos, y otros compuestos como el P, Fe, Mn y la mayoría de metales pesados están menos disponibles que en suelos ácidos. Los suelos ácidos son por definición también suelos carbonados. También hay suelos ricos en HCO3- (por ejemplo la roca dolomita contiene MgCO3-) donde pueden encontrarse plantas calcífugas como por ejemplo Anthyllis montana, Saxifraga longifolia en los Pirineos. Los suelos silíceos y otros sustratos pobres en bases son ácidos y, si tienen alto contenido en arcilla, son densos, húmedos y además más fríos que otros suelos más porosos. El Fe y el Mn se encuentran en gran cantidad y se pueden obtener fácilmente, y los compuestos de Al entran fácilmente en solución. Esto es razonable para asumir que todos los factores edáficos afectan sobre el metabolismo inorgánico y el vigor de las FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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plantas, conllevando ésto a una disminución de los rendimientos, una mayor susceptibilidad a los cambios climáticos y otras limitaciones, y reducir la capacidad para competir. La respuesta de las plantas a sustratos inadecuados puede ser muy variable. Las plantas calcícolas son capaces de coger fósforo y elementos traza de suelos calcáreos. Muchas familias de plantas como las Fabáceas, Brasicáceas, Solanáceas y Cucurbitáceas (algunas especies) son muy eficientes en coger Fe del suelo debido a un incremento en el eflujo de protones en la región de la raíz. De esta forma el Fe es reducido a una forma de transporte bivalente, y su absorción aumenta debido a la formación de mayor número de células de transferencia (Figura 3.3).

Figura 3.3 Cuando las plantas calcífugas son transferidas a suelos con cal, desarrollan síntomas de deficiencia de fósforo y hierro (tabla 3.3). Ésto se aplica especialmente para plantas de cultivo y especies ornamentales, de las cuales Citrus y muchas Ericáceas (Rhododendrom especies) son particularmente susceptibles. La clorosis de cal es una alteración metabólica muy compleja implicando la participación de nitrato, fosfato y metabolismo ácido. Las plantas calcífugas estrictas son también hipersensibles a HCO3-. Musgos de turba y gramíneas calcífugas tales como Deschampsia flexuosa producen grandes cantidades de malato en sus raíces cuando la concentración de HCO3- es demasiado alta. Esto inhibe el crecimiento y provoca daños en la raíz.

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Tabla 3.3 En suelos deficientes en cal, suelos ácidos, ricos en Fe, Mn y especialmente Al, los iones pueden causar un estrés severo en plantas calcícolas. Mientras que las plantas calcífugas son capaces de formar complejos inocuos con metales pesados e iones de Al, especies de plantas calcícolas y generalmente sensibles (tabla 3.3) llegan a ser dañadas cuando absorben excesivos iones Al+3 de suelos ácidos. Concentraciones tóxicas de Al arrasan los meristemos apicales de raíces y reducen el crecimiento de la raíz. Las plantas tolerantes al Al son capaces de detoxificar todos los iones Al+3 que difunden al córtex de la raíz el parénquima del cilindro central por unión de ellos con fitoquelados y ácidos orgánicos, por ejemplo el malato, citrato y oxalato. A altas concentraciones los iones Al+3 primero se acumulan en los núcleos de la puntad e la raíz y luego perjudican la membrana plasmática y ocupan los canales de Ca+2 los cuales interferirán con el sistema calcio-calmodulina. Las plantas de cultivos, especialmente cereales, son normalmente muy sensibles a altas concentraciones de Al en los suelos. En regiones tropicales con predominio de los suelos persialíticos las plantas cultivadas sufren un severo estrés de Al en el 40% de las áreas de agricultura. Por lo tanto, hay tendencias a crear variedades resistentes al Al a escala global. Ocurren claras diferencias en el metabolismo del Ca+2 entre los dos grupos de plantas. Muchas de las especies calcícolas contienen altos niveles de Ca+2 intracelular y altas concentraciones de malato, mientras que las calcífugas son normalmente poco solubles en Ca+2. Especies e incluso cultivos se pueden diferenciar en su capacidad de precipitación de Ca+2, principalmente en la forma de oxalato de calcio aunque también se pueden formar otros cristales que contienen calcio (Bangerth 1979). La concentración de calcio en plantas está en gran parte geneticamente controlada y es poco afectada por el suministro de Ca+2 en la raíz media, a condición de que la disponibilidad de Ca+2 es adecuada para el crecimiento normal de la planta. Ésto ha sido muy bien demostrado por Loneragan y Snowball (1969), quién comparó la concentración de Ca+2 de 18 especies diferentes crecidas en una solución de nutrientes, con otras crecidas en el campo. Como se puede ver en la figura 3.4. había poca diferencia en la concentración de Ca+2 de especies particulares si las plantas habían sido cultivadas en suelo o en una solución. Adicionalmente las concentraciones de Ca+2 de las monocotiledóneas fueron mucho más bajas que la de dicotiledóneas.

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Figura 3.4 Como hemos comentado anteriormente, el nivel de Ca+2 no es el único factor importante en la cuestión calcícola-calcífuga, para suelos calcáreos y ácidos difieren en otros aspectos. Los suelos calcáreos tienen un pH y un contenido en carbonatos mayor. Son más ricos en nutrientes, el nivel de metales pesados solubles es más bajo y también la actividad de la nitrificación y la fijación de nitrógeno por la bacteria son mayores. Un ejemplo que muestra la importancia del incremento en la solubilidad de metales pesados bajo condiciones ácidas se muestra en el trabajo realizado por Rorison (1960). Se observó la inhabilidad de la calcícola Scabiosa columbaria para crecer bajo condiciones ácidas originadas en gran parte de su no tolerancia al Al. Las plantas crecieron mal en suelo con un pH de 4,8 pero en soluciones nutrientes había poca diferencia en el crecimiento entre un pH de 4,8 a uno de 7,6. Cuando los niveles de Ca+2 se incrementaron sin inducir un cambio de pH, por la adición de CaSO4, no se observó ninguna mejora en el crecimiento de la planta. La adición de Al+3 a una solución de pH bajo, sin embargo, deprimió el crecimiento en un lugar similar a las plantas cultivadas en suelos con el mismo pH. En cuanto a la disponibilidad de los diferentes ecotipos para utilizar Fe, Hutchinson (1967) testó 135 especies de plantas diferentes en su sensibilidad a clorosis inducida por cal por altos niveles de CaCO3 en el suelo. Se observó que esas especies de plantas originarias de suelos ácidos fueron más susceptibles que otras calcáreas. La clorosis inducida por cal es un transtorno fisiológico que se caracteriza por una luz de color verde a amarillo de las hojas más jóvenes y la cual resulta de un exceso de HCO3en suelos calcáreos (Mengel 1994). Hutchinson (1967) también observó que la sensibilidad de los ecotipos de suelos ácidos a clorosis inducida por cal no fue debido a la carencia de captación de Fe por las raíces sino más bien por la inhabilidad de las

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raíces de metabolizar Fe. La clorosis inducida por cal puede ser a menudo un serio problema en cosechas en crecimiento en suelos calcáreos. McLaughlin y Wimmer (1999) resumieron 3 procesos que tienen la ventaja a largo plazo de disminuir la disponibilidad de Ca+2 para las plantas. Una es la incorporación de Ca+2 en la biomasa de la planta, donde está temporalmente no disponible para el sistema (en el caso de la biomasa de la madera en ecosistemas de bosque) o continuamente eliminado del sitio por el rendimiento cosechado (en el caso de sistemas agriculturales). Segundo, las pérdidas de Ca+2 disponibles del suelo por el lixiviado como incremento de las cantidades de Ca+2 intercambiable de las reservas del suelo son reemplazadas por H+ y especies de Al catiónico en el complejo de intercambio del suelo. Por último, pero no menos importante, la reducida disponibilidad de Ca+2 de las raíces puede deberse a la interferencia competitiva de especies catiónicas de Al y otros cationes tales como Mn+2 y Fe+2 que incrementan en la solución del suelo como caída de los nieveles de pH a valores inferiores a 5.0. La cantidad de Ca+2 absorbido por las plantas depende de la concentración en el medio de la raíz y también están controladas geneticamente. Ésto ha sido bien demostrado por Clarkson (1965) quién comparó unas especies calcícolas y calcífugas de Agrostis en su respuesta al Ca+2 . Ambas especies crecieron a pH 4,5 en una solución nutriente con incremento de las concentraciones de Ca+2 . Agrostis setacea (la especie calcífuga) fue poco afectada en su crecimiento por el suministro adicional de Ca+2, mientras que Agrostis stolonifera (la especie calcícola) respondió considerablemente al alto tratamiento con Ca+2 (Figura 3.5) Por lo tanto, las concentraciones de Ca+2 encontradas en tejidos de plantas pueden variar considerablemente. En general las concentraciones más bajas de Ca+2 se encuentran en monocotiledóneas en lugar de en dicotiledóneas como ya hemos mencionado. Especies de plantas y poblaciones dentro de las especies (ecotipos) de la vegetación natural que crecen preferentemente en suelos calcáreos (calcícolas) poseen mecanismos adaptativos para copiar coacciones en el crecimiento y nutrición mineral tales como baja disponibilidad de zinc y de hierro y a menudo altas concentraciones de calcio y bicarbonato en la solución del suelo. Por ejemplo, las calcícolas tienen mayor capacidad para adquirir hierro que las calcífugas; especies y ecotipos que se han adaptado a suelos ácidos (De Neeling and Ernst, 1986; Gries and Runge, 1992). Las calcícolas son a menudo muy eficientes en captar fósforo (Musick, 1978) al menos en algunos casos porque las raíces son altamente infectadas con micorrizas VA (Kianmehr, 1978). En acuerdo con esto, la incapacidad para movilizar fósforo en suelos calcáreos es considerado como un factor clave en el comportamiento calcífugo de muchas especies de plantas tales como Rumez acetosella y Silene rupestres (Tyler, 1992). Además, y en contraste con las calcífugas, las calcícolas con altas concentraciones de HCO3- tienen sólo efectos inhibitorios insignificantes en el crecimiento en extensión de la raíz (Lee and Woolhouse, 1969).

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Figura 3.5 El papel de las altas concentraciones de calcio en la adaptación de las plantas a suelos calcáreos parece ser más bien complejo. En calcícolas la anulación y la tolerancia de las altas concentraciones de calcio en el tejido de la planta parecen ocurrir. Por ejemplo, muchos miembros de Brasicáceas acumulan grandes cantidades de calcio soluble en sus vacuolas (tipos calciotrópicos) los cuales muchos tienen ventajas en condiciones de osmorregulación sobre hábitats de caliza secos (Kinzel and Lechner, 1992). De otra parte, en ciertas especies calcícolas la captación de calcio es más restringida que en especies calcífugas (Bousquet et al., 1981), por lo visto debido a una afinidad más baja por Ca+2 en la membrana plasmática de la raíz (Monestiez et al., 1982). Los mecanismos de la toxicidad por calcio en general y en las especies calcífugas en particular es mal entendido. En la especie calcífuga Lupinus luteus el crecimiento con severidad es deprimido aún en una concentración de 8 mM en la solución externa de calcio. Esta depresión no puede ser explicada por interferencia con altas concentraciones de Ca+2 en el apoplasma de la hojacon el papel del ABA en la regulación estomacal y además, el control de las relaciones de la planta con el agua (Atkinson, 1991). Probablemente en calcífugas la compartimentación estricta de Ca+2 a nivel celular y la permanencia de bajas concentraciones de Ca+2 en el citosol es menos efectiva que en calcícolas. Un alto nivel de proteínas de unión a calcio en el citoplasma de las especies calcícolas (Le Gales et al., 1980) podría apoyar esta sugerencia. En muchas plantas herbáceas que crecen en suelos calcáreos hay abundantes raíces calcificadas las cuales son formadas por solubilización de CaCO3 en la rizosfera y precipitación de CaCO3 en su cortex celular (Jaillard, 1985; Jaillard et al., 1991). Esto podría reflejar la movilización realzada de sustancias nutritivas moderadamente solubles minerales (fósforo, hierro, zinc…) en la rizosfera y simultáneamente la protección del tejido de la excesiva concentración de calcio por precipitación de CaCO3 en el tejido de la raíz.

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Hay pruebas sustanciales de que ciertos hongos micorrizas ecto- y ericoidesjuegan un papel en la adaptación de especies de plantas perennes a suelos calcáreos. Ésto puede ser alcanzado por la liberación de sideróforos y una mejora en la adquisición de hierro e incrementando así la tolerancia de la planta anfitrión a la clorosis inducida por cal. también puede ser causado por la producción de ácido oxálico que disuelve fosfatos de calcio solubles con moderación y simultáneamente protege la planta anfitrión de la respuesta de calcio excesiva por la precipitación de oxalato alrededor del hongo micelio. El hongo ectomicorrizal Paxillus involutus es particularmente efectivo cuando suministramos nitrato como fuente de nitrógeno (Lapeyrie el al., 1991). Sin embargo, hay claras diferencias entre las cepas: las de suelos calcáreos acumulan mucho menos calcio en sus hifas que las de suelos ácidos (Lapeyrie and Bruchet, 1986).

3.3 EL CALCIO COMO MACRONUTRIENTE El calcio es un macronutriente mineral esencial transportado en plantas en la corriente de transpiración. Se absorbe y transporta de forma iónica divalente Ca+2. Es abundante en la mayoría de los suelos, y rara vez se comporta como un factor limitante, salvo en suelos ácidos con lluvias abundantes, donde resulta necesario el aporte de sales cálcicas, principalmente carbonatos, que elevan el pH. Su movilidad es mucho mayor en el apoplasto que en el simplasto, de tal modo que en aquellos órganos que reciben la mayor parte del agua por el floema no es infrecuente que reciban un suministro adecuado en este elemento mineral, es decir, si el calcio no está libremente móvil en la planta, cortos períodos de déficit de calcio afectarán rápidamente al crecimiento de los tejidos. No hay movimiento de calcio de los tejidos más viejos a los nuevamente desarrollados. Ello es causa de alteraciones tan conocidas como la quemadura apical (tip burn) de la lechuga, la podredumbre estilar (blossom end rot) del tomate, o los nódulos amargos (bitter pit) de la manzana. En los cultivos hidropónicos, la deficiencia de Ca se caracteriza por un pobre desarrollo radicular. Los síntomas de la deficiencia de Ca son siempre más evidentes en los tejidos jóvenes y las zonas meristemáticas de raíces, tallos y hojas. Existen dos razones principales que explican este hecho: por un lado, la división celular se ve afectada por la deficiencia de calcio, y en los tejidos mencionados el índice mitótico es alto; por otro, la lámina media que se forma entre dos células hijas, uno de cuyos principales componentes es el pectato cálcico, puede verse alterada. El calcio es un nutriente esencial de las plantas, el cual juega muchos papeles en las funciones de la planta. Entra fácilmente en el apoplasto y se une en una forma cambiable a las paredes celulares y a la superpie externa de la membrana plasmática. Una alta proporción de calcio se puede encontrar en las vacuolas, mientras que curiosamente su concentración en el citosol es extremadamente baja, del orden de 1 µM, aunque se absorbe en grandes cantidades y su presencia en la planta es similar a la que puede tener el fósforo, el azufre o el magnesio, lo que puede significar hasta el 1 % de la materia seca. La mayor parte del calcio se localiza por fuera de la pared celular, en los pectatos de la lámina media, y en las membranas. Como hemos mencionado en el interior de la célula el calcio se encuentra en las vacuolas donde, dado el pH ácido de éstas, puede precipitar como sales de oxalato, fosfato, carbonato, sulfato, etc…, según las especies. Sin embargo, en el citosol su concentración sigue siendo muy baja porque,

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si bien activa algunas enzimas, muchas otras son inhibidas con concentraciones de Ca por encima de 1 µM (Figura 3.6). Estas bajas concentraciones de calcio se mantienen gracias a la escasa permeabilidad de las membranas a este ión, así como por la acción de transportadores de membrana (principalmente el Ca+2/H+- ATPasas), que retiran el calcio del citosol y lo expulsan al apoplasto o a compartimentos intracelulares (vacuolas, retículo endoplásmico o cloroplasto). Además, las corrientes citoplasmáticas también se ven inhibidas con concentraciones por encima de ese valor, así como la formación de sales de calcio insolubles con ATP y otros fosfatos orgánicos.

Figura 3.6 El calcio también es necesario para la integridad y la funcionalidad de las membranas y, además, recientemente se ha visto que está implicado como segundo mensajero en el funcionamiento de lagunas hormonas y en respuestas ambientales. Como segundo mensajero, el calcio está implicado en la fosforilación de algunas proteínas, de manera que puede desempeñar un papel importante en la actividad y la regulación de ciertas enzimas. Su unión reversible a una pequeña proteína citosólica, la calmodulina, le permite ejercer una importante función como modulador enzimático y desempeñar un papel fundamental en las señales celulares y en el desarrollo vegetal, como ya se ha demostrado en la célula animal. En la última década la investigación sobre el calcio ha experimentado un formidable desarrollo. Gracias a tecnologías que permiten apreciar cambios en la concentración del calcio intracelular ([Ca+2)i], se ha podido comprobar la implicación de este bioelemento como segundo mensajero en cascadas de señales de la planta dependientes del Ca. En este sentido, destaca el concepto de “firma de calcio” (“Ca+2 signature”), que explica cómo pequeñas variaciones del ([Ca+2)i] son responsables, al menos en parte, de los mecanismos de adaptación y respuesta de la planta a cambios de pH, luz, temperatura y otros que puedan tener lugar en el medio.

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Mucha de su actividad está relacionada con su capacidad de coordinación, por la cual se provee de estabilidad pero con acoplamientos intermoleculares reversibles, predominantemente en las paredes celulares y en la membrana plasmática (Marschner, 1995). El calcio está presente en el tiempo de división celular y puede ser encontrado en el huso mitótico. Es también crítico en la traducción de señales en rutas metabólicas por su unión con calmodulina, una proteína citoplasmática de la planta (Paliyath and Thompson, 1987) Poovaiah (1985) relató que el calcio unido a la calmodulina estaban implicados en la regulación de muchos procesos metabólicos, incluyendo respuestas de las plantas a l medioambiente y respuestas metabólicas al crecimiento regulador de la plantas. El calcio es requerido como cofactor en muchas enzimas, aunque a altas concentraciones se puede inhibir la actividad enzimática. Bush et al.(1986) concluyeron que el calcio afecta directamente al proceso de síntesis y transporte de enzimas. El calcio también juega un papel importante en la germinación de semillas. Bush et al.dijeron que el ácido gibrerélico y el ácido abcísico regulan la producción de αamilasa en el tejido de aleurona durante la germinación del grano de cebada. Ellos encontraron que el ácido giberélico incrementa y el ácido abcísico disminuye el flujo de ión calcio en el retículo endoplásmico. 3.4 TOXICIDAD POR CALCIO La principal concentración de Ca en la corteza terrestre está en cantidades de aproximadamente 36.4 g/Kg. Esto es así más alta que muchos otros nutrientes de plantas (Tabla 3.4). El calcio está presente en el suelo en varios minerales primarios. Estos incluyen el Ca portando silicatos de Al tales como feldespatos y anfóbolos, fosfatos de Ca y carbonatos de Ca. Estos últimos son particularmente importantes en suelos calcáreos (Donner and Lynn, 1989) y están normalmente presentes como calcita (CaCO3) o dolomita [CaMg(CO3)2]. El calcio está presente en varias formas de fosfato de calcio tales como apatitas, octo-Ca-fosfato y CaHPO4. La concentración de calcio de diferentes tipos de suelos varía mucho dependiendo principalmente del material de partida y del grado en el que el desgaste y el lixiviado han influido en el desarrollo del suelo. Los suelos derivados de caliza o tiza, y suelos de pantanos jóvenes son normalmente ricos en Ca con alto contenido de CaCO3 estando en el rango de 100 a 700g /Kg Ca. Incluso en la capa superficial de suelos desarrollados en caliza, sin embargo, pueden ser pobres en Ca cuando el lixiviado es excesivo. Los suelos viejos, altamente desgastados y lixiviados bajo condiciones húmedas, son generalmente pobres en Ca. Dos ejemplos típicos de tales suelos son los Spodosoles de la zona templada y los Oxisoles y Ultisoles de los trópicos húmedos. En más condiciones áridas de alto contenido de Ca en la capa superior del suelo pueden estar presentes en la forma de acumulación de yeso (CaSO4* 2 H2O).

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Tabla 3.4 El calcio portando minerales juega un papel importante en la pedogénesis. Así suelos derivados de Ca conteniendo material parental tales como basalto y dolerita generalmente contienen cantidades más altas de minerales de arcilla seundarios. Los suelos desarrollados de calcita, dolomita y tiza principalmente pertenecen al grupo de rendzinas de suelo (Mollisoles). Estos suelos bajos contienen apreciables cantidades de CaCO3 y por esta razón son alcalinos en cuanto al pH. Un pH del suelo alto y la presencia de Ca+2 favorecen la formación de complejos Ca-humatos y es responsable del color oscuro de los Mollisoles. El desgaste de calcio primario portando minerales depende considerablemente de la formación de H+ en el suelo. Los iones de hidrógeno y probablemente también agentes quelados pueden liberar calcio de la estructura enrejada de minerales causando así la disolución del mineral. El ritmo de lixiviación de calcio incrementa con la precipitación anual y con el contenido de Ca portando minerales en el suelo. Cantidades de Ca lixiviado bajo condiciones templadas están en un rango de 200 a 300 Kg Ca/ha. Hallbäcken (1992) relató que en Suecia durante el periodo que va de 1927 hasta 1984 la concentración de cationes de intercambio, principalmente Ca+2 y Mg+2 en suelos de bosque fue considerablemente reducida. Esta disminución fue aproximadamente dos veces tanto como había sido esperado por la captación de árboles de bosque. Los resultados de diferencias forman la entrada antropogénica de ácidos, principalmente el ácido sulfúrico. El desgaste de carbonato es muy dependiente de la producción de CO2 en el suelo. La calcita (CaCO3) es un mineral relativamente insoluble, la solubilidad estando sólo en el orden de 10 a 15 mg Ca/L (aproximadamente 0,3 mol/m3). En presencia de CO2, sin embargo, Ca (HCO3)2 es formado el cual es mucho más soluble en agua (Donner and Lynn 1989).

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CaCO3 + CO2 + H2O

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Ca(HCO3)2

Ca+2 + 2 HCO3-

Los suelos calcáreos tienen una alta concentración de HCO3- en la solución del suelo lo cual puede inducir la clorosis de Fe. En tale suelos la formación de Ca(HCO3)2 es también un proceso importante fabricando Ca+2 soluble y de ahí propenso a la lixiviación. También en suelos que no contienen CaCO3, el Ca y HCO3- pueden ser lixiviados donde el HCO3- puede también ser producido de la disociación de ácido carbónico contenido en el agua de la lluvia o por la reacción del H2O y CO2 principalmente producida por respiración. CO2 + H2O

H+ + HCO3+

La reacción es dependiente de pH sobre la presión parcial de CO2 el cual puede ser mucho más alto en el suelo que en la atmósfera. Ambos, el pH alto y la alta presión parcial de CO2 favorecen la formación de HCO3- + H+. Los iones de hidrógeno así producidos pueden intercambiar Ca+2 de suelos coloides. Estas reacciones en cierta medida pueden explicar por qué los usos de material orgánico al suelo pueden promover la lixiviación de Ca durante la descomposición de materia orgánica provocan un incremento en CO2 liberado y de ahí también en la formación de H+ + HCO3- en el suelo. TIPOS DE PLANTAS De acuerdo con el tipo de metabolismo de calcio, se puede hacer una distinción en cuanto a dos fisiotipos de calcio. Las especies calciófilas acumulan calcio soluble en agua unido con ácidos orgánicos en el citoplasma como malato o citrato; la savia celular por tanto contiene más Ca+2 que K+. Muchas Brasicáceas, Fabáceas, Geraniáceas, Ericáceas, Euforbiáceas y en la medida de lo que se conoce todas las crasuláceas son calciófilas. Otra opción que utilizan estas plantas para superar los efectos negativos de las altas concentraciones de Ca+2 habituales en suelos básicos es acumularlo en el xilema. En especies calciofóbicas las altas concentraciones de calcio son evitadas por su precipitación en forma de oxalato de calcio y/o por unión con pectinas de la pared celular (figura 3.22). Cactáceas, Poligonáceas, Quenopodiáceas, Lamiáceas y muchas Cariofiláceas son tipo oxalato. La producción de ácido oxálico es estimulada por la absorción de Ca. Así, miembros de esas familias pueden crecer sólo en suelos con cal cuando su metabolismo ácido les proporciona suficiente oxalato. Todavía otro mecanismo para la regulación de Ca es recreado; esto es realizado activamente por la vía de los hidatodos en algunas especies de Saxifragáceas y Plumbagináceas. En muchos casos, hay una estrecha conexión entre esos tipos metabólicos y la distribución de las especies (figura 3.23), aunque no es una correlación general. Entre familias y géneros de calciófilas hay especies que son tanto calcícolas como calcífugas. Esto es una buena ilustración del hecho de que fenómenos ecológicos son raramente el resultado de respuestas fisiológicas aisladas y ello subraya la necesidad de considerar todas las muchas y variadas relaciones entre las plantas y su medioambiente. No es poco probable que diferencias genéticas en la capacidad para absorber bioelementos esenciales, tales como el hierro, juegan un papel más importante en determinar la distribución de las especies y ecotipos en suelos calcáreos básicos que en el

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metabolismo de calcio. Hongos micorrizas están disponibles para suministrar arbustos calcífugos enanos suficientemente con P y Fe, en orden para permitirles crecer en suelos calcáreos (plantas simbiocalcícolas).

Figura 3.7 Izquierda: Contenidos de potasio, calcio y magnesio en las hojas de Silene vulgaris y Anthyllis vulneraria de zonas calcáreas. La especie calciofóbica Silene vulagaris fija el Ca tomado para producir oxalato insoluble en agua (tipo oxalato); este tipo de plantas contienen grandes cantidades de K. Por el contrario, la especie calciotrófica Anthillis vulnerari tolera un alto nivel de Ca soluble, con un nivel bajo correspondiente de K. (After Kinzel 1969; Horak y Kinzel 1971). La distinción entre estos dos fisiotipos se debe a Iljin (1940) Derecha: Respuestas del crecimiento de una especie calcífuga acidófila, Juncus squarrosus, una especie calcífuga, Nardus stricta, y una especie calcícola, Origanum vulgare, a los nutrientes cultivadas conteniendo diferentes cantidades de Ca. Bajo condiciones hidropónicas la respuestas de estas especies son muchas veces las mismas que bajo las condiciones ecológicas en su hábitat natural

3.5-SOLUBILIZACIÓN DEL HIERRO ¿CÓMO ADQUIEREN LAS PLANTAS EL HIERRO DEL SUELO? Aunque el Fe es abundante en el suelo, alrededor de aproximadamente el 5% de la corteza terrestre, su disponibilidad en suelos bien aireados es baja. En sistemas aeróbicos, la solubilidad del Fe inorgánico depende de los óxidos de Fe presentes en el suelo.

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De ahí, como la solución pH es reducida desde pH 8 a pH 4, el Fe+3 en solución aumenta de bajas concentraciones a aproximadamente 10-9 M (1 nM). El potencial redox del suelo tiene una gran influencia en la solubilidad del Fe, porque reducido, el ión ferroso (Fe+2) es considerablemente más soluble que el Fe+3(férrico). Sin embargo, para suelos típicos el pH va de 6 a 8, las especies Fe+3 dominan porque el Fe+2 es oxidado facilmente. Por lo tanto, en muchos suelos bien aireados, la solubilidad mínima del total de Fe inorgánico es fijada de 0,01 a 1nM. La concentración actual de Fe soluble que ha sido permitida en la solución del suelo es usualmente alta, en el rango de 10 a 1000 nM, debido a la quelación del Fe del suelo por ligandos solubles orgánicos. Esos componentes orgánicos resultan de la degradación de materia orgánica o de la síntesis microbiana de sideróforos, componentes Fe-quelados realizados por bacterias y hongos del suelo. El ión férrico quelado es la forma dominante de Fe disponible para la absorción por la planta; la concentración de Fe quelado requerido por el crecimiento óptimo de la planta es de alrededor de 0,1 a 10 µM una concentración una de un orden de magnitud mayor que lo encontrado en solución de suelo. Las plantas han desarrollado respuestas complejas para aumentar la biodisponibilidad de Fe en el suelo y para mantener el flujo de Fe en la raíz sustancial a bajas concentraciones de Fe en el suelo. Los procesos que utilizan las plantas para adquirir Fe de suelos con reservas relativamente no disponibles han sido el objetivo de mucha investigación en la nutrición del Fe a lo largo de los últimos veinte años. Las plantas pueden usar dos estrategias distintas para solubilizar y absorber Fe del suelo. Algunas plantas reducen quelatos férricos a la superficie externa de la membrana plasmática de la célula de la raíz y absorben los iones ferrosos producidos, considerando que otras excretan fitosideróforos, componentes orgánicos específicos de baja masa molecular con alta afinidad por Fe+3, el cual solubiliza iones férricos y hacen que ellos estén disponibles para la absorción. El mecanismo basado en los fitosideróforos es estricto para la familia de las Gramíneas (Poáceas), el mecanismo de reducción del Fe es usado por las dicotiledóneas y por las monocotiledóneas que no pertenezcan a la familia de las Gramíneas. ESTRATEGIAS PARA ADQUIRIR EL HIERRO Son muchos los datos cinéticos y bioquímicos que permiten explicar la adquisición de microelementos por las raíces. En dicho proceso intervienen muchos transportadores de baja y alta afinidad, la mayoría de ellos desconocidos a nivel molecular. A excepción del B, que se absorbe mayoritariamente de forma pasiva, en la absorción del resto de los micronutrientes están involucradas proteínas transportadoras de cationes o aniones, en general poco selectivas. Excepto para el cloro, los mecanismos de absorción de micronutrientes no han sido totalmente identificados. Mención aparte merece el caso del Fe, puesto que las plantas desarrollan dos estrategias distintas para su adquisición en condiciones de deficiencia en dicho oligoelemento: (I) la inducción de una reductasa férrica y (II) la inducción de la excreción de fitosideróforos. La estrategia I es característica de las dicotiledóneas y las monocotiledóneas no gramíneas. Cuando estas especies crecen en suelos con bajas concentraciones de Fe, aumentan en la parte subapical de las raíces tanto el poder de reducción del Fe como la

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actividad ATPasa, que tiende a disminuir el pH del medio y, consecuentemente, acidifica la rizosfera incrementando la solubilidad del Fe III. El pH apoplástico radicular desempeña un papel clave en la toma del Fe; en ese espacio se realiza la reducción de Fe III a Fe II por medio de una Fe III- quelato reductasa (FCR) presente en la membrana plasmática; esta forma Fe II es bastante más soluble que la forma Fe III. Por último, existe un transportador de membrana que introduce el Fe II en el interior de la célula. Estos tres sistemas (H+- ATPasa, FCR y el transportador de membrana) se inducen en condiciones de deficiencia de Fe en el medio. Por otro lado, las especies de estrategia I acumulan o excretan, o ambas cosas a la vez, compuesto fenólicos y flavinas, y acumulan ácidos orgánicos, principalmente malato y citrato. Aunque la causa de esta acumulación no está clara, se ha relacionado con la alta actividad de fosfoenol-piruvato carboxilasa detectada en algunas zonas de las raíces deficientes en Fe, que conduciría a un aumento de la fijación de carbono en dichas raíces. Plantas características que desarrollan esta estrategia son, por ejemplo, el guisante, el tomate y la soja. La estrategia II, desarrollada por las gramíneas(maíz, avena, cebada), se caracteriza por liberar, en condiciones de deficiencia de Fe, fitosideróforos(FS), que son aminoácidos no proteinogénicos que quelan el Fe III presente en el suelo. Su naturaleza química depende de la especie, y el mecanismo de excreción no está todavía claro, si bien se ha sugerido un mecanismo de vesículas. Se ha demostrado que existe proporcionalidad entre la cantidad de fitosideróforos liberados y el grado de clorosis férrica en la planta. Posteriormente, estos complejos, Fe III- fitosideróforos, son absorbidos sin reducción previa a través de un sistema de transporte de alta afinidad. Una vez que el complejo llega al citosol, se libera el Fe III y el fitosideróforo se degrada o se excreta nuevamente al excretor. Se ha comprobado que la velocidad de absorción de estos complejos también está en relación directa con el grado de deficiencia de Fe.

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Figura 3.8 LAS PLANTAS USAN UNA ESTRATEGIA DE REDUCCIÓN QUÍMICA O QUELACIÓN PARA ADQUIRIR EL HIERRO Durante los años 70 y 80, las investigaciones fisiológicas en la captación y nutrición del Fe llevada a cabo por Gramíneas, tales como el trigo, no pueden obtener eficazmente Fe de las soluciones nutrientes conteniendo Fe que es complejo para quemadores férricos fuertes, considerando que las dicotiledóneas pueden crecer bien usando el complejo Fe (III) como su fuente exclusiva Fe. Cuando los quemadores fuertes de Fe fueron aplicados en exceso molar para el Fe en medio hidropónico, las dicotiledóneas pueden obtener Fe fácilmente pero las Gramíneas llegan a ser deficientes en Fe. También las dicotiledóneas deficientes en Fe pueden separar el Fe de quelados de Fe(III), absorbiendo el Fe mientras dejan los quelados sintéticos en solución. El mecanismo de absorción de Fe por raíces de haba deficientes en Fe fue encontrado para implicar una reducción obligatoria de Fe+3quelado, el cual libera el ión Fe+2 del quelado y consecuentemente absorbe Fe+2 de la raíz. La hipótesis fue respaldada por la observación de que la aplicación de quemadores de Fe+2, batofenatrolinadisulfonato (BPDS), a la solución de nutrientes en exceso de Fe (III) unido a dietilendiamina(EDDHA), resultó en un 99% de inhibición de captación de Fe(medido como translocación de Fe59 a los brotes). Presumiblemente, en la reducción de férrico a ión ferroso en la superficie de la raíz, BPDS actuó como una trampa ferrosa, uniendo el ión a la superficie de la raíz y ahí por la prevención de su absorción. Posteriormente la búsqueda en el papel de la reducción de Fe en la absorción del Fe ha indicado que las dicotiledóneas y las monocotiledóneas no gramíneas responden a la deficiencia de Fe por inducción de varias y diferentes respuestas fisiológicas y bioquímicas. Esas alteraciones aparecen para formar parte de una respuesta integrada, que incrementa la habilidad de la planta para solubilizar y absorber Fe del medio ambiente. Esas respuestas a la deficiencia de Fe incluyen lo siguiente:

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Inducción en las células de la epidermis de la raíz de la férrico reductasa de la membrana plasmática, la cual reduce Fe(III) extracelular quelado y conduce a la acumulación de iones Fe+2 a la superficie externa de la membrana plasmática. Inducción del transportador de Fe+2 de la membrana plasmática de las células de la raíz que facilita la captación de Fe en la célula. Mejora del eflujo de H+ en la raíz en un lugar que aparece para participar en la inducción de la ATP-asa de H+ de la membrana plasmática de la raíz (esta respuesta ayuda a acidificar la rizosfera, aumentando la solubilización de Fe). Acumulación de citrato y malato en las raíces y consecuentemente la exudación de ácidos orgánicos, esos queladores efectivos de Fe (III) siendo pensados para incrementar la concentración de Fe(III) soluble en la rizosfera.

La importante respuesta de las dicotiledóneas a la deficiencia de Fe es representada en la figura 3.9. En este modelo, la absorción de Fe de la rizosfera es un proceso que ocurre en dos etapas. La primera etapa participa en la inducción por la deficiencia de Fe de la férrico reductasa, la cual reduce el Fe (III) quelado extracelular liberando iones Fe+2 libres. La segunda etapa es el transporte de Fe+2 al citoplasma por un transportador específico Fe+2 o un sistema de transporte de catión divalente menos específico. Además, la inducción de la ATPasa de H+ de la membrana plasmática incrementa la disponibilidad de Fe por acidificación de la rizosfera. La levadura ha sido usada como organismo modelo para estudiar el mecanismo reductivo de adquisición de Fe, porque la regulación molecular de la captación de Fe ha sido bien caracterizada. Dos genes codifican la reductasa férrica de la membrana plasmática, FRE1 y FRE2, que han sido clonados en levaduras y han sido mostrados para ser regulados transcripcionalmente por la deficiencia de Fe. Los transportadores con alta y baja afinidad por el Fe+2 también han sido clonados de levaduras. El transportador de lata afinidad (Km=150 nM) es codificado por el gen FTR1. La función adecuada de este transportador requiere otro gen, FET 3, una oxidasa que contiene varios iones de Cu. Por lo tanto, el Cu es requerido para la absorción normal de Fe por levaduras; además, la respuesta inducida por la deficiencia de Fe también es inducida por la deficiencia de Cu. Un transportador de Fe+2 de baja afinidad codificado por el gen FET4, es mucho menos específico para el Fe (Km=40 μM). La expresión de la reductasa férrica y los transportadores de lata /baja afinidad por el Fe+2 es inducida por la deficiencia de Fe. Entre los varios genes que están implicados en la regulación transcripcional de los genes transportadores de Fe de levaduras y han sido caracterizados están AFT1, el cual codifica un factor transcripcional que activa la transcripción de FRE1, FRE2, FET3 y FTR1, y el factor transcripcional MAC1, el cual regula la transcripción del gen de la reductasa férrica, FRE1.

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Figura 3.9 La levadura ha sido usada como organismo modelo para estudiar el mecanismo reductivo de adquisición de Fe, porque la regulación molecular de la captación de Fe ha sido bien caracterizada. Dos genes codifican la reductasa férrica de la membrana plasmática, FRE1 y FRE2, que han sido clonados en levaduras y han sido mostrados para ser regulados transcripcionalmente por la deficiencia de Fe. Los transportadores con alta y baja afinidad por el Fe+2 también han sido clonados de levaduras. El transportador de lata afinidad (Km=150 nM) es codificado por el gen FTR1. La función adecuada de este transportador requiere otro gen, FET 3, una oxidasa que contiene varios iones de Cu. Por lo tanto, el Cu es requerido para la absorción normal de Fe por levaduras; además, la respuesta inducida por la deficiencia de Fe también es inducida por la deficiencia de Cu. Un transportador de Fe+2 de baja afinidad codificado por el gen FET4, es mucho menos específico para el Fe (Km=40 μM). La expresión de la reductasa férrica y los transportadores de lata /baja afinidad por el Fe+2 es inducida por la deficiencia de Fe. Entre los varios genes que están implicados en la regulación transcripcional de los genes transportadores de Fe de levaduras y han sido caracterizados están AFT1, el cual codifica un factor transcripcional que activa la transcripción de FRE1, FRE2, FET3 y FTR1, y el factor transcripcional MAC1, el cual regula la transcripción del gen de la reductasa férrica, FRE1. Muchas de las investigaciones en la regulación de la absorción de Fe por las raíces de dicotiledóneas han sido fisiológicas en la naturaleza. Una regulación espacial interesante de la reductasa férrica a lo largo de la raíz diferencia además especies de plantas. En el tomate y Arabidopsis, por ejemplo, la deficiencia de Fe inducida por la actividad de la reductasa férrica es localizada en una corta zona detrás del ápice de la raíz. Sin embargo, para leguminosas tales como los guisantes, la reductasa es inducida a lo largo de la superficie de la raíz excepto para la Terminal de 1 a 2 cm (Figura 3.10). La deficiencia de Cu o Fe induce la reductasa férrica, pero otras deficiencias minerales no lo hacen. La deficiencia de Fe induce no sólo reducción de Fe (III) sino además la reducción de Cu (II) con la misma localización espacial patrón (Fig 3.10). La relevancia fisiológica de la reducción del Cu (II) no ha sido establecida. FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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Figura 3.10 LA CLONACIÓN DE GENES DE LA ADQUISICIÓN DE HIERRO EN PLANTAS HA PROPORCIONADO INFORMACIÓN SOBRE LAS BASES MOLECULARES DE LA NUTRICIÓN DE HIERRO, ASÍ COMO LAS POSIBLES VÍAS PARA LA ADQUISICIÓN DE LA PLANTA DE METALES PESADOS. Los mejores avances en el campo de la nutrición mineral de la planta han venido de clonar genes que codifican la llave de los componentes de la raíz en la adquisición de Fe en dicotiledóneas, la reductasa férrica y el transportador ferroso. El gen (FRO2) de la reductasa férrica de la raíz de Arabidopsis fue clonado recientemente por la ventaja de la similaridad de esta secuencia con los genes que codifican la FAD y los sitios de unión de NADPH de la reductasa férrica de levaduras y la NADPH oxidasa del fagocito humano. El análisis de la secuencia indica que FRO2 (Figura 3.11) es un miembro de la superfamilia de flavocitocromos que transportan electrones a través de las membranas, y el análisis funcional sugiere que es la reductasa férrica de la raíz. La transformación de mutantes de Arabidopsis con FRO2 restaura la actividad de la reductasa férrica de la raíz en mutantes defectuosos en reductasa. También, FRO2 es transcripcionalmente activado por la deficiencia de Fe en las plantas de semillero de Arabidopsis.

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Figura 3.11 Un segundo avance en el campo de la captación del Fe incluye la clonación de transportadores de Fe+2 de la raíz putativa de Arabisopsis. La clonación de transportadores de alta y baja afinidad por el Fe+2 en S.cerevisiae permitió la generación de levaduras mutantes en transportación de Fe defectivas en la captación de Fe+2. La complementación del doble mutante fet3fet4 transportador de Fe+2 en levaduras con la expresión de una biblioteca de ADNc en levaduras de Arabidopsis permitió el aislamiento de IRT1 mejoró la acumulación de Fe por el doble mutante fet3fet4 (figura 3.12) y restauró su disponibilidad para crecer en bajo Fe. El gel de RNA blot del análisis de la expresión de IRT1 en Arabidopsis mostraba que éste sólo es expresado en raíces y que expuesto a las deficiencias de Fe aumentaba mucho las concentraciones de RNAm de IRT1 en raíces. Posteriormente IRT1 ha sido mostrado para tener amplios sustratos específicos y para transportar otros iones además del Fe. El aislamiento de IRT1 dirigió al descubrimiento de una nueva familia de transportadores de micronutrientes (tabla 3.5).

Figura 3.12

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Tabla 3.5 Secuencia similares entre IRT1 y marcos de lectura previamente identificados abiertos con funciones desconocidas en levaduras fueron usados para clonar dos miembros de esta familia en levaduras, ZRT1 y ZRT2. Esos genes no codifican transportadores de Fe pero en vez de ello codifican transportadores de alta/baja afinidad por el Zn+2, respectivamente. La identificación de ZRT1 y ZRT2 facilitó que posteriormente se clonaran transportadores de Zn+2 de Arabidopsis. Todas las proteínas relacionadas con ZRT/IRT codificadas por la familia del gen ZIP codificaron transportadores de micronutrientes que presentaron 8 regiones que abarcan la membrana, y una región entre el tercer y cuarto dominio transmembrana que contiene un motivo rico en His que puede actuar como un sitio de unión a metal en el transporte de micronutrientes (figura 3.13).

Figura 3.13 Las concentraciones cinéticas dependientes de la acumulación de Fe por levaduras expresando IRT1 sugieren que este gen no codifica para un transportador de lata afinidad por el Fe. Es más, la afluencia saturable de Fe+2 mediada por IRT1 aparece para reflejar una afinidad relativamente baja de los transportadores por el Fe+2 (Km= 6

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μM, considerablemente más alto que de 10 a 1000 nM tipicamente presente en la solución del suelo). En comparación ,la Km de los transportadores de lata afinidad por el Fe en levaduras es 150 nM. IRT1 aparece para que el transporte de Fe+2 sea bastante más específico que el de Cu+2, Mn+2, Zn+2 y Ni+2. Sin embargo, la presencia de Cd inhibe la captación de la solución en un exceso de 10 veces, inhibe la afluencia de Fe+2, el cual sugiere que este transportador tal vez puede facilitar la captación de Cd en suelos contaminados. Las propiedades del transporte de iones metales de IRT1 homólogos aislados del guisante, designado RIT1 (del transportador de Fe de la raíz), han sido también caracterizados. En guisantes, la deficiencia de Fe induce no sólo la captación de Fe+2 de la raíz sino también la captación saturable de Zn+2 y Cd+2, con una Km de aproximadamente 5 μM. Parecido a IRT1, RIT es expresado en raíces y su expresión es sobrerregulada por la imposición de la deficiencia de Fe. Sin embargo, cuando se expresó en levaduras, RIT1 cataliza el transporte de Fe+2 de alta afinidad (Km= 54 nM; figura 3.14). Este transportador también media la afluencia saturable de Zn+2 de baja afinidad (Km= 4 μM; figura 3.14) y la afluencia de Cd+2. RIT1 aparece para la función primaria en la adquisición de Fe, pero también puede proporcionar el transporte en rutas metabólicas de Zn y Cd, particularmente en suelos contaminados.

Figuras 3.14

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LAS GRAMÍNEAS FACILITAN LA CAPTACIÓN DE HIERRO POR LA LIBERACIÓN DE FITOSIDERÓFOROS DE UNIÓN A HIERRO Muchas gramíneas han sido reconocidas para diferenciarlas de otras plantas por su incapacidad para utilizar Fe suministrado como quelado estables de Fe (III) tal como EDDHA. Por esto, y la ausencia de respuestas inducidas en la diferencia de Fe normalmente observadas en dicotiledóneas (aumenta la expresión de H+ y la actividad reductasa), las gramíneas han sido caracterizadas como “Fe-ineficinetes”. Sin embargo, cuando las gramíneas y dicotiledóneas crecen en suelos calcáreos conteniendo bajas cantidades de Fe disponible, las gramíneas son a menudo más efectivas que las dicotiledóneas en la resistencia de la clorosis por la deficiencia de Fe. Esta observación condujo a la hipótesis de que las gramíneas adquieren el Fe del suelo por mecanismos diferentes que el que usan las dicotiledóneas. El lavado de raíces de arroz contiene un componente que puede solubilizar el ión Fe; además, en respuesta a la deficiencia de Fe, la avena y las raíces de arroz exhiben una liberación estimulada de compuestos quelantes de Fe+3. Esta respuesta de las gramíneas a la deficiencia de Fe es específica para ellas; las raíces de dicotiledóneas no liberan compuestos quelados de Fe ante la deficiencia de éste. Posteriormente el trabajo ha identificado que los compuestos quelados de Fe como aminoácidos no proteicos, y dos de los compuestos quelados, mugineico y ácido avénico, han sido caracterizados (figura 3.15). Las rutas metabólicas para su biosíntesis no están todavía claramente definidas, pero ellos son conocidos para ser sintetizados de metionina por medio de nicotinamina.

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Figura 3.15 Debido a que el ácido mugineico y avénico son efectivos quemadores férricos, ellos han sido nombrados fitosideróforos, después del sistema de captación de Fe bien caracterizado en microorganismos que utilizan la liberación de compuestos quelados de Fe específicos llamados sideróforos. E.coli contiene un complejo del operón Fe de 3 genes que codifican el sideróforo, un gen codificando para el receptor de membrana, y una secuencia reguladora cerca que consiste en un represor, promotor y regiones operadoras. En respuesta a la deficiencia de Fe, el sideróforo liberado, el cual es específico para Fe+3, une ión férrico fuera de la célula. El complejo sideróforo Fe (III) se une al receptor específico del exterior de la membrana, y a continuación el complejo es transportado al interior de la célula. Cuando el requerimiento de Fe para la bacteria es FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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encontrado, el exceso de Fe se une a una proteína represora, y el complejo de proteínas de Fe se une a la región operadora del operón y apaga el sistema. Mucho menos es conocido en relación con el mecanismo de captación de Fefitosideróforos en gramíneas. El estudio de la captación de Fe en raíces de cebada deficientes en Fe usando el doble etiquetado 59Fe(III)-[14C]fitosideróforos, y el estudio del transporte en la investigación de la captación de Fe en arroz de los complejos Fe(III) con las formas de fitosideróforos D y L-enantioméricos, indica la presencia de un transportador de Fe en la membrana plasmática de la célula de la raíz en gramíneas que reconoce específicamente a los complejos Fe(III)- fitosideróforos y transporta el complejo entero a través de la membrana plasmática(Figura 3.16).

Figura 3.16 Ambas, la síntesis de fitosideróforos y la actividad del sistema de transporte del Fe (III)-fitosideróforo son estimulados por la deficiencia de Fe. En muchas especies de gramíneas esas respuestas parecen estar localizadas en una zona detrás del ápice de la raíz. Investigaciones en aspectos moleculares de este sistema de transporte en plantas están en las etapas tempranas y han centrado así de lejos en las rutas metabólicas biosintéticas para la producción de fitosideróforos. La nicotianamina sintasa, purificada de raíces de cebada deficientes en Fe, cataliza la primera etapa en la síntesis de fitosideróforos, la conversión de 3 moléculas de 5-adenosilmetionina a nicotianamina.

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La enzima existe como un homodímero con una subunidad de masa molecular de 30 KDa. La actividad de la nicotianamina sintasa, la cual es estimulada por la deficiencia de Fe, es 100 veces mayor en raíces que en hojas. Varios grupos de investigación han puesto en marcha esfuerzos para identificar los genes codificadores de esta enzima. Un substractivo enfoque de hibridación ha sido usado para clonar 2 genes específicos de cebada deficiente en Fe, IDS2 e IDS3, que son expresados en raíces de cebada en respuesta a la deficiencia de Fe. Los péptidos previstos codificados por esos genes comparten similaridades con dioxigenasas α-cetoglutarato, enzimas que participan en reacciones de hidroxilación similares a las requeridas para la síntesis de fitosideróforos seguros (por ejemplo la conversión de ácido deoximugineico a ácido mugineico), lo cual sugiere que bIDS2 e IDS3 tal vez codifiquen enzimas importantes en las rutas metabólicas de biosíntesis de fitosideróforos. Más lejos, avances relacionados con nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes y la regulación de las estrategias de adquisición de Fe en gramíneas dependen de la obtención de más información bioquímica y molecular sobre cada etapa en la síntesis de fitosideróforos, liberación de fitosideróforos y absorción del compejo Fe (III). AVANCES RECIENTES EN ELUCIDAR LOS ASPECTOS MOLECULARES DE LA ADQUISICIÓN DE HIERRO HAN AUMENTADO NEUSTRA COMPRESNCIÓN SOBRE LA CAPTACIÓN DE ZINC POR LA PLANTA Hasta recientemente, los mecanismos básicos de captación del Zn del suelo y el transporte de éste dentro de la planta no fueron estudiados activamente por los científicos especializados en plantas. Un reciente avance en la investigación en esta área ha sido estimulado por un aumento en la apreciación de la importancia del Zn para la biología. Por ejemplo, la investigación en la regulación transcripcional ha mostrado que el Zn juega un papel en la llave de los motivos estructurales en las proteínas transcripcionales reguladoras, incluyendo los dedos de Zn, los grupos de Zn, y el dominio de anillo de dedo. Esos motivos son encontrados en un largo número de diferentes proteínas, por ejemplo, el 2% de los productos de genes de levaduras identificados durante la secuenciación del genoma de levaduras contiene dominios de unión a Zn. La conciencia de la importancia de la nutrición del Zn para la agricultura está también aumentando (Figura 3.17).

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Figura 3.17 La deficiencia de Zinc en suelos ha sido reconocida recientemente como un importante problema en todo el mundo. Un estudio global llevado a cabo por la Organización de Comida y Agricultura, una agencia de las Naciones Unidas, encontró que el 30% de los suelos cultivados en el mundo son deficientes en Zn. Un trabajo anterior de la absorción por las raíces se centró en la adquisición fisiológica de Zn. Cuando se usaron para la captación soluciones conteniendo éstas de 0 a 10 μM de Zn+2, se caracterizó un sistema de captación de Zn+2 con una Km en un rango micromolar bajo. Este sistema es selectivo para el Zn+2 por enzima de otros cationes divalentes, pero las investigaciones fisiológicas indican que llo también pueda transportar Cd+2 y Cu+2. La afinidad del transportador de Zn+2 de la raíz por su sustrato putativo no coincide con las concentraciones de Zn+2 fisiológicamente relevantes encontradas en la solución del suelo, las cuales son generalmente de 1 nM a 1 μM, como mínimo 2 órdenes de magnitud más abajo que la Km determinada por el transportador de experimentos de flujo radiotracer en solución de cultura. Limitaciones técnicas han obstaculizado experimentos de captación con Zn+2 en el rango nanomolar, pero recientes técnicas que usan quelados sintéticos para amortigüar la actividad del Zn+2 libre en el rango nanomolar pueden hacer lo posible para determinar si la concentración cinética dependiente para la captación de Zn+2 indica la existencia de una alta afinidad transportadora de Zn+2 en raíces de plantas. Otra complicación en el estudio de la captación de Zn del suelo tiene que ver con el sustrato actual para el transportador de Zn. Mucho Zn de la solución del suelo puede ser quelado por varios ligandos orgánicos de baja masa molecular, pero nos preguntamos si los complejos de Zn para ligandos orgánicos pueden ser transportados en las células de la raíz. Esto es particularmente importante para gramíneas, como los fitosideróforos liberados por raíces de especies de gramíneas no sólo pueden unir Fe+3 sino también efectivamente pueden quelar Zn+2 (tan bien como Cu+2, Mn+2, Ni+2 y Co+2). Debido a que los fitosideróforos quelan a otros metales, algunas investigaciones sostienen que ellos deberían llamarse fitometalóforos. La información adquirida de la clonación de IRT1 codificado para el transportador de Arabidopsis facilitó la clonación de 2 transportadores de Zn+2 de

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S.cerevisiae. ZRT1 codifica un transportador de Fe de alta afinidad (Km= 0,5 a 1 µM) y es transcripcionalmente sobrerregulado por bajas concentraciones celulaes de Zn. ZRT2 codifica un transportador de baja afinidad (Km= 10 µM) que también puede ser regulado por el estado de Zn celular, aunque no está claro si esta regulación es transcripcional o postranscripcional. La clonación de esos transportadores de Zn permitió la creación de un mutante de levadura defectivo en la captación de Zn+2. zrt1zrt2 requiere altas concentraciones de Zn para un incremento normal. La complementación de este mutante con la expresión de la biblioteca de DNAc en la levadura Arabidopsis ha dirigido la clonación de los primeros genes codificadores de transportadores de Zn+2 en plantas. Designado ZIP1 por ZIP3, esos son miembros de la familia ZIP de genes que codifican micronutrientes transportadores (ver tabla 23.3). Secuencias similares entre los clones se ZIP fueron usadas para identificar un cuarto gen que transporta Zn+2, ZIP4, de una base de datos EST de Arabidopsis. ZIP1 y ZIP3 son expresados en raíces en respuesta a la deficiencia de Zn, sugiriendo que ellos están involucrados en la absorción de Zn del suelo. El UNAM de ZIP2 no fue detectado en Arabidopsis, mientras que ZIP4 fue expresado en raíces y brotes de plantas. El flujo de radiotracer (65Zn) estudiado con la expresión de ZIP1/2/3 en levaduras indicó que esos genes codifican sistemas de captación de Zn+2 con unos valores de Km entre 2 y 14 µM. La afinidad de esos transportadores por el Zn+2 es similar para determinados estudios de radiotracer con raíces y aparece para ser considerablemente más bajos que la típica actividad del Zn+2 presente en la solución del suelo. Estudios de la competencia con otros cationes divalentes sugieren indirectamente que esos transportadores tal vez medien la captación de Cd y Cu. Sin embargo, los mutantes zrt1zrt2 de levaduras, no pueden estar complementados con ZIP4, liderando la especulación de que ZIP4 codifica para un transportador de Zn intracelular que no está localizado en la membrana plasmática. Muchas de las recientes investigaciones del transporte de Zn en plantas han surgido del interés en el uso de las plantas para reparar suelos contaminados con metales pesados. El interés en biorremediación ha sido desencadenado por la evaluación de especies de plantas con hiperacumulación de metales pesados, las cuales son endémicas de suelos que son naturalmente metálicos. Esas plantas hiperacumuladoras también han sido encontradas en minas despojadas y otros suelos contaminados con metales pesados. Una de las hiperacumulaciones más conocidas es la de Thlaspi caerulescens, miembro de las Brasicáceas.

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4. SUELOS OLIGOTRÓFICOS 4.1 GENERALIDADES En hábitats oligotróficos hay generalmente deficiencia de nutrientes que determina el crecimiento de las plantas y el espectro de formas de crecimiento de la vegetación dominante. Especialmente seria es la carencia de elementos organogénicos disponibles en el suelo, principalmente nitrógeno y fósforo. Causas de estas deficiencias podrían estar relacionadas con la carencia sustancial de sustancias minerales (por ejemplo: arena de cuarzo), a la degradación y lixiviación de suelos, pero principalmente a una extremadamente lenta e incompleta descomposición de restos orgánicos. En suelos pobres, a menudo también ácidos y arenosos, se desarrolla formaciones de brezal y arbustos esclerófilos (garrigue, chaparral, fynbos, campos cerrados). Los suelos fríos de la tundra ártica y de alta montaña son pobres en nitrógeno y fósforo a cuenta del bajo rango de mineralización de restos, la acidez de las capas de materia prima de humus, y frecuentes acontecimientos de desaparición de la capa forestal por el agua (Fig. 4.1). Las concentraciones minerales en suelos de turba y pantanos son extremadamente bajas debido al alto contenido de sustancias húmicas, un pH muy bajo y el estancamiento de aguas subterráneas . En este tipo de lugares , la importancia de sustancias por procesos de vía aérea y las precipitaciones (ombrotrophy ; Tabla 4.1) juegan un papel crítico.

Figura. 4.1 El balance de nitrógeno de un lodazal estancado ombrotrophic en el norte de Suecia. La vegetación consiste en plantas vasculares (en este caso dominada por Rubís chamaemorus), líquenes y musgos. La entrada de nitrógeno desde la atmósfera es de NO-3 Y NH +4 desde la lluvia (0,1 g N m-2 a -1 ); NH3 ( 0,5 g N m-2 a -1); depósito seco

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(NDD ,0,2 g N m-2 a -1); y fijación de N por microorganismos diazotróficos (0,2 g N m-2 a -1). Adiciones de cantidades de restos de 1,6 g N m-2 a -1. Las balsas en la fitomasa restante se expresan en N m-2 a -1 y se muestran en recuadros. (Alter Rosswall et al.1975).

Tabla 4.1. Inclusión de elementos minerales (g m-2 a -1) por precipitación. (After Golley et al.1975; Kallio and Veum 1975; Likens et al. 1977). 4.2 TIPOS DE PLANTAS QUE COLONIZAN ESTE ECOSISTEMA La mayoría de plantas que viven hábitats pobres en minerales pertenecen a un tipo especial de organización y forma de crecimiento: por ejemplo, plantas parásitas; los líquenes de regiones frías (algunos ficobiontes fijadores de N2), y epífitas; musgos en la tundra y pantanos; gramíneas, principalmente montones de hierba y juncos; hierbas dicotiledóneas perennes enanas, especialmente plantas en roseta; arbustos enanos y matojos; a menudo con hojas pequeñas siempre verdes; plantas esclerófilas con alto índice esclerofilo de las hojas ( %fibra pura/ % proteína pura; Loveless 1961). Como tipo quimiotaxonómico, Ericaceas y familias relacionadas parecen estar adaptadas a suelos deficientes en nitrógeno; su actividad reductora de nitrato es extremadamente baja. Muchas de estas plantas tiene hojas duras como el cuero, ricas en lignina; además, su metabolismo celular tiende fuertemente hacia la acumulación de lípidos y la extracción de sustancias minerales (especialmente de fosfatos) está mejorada por simbiontes específicos de la raiz (micorrizas ericoides y arbutoides). En hábitats extremadamente pobres en sustancias minerales, aparecen formas de plantas altamente especializadas, como epífitas vasculares y plantas carnívoras, que aparecen de igual modo como epifíticas o terrestres en pantanos. 4.3 DEFICIENCIA GENERAL DE NUTRIENTES OLIGOTROFÍA Cuando las plantas son cultivadas en medios pobres, aumenta la asignación de recursos a raíces, con lo que disminuye la relación partes aéreas/partes subterráneas, las raíces tienden a aumentar su capacidad de absorción. Si la escasez de nutrientes es crónica en el medio, la absorción está limitada por la difusión de los nutrientes del suelo hacia las raíces y no por la capacidad de absorción, de modo que las platas que viven normalmente en tales medios, aunque tienen una elevada asignación relativa a raíces,

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han sido seleccionadas para tener una baja capacidad de absorción, ahorrando inversión en proteínas. En tales casos, la concentración de nutrientes en los tejidos disminuye. Si el suelo es pobre en N, tiene ventaja las plantas de hojas de vida larga, que mantienen producciones bajas pero no tienen que renovar demasiado las hojas (Figura 4.2) La capacidad para absorber un nutriente determinado no es independiente de la disponibilidad de otros, de modo que, si se aumenta la disponibilidad de N, la planta absorbe más P, y viceversa. Las plantas que asimilan nitratos, cuando sólo disponen de amonio presentan deficiencias en cationes como Ca y Mg. Por otra parte, la asignación de los nutrientes varía en función de su disponibilidad: cuando la disponibilidad de nutrientes es baja, la planta tiende a mantener mayores concentraciones en la zona apical que en vástagos o ramas laterales, y el número de hojas, o su tamaño, se adapta a las circunstancias. Se reduce también el esfuerzo reproductor, que en las especies de medios pobres, tiende a concentrarse en algunos años (llamados años de vecería o bellotera en la carrasca), después de un periodo especialmente propicio. En los ambientes pobres, es frecuente que los nutrientes estén disponibles de un modo más discontinuo, en flujos esporádicos, durante las cuales las plantas de lento crecimiento pueden hacer incluso un consumo de lujo, acumulando reservas, mientras que esta acumulación intensiva no se da en las plantas de crecimiento rápido, lo que es comprensible pues podrían alcanzar niveles tóxicos en los tejidos. De todos modos, parece claro que las especies de medios pobres presentan una fisiología frugal, ajustada a esta baja disponibilidad en los más diversos aspectos, y que, generalmente, reaccionan menos cuando la disponibilidad aumenta (Chapin III, 1980).

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Figura 4.2 esquema comparativo de las “estrategias” de dos plantas, una de crecimiento rápido (quenopodio) y otra de crecimiento lento (enebro).

OBTENCIÓN DE NUTRIENTES POR LAS PLANTAS La obtención de nutrientes depende de las características químicas de cada uno y su estado en el medio, así como de características de las plantas y de los procesos de descomposición. La importancia de unos u otros tipos de procesos depende de cada caso. El P es bastante peculiar (Figura 4.3 A), se trata de un elemento relativamente escaso. IMPORTANCIA DEL P La fuente principal de este elemento es la meteorización de minerales primarios, sobre todo apatito, y se encuentra como ortofosfato (PO4-3 ) como único estado oxidativo estable, que es poco soluble, de modo que los intercambios a través de soluciones son limitados. A lo largo del tiempo geológico, el P tiende a disminuir por lixiviación y erosión. Las plantas producen fosfatasas extracelular en respuesta a la falta de P. Se ha pensado durante bastante tiempo que la disponibilidad de P es independiente de la descomposición de la materia orgánica, y que la mineralización se produce a medida que la demanda de P provoca la producción de fosfatasas, pero hay crecientes evidencias de que los factores ambientales, y en especial el tipo de suelo, son determinantes en esta disponibilidad. A escalas de tiempo más largas, el control último corresponde a la meteorización y lixiviación (Gressel y McColl, 1997). Por tanto, para el fósforo los procesos esenciales tienen que ver con la química del suelo y no con la actividad biológica. IMPORTANCIA DEL N En cambio el N (Figura 4.3 B), durante la descomposición de la materia orgánica se libera en una serie de formas (de mayor a menor grado de oxidación: nitratos, nitritos, nitrógeno molecular, amoníaco), cada una de las cuales tiene sus propias

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particularidades. Algunas especies captan principalmente los nitratos, otras las sustancias amoniacales (por ejemplo, en las landas y turberas ácidas, donde no hay muchas bacterias nitrificantes, plantas como las ericáceas son incapaces de absorber nitratos), muchas las dos formas. Incluso parece que pueden producirse cambios en fases distintas de la vida de la planta en cuanto a la capacidad relativa de absorber una forma u otra. Además, en estos compartimentos influyen de modo importante las simbiosis micorrízicas. No sólo las formas inorgánicas pueden ser absorbidas por las micorrizas y pasar a las plantas, también pueden serlo algunas moléculas orgánicas nitrogenadas (por ejemplo aminoácidos). La proporción entre las formas de N depende de las tasas de nitrificación, es decir, de paso de amonio a nitratos por oxidación, tasas que son mínimas en las zonas de tundra frías y encharcadas y bajas, en general, en suelos muy ácidos. Aunque el nitrato exige más inversión de energía por parte de a planta para reducirlo a radicales NH2 e incorporarlo a la materia orgánica, tiene ventajas sobre el amonio por su mayor movilidad en el suelo, ya que el amonio difunde con mayor dificultad, además de ser tóxico a ciertas concentraciones. El 15N es mucho menos abundante que el 14N. La referencia estándar es el N2 del aire, cuya razón isotópica 15N: 14N es Restándar = 0,0036765, es decir que, para esta razón isotópica, se toma N =0. Una muestra tomada en la naturaleza puede ser empobrecida o enriquezida en δ15N, en relación con éste estándar, y la mayoría de valores quedan comprendidos en un rango de más o menos el 30 por mil del estándar. Las plantas asimilan discriminando negativamente el 15N, lo que, con las precauciones necesarias, puede permitir el uso del δ15N como indicador de ciertos procesos.

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Figura 4.3 Las plantas vasculares que viven en simbiosis con microorganismos que fijan N atmosférico (pasándolo a amonio) gozan de una ventaja importante en los medios pobres en este elemento, que les permite ser las primeras en colonizarlo. En estas plantas, la proporción de las isótopos 14N y 15N es parecida a la que se da en la atmósfera, mientras que las plantas no fijadoras muestran proporciones variables en función de la mineralización de N en el suelo (y de la vecindad de fijadores). Las plantas carnívoras, habitantes de medios extremadamente pobres en N, lo consiguen en forma de aminoácidos a partir del cuerpo de los insectos y otros pequeños animales. Aunque hay relativamente pocas especies de plantas carnívoras es sorprendente la variedad de formas que la evolución ha ingeniado para este propósito. Todas estas variaciones tienen sus costes en carbono, ya sea para dar sustrato a los simbiontes, ya para alimentar a los hongos micorrízicos ( que pueden consumir entre el 5% y el 10% de los recursos de carbono de la planta), ya sea para construir estructuras específicas y sustancias pegajosas para la captura de animales. El transporte y la absorción de N contra gradiente hasta el citoplasma, como ocurre con todos los nutrientes, tiene también su coste energético, que se ha estimado entre el 5% y el 20% de la respiración total de la planta. Si lo que obtiene la planta es N inorgánico (nitratos o amonio), los costes energéticos de su paso a formas orgánicas (asimilación) son bastante mayores (por ejemplo, la asimilación de amonio en las raíces puede suponer 2-5% del carbono fotosintético) que si se obtienen ya aminoácidos, y el coste alcanza un máximo

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en el proceso de fijación de N atmosférico, que requiere de 7 a 10 ATP por átomo fijado y del 25 al 40 % del carbono fotosintético. Cuando se consideran todos los costes en el balance del carbono se desde la obtención al transporte y la asimilación del N, se encuentran valores del 25-40% para el amonio, 20-50% para el nitrato, 40-55% para la fijación de N y 25-50% para las micorrizas. Ello da idea de la importancia del N en la economía global de la planta (Chapin et al., 1994). En este contexto, es comprensible que las fijadoras sean frecuentes entre las primeras colonizadoras en la sucesión, pues en los primeros estadíos de ésta hay pocos nitratos y amonio en el medio y, en cambio, no existen problemas para disponer de luz y fijar carbono, es decir que las plantas puedan usar la energía con generosidad. Y también se entiende que, en fases posteriores, con más nutrientes y más competencia, tan elevados costes les pasen factura y resulten eliminadas. Comparando muy diversos tipos de comunidades, se han encontrado relaciones claras entre la concentración de N, o la de P, en los tejidos y la RGR de las plantas, como muestra la figura 4.5.

Figura 4.5 Relaciones de la concentración de N (a) y la de P (b) con la tasa relativa de crecimiento RGR en comunidades de bosque, matorral y pasto de diversa procedencia. Según datos de Cebrián (1996) procedentes de fuentes diversas. La absorción de los nutrientes aumenta a medida que aumenta la concentración en el medio, lo que significa que la absorción está regulada por las necesidades de la planta, por su demanda. En la absorción de nutrientes muchas veces juega un papel decisivo las micorrizas. Como las hifas de éstas tienen un diámetro del orden de 10 veces inferior al de las raíces más finas, se construye 100 veces más longitud de hifas que de raíces para igual inversión, y es posible explorar mejor el suelo en busca de nutrientes inmóviles. La ventaja de las micorrizas es tanto mayor cuanto más gruesas son las raíces, de modo que las plantas de raíces más gruesas es más probable que presenten micorrizas que las de raíces más finas (Fitter, en Crawley, 1997). USO DE LOS NUTRIENTES Casi todo el N (75%) se invierte en cloroplastos y más concretamente en la fotosíntesis. El componente con N más importante en la limitación de la fotosíntesis parece ser el enzima RUBISCO (ribulosa-2,5-bifosfato carboxilasa-oxigenasa), aunque este papel limitante es variable, y no es el RUBISCO el único compuesto con N que

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puede ser limitante. Dada las relaciones entre N, RUBISCO y fotosíntesis, no resulta extraño que la concentración de N pueda relacionarse con la producción. Cuando hay poca cantidad de agua y baja la conductancia estomática, no es útil invertir en N, de modo que las plantas de zonas áridas suelen presentar concentraciones bastante bajas. Las plantas C4 pueden funcionar con concentraciones no muy altas de N, las C3 necesitan concentraciones no muy altas de N, las C3 necesitan concentraciones mayores para alcanzar las máximas producciones. La capacidad fotosintética en principio aumenta linealmente con el aumento de concentraciones del N, mientras no haya otros factores limitantes. En las hojas pobres en N, que invierten mucho N en ácidos nucleicos y proteínas asociados a la regulación y respiración de la célula, esta capacidad es baja. Sin embargo, es baja también en hojas que están por encima de un valor crítico de contenido en N, seguramente porque entonces aumenta excesivamente la respiración. Hay que tener en cuenta que, como las hojas pobres en N suelen vivir más tiempo, la asimilación total de carbono a lo largo de su vida puede ser mayor o igual que la de las hojas ricas, y que éstas tienen elevadas perdidas por mayores tasas respiratorias. Si hay poca luz, las hojas tienden a ser pobres en N, son más delgadas, reduciendo así sus costes de construcción y mantenimiento. Por eso se encuentran gradientes verticales de variación en la concentración de N en los doseles: una distribución apropiada de concentraciones en el perfil vertical del dosel maximiza la fotosíntesis para una determinada disponibilidad total de N. En la figura 4.6 puede observarse que la disponibilidad de N no afecta solamente a la tasa de renovación de las hojas, sino también a la de las raíces finas.

Figura 4.6. Relación aproximada entre la tasa de renovación de raíces finas y la disponibilidad de nitrógeno. Redibujado a partir de Aber et al. (1985). Durante la estación de crecimiento, crece la relación masa/superficie de la hoja y estos nutrientes básicos se diluyen, mientras aumentan los que tienen papeles estructurales como el Ca, Mg y Fe. Durante la senescencia, vuelve a disminuir la relación masa/superficie. Entonces, una parte más o menos grande, pero que puede llegar a superar, en algunos casos, el 70% de N y P contenido en la hoja, es reabsorbido y retranslocado a otros tejidos, para evitar su pérdida en el desfronde. A lo largo de la FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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vida de la hoja, se producen además pérdidas de nutrientes por lixiviación, siendo las mayores las de K, que es el más móvil con diferencia, seguido de P y N. Dado el uso intenso del N por los organismos, no es extraño que sea eficazmente retenido en muchos ecosistemas. Durante las primeras fases de descomposición de la hojarasca, en vez de liberarse N al medio, la concentración de N en la hojarasca suele aumentar, ya que el N es retenido por los microbios. CAUSAS CULTIVOS Tradicionalmente, el hombre ha empleado abonos para enriquecer el suelo y aumentar la producción de cultivos. Además, como el caso del C, las emisiones antropógenas determinan el enriquecimiento del medio en algunos nutrientes. La fertilización por N, intencionada o no, casi siempre produce incrementos en el crecimiento y, como consecuencia, disminuye la concentración disponible de otros elementos. Si esta disminución es excesiva, el P sobre todo puede actuar como factor limitante para el efecto fertilizador del N. LIXIVIACIÓN, RETRANSLOCACIÓN Y DESFRONDE Las plantas pierden nutrientes por diversos procesos, especialmente por lixiviación y desfronde (desprendimiento de partes de biomasa que se incorporan al suelo). L a lixiviación es mayor en el caso de los elementos más móviles, pero depende en gran medida de la forma de la hoja y de su cutícula. Las hojas esclerófilas son menos susceptibles a la lixiviación y más frecuente sobre suelos pobres, pero no parecen muy eficientes en la retranslocación, es decir, la recuperación de nutrientes en las hojas senescentes, antes del desfronde. La movilidad de los nutrientes dentro de la planta es variable, siendo mucho mayor para el N, P o K que para el Ca, que suele estar asociado a materiales estructurales. Dado que, en la comunidad vegetal, los materiales que se pierden por lixiviación o desfronde en gran parte no salen del sistema, sino que van al suelo, donde son procesados hasta quedar nuevamente disponibles para su utilización por las plantas, lo mismo podemos considerarlos como pérdidas de la vegetación que como aportes al suelo. DESCOMPOSICIÓN La descomposición es un proceso crucial, tanto en el ciclo global del carbono (devuelve a la atmósfera el contenido en los materiales vegetales muertos o exudados por las raíces) como en los cíclos de nutrientes (que libera y vuelve a poner en disposición de generar nueva producción). La tasa de descomposición, que es regulada por la temperatura, la humedad, la composición del material a descomponer y los nutrientes del suelo, factores todos ellos que afectan a la actividad de los detritívoros y descomponedores, es determinante para la producción de los ecosistemas y, como en el caso del desfronde, existe una relación lineal significativa (Figura 4.7) entre tasa de descomposición y RGR para un conjunto variado de comunidades vegetales (Cebrián, 1996).

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Figura 4.7 Relación entre la tasa de descomposición y la tasa de crecimiento relativo (RGD) para distintos tipos de comunidades. La regresión es altamente significativa. Según Cebrián, modificada. Un ejemplo de cómo la descomposición puede frenar la producción lo tenemos en ambientes fríos e inundados (anóxicos), donde la materia orgánica se descompone con gran lentitud (es el caso de las turberas). En estas condiciones, la producción es muy baja ya que la mayor parte de nutrientes están retenidos en la materia orgánica muerta. Los cambios ambientales explican las fuertes variaciones que se encuentran en las tasas de descomposición entre diferentes estaciones del año, entre el día y la noche (en que hay más humedad), o entre antes y después de lluvias. Sin embargo, todavía son más abundantes los cambios en la descomposición asociados a las distintas características del material. Las hojas de tipo perennifolio, gruesas y de vida larga y pobres en N, se descomponen más lentamente que las de caracteres opuestos, lo que limita la producción en los ecosistemas con hojas del primer tipo, al quedar gran parte del N retenido más tiempo en la materia orgánica muerta. La presencia de fenoles, ligninas y taninos (hojas otoñales pardas, ácido esfáglico en las turberas de esfagnos), poco digerible, o de otras sustancias de carácter defensivo, hace más lenta le descomposición, sobre todo porque el N forma complejos orgánicos con los taninos, en lugar estar en forma de nitratos, amonio o aminoácidos, y se hace menos asimilable,. Sin embargo, algunas ectomicorrizas y micorrizas ericoides hacen todavía posible su uso por las plantas que las poseen (como coníferas y ericáceas respectivamente). En zonas pobres en N, los pinos aumentan la producción de taninos y la abundancia de plantas ericoides se explicaría por su mayor facilidad para asimilar complejos orgánicos nitrogenados. Si estos lugares pobres y ácidos reciben reciben aportes suplementarios de N (por ejemplo, por contaminación o por plagas que atacan a los arbustos), pueden ser invadidos por gramíneas, cuyo mantillo se descompone más deprisa. Estos fenómenos se han visto en especies como Molinia caerulea o Deschampsia flexuosa. Pero los mantillos más pobres no siempre dan ventaja a planta ectomicorrizas o micorrizas ericoides: las proteáceas, a menudo dominantes en ambientes con una larga estación seca en muchos paises del hemisferio sur, como las zonas mediterráneas de Sudáfrica, Australia y Chile, crecen en medios pobres en los que además el fosfato está en forma insoluble, y sin embargo carecen de micorrizas, lo que nos muestra que es difícil generalizar.

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En general lo que mas influye en las tasas de descomposición, es la proporción relativa entre lignina o carbono y nutrientes (N Y p). A más lignina o mayor proporción de C, menos opatabilidad para los fitófagos y detritívoros y menos actividad descomponedora. Ello supone que, en los tipos de vegetación en que hay más asignación a partes leñosas y menos a hojas, la descomposición será también más lenta. Las raíces, a través de exudados, también afectan a las tasas de descomposición, aunque al parecer no siempre en el mismo sentido, y la información disponible es muy escasa. El papel de los microbios suele asociarse a la liberación de nutrientes, al descomponer el material procedente del desfronde. Si el material a descomponer es pobre, a actividad microbiana puede producir una inmovilización de los nutrientes, compitiendo con las plantas, algo que al parecer se da cuando la relación C/ N del mantillo es superior a 20. Normalmente, la propia actividad bacteriana tiende a bajar esta relación, y tras un primer periodo de inmovilización viene otro de mineralización neta. Pero todo depende del valor de la relación y de las proporciones relativas de N y P, ya que a veces es el primero y a veces el segundo los que actúan como limitantes de la descomposición y, por tanto, de la reproducción.

4.4 ESTRATEGIAS NUTRICIONAL

PARA

AUMENTAR

LA

EFICIENCIA

Las plantas que están permanentemente confinadas a hábitats deprimidos en nutrientes emplean estrategias de eficiencia (Ernst 1983) para conseguir la necesitada actividad metabólica requerida para mantener su habilidad competitiva a pesar del recorte de nutrientes. Esto puede hacerse mediante el aumento de la eficiencia con la que son tomadas las sustancias minerales (eficiencia de absorción; por ejemplo, incrementando el crecimiento de la raíz o la formación de células de transferencia) o mejorando la disponibilidad de nutrientes en los limites inmediatos de las raíces (eficiencia de movilización, por ejemplo, excreción de ácidos y excreción de sustancias por las raíces). En suelos con una deficiencia general de sustancias minerales, y en suelos ácidos, la utilización especialmente eficiente de nutrientes puede conseguirse por su redistribución entre las plantas por la producción de nuevos órganos (eficiencia de retranslocación); este asegura su conservación por largos periodos. Por ejemplo, durante la formación de semillas en especies anuales, los macronutrientes, especialmente fósforo, son transferidos en cantidades desproporcionadamente grandes a los órganos reproductores a expensas de los órganos vegetales. En las especies perennes, los bioelementos son almacenados temporalmente en los órganos supervivientes y desde aquí pueden ser retranslocados, asegurando la planta su requerimiento básico para la supervivencia en un hábitat pobre en nutrientes minerales. En las regiones frías, las especies perennes están en ventaja comparadas con las anuales. La longevidad de las hojas siempre verdes tiene un efecto similar; sólo parte del follaje tiene que ser reemplazado cada año, y la alta pérdida de sustancias minerales ocasionada por la caída de hojas se evita. Una “forma de crecimiento enana” genotípica, morfogenética o reguladora hormonal facilita el mantenimiento de concentraciones adecuadas de sustancias minerales en los tejidos, y permite una mejor utilización de los reservorios disponibles de nitrógeno y fósforo para producción de materia seca. De esta forma, las plantas herbáceas sobre frío y por tanto suelos de montañas pobres en nitrógeno consiguen altas concentraciones de nitrógeno que las especies comparadas de

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latitudes más bajas (Figura 3.8). En hábitats donde las sustancias minerales están en pequeñas reservas, como en alta montaña, la tundra o brezal, las especies más excitosas son aquellas con estrategia de conservación de nutrientes. Bajo condiciones medioambientales abióticas restrictivas, la estrategia más excitosa es evitar altas producciones, y permitir un ajuste armonioso de todos los procesos metabólicos por una limitación controlada genéticamente al crecimiento.

Figura 4.8. Frecuencia de distribución del contenido de nitrógeno en las hojas de especies de plantas herbáceas de tierras bajas (350 msnm) y de altas alturas (1150 msnm) en el norte de Suecia. Las plantas que crecen bajo condiciones climáticas menos favorables en las altas alturas tienen hojas más pequeñas, aunque tienen un contenido de nitrógeno estadísticamente más alto (basado en la superficie de la hoja y en materia seca) (After Körner, 1989). 4.5 ADAPTACIONES A SUELOS OLIGOTRÓFICOS La simbiosis es la asociación de de dos o más especies que se organizan estructural y fisiológicamente para llevar una vida en común. En suelos oligotróficos, como hemos visto se dan muchas relaciones de este tipo, destacan : el parasitismo, la asociación es destructiva o desventajosa para el organismo de algunos de los miembros; y el mutualismo, en la que la asociación es ventajosa, o a menudo necesaria para uno o ambos y no es dañina para ninguno de los dos. PLANTAS PARÁSITAS La mayoría de plantas que conocemos son seres fotoautótrofos, esto es, extraen materia inorgánica (agua y sales minerales) del suelo y la transforman en materia orgánica que utilizan para su crecimiento y desarrollo, por mediación del CO2 atmosférico y la luz del sol. Este proceso, denominado fotosíntesis, se realiza gracias a los pigmentos presentes en unos orgánulos llamados cloroplastos; y son estos pigmentos (más concretamente las clorofilas) los que dan el característico color verde a los vegetales. Pero existen plantas que no responden a este patrón y se han adaptado a vivir de una forma no tan común. Son las plantas parásitas, entre las que podemos distinguir hemiparásitas y holoparásitas:

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Las primeras poseen clorofila y realizan la fotosíntesis, pero en lugar de captar el agua y las sales minerales del suelo sustraen estas sustancias de otra planta. Este es el caso del muérdago (Viscum album) (Figura 4.9) cuyos ejemplares viven preferentemente sobre las ramas de encinas, olivos, pinos, manzanos y robles. Es una planta muy tóxica cuyo nombre se le da muchas veces y de forma errónea al acebo, que es realmente la que se usa como adorno navideño.

Figura 4.9. Muérdago parasitando a Pinus sylvestris Las holoparásitas, sin embargo, no poseen clorofila ni capacidad para realizar la fotosíntesis, por lo que extraen directamente la materia orgánica ya formada (savia elaborada) de otras plantas. Al no realizar fotosíntesis no necesitan hojas (que serían algo así como los órganos "captadores de luz") ni por tanto tallos que funcionen como soporte para las mismas. Conociendo estos datos no sorprende observar que como

órganos vegetativos sólo posean unas raíces modificadas (haustorios) que penetran en el tejido del hospedador. Figura 4.10. Rafflesia arnoldi El más típico ejemplo de planta holoparásita es la Rafflesia arnoldi (Figura 4.10), que habita en algunas junglas tropicales. En esos ambientes sus hospedadores son abundantes, por lo que no le supone un problema obtener el sustento necesario para

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crear una de las mayores flores conocidas, que puede pesar unos 7 kg y medir más de un metro de diámetro. Las plantas del género Cuscuta (Figura 4.11) viven unos 10 días a costa de las sustancias nutritivas de su semilla, y si no logran encontrar un hospedador al que parasitar en ese tiempo, mueren. Al germinar crecen describiendo ángulos, para "barrer" un área mayor y aumentar las posibilidades de contactar con la planta hospedadora adecuada. Lo más sorprendente es que parece que pueden "oler" a su víctima y dirigir su crecimiento hacia ella. Una vez localizado el objetivo, se van enroscando alrededor del

tallo hospedador y les introducen los haustorios con los que se alimentarán a partir de ese momento. Figura 4.11 Cuscuta californica enroscada en una planta hospedadora. Se observa cómo los haustorios penetran en el tallo En el género Orobanche (Figura 4.12), las semillas no germinan a no ser que las raíces de la planta atacada se encuentren próximas. Estas semillas se activan gracias a sustancias estimuladoras presentes en los exudados radicales del hospedador, que no tienen efecto a más de un centímetro de distancia. Pasan prácticamente todo su ciclo vital bajo tierra, buscando raíces de nuevos hospedadores, y únicamente emergen a la superficie durante la época de floración. Algunas especies de este género causan graves

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daños a los cultivos del hombre, por lo que éste último intenta erradicarlas allá donde surgen. Figura 4.12 Orobanche ramosa parasitando a Oxalis pes-caprae Son sin duda ejemplos curiosos de cómo la evolución moldea sorprendentes adaptaciones a un tipo de vida algo inusual MICORRIZAS: HONGOS SIMBIONTES DE PLANTAS VASCULARES La asociación de hongos con una amplia variedad de plantas vasculares recibe el nombre de micorrizas.. Atendiendo a su distribución, penetración y morfología, aparecen tres tipos principales: ectomicorrizas, micorrizas vesículo-arbusculares y ectendomicorrizas. Las ectomicorrizas están formada por más de de 5000 especies de Basidiomycetes y algunos Ascomicetes. Forman una vaina externa, de 20-40 m de espesor, que rodea la raiz, emitiendo hifas hacia el exterior, hacia el suelo, y hacia el interior, creciendo entre las células corticales sin alcanzar la médula. No existen penetraciones celulares, aunque anulan el crecimiento de los pelos radiculares e induce deformaciones del órgano mediante la secreción de auxinas y citoquininas (Ahmadjian y Parecer, 1986). Las micorrizas vesículo-arbusculares, son Zygomycetes, producen penetraciones celulares de dos tipos: haustorios ramificados dicotómicamente (arbúsculos) que degeneran a los pocos días, siendo sustituidos por otros nuevos, y vesiculas de acumulación. Los haustorios arbusculares no penetran la membrana de la célula huésped, estando completamente recubiertos por ella. Las ectendomicorrizas penetran con sus hifas las células corticales enrollándolas en su interior antes de ser digeridas. Otros tipos de micorrizas, como las formadas con ericales, han sido menos estudiadas. (Figura 4.13)

Figura 4.13 Esquema de los tres tipos principales de micorrizas. MICORRIZA DE ERICÁCEAS Las formas de asociación de mycorrhizas de ericáceas entre hongos y plantas del orden Ericale. Las hifas del hongo penetran en las células corticales de la raíz de la planta hospedadora pero no se forman vesículos arbusculares. Esto distingue a este grupo de la ectomycorrhizae, ya que este último no forma rollos dentro de las células corticales de la raíz. Este grupo se subdivide en tres formas principales de ésta asociación, ericoide, arbutoide y monotropoide. MICORRIZA ERICOIDE Las especies de las familias Ericaceae y Monotropaceae se asocian siempre con mycorrhiza y se consideran mycotrofos obligados. Estas especies pueden crecer sin una asociación de micorriza, pero en suelos fértiles el crecimiento se reduce seriamente. Se FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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cree que las raíces de algunas especies como brezos (Calluna), arándanos (Vaccinium) y azaleas (Rhododendron) producen una secreción que reacciona con los nutrientes del suelo y causa la concentración de toxinas. Los hongos desintoxican el entorno del suelo y permite a las plantas crecer. De esta manera, las micorriza ericoide pueden crecer de manera efectiva en suelos pobres o ricos en nutrientes con un compañero micorriza. Los hongos involucrados en esta asociación son ascomicetos del género Hymenoscyphus. El hongo compañero en una mcorriza ericoide también segrega toxinas que reduce el crecimiento de otros hongos micorriza. De esta forma, algunas especies de árboles que dependen de asociaciones de micorriza para el crecimiento a menudo tienen serias dificultades para establecerse en brezales. Sólo algunas especies de Amanita y Boletus no se ven afectadas, lo que empuja a los abedules a ser los árboles colonizadores más corrientes en este tipo de hábitats. En las asociaciones de micorriza ericoide, los hongos forman un estuche alrededor de la raíz de un modo similar a la ectomycorrhizae, pero en esta ocación la ascociación es mucho más perjudicial. Las hifas del hongo infectan de manera extensiva las células epidérmicas y de la corteza. Las hifas penetran en las células de la raíz y forman rollos, que degeneran como resultado de la actividad del hospedador y tienen mayor tiempo de vida que estructuras similares en otras asociaciones de micorriza. Sin embargo, durante el proceso de degeneración las células de las plantas también mueren. No se forma la red de Harting en esta asociación. MYCORRHIZA ARBUTOIDE Durante esta infección, un estuche de hifas se forma alrededor de la raíz y está presente una red de Harting intercelular alrededor de la capa más externa de las células corticales. La morfología del sistema de raíces es similar al descrito para ectomycorrhizae. Las formas de asociación entre un hongo basodiomicete y una especie de Arbustus, Arctostaphylos y Pyrolaceae (por ejemplo, Pyrola asarifolia). Los hongos involucrados en la asociación de micorriza son basidiomicetes y también pueden formar asociaciones de ectomicorriza con especies de árboles cercanos. Las hifas penetran en las células de la raíz y forman rollos, estos rollos degeneran como resultado de la acción del hospedador, pero las células del hospedador no mueren. MICORRIZA MONOTROPOIDE En esta asociación de micorriza el hongo infecta especies de la familia Monotropaceae (un pariente cercano de Ericaceae) como Hypopitys uniflora, antes Monotropa y Pterospora andromedea. En esta infección se forma un estuche alrededor de la raíz y una red de Harting, de forma similar a la ectomicorriza. Sin embargo, esta asociación de micorriza se distingue de las otras por la forma de penetración de algunas hifas de las paredes de las células en la corteza de la raíz. El hongo de micorriza también forma una asociación de micorriza con las especies de árboles cercanos y de esta manera hay un flujo de carbohidratos desde el árbol a la especie Monotropaceae. Los hongos involucrados en esta relación son las especies basidiomicete. Aunque las micorrizas se desarrollan en casi todas las latitudes, son principalmente abundantes en climas tropicales. Su desarrollo es tanto mejor cuanto

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más pobre en nutrientes es el medio en el que crece el huésped. La captación de fósforo es uno de los ejemplos claros de las ventajas de esta simbiosis. Las raíces captan fosfatos a mayor velocidad de la que el anión tiene en el suelo. Esto provoca una depresión de la concentración del elemento en las cercanías de las raíces. Las hifas externas aumentan el volumen edáfico que actúa como reservorio y mantiene una velocidad adecuada de dosificación, ya que el fósforo se mueve más rápidamente a través del hongo que en el propio suelo. El suministro de 32PO43- a las hifas externas separadas del suelo y su recuperación en radicular confirman el transporte. Semejante comprobación se ha realizado suministrando 15NO3- . En este caso, un detalle adicional consiste en que la micorrizzacción incrementa la actividad glutamina sintetasa radicular, relacionada con la rápida asimilación del NH4+. El transporte de esqueletos carbonados se ha estudiado experimentalmente mediante dos técnicas distintas. Suministrando 14CO2 a las hojas del huésped, fotosintéticamente activas, se recupera radiactividad en el hongo, principalmente como trehalosa o manitol. Los mismos resultados se obtienen suministrando 14C-sacarosa desde un bloque de agar a la sección de corte de una raiz micorrizada, recuperándose en el hongo más del 70% de la radiactividad total. Esto indica que los fotoasimilados son transportados a la raíz como sacarosa, que sería captada y posteriormente modificada por el hongo (Smith y Douglas, 1987). En otras ocasiones se ha utilizado fuentes de carbono más elaboradas. La micorriza de tipo orquídeo, Thanatephorus cucumeris, es capaz de degradar celulosa, acompañándose esta degradación de un crecimiento neto de la planta hospedante, Dactylorchis purpurilla. Cuando al hongo se le suministra 14C-glucosa, la 14Ctrehalosa neo-sintetizada disminuye en paralelo a la acumulación de 14C-sacarosa en el huésped. Pero esta reversibilidad de dirección del intercambio de huésped a hongo, no solo afecta a los azúcares, sino con mayor intensidad a los aminoácidos (Figura 4.14).

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Figura 4.14 Esquema de la cooperación nutricional entre la micorriza y su simbionte. El árbol suministra sacarosa al hongo, que puede ser utilizada para su propia respiración o para convertirla en trehalosa, mientras que el hongo suministra al árbol preferentemente fosfatos del suelo. Algunas micorrizas pueden utilizar celulosa exógena para sintetizar sus propios azúcares. LOS EPIFITOS Un epifito es una planta aérea, es un vegetal que no arraiga en el suelo, sino que se fija a un árbol u otro objeto elevado en el que tenga asegurada la luz y la humedad. Los epifitos no son parásitos, sino que viven de la humedad del aire y de partículas de polvo, que absorben sobre todo por medio de hojas especializadas y, en muchas especies, también de raíces aéreas que ayudan también a sujetar la planta. Las hojas carnosas de las orquídeas epifitas son reservorios de agua y nutrientes. Las de ciertas bromelias están dispuestas de forma apropiada para acumular el agua de lluvia, o bien tienen escamas que se abren y cierran en función de la humedad o la sequedad. En regiones templadas hay numerosos musgos, líquenes, algas y hepáticas que viven como epifitos Los líquenes son organismos constituidos por la simbiosis entre un hongo llamado micobionte y un alga o cianobacteria llamada ficobionte. La asociación de estos dos organismos puede ser muy variada pudiéndose diferenciar varios tipos estructurales muy diferentes desde el más simple, donde hongo y alga se asocian de forma casual al más complejo donde micosimbionte y fotosimbionte se organizan en un talo de morfología muy diferente a los dos organismos que los constituyen y donde el alga o cianobacteria se encuentra formando una capa bajo la protección del hongo. Los líquenes son organismos excepcionalmente resistentes a las condiciones ambientales adversas y capaces, por tanto, de colonizar muy diversos ecosistemas. La protección frente a la desecación y la radiación solar que aporta el hongo y la capacidad de fotosíntesis del alga confieren al simbionte características únicas frente a otros organismos. La síntesis de compuestos únicamente presentes en estos organismos, las llamadas sustancias liquénicas permiten un mejor aprovechamiento de agua, luz y la eliminación de sustancias perjudiciales Los líquenes con algas verdes como fotobionte (ficobiontes) colonizan una amplia variedad de hábitats, comportándose como vegetales resistentes a las condiciones ambientales más extremas. Los hay saxícolas, colonizadores de rocas, a las que agraden tanto mecánica como químicamente, produciendo desagregación y neogénesis de materiales. En su mayor parte epilíticos, pueden hacerse endolíticos si las circunstancias ambientales (fuertes vientos, por ejemplo)así lo requieren. Un gran número de especies terrícolas, colonizando suelos tanto minerales como orgánicos. Otros son epifitos colonizando una amplia gama de árboles y arbustos, e incluso briófito. FISIOLOGÍA DEL EPIFITISMO Las plantas epifitas son aquellas que viven sobre troncos y ramas de otras plantas, generalmente árboles y arbustos, mientras que aquellas que se desarrollan sobre hojas reciben el nombre de epifilas. Bajo el punto de vista fisiologico, se ha aceptado

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siempre que el epifito no causa daño a su fitóforo . Sin embargo, algunas bromeliáceas tropicales se desarrollan tanto que llegan a “asfixiar” al árbol sobre el que crecen. En climas templados, musgos y líquenes son los principales epifitos. Se ha constatado que muchos de estos líquenes, generalmente fruticosos, son capaces de penetrar con sus hifas hasta el tejido vivo de la rama, invadiendo los vasos floemáticos y xilemáticos. Dado que las hifas suelen ir cubiertas de fenoles son potentes inhibidores fotosintéticos, no suelen pasar de la nervadura media y difícilmente penetran a través de la membrana cloroplástica, por lo que parece que su acción va dirigida más hacia evitar que nuevas hojas se formen que a envejecer las hojas ya formadas. BIOLOGÍA DEL EPIFITISMO Los epifitos viven en sustratos orgánicos y para su abastecimiento de minerales dependen de los depósitos de la atmósfera. Las hojas forman nichos y urnas (heterófilos, por ejemplo, en Platycerium and Dischidia), o rosetas con forma de embudo (por ejemplo, en Asplenium spp. Y Bromoliaceas) y cisternas para recoger las precipitaciones y detritos. La absorción sube en las hojas (por ejemplo, en Bromoliaceas) y facilita la entrada de iones del agua de las precipitaciones. Las diferentes formas morfológicas son adaptaciones funcionales para acumular recursos. El epifito, por definición, sólo utiliza como soporte, sin que de una manera clara obtenga de él beneficios nutricionales. Su desarrollo en las zonas más altas del tronco puede ser tomado como un sistema de prospección de luz solar. En las zonas extratropicales, los epifitos están reducidos a algas (algunas diatomeas), musgos y líquenes, mientras que las plantas de mayor porte se comportan como epifitos en zonas tropicales (Viscum, Picus, Asplenium y muchas orquídeas). Estas plantas emiten raíces columnares, que se descuelgan hasta el suelo, colaborando entonces a la nutrición mineral del epifito. En caso contrario, la nutrición del epifito queda supeditada a la intensidad y frecuencia de chubascos tropicales. Esto hace que muchos epifitos hayan desarrollado órganos especiales para el almacenamiento de agua. Por ejemplo, muchas orquídeas y algunas aráceas han diferenciado el denominado velamen radicum, una diferenciación de la protodermis radicular que yuxtapone capas pluriestratificadas sobre la exodermis. Las células componentes del velamen radicum mueren y las celdillas vacías actúan como captadoras y acumuladoras de agua, que lentamente irá penetrando a través de la exodermis. En otros casos, como Dischidia rafflesiana, la hoja soporta un crecimiento acelerado en expansión mientras reduce su crecimiento marginal. El resultado es el envolvimiento del eje longitudinal por el haz, y agua. En otros casos, como Tillandsia, género perteneciente a las bromeliáceas, la absorción de agua se realiza exclusivamente por pelos existentes en la superficie del limbo foliar, dado que, secundariamente, colonizan cables eléctricos, de los cuáles no pueden absorber líquido. ECOFISIOLOGÍA DE LA IMPLANTACIÓN DEL EPIFITO SOBRE EL SUBSTRATO La literatura botánica al uso recoge un buen número de casos en los que puede establecerse una cierta correlación entre propiedades físico-químicas de la corteza de los árboles y la población de epifitos que soportan, aunque hablar de especificidad o selectividad en la elección del huésped sea algo extraordinariamente arriesgado. Por ejemplo, se ha descrito que la textura d el a corteza puede ser un factor determinante de la colonización: es más fácil que las esponjas fúngicas queden atrapadas e inicien su

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desarrollo sobre superficies rugosas. También se ha comprobado que son diferentes las comunidades de líquenes que colonizan las superficies lisas o rugosas de un mismo tronco. Con frecuencia, se ha sugerido que la distribución de ciertos líquenes crustáceos epifloédicos viene determinada por la disponibilidad de humedad a partir de la corteza viva de los árboles, y que la absorción y acumulación de agua por estas cortezas dependen de una serie de factores químicos y estructurales. Des Abbayes (1932) determinó en este sentido que esta capacidad es mayor en robles que en pinos y que la liberación de agua desde la corteza a potenciales epifitos cumple la misma relación. En idéntico sentido se han establecido relaciones y diferencias entre Quercus vetulina Y Q. alba, o entre Pinus albicaulis y Larix lyalli; incluso para el mismo árbol, Margot (1965) pudo determinar diferencias de humedad en un gradiente descendente con la edad de los álamos y un continuum de epifitos de acuerdo con este gradiente. E l tipo de líquenes que colonizan cortezas de árboles también está en relación con la disponibilidad de electrólitos, que puede reflejarse en el contenido en cenizas de dichas cortezas. Barkman (1958) fue capaz de establecer colonias específicas de líquenes epifitos en función del porcentaje de cenizas obtenido, lo que daba pie a establecer una clasificación de huéspedes en tres tipos diferentes: a) Corteza eutrófica, cuyo porcentaje de cenizas estaba entre 8% y 12%. b) Corteza mesotrófica, cuyo porcentaje de cenizas oscilaba entre 3% y 5%. c) Corteza oligotrófica, cuyo porcentaje de cenizas se establecía entre 0,4% y 2,7%. También se ha aducido en un buen número de casos en el que el pH de la corteza actúa como cofactor de selección de la especie particular de epifito. Se pueden encontrar diferencias notables de pH entre grandes grupos de árboles. Mientras que la mayor parte de los caducifolios tienen un pH en corteza entre 4,5 y 7, las coníferas lo tienen más bajo, entre 3 y 5. Un efecto primario del pH puede ejercerse sobre la promoción de la germinación de esporas fúngicas y sobre el crecimiento de algas de vida libre, potenciales formadores de asociación simbiótica. El pH óptimo para el crecimiento de las algas suele ser cercano a la neutralidad y, por tanto, diferente al de la corteza y al óptimo de germinación de las esporas. Podría especularse acerca de un crecimiento del alga formadora de un liquen, controlado por el potencial micobionte en función de los nutrientes orgánicos disponibles. PENETRACIÓN DEL EPIFITO EN SU SUBSTRATO La penetración de los líquenes epifitos en su fitóforo y el grado en que la completan ha sido un tema fuertemente controvertido sin que, hasta hace muy pocos años, se aportaran pruebas definitivas a este respecto. L a cuestión estaba planteada entre dos extremos: o bien se trataba de una penetración activa que alcanzaba tejidos vivos, o bien como una penetración superficial, a través de heridas y lenticelas, nunca activas ni intracelulares. Er (1917) describía como hifas de Ramalia penetraban en su huésped a través de la corteza, córtex, floema y cambium cuando se aceptaba, en general, que los líquenes fruticosos quedaban confinados a las capas de la peridermis. Bonnier(1889) describía como las hifas de Trentepohlia llegaban hasta la peridermis de su soporte, perforando las paredes celulares. Lindau (1904) demostró, por su parte, que líquenes epifitos

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penetraban hasta la peridermis del fitóforo, creciendo entre sus células por simple presión mecánica sin perforar las paredes celulares .

Tabla 4.2 Relaciones tróficas entre epifitos y corteza del substrato arbóreo Los más modernos estudios de microscopía electrónica indican que la penetración de líquenes fruticosos en troncos o ramas de especies caducifolias, como Quercus pyrenaica y Fagus sylvatica, y de alguna perennifolia, como Quercus rotundifolia, alcanza los tejidos más internos, llegando hasta los elementos vasculares secundarios, tanto floema como xilema. Dentro de los vasos han sido encontradas hifas fúngicas (Figura 4.15) que, estadísticamente pueden atribuirse a la penetración del micobionte, ya que la presencia de cuerpos concéntricos no es hoy criterio suficiente para discernir entre hongo simbionte y parásito. La penetración parece ser activa, derivado del hecho de los cambios de coloración observados tras tinción de las paredes celulares. Esta penetración activa parece tener su base en la secreción de algunas glicosidasas, posiblemente constitutivas, ya que no hay ninguna prueba concluyente de su naturaleza inducible por materiales de pared. Su papel fisiológico real debe estar relacionado con la edad del talo así como su crecimiento y recambio celular. Secundariamente, se ha observado que los talos tiene una discretas actividad hidrolizante de ligninas, posiblemente debida a una moderada especificidad de sus dépsido hidrolasas. No se ha observado esta penetración en profundidad en troncos o ramas de gimnospermas, quedando reducida a un desarrollo radial en los espacios intercelulares de la peridermis. ACCIÓN DE LOS EPIFITOS SOBRE EL CRECIMIENTO DEL FITÓFORO Y LA ESTRUCTURA DE SU DOSEL Un considerable número de observaciones de campo induce a pensar que el establecimiento de epifitos sobre un fitóforo particular provoca una sensible pérdida de la vitalidad de éste. Unas densa población de líquenes implantados sobre ramas de Q. rotundifolia conduce a la falta de hojas, sin que ello pueda ser atribuido a la edad de la rama. Este efecto es particularmente dramático en arbustos jóvenes, en los que la invasión por líquenes coincide con una atrofia del individuo. En este mismo sentido, Asahina y Kurokawa describieron la inhibición del desarrollo de ejes caulares de té por líquenes epifitos. Sobre esto, Brown y Mikola (1974) observaron un descenso en la velocidad de crecimiento de Pinus sylvestris causado, probablemente, por la acción inhibidora de los líquenes terrícolas sobre la asociación con micorrizas. FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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Figura 4.15 Corte transversal del leño de Betula alba, en el que pueden observarse grupos de hifas (H) adosadas a la cara interna de las paredes de fibras (f) e incluso atravesando dicha pared (→) (tomado de Monsó et al., 1992). Respecto al dosel arbóreo, existen diversos grados de desfoliación, que guardan una cierta relación con la distribución de los epifitos. Por una parte, una mayor biomasa de la población instalada sobre una rama se corresponde, en terminos generales, con un mayor valor de la razón número de hojas en ramas control/número de hojas en rama invadida. Pero también, en ocasiones, se encuentran casos de ramificaciones dicotómicas, con poblaciones liquénicas comparables, en las que, mientras unas han quedado totalmente atrofiadas, otras han continuado su desarrollo más o menos pobremente. En general, las ramas afectadas suelen conservar las hojas del último año o las más apicales, habiendo perdido todas, o una gran parte, del resto. Un resumen de las observaciones realizadas sobre encinas incluye la drástica reducción del número de hojas, que para las ramas muestreadas llega a alcanzar proporciones de un sexto respecto a las ramas control. También el número de ramificaciones se ve afectado por la población de epifitos, siendo tanto mayor este efecto cuanto más joven sea la subramificación considerada. La relación números de ramas sin líquenes/número de ramas con líquenes es de 1,1 para ramificaciones secundarias, de 1,7 para las terciarias y de 3,0 para las cuaternarias, lo que indica el progresivo decaimiento de la rama afectada. En las ramas con abundante cobertura, se observa también una reducción de volumen respecto a las ramas libres de epifitos, quedando aquellas reducidas a la mitad o a la tercera parte del espacio ocupado por estas últimas. No es fácil abordad el estudio de las causas por las cuales la desfoliación se produce. De los estudios realizados sobre el ataque de la corteza del fitóforo y del posible ataque hidrolítico desde los espacios intercelulares. Ozenda y Clauzade (1970) especifican que estas interacciones “s’accompagnent peut-être de substances lichëniques jouant un rôle phytocide pour l’hôte” haciendo referencia específica al caso de los ácidos sequicaico y úsnico producidos por el liquen tropical Ramalia tayloriana. ULTRAESTRUCTURA Y FISIOLOGÍA DE LA DESFOLIACIÓN La desfoliación provocada por epifitos se basa en dos supuestos principales: a) Las hifas liquénicas penetran hasta los haces conductores de las ramas del fitóforo. b) Los fenoles liquénicos pueden difundir la disolución contenida en los haces vasculares y, en su seno, transportada hasta las hojas, donde ejercerían su acción fitocida. FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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La reconstrucción de estos supuestos en condiciones de laboratorio no es fácil. Una primera aproximación se realiza cortando extremos apicales de ramas de encina, por ejemplo, y sumergiendo el extremo cortado en una disolución de bicarbonato sódico, que contenga o no concentraciones variables de los fenoles supuestamente fitocidas. En estas condiciones, los cloroplastos aislados de hojas procedentes de ramas tratadas con fenoles mostraban desarrollar actividad fotoquímica ligada al PSII (fotorreducción de DCPIP) a una velocidad 10 veces menos que aquellos procedentes de ramas no tratadas. Sin embargo, tal actividad era restaurada cuando los cloroplastos deficientes eran suplementados con la concentración adecuada de MnCl2. El presumible déficit en Mn+2 cloroplástico, Causado por los fenoles, fue confirmado mediante la valoración de la concentración de este catión por espectrofotometría de absoprción atómica, por lo que parece confirmarse que los fenoles, absorbidos en la zona de corte, eran translocados alas hojas donde, quelando Mn+2 cloroplástico (figura 4.16), determinaban la depresión fotosintética (Orús et al., 1981). La llegada de los fenoles hasta las hojas, en condiciones naturales, es posible dado que muchos de estos compuestos cristalizan sobre las paredes celulares (figura 4.17), pudiendo entonces disolverse con una cierta facilidad en el agua xilemática.

Figura 4.16 Contenido en manganeso de cloroplastos aislados de hojas de Quercus rotundifolia que han estrado unidas a ramas incubadas durante cinco dias en una disolución de NaHCO3 1,0 Nm(o) o enNaHCO3 con 14 µg mL-1 una mezcla de fenoles liquénicos obtenidos del epifito Evernia prunastri ( • ) (tomado de Orús et a., 1991).

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Figura 4.17.Hifas medulares del epifito Evernia prunastri, observadas al micrioscopio electrónico de barrido, sobre cuya superficie se observan grandes acúmulos de fenoles cristalizados. ¿DESFOLIACIÓN O INHIBICIÓN DEL DESARROLLO FOLIAR? Se analizó el contenido de fenoles liquénicos del fluido xilemático de ramas de melojo. Las ramas fueron seccionadas en sus extremos basal y apical durante dos épocas de año: en marzo, cuando aún no había hojas desarrolladas, sólo yemas foliares, y en noviembre, cuando las hojas están maduras o, incluso, iniciando la senescencia. En estas condiciones, solamente los extremos apicales de ramas sin hojas mostraban contener un fenol liquénico, el ácido evérnico, y una cierta concentración de su catabolito (o precursor, según sea el caso), ácido evernínico (Figura 4.18). Cuando las ramas tenían hojas, ni em extremo basal ni el extremo apical de aquellas contenían fenoles liquénicos detectables, pero podría cuantificarse una cierta cantidad de ácido evérnico en el exudado xilemático de la nervadura media foliar. Las células del mesófilo no contenían fenoles liquénicos. Consecuentemente con estos resultados, no se encontraron diferencias significativas en las actividades ligadas al PSII, tanto en la fotorreducción de DCPIC como en la fotoproducción de oxígeno, en cloroplastos aislados de hojas de ambos tipos de ramas, con o sin población de epifitos (Ávalo et a., 1986).

Figura 4.18 Trazos cromatográficos en HPLC de la savia xilemática obtenida de los extremos apicales (A) y basales (B) de ramas, de la nervadura media (C) o de un extracto foliar (D) de Quercus pyrenaica que soporta una alta densida de talos del epifito Evernis prunastri (tomado de Ávalos et al., 1986). Sobre la base de los resultados descritos, la relación previamente establecida entre la pérdida de actividad fotosintética y desfoliación no parece posible. Al intentar establecer una relación entre presencia de epifitos y número y velocidad de desarrollo de yemas foliares, se ha demostrado que tanto las ramas primarias como secundarias que soportan epifitos forman menos yemas y, de éstas, se desarrollan menos hojas y más tardíamente que aquellas que no muestran líquenes implantados. Aquellas yemas que podrían calificarse como retrasadas contienen cantidades discretas de ácido

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evérnico, fenol que ha podido ser aislado y caracterizado a partir de dichas yemas (Legaz. Et al.,1988) INTERACCIONES NUTRICIONALES ENTRE EPIFITOS Y SU FITÓFORO La nutrición mineral de los líquenes epifitos posee hoy dia escasa información experimental. La mayor parte de los datos que se tienen tratan de correlacionar el contenido en minerales de los talos y sus correspondientes substratos. Así, Solberg y SELMER-Olsen (1978) y Solberg (1979) demostraron que la concentración de nitrógeno, fósforo, azufre, uranio y molibdeno en Alectoria fremontii es seis veces más altas que en su correspondiente substrato, los troncos de Pinus sylvestris. Aún más altas es la proporción de selenio y mercurio, 19 y 11,5 veces, respectivamente, más alta en el liquen que en su fitóforo. Sin embargo, hay más vanadio en la corteza del tronco y también mayor proporción de manganeso. Aparentemente, no existen diferencias significativas en el potasio y cobalto contenidos en talos colectados a dos alturas diferentes en el tronco del pino. No obstante, la concentración de nitrógeno, fósforo, azufre, selenio, vanadio, mercurio y uranio era mayor en líquenes que crecían en la zona inferior del tronco. Esta acumulación era debida al aporte de lixiviados por el agua de lluvia, que escurre a lo largo del tronco. Esta posibilidad había sido puesta de manifiesto mediante experimentos de simulación de lixiviado por inmersión de talos de Platismatia glauca en agua de lluvia reconstituida (Lang et al.,1976). El calcio y el magnesio eran perdidos en estas condiciones en la disolución externa, tanto más cuanto más alta era la temperatura del sistema. También el potasio salía del talo a la disolución externa, aunque esta pérdida disminuía con el tiempo. Por el contrario, el amonio era activamente extraído de la disolución. Todos estos cambios respondían siempre al tiempo de inmersión según cinéticas hiperbólicas, aunque el tiempo de saturación variaba con los diferentes cationes. Resultados concordantes han sido obtenidos para diferentes especies que crecen en bosques de Pseudotsuga menziesii, Abies balsamea, Acer saccharum o en robledales (Pike, 1978). En general, los líquenes situados en la porción más baja del dosel arbóreo pierden minerales por lixiviación más rápidamente que los líquenes que crecen en la parte superior de aquel. La simulación por inmersión, en laboratorio, de talsos de Lobaria oregana, indica que esta regla se cumple, especialmente para el potasio. Sin embargo, el agua de lluvia, lixiviando minerales de las hojas de los árboles, puede subvenir a ciertas necesidades nutricionales de los epifitos. Los datos aportados por Pike indican que los requerimientos de los líquenes en nitrógeno, calcio y magnesio pueden ser perfectamente subvenidos por la entrada desde la atmósfera en el bosque de A. balsamea, aunque, probablemente, esta entrada no sea suficiente para el fósforo y el potasio. En el bosque de Pseudotsuga, solo el calcio y el magnesio son suficientemente aportados por el agua de lluvia. De todas formas, el contenido relativo en ciertos cationes en el liquen es paralelo al contenido de los mismos en las hojas de los árboles. El calcio muestra su más alta concentración en los líquenes de dos bosques caducifolios (robledal y bosque mixto de Acer saccharum y Betula lutea),cuyos doseles son relativamente ricos en dicho catión.. La misma relación puede establecerse para el magnesio en los líquenes del robledal. Sin

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embargo, hay que notar que la absorción por rizinas debe ser insignificante, ya que estas estructuras no tiene función absorbente (Hensen y Jahns,1974). A pesar de ello, especies de Usnea y Parmelia que crecen sorbre cipreses y sobre arbustos contiene mayoritariamente los elementos principales del substrato (Bosserman y Hagner, 1981). Por ejemplo, ambos tipos de líquenes, creciendo sobre ciprés, contenían más calcio, cromo y estroncio que los que crecían sobre arbustos. Los análisis de correlación indicaban una estricta dependencia entre los líquenes y su substrato, aunque ningunote los dos géneros era afectado por su substrato más que el otro. La correlación era tan ajustada que había mayor abundancia de líquenes epifitos sobre ramas de ciprés que sobre troncos, dado que aquellos órganos, así como las acículas, tienen más altas concentraciones de calcio, potasio y fosfato que la madera y la corteza de los troncos. PLANTAS CARNIVORAS Las plantas carnívoras segregan enzimas digestivas (proteasa, peptidasas) de células glandulares pegajosas (por ejemplo Pinguicula, Drosera) o hojas modificadas (hojas con forma de cántaro: Sarracenia, Darlingtonia; hojas atrapadoras: Nepenthes, Cephalotus; trampas: Dionaea, Aldrovanda, Utricularia) y absorben aminoácidos e iones a través de las mismas glándulas. Además, los restos parcialmente digeridos de los animales atrapados son descompuestos y mineralizados por bacterias. Un precursor evolutivo de los carnívoros son los protocarnívoros. En este caso, las plantas no tienen órganos especializados para atrapar animales pero a pesar de esto, los estomas, hojas o flores tienen superficies muy pegajosas (por ejemplo, especies con superficies glandulares del género Geranium, Potentilla, Stellaria, y también hojas del género Solarium tuberosum) donde la presa es atrapada y descompuesta por proteínas liberadas y bacterias que viven la superficie pegajosa y finalmente digeridas por las plantas. La alimentación carnívora es una adaptación por la que el crecimiento de las plantas en hábitats distróficos recibe nitrógeno y fósforo suplementario. La especie Pinguicula de altas latitudes, obtiene del 20% al 60% de su nitrógeno y 30%-80% de su fósforo de la digestión de proteínas. La utilización directa de fuentes de nutrientes orgánicos no solo permite una rápida sustitución de las hojas, sino también la acumulación de importantes nutrientes organogénicos para nuevos crecimientos y producción más abundante de semillas. Como he dicho anteriormente la adaptación de algunas plantas a una alimentación carnívora (animales minúsculos, preferentemente insectos) supone solamente un suplemento de dieta, dado que todas ellas pueden completar su ciclo vital sin haber capturado ninguna presa a lo largo de dicho ciclo. Bajo el punto de vista morfológico, todas las plantas carnívoras han diseñado órganos captores, trampas que responden a la percepción de un estímulo mecánico mediante dos tipos de acciones: muchas de ellas manifiestan una primera respuesta de movimiento rápido que sirve para atrapar la pieza. Una segunda respuesta consiste en la secreción de enzimas digestivas por parte de de los sistemas glandulares, que hidrolizan macromoléculas para que la planta asimile los productos de hidrólisis. Muchas de ellas también poseen glándulas de secrección de mucílago o néctar y glándulas productoras de pigmentos, ornamentales y vistosas, como un modo de atraer y retener a la presa.

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La alimentación carnívora implica captura, muerte y digestión de animales vivos, características de la nutrición de muchos organismos quimiergónicos. Fuera del reino animal, existen hongos que forman un grupo especial de parásitos facultativos y que son capaces de capturar pequeños animales, como nematodos y rotíferos; y algas móviles, Euglena, por medio de dispositivos especiales. Las plantas carnívoras (en sentido estricto) se caracterizan por colonizar suelos pobres en nitrógeno (turberas, cenizas volcánicas, laderas de montes con fuerte erosión) aunque también las hay acuáticas, como algunas especies del género Utricularia. Las hojas de todas estas plantas no forman parénquima en empalizada pero poseen cloroplastos bien constituidos, con suficiente cantidad de clorofila como para realizar

eficientemente la fotosíntesis. (Figura 4.19) Figura 4.19 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS PLANTAS CARNÍVORAS Las plantas carnívoras realizan una fotosíntesis relativamente eficiente. Todas las estudiadas hasta ahora son plantas C3, por lo que mantienen su conjunto de hexosasP mediante el ciclo de Calvin. No se han encontrado carnívoras C4 ni adaptaciones al metabolismo CAM. Sin embargo, un suplemento orgánico puede acelerar su crecimiento. Usando Utricularia en cultivo axénico a la luz, su crecimiento se acelera mediante suministro de sacarosa, acetato o ambos combinados. Incluso se puede detectar crecimiento significativo en oscuridad sobre sacarosa. Sin embargo, la fotosíntesis sigue siendo el sistema fundamental de producción de biomasa. Chandler y Anderson (1976) han demostrado que Drosera whittakeri crece de 8,7 mg a 48,5 mg en luz de 8,5 W m-2 mientras que sólo llega a 17,9 mg bajo una intensidad de 1,5 W m-2 con un suplemento de Drosophila melanogaster. Los mismos autores demostraron que

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alimentando Drosera binata, que crecía sobre arena, con moscas, su crecimiento mejoraba con independencia de que en la disolución nutritiva usada para el riego existiese nitrógeno o no e igualmente sucedía para el fósforo. Se debe suponer que el suplemento en la dieta alimenticia proporciona suficiente nitrógeno de las proteínas de la mosca. Por ejemplo, alimentando los odres de Nepenthes durante 17,5 h con 14CAla, se encuentran diferentes compuestos radiactivos en todas las fracciones de las paredes del odre. Cabría incluso pensar que la planta prefiere el nitrógeno orgánico a los nitratos, que puede tomar desde el suelo. La captura de insectos, cuyas proteínas han sido marcadas previamente con 14C-leucina, por hojas de Dionaea indica que la práctica totalidad del marcaje se incorpora a las proteínas foliares. Parece, por tanto, que el sistema implica una digestión hidrolítica de las proteínas de la presa, cuyos aminoácidos serán posteriormente utilizados por los sistemas enzimáticos foliares. Por el contrario, las grandes reservas de inositoles-P que la planta tiene podrían explicar su insensibilidad al déficit exógeno de fósforo. Un suplemento de insectos también puede revertir total o parcialmente déficit de Mg+2 o de K+ para Utricularia gibba, pero en ningún caso debe suponerse que el insecto sea una buena fuente de microelementos. ADAPTACIONES MORFOLÓGICAS DE LAS PLANTAS CARNÍVORAS: En plantas sensu stricto, las principales diferenciaciones morfológicas logradas par realizar la captura y posterior digestión de las presas son: PELOS Y TENTÁCULOS (TRAMPAS ADHESIVAS) Las hojas de especies del género Drosera presentan emergencias pedunculadas terminadas en una cabezuela, verdaderos tricomas glandulares. El pedúnculo pluricelular está recorrido por un cordón de traqueadas que forman más arriba el corazón de la cabezuela. En ella, una capa endodérmica, en la que puede observarse la banda de Caspary, las recubre, estando a su vez envuelta por un epitelio glandular externo, separado del exterior por una cutícula perforada por varios poros. Este epitelio produce una secreción viscosa que recubre la cabezuela de gotas brillantes. Los pequeños animales, atraídos por ella, quedan pegados a la glándula y, cuando forcejean para liberarse, contactan con glándulas adyacentes, quedando cada vez más retenidos. El estímulo mecánico hace que los tentáculos se curven hacia el centro de la hoja, con lo que el limbo foliar termina por formar una concavidad que envuelve al insecto. Este movimiento envolvente es un movimiento de crecimiento. Las células de la cara opuesta a la zona de contacto del insecto crecen más rápidamente que las de la cara contactada, lo que implica que el pelo se incurve envolviendo al animal que ha producido el estímulo. Al ser un movimiento de orientación producido por un crecimiento diferencial, no puede repetirse indefinidamente, sino sólo pocas veces, como máximo tres. (Figura 4.20) Las células internas del pedúnculo tienen las características de células de transferencia. En la región de cabeza existen numerosos plasmodesmos que comunican diferentes células. La adición de leche de vaca sobre estos tricomas permite que el calcio sea detectado en las células glandulares 1 min después de la adición. El catión es absorbido por estas células y transportado por el apoplasto hasta la endodermis, a la que atraviesa vía simplasto. De acuerdo con estas observaciones, se piensa que la reabsorción de los productos de digestión puede producirse en contra del flujo de mucílago y enzimas digestivas.

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Figura 4.20. Hoja de Drosera capensis capturando una mosca En especies del género Pinguicula también se adhieren insectos a las cabezuelas glandulares viscosas de los pelos de la cara superior de la hoja. Las hojas de Pinguicula poseen dos tipos de pelos glandulares pedunculados y sesiles. Las glándulas pedunculadas tienen una célula basal grande, una célula peduncular y una columna con una cabeza de 8 a 32 células, generalmente 16 (Figura 4.21) Sobre la cabezuela , como en el caso de Drosera, son evidentes las gotas de secreción mucilaginosa, que lleva a cabo la captura de insecto. Las glándulas sesiles están formadas por una célula basal, sobre la que se dispone una columnar que sostiene una cabeza de dos a ocho células. La célula columnar recuerda a las células endodérmicas cuyas paredes están cutinizadas. Las células secretoras maduras de estas cabezas tienen grandes invaginaciones con protuberancias en la pared celular, semejantes a las que se observan en las células en las células de transferencia. En Pinguicula, están sobre todo muy desarrolladas en las paredes radiales de la cabeza de ambos tricomas, cabezas que no tienen una cutícula bien desarrollada, por lo que la secreción de mucílago se ve notoriamente facilitada. En estas protuberancias de las

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paredes radiales se acumulan fosfatasas ácida, esterasas y RNasa citoquímicamente detectables (Heslp-Harrison y Knox, 1971). Este lugar de acumulación es posiblemente el punto de tránsito hacia el exterior, también a través de la cutícula pobremente desarrollada. La secreción además de contener estas enzimas digestivas, tiene propiedades detergentes, gracias a lo cual puede empapar el exoesqueleto del insecto, resistente y refractario al agua (Heslop-Harrison, 1976). Las glándulas vecinas, estimuladas por los movimientos de la presa, participan en un llamado acúmulo de secreción. En este punto de la captura, las reacciones histoquímicas demuestran que las protuberancias de pared se van decolorando obtenidas en glándulas no estimuladas, lejos del acúmulo de secreción. Los productos de la digestión entran en la hoja aparentemente por las cabezuelas de los tricomas sesiles.

Figura 4.21 Esquema de un pelo glandular pedunculado de Pinguícula

Figura 4.22 Detalle de la hoja de D. rotundifolia y tentáculos. En especies del género Drosophyllum también existen glándulas pedunculadas que segregan mucílago, eficiente en la captura del insecto, y otras sesiles, que segregan

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enzimas digestivas. El mucílago es segregado por las células más externas de las glándulas pedunculares, secreción en la que está involucrado un buen número de dictiosomas. La superficie de las células secretoras incrementa grandemente con invaginaciones en las que se localizan protuberancias, como sucedía en Pinguicula y Drosera. La cutícula posee poros a través de los cuales sale el mucílago. La secreción de éste es dependiente de la respiración mientras que la velocidad de secreción es afectada por la temperatura. (Figura 4.22) VESÍCULAS (TRAMPAS DE SUCCIÓN) Las especies de Utricularia que habitan sumergidas en aguas tranquilas, llevan en sus hojas laciniadas algunas de sus divisiones foliares transformadas en vesiculitas verdes, cuya superficie interna corresponde al haz foliar. Las vesículas constituyen trampas de caza llenas de agua. Un opérculo, que soporta pelos sensibles o pelos “gatillo”, cierra una pequeña abertura sobre la que se inserta una antena ramificada. Cuando los diminutos animales acuáticos tocan alguno de estos resortes, el opérculo se abate hacia el interior y abre la entrada a la vesícula, con lo que las presas son arrastradas por una corriente de agua hacia dentro. La succión se produce por un relajamiento de las paredes de la vesícula, que se mantiene tensas y abolladas hacia el interior gracias a la actividad de glándulas internas, de corto pedúnculo, que extraen agua del interior y la bombean al exterior, lo que crea un déficit de potencial de agua. (Figura 4.23) El mecanismo de estas trampas también depende de estructuras glandulares. Las glándulas pedunculadas y sesiles del exterior de la trampa segregan mucílago y sacarosa para atraer a los animales. También en el exterior pueden observarse pelos en forma de botón (H2), como, por ejemplo, en Utricularia dichotoma, mientras que en el interior de la trampa está cubierto de tricomas estrellados de cuatro brazos (H1), como en U. intermedia, o tricomas bífidos (H3), como puede observarse en U. vulgaris.(Figura 4.24)

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Figura 4.23 Utricularia vulgaris capturando un copepodo

Figura 4.24 Órgano captor de Utricularia. Una antena (A) protege pelos sensibles (PS) al estímulo mecánico de tal forma que, al contraerse las paredes del utrículo, el anima el succionado a través de la boca (B) hacia el interior, tras lo cual se cierra la entrada (E). Los pelos glandulares de diferentes especies de Utricularia han sido señalados en el esquema como H1 (pelos en forma de estrella), H2 (pelos sensibles con apariencia de botón) y H3 (pelos de dos brazos alrededor de la boca) TRAMPAS BIVALVAS O CEPOS

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Extraordinariamente notable es la rapidez con la que Dionaea muscipula, Droseraceae propia de céspedes instalados sobre suelos arenosos y húmedos, cierra sus mitades foliares pectinadas, densamente cubiertas de pelos digestivos en el haz, cuando sus pelos táctiles, tres en cada mitad, experimentan algún contacto, aprisionando así el insecto (Figura 4.25). El cierre de la hoja se lleva a cabo mediante cambios de potencial eléctrico que se originan en los pelos sensoriales multicelulares, cada uno de los cuales consta de una zona basal, o podium, sobre la que se inserta un pedúnculo en forma de palanca a través de una zona de indexación, de muy alta sensibilidad. Análoga organización poseen las hojas, mucho más pequeñas, de Aldrovanda, también droserácea, que vive sumergida y carece de raíces.

Figura 4.25 Cara interior de los lóbulos de Dionaea muscipula mostrando los seis pelos gatillos. A veces ha podido simularse un episodio de captura alimentando las hojas de D. muscipula con pequeños trozos de película de color expuesta. El limbo se cierra sobre el trozo de película, se estimulan las glándulas sesiles en forma de botones pluricelulares y la gelatina del film se digiere antes de que la hoja se abra de nuevo. La digestión comienza aproximadamente 30 min después del cierre del limbo. Las paredes celulares de las glándulas digestivas en reposo muestran un buen número de protuberancias, que disminuyen de tamaño las últimas fases de la digestión. ODRES Diferenciaciones foliares que enrollan el limbo de tal manera que forme una especie de recipiente, generalmente provisto de un opérculo. En otras carnívoras predomina la forma jarra u odre en el apartado captador. Tal ocurre en Nepenthes, Cephalothus, Sarracenia y Darlingtonia. Las jarras de Nepenthes suelen estar cubiertas por una especie de tapadera inmóvil. Procede del limbo de una hoja, la base de la cual se ensancha en forma de lámina (Figura 4.26). El peciolo que une las dos partes puede reaccionar a los estímulos de contacto como un zarcillo y así fija su pesada jarra al ramaje. Hay que considerar que alguno de estos odres puede contener hasta 1 l de líquido en su interior. Este líquido consiste en agua en la que está disuelta la secreción de las glándulas de las paredes del interior del odre, que

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corresponde al haz foliar. Éste está recubierto de distintos tipos de glándulas, que parecen diferir más en su posición y en su supuesta función que en su estructura. Existen glándulas “ornamentales”, de origen epidérmico, en la superficie interior del opérculo y en otras zonas, glándulas que segregan néctar. En la parte interna de la pared del ascidio existen numerosas glándulas digestivas y hacia la base del mismo existen glándulas cuya función debe ser digestiva y absorbente. Estas glándulas establecen un transporte a corta distancia entre el líquido contenido en el odre y los tejidos de la pared del mismo. Las glándulas multicelulares situadas bajo el nivel del líquido segregan principalmente fosfatasas ácida y esterasa. Los animales, atraídos por la abigarrada coloración del odre y por la secreción de néctar que se produce en el borde del mismo, al posarse sobre éste, que es muy liso, resbalan, caen al líquido, del que ya no pueden salir por impedírselo una secreción cérea que recubre la aparte superior de la superficie interna de la jarra y son digeridos por acción enzimática.

Figura 4.26 Nepenthes La eficiencia en la captura ha sido objeto de estudio en muy pocas ocasiones y los datos que se poseen no son concluyentes. Por ejemplo, se ha grabado en vídeo el proceso de captura durante un tiempo determinado por parte de los odres de Sarracenia purpurea y después se ha analizado el vídeo en función de varias variables. La eficiencia global de la captura fue solo de un 0,83 aun 0,93%, constituyendo hormigas el 74% de las presas potenciales. Se da la circunstancia curiosa de que la eficiencia de la captura específica de hormigas es muy baja, del orden de un 0,37%. No se han encontrado correlaciones entre el número de presas potenciales que visitan el odre y la edad del propio odre, ni con el tamaño de la planta, temperatura del aire u hora del día (Newell y Nastase, 1998). (Figura 4.27)

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Figura 4.27 Sarracenia purpurea Sin embargo, no todos los insectos son presas potenciales. Hormigas del género Colobopsis han desarrollado un complicado sistema, no del todo conocido, de coevolución con los órganos captores de Nepenthes bicalcarata, viviendo en sus zarcillos e incluso realizando la puesta en los espacios intertisulares internos. Estas hormigas son capaces de zambullirse en el líquido digestivo que llena el odre y nadar libremente en él en busca de alimento, y salen ilesas. Incluso llegan a efectuar trabajos en equipo cuando la presa es demasiado grande, realizando un esfuerzo común entre varios individuos para arrastrarla fuera del odre. Estas acciones parecen beneficiar a la planta. La descomposición de grandes masas del tejido animal puede ensuciar el agua del odre y provocar trastornos que podrían calificarse, salvando las distancias, de indigestión de la planta. Cómo estas hormigas son capaces de trepar después por las paredes del odre, pulimentadas y resbaladizas, y escapar es algo que aún se desconoce. En otras ocasiones el habitante del odre es de mayor envergadura. Algunas ranas son capaces de introducirse en las trampas y sumergir la parte posterior del cuerpo en el líquido digestivo, quedando la cabeza fuera del mismo, atenta y vigilante a la caída de algún insecto que pueda robar a la planta. Parece que la piel del anfibio puede resistir el ataque de las enzimas digestivas de la planta durante periodos de tiempo prolongados. Sin embargo, el sistema de sujeción de animal a las paredes internas del odre falla y la rana cae en el interior de la trampa y termina por morir. SECRECION DEL NÉCTAR Y DEL MUCÍLAGO El néctar está compuesto fundamentalmente por azúcares (monosacáridos, sacarosa, algunos oligosacáridos) y en mucha menor proporción por aminoácidos, algunos iones inorgánicos y trazas de vitaminas y ácidos di y tricarboxílicos. La forma mayoritaria es la sacarosa y sus monosacáridos componentes, asociándose la hidrólisis enzimática del disacárido al propio proceso de secreción. Es indudable que la procedencia de los componentes azucarados del néctar es el floema. Parte de la sacarosa

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transportada pasaría, vía célula acompañante, hasta las células parenquimatosas y, desde ellas, a las glandulares mediante un complejo sistema de plasmodesmos (Figura 4.28).

Figura 4.28 Esquema ilustrativo de la secreción del néctar. Parte de la sacarosa floemática es transvasada, vía plasmodesmos, a las células secretoras, a través de las cuales se vierte al exterior, siendo parcialmente hidrolizadas por invertasas segregables. Los estudios de velocidad de secreción indican que parte del segregado puede ser reabsorbido por la propia célula secretora. La superficie externa del plasmalema de las células secretoras de los nectarios aumenta como una consecuencia de la presencia de protuberancias de la pared celular. Este alargamiento efectivo, que supone la adquisición de una forma sinusoide, puede permitir el disponer de más espacio para la implantación de transportadores específicos e, incluso, para facilitar la eliminación del néctar por difusión pasiva. Existen evidencias circunstanciales de abundancia de vesículas del retículo endoplásmico, como es el caso de las células secretoras de Drosophylum, por lo que se piensa en una secreción granulocrina. Sin embargo, esto es sólo válido para mucilagos polisacarídicos La cadena alongada del polisacárido en las vesículas del retículo endoplásmico y complejo de Golgi va llenando progresivamente tales vesículas, que se desgajan del cuerpo central. Los disctiosomas individualizan también vesículas cargadas de polisacáridos, emigran hasta el plasmalema y allí se sueldan a su estructura, vaciando por exocitosis su contenido al exterior. El sistema apoplástico de la pared celular y la cutícula perforada no suponen inconvenientes a la salida. Sin embargo, esto no se observa en los nectarios. Por el contrario, en la mayor parte de los casos se han desarrollado mecanismos moleculares específicos para el transporte de azúcares, por lo que, en estos casos, se trata de una secreción ectocrina. Como la cutícula que cubre las células secretoras está generalmente perforada, tampoco supone inconveniente para la salida del néctar. Las células glandulares y sus vecinas poseen muchas mitocondrias, por lo que cabe esperar que la secreción sea dependiente de la obtención de energía. De hecho, la secreción es inhibida por anoxia, por inhibidores del transporte electrónico mitocondrial y por desacopladores de la fosforilación oxidativa. SECRECIÓN DIGERIDOS

DE

ENZIMAS

DIGESTIVAS

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Y

ABSORCIÓN

DE

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Los odres de Nepenthes y Sarracenia cerrados contienen en su interior una disolución de enzimas proteolíticas, aun en ausencia de presa capturada y de contaminación microbiana. La secreción de enzimas es, por tanto, un proceso espontáneo que no ha podido ser experimentalmente estimulado mediante la adquisición de insectos o cuerpos extraños. Por contraste, los órganos de captura abiertos al aire libre (Dionaea, Drosera, Pinguicula) requieren estímulos químicos para segregar enzimas digestivas. Esta secreción puede estimularse experimentalmente mediante el suministro de Na+ , NH4+, urea y aminoácidos, todos ellos compuestos contenidos en la hemolinfa de los insectos. No se estimula, sin embargo, mediante el suministro de ovoalbúmina, K+ , Ca+2 o glucosa. La adición de glucosa o sacarosa 0,2 M incrementa el potencial de acción desde el mucílago en tentáculos de Drosera, lo que puede ser debido, sencillamente, a una dilución del alto contenido iónico del propio mucílago alrededor de la cabeza del tentáculo. Disoluciones de diferentes sales causan un descenso de los potenciales eléctricos, presumiblemente por una acción directa sobre los receptores de membrana, ya que los diferentes iones contribuirán a cambios en el potencial transmembrana. Gotas de agua o pequeños cristales no tienen ningún efecto sobre el movimiento de los tentáculos de Drosera ni sobre la secreción de enzimas, mientras que dichos fenómenos son elicitados por una variedad de compuestos nitrogenados. El ácido úrico, componente de las excreciones de los insectos, resulta ser el más efectivo en elicitar secreción de proteínas, mientras que otros compuestos nitrogenados minoritarios no tienen efecto. El máximo de secreción en Drosera y Dionaea es alcanzado al tercer o cuarto día tras la captura. En Dionaea las enzimas están acumuladas en vacuolas y en cisternas del retículo endoplásmico. En Pinguicula, por el contrario, la máxima acumulación de enzimas se observa en los embalsamientos citoplásmico que establecen las protuberancias de las paredes celulares anticlinales de los tricomas sesiles. El apoplasto se transforma, entonces, en un reservorio de enzimas. La secreción, es por tanto, granulocrina en Dionaea y ectocrina en Pinguicula para las enzimas que se mueven en el apoplasto. Pero durante la maduración, las cabezas secretoras se autolisan y se convierten en auténticos sacos pasivos de Cl- , posdiblemente con K+ como contraión, lo que causa un eflujo osmótico de agua que drena las enzimas contenidas en al cabeza. Las enzimas digestivas encontradas en las secreciones glandulares de carnívoras son, esencialmente, proteasas (amino y carboxipeptidasas), fosfatasas, lipasas, amilasa en alguna ocasión, DNasa, transaminasas para las transformaciones glutamato-oxalacetato y glutamato-piruvato, esterasas y peroxidasas. En Sarracenia purpurea se ha investigado el origen de tales enzimas digestivas por un sencillo proceso experimental. Un odre recién abierto es cargado con 15 ml de agua destilada y, a tiempos sucesivos, se extraen alícuotas de esa agua para ser analizadas (Gallie y Chang, 1997). Se han encontrado dos RNasas ácidas, de 26 y 28 KDa de peso molecular, prácticamente inexistentes al comienzo del experimento que, sin embargo, son activamente sintetizadas hasta alcanzar un máximo al cuarto día después de al carga del odre, para decrecer con posterioridad. Otras enzimas con actividad RNasa, como las ácidas de 29 y 30 KDa y una neutra de 175 kDa, son realmente nucleasas, ya que pueden hidrolizar tanto RNA como DNA. Una nucleasa de 50 kDa, de presencia transitoria, puede ser un efecto de la aparición simultánea de proteasas y su acción sobre la nucleasa de 175 kDa. Las nucleasas de 29 y 30 kDa siguen las mismas pautas de producción que las auténticas RNasas, pero la nucleasa

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neutra comienza a ser producida a partir del séptimo día tras la carga, para alcanzar un contenido máximo a los 21 días y disminuir después. La producción de estas nucleasas se ve incrementada con la adición al agua del odre de RNA, DNA o seroalbúmina bovina. Por otra parte, la síntesis de proteasas y fosfatasas también progresa durante los días posteriores al llenado del odre. Generalmente, la producción de estas hidrolasas va acompañada de un descenso del pH del agua que las contiene y su síntesis es disparada por la adición de NH4 Cl, aunque no por K+ ni Na+. Parece, por tanto, que los iones amonio constituyen la señal química cuya transducción dispara la síntesis de hidrolasas. Mediante el suministro de alimentos radiactivamente marcados y las correspondientes autorradiografías, se ha demostrado que las mimas glándulas secretoras de enzimas digestivas son responsables de la absorción de los productos de descomposición de la presa. Dixon et al. (1980) observaron que variantes fenotípicas de Drosera erythrorhiza a las que les faltaban los tentáculos eran incapaces de absorber el 14 C de presas radiactivamente marcadas. Los compuestos orgánicos, principalmente los aminoácidos, son más rápidamente absorbidos que los inorgánicos, Probablemente, la absorción de los aminoácidos deba ser considerada como un simporte a través de las membranas de las células glandulares, movido por el gradiente electroquímico de protones establecido por las bombas de protones de sus membranas,. Esta absorción debe también ser químicamente estimulada. 5. SUELOS CON METALES PESADOS 5.1 INTRODUCCIÓN Bajo el término de metal pesado suelen agruparse todos los metales, excluyendo los alcalinos y alcalinotérreos, cuyo peso específico (densidad atómica) supera los 5 a 6 g/cm3 o aquellos que tienen un número atómico superior a 20 (Figura 5.1). Diversos autores han criticado el uso de este término argumentando que el peso de un metal per se no implica propiedades físico-químicas homogéneas ni proporciona información alguna acerca de sus posibles funciones biológicas o su comportamiento medioambiental (Woolhouse, 1983). De hecho, entre los metales pesados encontramos nutrientes esenciales para las plantas (Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni) y animales (Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni, Cr, Co), elementos beneficiosos para el crecimiento y desarrollo de ciertas especies vegetales bajo determinadas circunstancias (Cr, V, Ti, Co, Se, etc) y elementos que, hoy por hoy, no se considera que tengan función o efecto positivo en los seres vivos (Cd, Hg, Pb, Tc, etc). De aquí, que muchos autores prefieran usar el término elemento traza para designar genéricamente aquellos elementos que pueden causar efectos biológicos a bajas concentraciones (Phipps, 1981; Hagemeyer y Breckle, 1996; Bargagli, 1998). No obstante, tal como puntualiza Tiller (1989), el término metal pesado puede ser útil como una denominación globalizadora que abarca todos aquellos elementos metálicos que sean relevantes como contaminantes potencialmente tóxicos para el medio ambiente.

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Figura 5.1 Tabla periódica de elementos químicos De todas maneras, hay que recordar que el efectos biológico de los metales pesados depende ampliamente de la capacidad de los iones de estos elementos para formar complejos estables con los componentes orgánicos de la materia viva (Woolhouse, 1983). En este sentido pueden distinguirse los siguientes grupos, de acuerdo con su índice de covalencia (producto de la electronegatividad (Xm) elevada por el radio iónico (r)(Figura 5.2): 1.- Iones de la clase A o ácidos fuertes, con bajo índice de covalencia y preferencia para ligandos con oxígeno (grupos carboxilo, sulfatos, fosfatos, etc). 2.- Iones de la clase B o ácidos débiles, con índice de covalencia elevado y preferencia para la unión a compuestos con grupos amino o sulfidrilo, entre otros. 3.- Iones de la clase frontera o “borderline”, con valores de índice de covalencia intermedios y una gran capacidad de unirse a una amplia gama de ligando, incluyendo tanto los donadores de oxígeno como aquellos preferidos por los iones de la clase B. La clase A incluye iones de elementos alcalinos y alcalinotérreos entre los cuales hay macronutrientes esenciales para todas las plantas (K+, Ca2+, y Mg2+), nutrientes esenciales o beneficiosos para determinadas especies (Na+ para halófitas) y algunos sin función biológica conocida (p. ej. Ba2+). Estos iones de elementos alcalinos y alcalinotérreos combinan su bajo índice covalente con un bajo índice iónico (cociente entre el cuadrado de la carga (Z) y el radio iónico (r))y sólo son tóxicos a altas concentraciones, en el rango de mM. Estas elevadas concentraciones iónicas dañan a las plantas no solamente por interacciones con los componentes orgánicos de las mismas, sino también por provocar una sensible bajada del potencial osmótico del sustrato de crecimiento. Esta combinación de estrés iónico y osmótico se conoce normalmente con

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el nombre de estrés salino ya que la sal común (NaCl) es el causante más frecuente de este tipo de estrés.

Figura 5.2 Clasificación de iones metálicos de acuerdo con sus índices iónico y covalente. Los índices se calcularon con los valores de electronegatividad de AllredRochow y los radios iónicos (Å) de coordinación 6 según P. Lof. (1987). Periodic Table of Elements, Elsevier, Amsterdam

5.2 ORIGEN DE LOS METALES PESADOS EN EL SUELO Desde el punto de vista medioambiental, los metales pesados más interesantes son el cadmio, cobre, níquel, plomo, cromo, zinc y mercurio (Tiller, 1989). Entre los iones metálicos más tóxicos cabe destacar el Cd y el Hg. El mercurio en el suelo se presenta fundamentalmente precipitado como hidróxido Hg(OH)2. No obstante, en medios no muy oxidantes el Hg(II) puede reducirse a Ha(I) y después a mercurio metñalico, el cual es muy volátil y puede difundirse fácilmente a través de los poros del suelo. Algunos procesos naturales (pedogénesis, volcanes, huracanes, incendios forestales, etc) constituyen una fuente relevante de metales pesados en el suelo, si bien las aportaciones más importantes tienen lugar a través de la acción antropogéica, como son la actividad industrial y algunas prácticas agrícolas: abonado con residuos urbanos (lodos de depuradora y compost de residuos sólidos urbanos), aguas residuales, residuos ganaderos, productos fitosanitarios, etc. (Tiller, 1989). 1.- Origen natural de los metales pesados en el suelo. Los metales pesados contenidos en el material original, al meteorizarse, se concentran en los suelos. Estas concentraciones naturales de metales pueden llegar a ser tóxicas para el crecimiento de las plantas. Concentraciones naturales muy altas en los suelos pueden ocasionar acumulación de algún metal en plantas y provocar efectos tóxicos para los animales que las ingieren. También hemos de considerar las actividades volcánicas, que emiten metales pesados tales como: As, Hg, Se, etc. Según Manta et al. (2002) la presencia de

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los metales Pb, Zn, Cu, Sb y Hg en el suelo suele ser debida a contaminación antropogénica, mientras que la de Mn, Ni, Co, Cr, V y Cd en su mayoría es debida a la alteración de materiales originales o primarios. 2.- Fuentes antropogénicas. Las actividades humanas han ejercido un efecto considerable en la concentración y movilidad de los metales en los suelos. Entre estas actividades, destacamos las siguientes: 2.1.- Productos químicos agrícolas (plaguicidas y fertilizantes que pueden contener trazas de metales pesados) y lodos residuales. 2.2.- Actividades de minería y fundición. El proceso de minería implica: la extracción de las menas, el procesado preliminar, la evacuación de los residuos y el transporte de los productos semi- procesados. Todas estas operaciones pueden producir una contaminación localizada de metales. El polvo originado puede ser depositado en los suelos a muchos kilómetros de distancia. En áreas mineras, las capas superiores de suelos minerales presentan concentraciones elevadas de cobre, níquel, arsénico, selenio, hierro y cadmio. 2.3.- Vertidos accidentales mineros. Uno de los sucesos más graves tuvo lugar el mes de abril de 1998 en Aznalcollar (Sevilla), cuando se produjo la rotura de una balsa de residuos mineros, ocasionando aguas ácidas y una riada de lodos con contenidos importantes de metales: As, Cd, Zn, Cu, Cr, Fe, Mn, Hg, Ni, Pb. 2.4.- Generación de electricidad y otras actividades industriales. La combustión del carbón es una de las principales fuentes de deposición de metales en suelos. Las centrales térmicas de combustión de petróleo pueden ser fuentes de plomo, níquel y vanadio. Las mayores fuentes industriales de metales incluyen fábricas de hierro y acero que emiten metales asociados con las menas de hierro, como el níquel. Las fábricas de baterías, pueden emitir cantidades considerables de plomo. Los metales asociados con áreas altamente industrializadas, incluyen arsénico, cadmio, cromo, hierro, níquel, plomo, zinc, y mercurio. La combustión de carburantes puede dar lugar a emisiones aéreas de plomo. 2.5.- Residuos domésticos. En los países europeos aproximadamente un 4% de los residuos sólidos urbanos está compuesto de metales (Ministerio de Medioambiente, 1999). Uno de los problemas más serios de las sociedades modernas es cómo deshacerse de este volumen de residuos domésticos. Las dos alternativas son enterrar o incinerar. El enterramiento puede contaminar las aguas subterráneas, mientras que la incineración puede contaminar la atmósfera al liberar algunos de los metales volátiles. Los metales estudiados, plomo y mercurio, tienen distintas fuentes antropogénicas. Así, el Pb, procede principalmente de baterías, gasolina, pigmentos, minición, soldadura, pintura y la industria automovilística, mientras que el Hg proviene fundamentalmente de la producción de cloruro y sosa caústica, insecticidas, industrias farmacéutica y metalúrgica, odontología, y de la producción de polímeros sintéticos (ya que actúa como catalizador).

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5.3 PROCESOS QUE DETERMINAN LA DINÁMICA DE LOS METALES PESADOS EN EL SUELO. En la figura 5.3, se esquematizan los cuatro caminos distintos que pueden seguir los metales pesados incorporados al suelo (Calvo de Anta, 1997): *Vía 1: Quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la disolución del suelo o bien fijados por procesos de adsorción, complejación y precipitación. *Vía 2: Ser absorbidos por las plantas y así incorporarse a las cadenas tróficas. *Vía 3: Pasar a la atmósfera por volatilización. *Vía 4: Movilizarse a las aguas superficiales o subterráneas.

Figura 5.3 Dinámica de los metales pesados en el suelo. Los procesos más importantes a los que se ven sometidos los metales pesados en el suelo, lixiviación, volatilización, absorción por organismos, adsorción, complejación y precipitación, se ven afectados por las condiciones físico-químicas del medio, principalmente por: a) el pH del medio, b) su potencial rédox y c) la especiación de cada metal. La importancia de las condiciones fisicoquímicas y bióticas del medio y las repercusiones de su modificación son particularmente interesantes en el análisis de diferentes situaciones de impacto. A) pH del medio: A excepción de pH ácidos, los metales son poco móviles en los suelos y tienden a acumularse en los horizontes superficiales, biológicamente más activos, lo que hace que los metales estén fácilmente accesibles para los vegetales. Además el pH es un parámetro importante a la hora de definir la movilidad del catión, ya que la adsorción de los metales pesados al suelo está fuertemente condicionada por el pH del medio. La mayoría de los metales tienden a estar más disponibles a pH ácido. Los cambios en el pH afectan a la formación de diferentes especies químicas, como complejos de hidróxidos y carbonatos. En general, en medios de pH moderadamente alto se produce la precipitación del metal como hidróxidos,

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aunque en medios muy alcalinos, los metales pueden nuevamente pasar a la disolución del suelo como hidroxicomplejos. B) Potencial de oxidación-reducción (Eh) del suelo: El potencial de oxidaciónreducción es responsable de que el metal se encuentre en estado oxidado o reducido. Los diagramas Eh-pH se utilizan para mostrar la estabilidad de compuestos de metales pesados y constituyen una herramienta para predecir el comportamiento de los metales pesados frente a un cambio en las condiciones ambientales. Las condiciones rédox pueden producir: i) un cambio directo en la valencia de ciertos metales; por ejemplo, en condiciones reductoras el Fe3+ se transforma en Fe2+, siendo los iones reducidos más solubles; ii) una influencia indirecta en la movilidad de los metales. Un ejemplo es el descrito por Iimura (1981) referente al envenenamiento causado por arroz en suelos de Japón con alto contenido en Cd. Con técnicas tradicionales de cultivos no se producían daños, al mantenerse el suelo en condiciones reductoras todo el año. Ahora bien, el drenaje temporal realizado para facilitar el laboreo causó la oxidación de S= a SO=4, lo que produjo un descenso del pH acompañado de un aumento de la concentración de Cd en disolución y, por tanto en el arroz, provocando la disentería. Este ejemplo es ilustrativo de la importancia de la especie y no de la cantidad total de un determinado compuesto. En ambientes muy reductores el Fe se puede combinar con el S2hasta convertirse en pirita. Cuando los suelos y sedimentos contienen cantidades significativas de pirita y aumenta el Eh (creación de condiciones más oxidantes) el S2-se oxida a liberando cantidades de H2SO4, el suelo se acidifica fuertemente y los metales se hacen muy solubles. Esta relación entre el Eh y el pH del medio se observa en el diagrama Eh-pH para el Pb que se muestra el la Figura 5.4.

Figura 5.4 Diagrama Eh-pH para el Pb en medio acuático y medio marino. La fase estable dominante es PbCO3, que se hace más inestable si las condiciones ambientales son más ácidas (Fig. 5.4). El PbCO3 tiene un elevado producto de solubilidad y cuando este mineral se encuentra en aguas superficiales, se observan altas concentraciones de Pb. Por otro parte, cuando

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el azufre es abundante se forman complejos indicados en el diagrama de la derecha. Bajo condiciones reductoras (bajo Eh) el PbS es la fase estable. El sulfuro de plomo se forma en estuarios y medios marinos donde los sulfatos se reducen a sulfuros que reaccionan con plomo para formar sulfuro de plomo (insoluble). Por lo tanto, condiciones ambientales que provoquen un aumento del potencial rédox podrían originar la inestabilidad del sulfuro de plomo, con una subida de la concentración de plomo disuelto. Muy ilustrativa es la tabla que Plant y Raiswell (1983) han desarrollado sobre la movilidad de los metales pesados y elementos asociados en función de las condiciones de pH y Eh (Tabla 5.1).

Tabla 5.1 Movilidad relativa de los metales pesados según el Eh y pH del suelo. C) Especiación de los metales pesados. Las cantidades totales de un metal pesado presentes en un suelo constituyen una medida poco representativa de la posible toxicidad y disponibilidad de ese metal. No sólo el tipo de sustancia contaminante va a influir en la toxicidad de un elemento metálico. Es importante conocer la forma química bajo la que se presenta el metal, es decir su especiación, ya que va a regular no sólo su disponibilidad (según se encuentre disuelto, adsorbido, ligado o precipitado) sino también el grado de toxicidad que presente, ya que ésta depende directamente de la forma química en sí misma. Sin embargo, por su facilidad de medida y reproduciblidad, en los estudios de contaminación se utilizan muy frecuentemente los valores totales para definir los umbrales de contaminación. Todos los metales pueden aparecer en el suelo en formas de muy baja asimilabilidad, actividad y movilidad geoquímica que, generalmente, se relaciona con el predominio de compuestos escasamente solubles (sulfuros, hidróxidos, fosfatos...) o pueden aparecer en especies más solubles. En algunos casos hay diferencias importantes entre la toxicidad de las distintas formas de oxidación de un mismo elemento (influencia del potencial rédox), como es el caso de los compuestos de Cr(III) y Cr(VI). Así el Cr(VI) es muy móvil y tóxico como anión, mientras que el Cr(III) es relativamente insoluble, se adsorbe fuertemente sobre las superficies y además es menos tóxico. Metales como Hg, Pb, As, Sn y Cr pueden sufrir metilación bacteriana, lo que da lugar a una movilización de estos metales, ya que la formación de compuestos organometálicos, liposolubles, aumenta la toxicidad de los FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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elementos metálicos debido a que pueden atravesar fácilmente las membranas biológicas incorporándose a la cadena trófica. Especialmente importante es la metilación de Hg resultando CH3Hg+, un compuesto mucho más tóxico que el mercurio. Este elemento es ampliamente utilizado para extraer oro de sedimentos y suelos en Brasil, Venezuela, Filipinas e Indonesia (Vidalón, 1997). El mercurio se añade a los sedimentos que contienen partículas de oro finamente divididas, tratándose grandes volúmenes de tierra. El oro forma un amalgama que puede ser separada fácilmente (por sedimentación) de la tierra tratada. La amalgama separada es quemada para volatilizar el mercurio y como resultado el mercurio entra en la atmósfera. El vapor de mercurio elemental liberado en la atmósfera durante la tostación de la amalgama Au/Hg y vaporizado durante los distintos procesos de extracción de oro es oxidado a Hg2+ mediante ozono, energía solar y vapor de agua. Una vez formado, el mercurio iónico Hg2+ es arrastrado de la atmósfera por las lluvias y depositado sobre ambientes terrestres y acuáticos donde es convertido en metil mercurio en el suelo. El metil mercurio puede ser fácilmente transportado del suelo al medio acuático. También se pierde mercurio durante todo el proceso y dicho mercurio termina en los ríos, donde es asimilado por los organismos acuáticos. La importancia adquirida por la especiación ha obligado al desarrollo de un número de técnicas de análisis químico o de modelizaciones termodinámicas. El análisis químico proporciona información sobre la forma en que se presenta un determinado elemento o especie: soluble en agua, cambiable, ligado a la materia orgánica, adsorbido, ocluido, etc; o aplica nuevos términos como: lábil, no lábil, complejo estable, bioasimilable, etc. Las modelizaciones termodinámicas utilizan el equilibrio, los mecanismos de reacción y las constantes por las que se rigen, para calcular la actividad de las diferentes especies en las disoluciones. En relación con los metales pesados, vamos a describir brevemente cada uno de los procesos que pueden sufrir estas especies una vez que se incorporan al suelo: LIXIVIACIÓN En un suelo, tanto la movilidad del metal pesado hacia horizontes más profundos como su disponibilidad para la planta, están condicionadas por una serie de factores que influyen en los mecanismos de adsorción y precipitación de estos elementos, como son la textura, el contenido de materia orgánica, el pH, el contenido de carbonatos, etc. Si bien las partículas sólidas coloidales de sustancias húmicas o asociaciones organominerales contribuyen notablemente a la retención y/o inmovilización de los metales, la materia orgánica soluble (MOS) del suelo es potencialmente móvil y por tanto puede transportar especies adsorbidas de un sitio a otro. La importancia de la MOS en el co-transporte depende de la unión de la especie química con la MOS y del transporte del complejo resultante deun compartimento a otro. Los mecanismos de unión son esencialmente los mismos que se dan entre especies químicas y compuestos orgánicos de diferente naturaleza presentes en el suelo. Si el enlace MOS-metal pesado

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es muy fuerte, a MOS sirve como sumidero y si no lo es, puede transportarlo a otra parte de la zona no saturada o saturada provocando un potencial impacto ambiental. El pH es un factor importante que determina la mayor o menor facilidad con que los metales pueden ser transportados a través del perfil del suelo. Aunque la relación entre el pH de un suelo y las fracciones soluble y disponible de un metal en el mismo difiere para cada elemento, las condiciones ácidas favorecen, en general, el mantenimiento de formas solubles de los compuestos metálicos, y suponen un elevado potencial de lixiviación de metales, que se acentúa en aquellas zonas con predominancia de texturas gruesas y materiales con escasa capacidad de adsorción. Los vertidos procedentes de explotaciones mineras piríticas constituyen aportes elevados de diversos metales y contribuyen a la acidificación del medio por la naturaleza de los compuestos que contienen (Xu et al., 2000). El accidente minero ocurrido en 1998 en Aznalcóllar (Sevilla) es un ejemplo representativo de los problemas acarreados por estos vertidos. Los residuos reunían tanto lodos con las fracciones no aprovechables dentro del proceso de obtención de pirita, ricos en metales pesados, sulfuros y arsénico, como aguas ácidas procedentes del lavado del mineral. La rotura de la balsa de almacenamiento de estos residuos ocasionó el vertido de un volumen aproximado de 2 y 4000 m3 de lodos y aguas ácidas, respectivamente, a los cauces e los ríos Agrio y Guadiamar, afectando a una franja de unos 62 Km de longitud y 500 m de anchura media, desde el punto del accidente has Entremuros, en el límite con el Parque Nacional de Doñana, sobre una superficie de 4634 Ha. Afortunadamente, el vertido tuvo lugar a finales de abril, al final de la época de lluvias, y se pudo llevar a cabo una apresurada operación de limpieza del cauce y su llanura de inundación antes de que se produjeran las primeras lluvias otoñales. En este contexto, Polo et al. (2001), evaluaron las condiciones bajo las cuales se produciría el transporte de ciertos metales pesados, con el fin de no sólo cuantificar dicho aporte, sino también localizar aquellos puntos sujetos a un mayor riesgo, y elegir las alternativas más efectivas de tratamiento del suelo y control de dicho transporte. Los resultados obtenidos agrupan a los metales estudiados (zinc, cobre, hierro, manganeso, cadmio y plomo) según su comportamiento, en función de la concentración inicial en la superficie del suelo y del pH y la textura del mismo. Los puntos con mayores fracciones de arena mantuvieron un valor de pH ácido que permitió la estabilidad de formas solubles de los compuestos metálicos, redundando en elevadas concentraciones de los metales en estudio en los lixiviados obtenidos. Por ello, las zonas de la cuenca con predominancia de texturas gruesas pueden constituir sumideros de metales hacia el acuífero subyacente, potenciados en períodos húmedos prolongados. Las consecuencias de un vertido contaminante afectan no sólo a la calidad de las aguas superficiales sino también a las reservas subterráneas por transporte a través de la zona no saturada del suelo. VOLATILIZACIÓN Según Chaney et al. (1997) algunos metales pueden acumularse en las raíces de las plantas y convertirse en especies volátiles como el dimetilselenuro o el Hg0. Aunque muchas plantas pueden volatilizar dimetilselenuro (o dimetildiselenuro en el caso de las plantas hiperacumuladoras) (Terry et al., 1994), la contaminación por sulfatos y la salinidad en suelos a su vez contaminados por selenio generalmente inhiben el proceso de la fitovolatilización (Terry et al., 1994).Con respecto a la volatilización del Hg,

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Barkay et al. (2003) afirman que la resistencia bacteriana a compuestos del Hg orgánicos e inorgánicos es uno de los fenotipos más observados en las Eubacterias. Las bacterias Gram-positivas o Gram-negativas tienen típicamente un mínimo de enzimas mercurio-reductasa que reducen el Hg iónico, Hg2+, a Hg0, especie volátil y relativamente inerte. En la literatura existen diversos estudios que identifican bacterias de suelos, aguas y sedimentos, que pueden transformar compuestos mercuriales orgánicos e inorgánicos, mientras que otras sólo podían a partir de compuestos inorgánicos (Schottel et al., 1974). Posteriormente se han asilado fácilmente bacterias aerobias y facultativas capaces de volatilizar el mercurio de suelos, aguas y sedimentos, así como de distintos animales (Goldstein et al., 2001). El Hg también puede reducirse en el suelo abióticamente, mediante reacciones fotoquímicas o en oscuridad, con radicales libres orgánicos e inorgánicos (Nriagu et al., 1994). 2Hg(I)

Hg(II) + Hg (0)

ABSORCIÓN POR ORGANISMOS . PROCESOS METABÓLICOS Los organismos del suelo son capaces de absorber metales pesados del entorno y acumularlos en algunas de sus estructuras (p. ej., el Cu en las cutículas quitinosas). La absorción de metales pesados se ve afectada por distintos factores medioambientales, como el pH, la fuerza iónica, la presencia simultánea de distintos metales pesados y la naturaleza de ligandos inorgánicos y orgánicos en disolución. El pH es uno de los factores más importantes que influyen en la bioabsorción. Pagnanelli et al. (2003) estudiaron la absorción de plomo, cobre, zinc, y cadmio por Spaerotilus natans a diferentes pH de equilibrio (3-5 unidades). Sus resultados mostraron el efecto positivo del aumento del pH en la absorción de los contaminantes. Algunos microorganismos desarrollan resistencias a determinados metales pesados tóxicos que absorben del medio. El Hg2+, por ejemplo, es muy dañino, pero se conoce la resistencia a él de varios microorganismos, gracias a un mecanismo que implica su reducción a mercurio elemental, mediado por una mercurio-reductasa: Hg2+ + NADP + H+ = Hg0 + 2H+ + NADP+ Se han aislado mercurio-reductasas en microorganismos como Escherichia coli, Thiobacillus ferrooxidans, Streptomyces, Streptococcus y Caulobacter (Scheelert et al., 2004). La absorción de las especies metálicas puede venir seguida de mecanismos de acumulación en el interior de las células de biomasas vivas; varios estudios incluyen el uso de bacterias Gram+, Gram-, algas marinas, etc. (Flores et al., 2001). Por otro lado, las micorrizas pueden provocar un incremento de la absorción de metales pesados en algunas especies de plantas, evidenciando una alternativa de utilización en biorremediación o descontaminación del suelo a través de cubiertas vegetales. La mayoría de las plantas capaces de crecer en tierras ricas en metales lo hacen excluyendo iones potencialmente tóxicos de sus sistemas de raíces. En otras plantas, los metales son utilizados como micronutrientes, aunque a menudo aún concentraciones mínimas saturan a la planta. Las plantas más tolerantes son las conocidas como hiperacumuladoras de metales. Las hiperacumuladoras son plantas que acumulan altas concentraciones de metales en sus tejidos y tienen dos características principales: a) la

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habilidad de crecer y desarrollarse en tierras con unos niveles de metales que son tóxicos para casi todas las especies de plantas y b) los metales acumulan exclusivamente en el tallo, y no en las raíces. Las especies hiperacumuladoras existentes tienen las desventajas de ser pequeñas y tardar mucho en crecer. Esto supone un importante inconveniente desde el punto de vista de la utilización de estas plantas para purificar suelos contaminados por metales tóxicos (fitodescontaminación). Algunos metales pesados como el cobre, el zinc o el hierro son elementos esenciales para el metabolismo de los peces, que los extraen del agua, del alimento o de los sedimentos. A través de las mismas vías de entrada se absorben otros metales que no tienen ningún papel biológico como el mercurio, el cadmio o el plomo. Numerosos estudios muestran que la acumulación de metales en los peces puede afectar al desarrollo de los organismos, sobre todo en las primeras etapas del crecimiento. Además, su acumulación en los niveles superiores de la cadena trófica puede suponer un riesgo para la salud humana. PRECIPITACIÓN Los distintos procesos de retención de los metales pesados en el suelo hacen que la concentración de muchos de ellos en la disolución del suelo sea inferior a los valores correspondientes a la solubilidad de los componentes puros. Por otra parte, Driessens (1986) mostró cómo la solubilidad de un metal en un compuesto iónico mezclado puede disminuir con respecto a la solubilidad del compuesto puro. De esto se deduce que la incorporación de un metal a un óxido de hierro o aluminio, en cantidades trazas, da lugar a una concentración del compuesto formado varios órdenes de magnitud inferior al esperado a partir de los valores de solubilidad del metal aislado (McBride, 1989). Sólo en los casos en los que altas cargas metálicas precipitan en fases sólidas es posible determinar la solubilidad del metal, por ejemplo, malaquita en suelos con elevados contenidos en Cu (Lund y Fobian, 1991). La tabla 5.2 muestra los pKs (pKs = -log Kps) de algunas sales de Pb y Hg poco solubles (Bandoli et al., 1999), donde Kps es el producto de solubilidad e la sal. El Pb, cuando existen importantes cantidades de fosfatos en los suelos, puede precipitar como fosfatos de plomo y quedar inmovilizado.

Tabla 5.2 pKs de algunas sales de Pb y Hg (Bandoli et al. 1999). COMPLEJACIÓN

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La complejación por la materia orgánica del suelo es uno de los procesos que gobiernan la solubilidad y la bioasimilidad de los metales pesados. La materia orgánica soluble del suelo reacciona con los metales formando complejos de cambio y quelatos, lo que puede hacer que migren con mayor facilidad a lo largo del perfil. La estabilidad de los complejos materia orgánica-metales varia según el metal. En los complejos menos estables el metal se asocia con los grupos hidroxilos y carboxilos débilmente ácidos, mientras que en los complejos más estables están asociados están asociados con carboxilos fuertemente ácidos. El Cu forma complejos muy estables, por lo que algunas plantas de suelos orgánicos presentan carencia de este elemento. La toxicidad de los metales pesados se potencia en gran medida por su fuerte tendencia a formar complejos organometálicos, lo que facilita su solubilidad, disponibilidad y dispersión. La secuencia de la estabilidad de estos complejos para determinados cationes es, según Klamberg et al. (1989): Fe3+ > Al3+ > Cu2+ > Pb2+ > Fe2+ > Ni2+ > Cd2+ > Zn2+ > Mn2+ Un ligando polidentado puede ocupar dos o más posiciones alrededor de un solo catión. Generalmente son moléculas orgánicas de gran tamaño conocidas como quelatos (del griego, pinza o tenaza). Por ejemplo, algunas enzimas son ligandos polidentados que ocupan varias posiciones alrededor de un catión central y que también se enlazan temporalmente para sustraer moléculas, por lo que catalizan cambios químicos en el sustrato. Los ligandos como H2O, OH-, F- y CN- solamente pueden ocupar una posición alrededor de un catión central y se les conoce como monodentados. Los ligandos de unión como O2-, CO32- y PO43- pueden ocupar una posición en las esferas de coordinación de cada uno de los diferentes cationes y formar un complejo polinuclear (se refiere al ion central o de coordinación). El ácido etilendiaminotetracético (EDTA) es un ligando quelatante en el que las posiciones alrededor del núcleo carbonado están ocupadas por 2 grupos amino y 4 grupos acetato. Los quelatos son completamente solubles y tienden a mantener a ciertos metales, como el hierro, zinc y cobre en disolución como fuente de suministro de nutrientes para las plantas, a menos que un nutriente dado sea desplazado del complejo por iones que se encuentren en grandes cantidades o que formen complejos más estables. También se utilizan para extraer de los suelos micronutrientes e iones de metales pesados. A concentraciones de cationes iguales, los de los metales de transición compiten más efectivamente que otros por ligandos de todo tipo, incluyendo los quelatos. Los iones de los metales de transición tiene la ventaja de poder cambiar algunos electrones para acomodar mejor las configuraciones de los ligandos. McGarvey et al. (1985) aplican la complejación por EDTA para la descontaminación del medio de metales pesados. Utilizan resinas con ácido iminodiacético, que representa una mitad de la molécula de EDTA. Vieron cómo los metales monovalentes eran retenidos únicamente mediante interacciones débiles de intercambio catiónico, por lo que eran desplazados rápidamente por los metales pesados. El cobre y otros metales divalentes formaban quelatos con el grupo activo, con una selectividad que, en la mayoría de los casos, seguía el siguiente orden: Cu > Pb > Ni > Zn > Co > Cd > Fe > Mn > Ca > Mg > > Na. Los cationes divalentes capaces de formar los complejos con EDTA más fuetes son el Cu (II) y el Hg(II) (Figura 5.5)

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Figura 5.5 Valores de logaritmos de constantes de estabilidad de complejos EDTAmetales (Guilhaus, 1999). El complejo Fe-EDTA predomina en las disoluciones ácidas debido a su gran estabilidad. El ligando EDTA muestra preferencia por Fe(II y III) a pesar de las altas concentraciones de los iones Ca2+ y Mg2+ en la disolución del suelo, excepto en suelos alcalinos, donde las concentraciones de los iones Ca2+ y Mg2+ y la muy baja solubilidad del hidróxido de Fe(III) favorecen la formación de los complejos de estos elementos divalentes con EDTA. Nowack et al. (1996) observan cómo la baja biodegradabilidad del EDTA (utilizado como agente complejante por distintas industrias) en las plantas de aguas residuales provoca la aparición de este compuesto en distintos ambientes acuáticos, como ríos, lagos y aguas subterráneas. El complejo EDTA-metal facilita la lixiviación del metal por la naturaleza aniónica del complejo formado. ADSORCIÓN Destacamos la importancia de este proceso, ya que al igual que otros contaminantes, orgánicos e inorgánicos, el destino de los metales pesados en el medio ambiente está controlado fuertemente por las reacciones de adsorción por los coloides del suelo. Los tres constituyentes coloidales del suelo más activos, minerales de las arcillas, óxidos metálicos y materia orgánica, son importantes adsorbentes de metales pesados (McBride, 1989), debido principalmente a sus capacidades de intercambio catiónico y a su habilidad de formar complejos de esfera interna mediante grupos reactivos superficiales, tales como grupos carboxílicos e hidroxílicos (Weng et al., 2001). La influencia de los óxidos de Fe y Mn es importante en el caso del Pb. En cambio, el Cu y el Cd tienen más tendencia a ser adsorbidos por la materia orgánica. Un mayor grado de adsorción metálica al suelo provoca una disminución de su lixiviación, volatilización y absorción por organ ismos, disminuyendo así el posible impacto ambiental de altas concntraciones metálicas. Por ello, el proceso de adsorción ha sido

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muy aplicado en la descontaminación de metales pesados tanto de suelos como de aguas. Las reacciones de adsorción de los metales pesados por los suelos están influenciadas por la presencia de ligandos orgánicos e inorgánicos capaces de combinarse con los metales para formar quelatos y/o complejos. Diversos autores han concluido que los ligandos inorgánicos afectan en menor medida la adsorción metálica que la complejación orgánica (Lindsay, 1979). La presencia de ligandos orgánicos puede influenciar la capacidad de retención de metales pesados del suelo de dos maneras distintas (Pardo, 2000): a) al competir más eficazmente por los cationes metálicos que los sitios de la superficie sólida o ser adsorbidos preferencialmente en la superficie, reduciendo la capacidad adsorbente del sistema, puede disminuir la retención de metales pesados por parte del suelo y b) al formar complejos superficie-metalligando capaces de complejar o quelatar el ion metálico al mismo tiempo que permite la coordinación del metal a la superficie, puede aumentar la capacidad adsorbente de metales pesados del suelo. Por otra parte, cambios en la carga superficial de los componentes del suelo pueden afectar al grado de adsorción metálica en medios sólido, ya que las reacciones de adsorción de metales están íntimamente ligadas a la densidad de carga superficial neta negativa del adsorbente. Según Jenne (1968), la capacidad adsorbente de los metales divalentes está determinada principalmente por las cantidades de carbono orgánico y de óxidos de hierro y manganeso amorfo presentes en el suelo, ya que estos componentes tienen altas afinidades por los cationes metálicos. Gillet et al. (2002) analizaron la distribución vertical de los componentes húmicos y restos vegetales para analizar el impacto de la contaminación de los metales pesados (principalmente Zn) sobre las formas húmicas y la actividad de la fauna del suelo, comparando horizontes dentro de un perfil y perfiles húmicos entre sí, obteniendo la reciente historia del lugar. Ponizovskii et al. (2001) no observaron ningún movimiento vertical de plomo, desde el horizonte superficial de ninguna de los suelos que estudiaron, indicando su elevada retención del metal en el suelo. No obstante, para conocer los procesos de retención del metal en el suelo, su biodisponibilidad y la posibilidad de eliminación de esos suelos mediantes escorrentías superficiales y profundas, es necesario conocer la naturaleza de los compuestos de plomo formados (residual, adsorbido, unido a carbonatos, a óxidos de hierro o de manganeso, a materia orgánica, intercambiable, móvil, etc.) y su distribución. ADSORCIÓN A MINERALES DE LA ARCILLA La naturaleza química de las interacciones entre los metales pesados y las arcillas cambia según el pH del medio: a bajos valores de pH el proceso de cambio iónico es el que predomina en la retención de los metales, mientras que a altos valores de pH, la retención metálica está acompañada de la liberación de iones de hidrógeno, y parece ser más específica que la retención a menores valores de pH. Así, el clásico modelo de intercambio iónico no cubre todo el rango del fenómeno de adsorción y una parte de la adsorción de metales pesados se da en sitios creados por el desplazamiento de protones de hidroxilos superficiales, responsables de la complejación superficial. Barbier et al. (2000) estudiaron la características ácido-base de dos tipos de montmorillonitas, analizando la retención de Pb(II) y Cd(II) en función del pH. Vieron

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cómo la adsorción aumentaba con el pH, y cómo el plomo era siempre retenido en una proporción mayor que el cadmio. Babel et al. (2003) estudiaron la capacidad absorbente de metales pesados de, entre otros adsorbentes de bajo coste, los minerales de la arcilla. Sus capacidades adsorbentes se deben a su alta superficie específica y sus capacidades de intercambio. La carga negativa de la estructura de estos silicatos laminares les da la capacidad de retención de los iones metálicos. La mayor capacidad de intercambio catiónico, dentro de los minerales de la arcilla, la tienen las montmorillonitas (esmectitas), frente a la de las caolinitas y micas. Por ello un gran número de estudios con montmorillonitas han mostrado su efectividad para la retención de metales como Zn2+, Pb2+ y Al3+ a partir de disoluciones acuosas (Staunton y Roubaud, 1997). Srivastava et al. (1989) compararon la adsorción de plomo y cadmio por montmorillonita y caolinita. Vieron cómo la capacidad adsorbente de Pb2+ y Cd2+ es mayor en la montmorillonita (Pb: 0.68, Cd: 0.72 mg/g) que en la caolinita (Pb: 0.12, Cd: 0.32 mg/g). Undaybeytia et al. (1996) estudiaron la adsorción de Cd2+ sobre una montmoriollonita cálcica de Arizona. Vieron la alta tendencia del Cd2+ de formación de complejos con el ion Cl-, lo que provoca una menor adsorción del metal pesado sobre la arcilla frente al grado de adsorción sobre la misma de otros metales como el Zn2+. Yadava et al. (1991) estudiaron el efecto de la temperatura en la adsorción de plomo por parte de una arcilla procedente de China. Se observó la alta dependencia de la temperatura del proceso de retención del metal pesado por parte del mineral de la arcilla (encontrando una mayor retención del metal a bajas temperaturas), así como que la adsorción seguía una isoterma de Langmuir. La capacidad adsorbente máxima de la arcilla fue de 0.411 mg de Pb2+/g. El valor negativo de la variación de entalpía indicó que el proceso de adsorción era exotérmico. La bentonita es otro material muy valorado por su tendencia a adsorber agua en los sitios del espacio laminar. González-Pradas et al. (1994) estudiaron la adsorción de Cd2+ y Zn2+ sobre una bentonita natural en disolución acuosa. Se vio cómo el Cd2+ era adsorbido dos veces más que el Zn2+ (Tabla 5.3), ya que el Cd2+ tiene menos efectos polarizantes hacia la carga superficial de la bentonita que los iones de zinc.

Tabla 5.3 Capacidades adsorbentes (mg/g) de arcillas para diferentes metales pesados

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Los óxidos y (oxi)hidróxidos de hierro, aluminio y manganeso juegan un importante papel en la retención e inmovilización de los metales pesados. Incluso los óxidos de hierro parecen ser adsorbentes más selectivos que tenidos de Fe y Mn tienen una gran capacidad de adsorber metales divalentes, especialmente Cu, Pb (Sauvé et al., 2000) y en menor extensión Zn, Co, Cr, Mo y Ni. McKenzie et al. (1980) vieron cómo, bajo condiciones de laboratorio, los óxidos y oxihidróxidos de hierro adsorbía iones de Pb(II) de la disolución casi completamente, en el rango de pH entre 3.5 y 5.5. Ponizovskii et al. (2001) también estudiaron la adsorción de este metal por los óxidos del suelo. Concluyeron que los óxidos de manganeso también retenían el Pb(II) disuelto, si bien el aumento del pH provocaba un descenso significativo en esta retención metálica. El cambio en la superficie específica de la fase sólida provocó un efecto mínimo. Vieron cómo algunos iones de plomo eran retenidos más fuertemente que otros por los óxidos de manganeso o de hierro (goetita), por lo que concluyeron que existía una heterogeneidad en los sitios de adsorción de estos constituyentes individuales del suelo. Srivastava et al. (1988) estudiaron la eliminación de Pb2+ y Cd2+ de disoluciones acuosas usando un óxido de aluminio y goetita. Encontraron que la goetita tenía una mayor capacidad adsorbente para ambos iones metálicos (72mg/g para Cd2+ y 230mg/g para Pb2+) que el óxido de aluminio (31mg/g para Cd2+ y 33mg/g para Pb2+) y que la retención del Pb2+ era mayor que la de Cd2+. Numerosos autores han estudiado la adsorción de metales pesados sobre goetita y otros óxidos e hidróxidos. Benjamín y Leckie (1981) estudiaron la adsorción competitiva de Cd, Cu, Pb y Zn sobre oxihidróxidos amorfos de hierro, y enconraron un desplazamiento del pico de adsorción para un competidor por los sitios de adsorción. Bargar et al. (1997) evaluaron la adsorción de Pb a óxidos de hierro en función del pH, carga y electrolito de fondo. La carga superficial de los óxidos de hierro se compensa por la adsorción de una cantidad equivalente de aniones o cationes, o las respectivas regiones cargadas de moléculas polares sostenidas en la doble capa difusa más externa (Schwertmann et al., 1989). En el caso de fuerzas electrostáticas la adsorción se dice que es “no específica” y depende de la carga iónica. Pero la adsorción de iones a óxidos de hierro también puede ser “específica” (quimiadsorción o cambio de ligando) de forma que el ion pase a formar parte de la esfera de coordinación del Fe y, por cambio de ligando, se enlace covalentemente con él. La adsorción específica puede darse sobre una superficie neutra e incluso sobre una superficie con carga del mismo signo que el ion adsorbido, lo que no ocurre con la adsorción no específica. En la adsorción específica de metales pesados, la goetita y hematita retienen estos metales siguiendo el orden: Cu > Pb > Zn > Cd > Co > Ni > Mn, excepto por el intercambio de posición del Cu y el Pb en la hematita (Gerth y Brümmer, 1983). El factor más importante determinante de la extensión de la adsorción es el pH (Figura 5.6). El pH del máximo incremento en la adsorción se ha visto que está linealmente relacionado con la primera constante de hidrólisis del metal K1 = (MOH+) / (M2+) · (OH-). Esto indica que las especies hidrolizadas (MOH+) son adsorbidas preferentemente frente a la no hidrolizada (M2+). Barrow et al. (1981) destacaba la adsorción preferencial de los pares de iones (metal-anión)+ por parte de los óxidos del suelo frente al catión metálico aislado, M2+.

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Figura 5.6 Influencia del pH sobre la adsorción de algunos metales y oxianiones metálicos sobre hidróxido de Fe amorfo (Manzione et al., 1994). La estructura de la superficie del complejo, formado entre los grupos funcionales del óxido de hierro y el metal pesado, no es totalmente conocida. A partir de la liberación medida de uno o dos protones por átomo de metal adsorbido, se han propuesto varias reacciones (McKenzie, 1980), en las que se forman complejos mono y binucleares: Fe-OH

+ Fe-OH

O

M2+

+ M2+

Fe-O-M+

H+

+

Fe-O O

Fe-OH

M

+

2H+

Fe-O

Al aumentar el pH del sistema, serán adsorbidas las especies hidroxo, MOH+, más que las M2+: Fe-OH

+

MOH+

Fe-O-MOH

+

H+

Coincidiendo con lo expuesto, Ponizovskii et al. (2001) vieron cómo los óxidos de hierro experimentan un aumento de la retención del plomo en un estrecho rango de pH hasta el nivel de pH que permite la retención de MOH+: SOH0 + M2+ + H2O = [SO- MOH+] + 2H+, donde SOH0 es la sección sin carga de la superficie del óxido y [SO- MOH+] indica la forma adsorbida del plomo como monohidróxido. La adsorción del catión metálico a partir de disoluciones más ácidas seguiría la reacción: SOH0 + M2+ = [SO- - M]+ + H+ La adsorción de los metales pesados por los óxidos del suelo es de gran importancia para la movilidad de los metales pesados tóxicos y, por tanto, para la contaminación de aguas subterráneas, siendo especialmente importante desde el punto de vista de la acidificación de los suelos en áreas industriales. Tal y como se ha observado para otros sistemas adsorbente-adsorbato, el tiempo y la temperatura son dos factores que influyen de forma importante en la adsorción de metales por los óxidos de hierro. Gerth y Brümmer (1983) encontraron una relación lineal entre la adsorción de Ni, Zn y Cd en goetita y la raíz cuadrada del tiempo,

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indicando que los procesos de difusión estaban implicados en los de adsorción. Este proceso de difusión además se acelera con el incremento de la temperatura. Dho et al. (2003) vieron cómo la adsorción de Zn y Cu por parte de los óxidos de Mn y de Fe naturales ocurría mediante reacciones endotérmicas, lo que representa que las constantes de equilibrio y capacidades de adsorción aumentan cuando se produce un incremento de la temperatura. El movimiento hacia microporos (la difusión) también puede explicar por qué algunas proporciones de metales pesados son muy difíciles de extraer del suelo, incluso con ácidos fuertes. ADSORCIÓN A LA MATERIA ORGÁNICA La materia orgánica es uno de los componentes del suelo más importantes responsable del enlace de metales pesados, tanto como fase sólida como complejos solubles (McBride, 1989). El comportamiento de polímeros naturales como los ácidos húmicos y fúlvicos de los suelos en la interacción con metales es un proceso que puede contemplarse en dos etapas: por un lado, los componentes solubles de las sustancias húmicas pueden formar complejos que serán los responsables del aumento de la solubilidad de los metales y, por otro lado, las partículas sólidas coloidales de sustancias húmicas o asociaciones organominerales contribuyen notablemente a la retención y/o inmovilización de metales. En cualquier caso la interacción con los metales tiene lugar a través de los diferentes grupos funcionales presentes en los polímeros orgánicos. No obstante, independientemente de que la interacción dé lugar a la solubilización del metal o a su inmovilización parece que ello está más relacionado con el tamaño y solubilidad del polímero que con los grupos funcionales involucrados. Así, los ácidos fúlvicos juegan un papel importante en el transporte de los metales en la solución del suelo, debido a su menor peso molecular y mayor solubilidad comparada con los ácidos húmicos (Madrid, 1999). Por otro lado, las interacciones metales pesado-materia orgánica determinan tres amplios grupos de especies interrelacionadas entre sí con diferente influencia en la biodisponibilidad para los organismos vivos (Madrid, 1999): 1. Las superficies sólidas orgánicas pueden retener metales que no están inmediatamente disponibles para las plantas. Los metales retenidos de esta forma se comportan de forma similar a los retenidos por las superficies de los componentes minerales. No obstante, algunos metales, como el cadmio, pueden mostrar una asociación preferente por los componentes de la disolución acuosa que por las superficies sólidas (Neal y Sposito, 1986). 2. Algunos componentes de la materia orgánica natural pueden eventualmente estar disueltos y formar complejos con los metales en disolución, lo que puede depender de equilibrios de adsorción/desorción con las superficies sólidas. A estos equilibrios pueden contribuir moléculas orgánicas monómeras exudadas de la raíz o polímeros del suelo. Si estos complejos son fuertes los efectos tóxicos de los metales disminuyen, aunque se ha comprobado que algunos complejos solubles de lípidos pueden atravesar las biomembranas, ejerciendo su efecto tóxico (Carlson-Ekvall y Morrison, 1995). 3. Los iones metálicos que se encuentran libres o débilmente unidos son las especies más biodisponibles. Su concentración viene determinada por procesos de equilibrio, adsorción/desorción en las superficies sólidas orgánica e inorgánicas.

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Se ha observado que los ácidos húmicos tienen una menor afinidad por los metales pesados al aumentar la concentración de éstos (McBride, 1989). Este fenómeno se ha atribuido a la retención preferencial de los cationes metálicos por los sitios de alta afinidad a bajas concentraciones del metal complejado (McBride, 1989). Los grupos funcionales reactivos más abundantes en los ácidos húmicos del suelo son los ácidos carboxílicos y fenólicos, existiendo una fuerte afinidad de los metales pesados hacia ellos (Ponizovskii et al., 2001), aunque los ligandos derivados del N y el S, si bien son menos abundantes, pueden formar enlaces de alta afinidad con los cationes metálicos. Estudios espectroscópicos han mostrado que un 15-70% del total del S en el ácido húmico se encuentra en formas reducidas (Xia et al., 1998), tales como grupos sulfhidrilos o tioles (R-SH). Estos grupos forman enlaces de alta afinidad con el Hg(II) (Celis et al., 2000b; Lagadic et al., 2001). Por otro lado, es importante destacar la capacidad del Hg(II) para unirse fuertemente no sólo a la materia orgánica sólida, sino también a los sulfuros inorgánicos disueltos, y especies de S sin carga disueltas, lo que produce un aumento de la solubilidad y movilidad del metal, alteran do su biodisponibilidad para las plantas (Wang et al., 1997). Los ácidos húmicos del suelo pueden retener Pb(II). Los cationes de Pb(II) pueden enlazarse a los ácidos húmicos del suelo mediante grupos hidroxilos y carboxilos. También pueden participar en estos complejos los grupos débilmente ácidos y no disociados de los azúcares, fenoles, etc. (Soldatini et al., 1976). Adhikari et al. (2003) destacaron el papel de la materia orgánica en la adsorción de los metales pesados al correlacionar las variaciones en la adsorción de Cd y Pb por parte de distintos suelos con diferentes pH, C.C.C. y contenido en materia orgánica de los mismos. Weng et al. (2001) modelizaron la contribución de los adsorbentes individuales de metales pesados a las propiedades adsorbentes de un suelo arenoso. Sus resultados mostraron que la materia orgánica era el adsorbente más importante en la retención de Cu2+, Cd2+, Zn2+ y Ni2+ en este tipo de suelos. Cuando la concentración metálica es alta en comparación con el contenido en materia orgánica, la contribución de los minerales de la arcilla a la retención de los metales pasa a ser más importante. La adsorción de Cu, Cd, Zn y Ni por parte de los hidróxidos de hierro no fue significativa, lo contrario que ocurrió con el Pb, para el que el modelo estimó una fuerte adsorción. ADSORCIÓN A COMPLEJOS ORGANOMINERALES Los coloides organominerales naturales son asociaciones íntimas de partículas inorgánicas y materia orgánica entre las que tienen lugar muchos y muy variados tipos de interacciones. El modelo actual de una partícula coloidal natural (figura 7, más adelante) consiste en un núcleo mineral asociado con óxidos, hidróxidos u oxihidróxidos metálicos y todo ello recubierto, en mayor o menor grado, por materia orgánica (Day et al., 1994). Estudios de las propiedades textuales y mineralógicos, así como de la composición de la disolución del suelo indican un importante papel de los coloides organominerales en los suelos. Theng et al. (1986) encontraron evidencias, mediante difractometría de rayos X y espectroscopia RMN-C13, de la existencia de complejos organoarcillosos (formados por una mica-esmectita y sustancias húmicas) en dos suelos de Nueva Zelanda. Distintos autores (Theng et al.,1986) han concluido que cerca de la mitad de la materia orgánica asociada a los minerales de la arcilla estaba

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formada por materiales húmicos, estando la otra mitad formada por largas cadenas alifáticas. Sin embargo, estos compuestos alifáticos de bajo peso molecular son transportados al espacio interlaminar de la arcilla, actuando desde allí como vehículos de transporte de compuestos hidrofóbicos a través del perfil del suelo. El ejemplo clásico de la interacción organomineral es la formación de spodosoles. Estos suelos se dan en regiones con climas húmedos y fríos a partir de materiales ácidos originales o transformados (Mckeague et al., 1983). La formación de compuestos organominerales parece estar asociada al proceso de formación de estos tipos de suelos. Este proceso puede entenderse como una serie de reacciones del suelo en las que la materia orgánica del horizonte superficial se descompone y los ácidos fúlvicos y compuestos resultantes atacan las estructuras minerales formando con el Fe y el Al liberado una variedad de complejos. Muchos de estos complejos se mueven a lo largo del perfil del suelo, debido a su solubilidad en agua. La carga negativa de estos compuestos disminuye progresivamente, de tal manera que cuando pasan del horizonte O y E al B, pueden precipitar, cubriendo partículas minerales y formando agregados (McBride et al., 1983). Los coloides organominerales son los principales contribuyentes a los procesos de adsorción y transporte de, entre otros, los metales pesados. Las interacciones mutuas entre los minerales de la arcilla, óxidos de hierro y la materia orgánica pueden alterar en gran medida las propiedades adsorbentes de estos contribuyentes del suelo por los metales pesados, ya que tales interacciones normalmente implican sitios de intercambio catiónico y grupos superficiales carboxílicos e hidróxilos, que son potenciales sitios de adsorción para los metales pesados (Cornejo y Hermosín, 1996). Las predicciones de la adsorción basadas en la suma de las capacidades adsorbentes de los constituyentes individuales del suelo pueden desviarse seriamente de la realidad. Por todo, las predicciones de la adsorción a partir de la composición del suelo se mejorarán con un mayor conocimiento de cómo las interacciones entre los componentes individuales del suelo afectan al comportamiento adsorbente de los coloides naturales (Cowan et al, 1992). Existe una amplia literatura sobre la interacción de metales pesados con componentes del suelo sintéticos y purificados, tales como minerales de la arcillas, óxidos metálicos y ácidos húmicos. Aunque es más escasa la información sobre la interacción de estos contaminantes con adsorbentes múltiples o polifásicos, en los últimos años se ha prestado una mayor atención al estudio del comportamiento de estos adsorbentes múltiples para conseguir una interpretación más real del proceso de adsorción de metales pesados en el suelo (Taylor y Theng, 1995). Muchos de estos estudios mostraron un comportamiento muy diferente de los complejos adsorbentes del esperado a partir de la simple suma de los de sus componentes individuales. Los óxidos metálicos se encuentran frecuentemente asociados a las superficies de los minerales de la arcilla, con una compensación mutua de las cargas. Zhuang et al. (2002) ha estudiado la adsorción de plomo sobre estas asociaciones, observando cómo los recubrimientos de óxidos de aluminio sobre minerales de la arcilla (caolinita, montmorillonita e ilita) no producía efectos significativos. Por otra parte, la materia orgánica se fija a los bordes de las partículas de arcilla y a los revestimiento de óxidos metálicos confiriendo propiedades hidrofóbicas a las

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superficies minerales. Los fenómenos de asociación son tan comunes que para algunos suelos se ha encontrado que la materia orgánica libre, no asociada a componentes inorgánicos, supone tan sólo un 10-20% del total (Greenland, 1965). Las sustancias húmicas adsorbidas sobre partículas minerales facilitan la adsorción de cationes metálicos. Arias et al. (2002) vieron cómo los recubrimientos por ácidos húmicos en la caolinita aumentaban la capacidad adsorbente del sistema para cobre y cadmio. Numerosos autores han puesto de manifiesto la elevada afinidad de las sustancias húmicas por la superficie de los óxidos de hierro. La adsorción de la materia orgánica natural a los óxidos de hierro es extremadamente rápida y ocurre con concentraciones muy bajas de materia orgánica (Peiffer et al., 1999) e incluso para concentraciones muy bajas de materia orgánica en disolución (Day et al., 1994). La asociación modifica sustancialmente las características superficiales de los óxidos de hierro, las cuales pueden llegar a estar controladas por los recubrimientos de materia orgánica. El principal mecanismo de interacción en las asociaciones entre óxidos metálicos y los ácidos húmicos del suelo es la interacción de los grupos funcionales ácidos de las sustancias húmicas con la superficie hidroxilada de los óxidos de hierro. Los mecanismos de interacción más importantes entre los óxidos de hierro y las sustancias húmicas son : a)

b)

el cambio aniónico o interacción electrostática entre las superficies con carga positiva del óxido y los grupos carboxílicos y fenólicos desprotonados de las sustancias húmicas. La adsorción química o cambio de ligando entre estos mismos grupos de las sustancias húmicas u los grupos OH y OH2 superficiales del óxido de hierro.

Diversos estudios ponen de manifiesto que el mecanismo de adsorción química o cambio de ligando es incluso más importante que la interacción electrostática, (Day et al., 1994). Las interacciones mutuas entre los óxidos de hierro y la materia orgánica implican grupos superficiales carboxílicos e hidroxílicos, potenciales sitios de adsorción par a los metales pesados, por lo que pueden disminuir la capacidad de retención de metales de estas asociaciones.

5.4 IMPORTANCIA DEL ESTRÉS POR METALES PESADOS Considerando la amplia incidencia sobre el crecimiento vegetal, y, por ende, en la producción agraria, de factores de estrés tales como el déficit hídrico, la salinidad, el frío o enfermedades infecciosas, el problema de la toxicidad por metales pesados podría parecer de importancia secundaria y de distribución limitada a ciertas zonas contaminadas por actividades industriales o mineras, terrenos alrededor de fundiciones o suelos naturalmente ricos en metales debido a afloramientos minerales. No obstante, durante los últimos años ha habido un fuerte aumento en las investigaciones sobre el estrés por toxicidad de metales en las plantas. Este creciente interés lo podemos atribuir no solamente a un incremento general en la concienciación medioambiental de los

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científicos, sino sobre todo a una serie de factores concretos entre los cuales podemos destacar: 1.- El incremento de las concentraciones de metales pesados en los suelos agrarios debido a la utilización de fangos de depuración de aguas residuales, compost de basura, determinadas sustancias agroquímicas, purines de cerdo ricos en metales, etc. El punto más crítico en este tipo de problemas, más que la toxicidad de los metales para las propias plantas, suele ser su capacidad de acumulación de los metales tóxicos y su posible transmisión, en la cadena trófica, hacia el hombre. Especial atención en este sentido merecen el Cd y el Pb, y la investigación en fisiología vegetal se centra principalmente en el estudio de los mecanismos de absorción y transporte de estos metales en plantas de fuerte presencia en la dieta diaria (cereales, patatas, leguminosas), para así poder seleccionar eficazmente variedades de plantas alimenticias pobres en estos metales fuertemente tóxicos. Sólo en contados casos, en estudios con plantas de cultivos destinados al consumo humano o animal se intenta emplear el conocimiento de los mecanismos de absorción y transporte para conseguir un aumento en la concentración tisular de ciertos metales. Un ejemplo son las investigaciones acerca de la capacidad de acumulación de Cr en cereales para enriquecer la dieta humana en este elemento, que es esencial para el hombre, pero que se halla en proporciones bajas en estos alimentos vegetales. Las prácticas agrícolas arriba mencionadas ocasionalmente también pueden producir una disminución en la productividad de las cosechas. Un ejemplo ya clásico es la disminución en la productividad de cultivos sensibles sobre suelos que durante años había sido cultivados con vid o lúpulo y recibieron periódicamente tratamientos con caldo bordolés (sulfato de Cu) como fungicida preventivo. También excesos de Zn pueden ocasionar fitotoxicidad antes de afectar a la salud humana, ya que en el hombre y los animales el Zn actúa como toxina de paso (es eliminada con cierta facilidad) mientras que en las plantas interfiere fuertemente con la división celular, el metabolismo de P, la actividad de enzimas y la regulación hormonal. 2.- El hecho de que una gran proporción del suelo agrario mundial (aprox. 40%), situada en los trópicos, es suelo ácido que presenta serios problemas de productividad debido a la toxicidad de aluminio y, en menor proporción, a la de Mn, en combinación con deficiencia de P. Sólo el desarrollo de variedades tolerantes al Al y con una alta eficiencia de P, junto con una adecuada gestión integral de las explotaciones agrarias, permitirá en estas zonas económicamente deprimidas una producción sostenible de cosechas, capaz de alimentar su población. 3.- La creciente acidificación de suelos forestales en el Norte y Centro de Europa y en el Norte de América debida a la lluvia ácida, consecuencia de la contaminación atmosférica. Esta acidificación favorece la disponibilidad para los vegetales de iones metálicos potencialmente tóxicos. 4.- Vertidos accidentales masivos de metales tóxicos en zonas de gran interés medioambiental y mediático (por ejemplo el vertido de Aznalcollar).

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5.- La posibilidad de utilización de plantas para la restauración de zonas contaminadas por metales pesados mediante técnicas de fitorremediación basadas en la fitoextracción, la fitoestabilización o fitofiltración y la importancia para ello de la selección y desarrollo de variedades vegetales tolerantes a los metales pesados. 6.- El interés en la conservación de los diferentes tipos de poblaciones de metalofitas y serpentinofitas (flores de suelos serpentinos) específicas de zonas ricas en metales. Esta vegetación contiene genes de tolerancia a la toxicidad por metales de gran interés científico y técnico. 5.5 CONCENTRACIONES TÓXICAS CRÍTICAS, DISPONIBILIDAD Y BIOACUMULACIÓN DE LOS METALES. RELACIÓN PLANTA-SUELO La fitotoxicidad de los metales en el suelo no depende de la concentración total sino de su biodisponibilidad. A pesar de ello, fundamentalmente por razones prácticas y para la simplificación de recomendaciones y de las disposiciones legales, diversas publicaciones ofrecen tablas de concentraciones tóxicas críticas basadas en concentraciones totales. También las concentraciones máximas permitidas en suelos de uso agrícola se indican como concentraciones totales (Tabla 5.4).

Tabla 5.4 Rango de concentraciones tóxicas críticas (CTC) en suelos y plantas para diferentes metales, concentraciones mínimas permitidas en suelos de uso agrícola y concentraciones típicas de metales en plantas hiperacumuladoras. Todas concentraciones en mg/kg peso seco. Diferentes propiedades físicas y químicas del suelo además de factores biológicos condicionan la solubilidad y especiación de los metales y con ello su disponibilidad y su fitotoxicidad. De forma resumida podemos destacar entre los factores más relevantes para la disponibilidad el pH, el potencial de óxido-reducción, la capacidad de intercambio catiónico y la materia orgánica. La mayoría de los metales son más solubles en suelos ácidos y solamente la disponibilidad del Mo suele aumentar con FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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el pH. Bajos valores de potencial de óxido-reducción, como se observan en suelos encharcados con problemas de hipoxia, sin embargo, valores moderados de potenciales rédox favorecen la disponibilidad. El contenido y tipo de materia orgánica del suelo y la actividad microbiana no solamente influyen la solubilidad de los metales en el suelo sino sobre todo afectan a la especiación. Hay que tener en cuenta que no todas las especies químicas solubles de un metal tienen la misma toxicidad. Por regla general la forma de catión libre suele ser la forma más fitotóxica. La formación de complejos, especialmente los producidos por la unión a componentes orgánicos solubles del suelo, pueden reducir considerablemente la toxicidad a pesar de incrementar la concentración total soluble. Los ligandos con mayor afinidad para los metales son principalmente los ácidos orgánicos (cítricos, málico, tartárico, etc.), los fenoles, y ciertos aminoácidos tales como los sideróforos de origen microbiano y los fitosideróforos exudados por las propias plantas. PATRONES DE ACUMULACIÓN EN PLANTA A pesar de avances fundamentales en los últimos años, gracias al empleo de electrodos específicos y el desarrollo de programas de simulación tales como GEOCHEM, la complejidad del medio edáfico aún hace difícil establecer con carácter general para los diferentes tipos de suelos concentraciones tóxicas críticas fiables basadas en la actividad de las especies químicas responsables de los efectos fitotóxicos. Por ello, desde el punto de vista fisiológico es preferible definir concentraciones tóxicas críticas (CTC) en base a las concentraciones tisulares del metal que causan una reducción estándar (normalmente del 10%, CTC10%) en el crecimiento (p. ej. elongación radicular relativa, RRL), la productividad, la tasa fotosintética u otro proceso fisiológico relevante (Figura 5.8). Estas CTC10% varían ampliamente en diferentes especies, lo que implica grandes diferencias en la tolerancia de las plantas a metales potencialmente tóxicos (Tabla 5.4).

Figura 5.8 Concentración tóxica crítica (CTC10% ) de Zn en hojas de judía relacionada con un 10 % de disminución de la productividad (peso seco frutos). Modificado Ruano et al. (1991) Igualmente se pueden observar fuertes diferencias entre especies en su capacidad de absorber y de translocar estos metales. Según sus patrones de acumulación de

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metales pueden distinguirse fundamentalmente tres tipos de plantas (Baker, 1981): las acumuladoras, las indicadoras y las excluyentes (Figura 5.9).

Figura 5.9 Patrones de acumulación de metales en plantas en función de la disponibilidad en el suelo (Baker, 1981). Muchas especies vegetales muestran un patrón tipo acumulación en las raíces, mientras que el transporte hacia la parte aérea está restringido, observándose el típico patrón de exclusión. Como los procesos fotosintéticos son especialmente sensibles a la toxicidad de los metales y las raíces parecen capaces de almacenar mayores concentraciones de metales en forma inocua, esta dualidad en los patrones de acumulación se interpreta como un mecanismo importante en la tolerancia de metales pesados en muchas especies. Una relación lineal entre la concentración del metal en el medio y la concentración tisular es un fenómeno interesante, especialmente desde el punto de vista práctico ya que permite, a partir del análisis químico de las plantas, deducir la concetración en el sustrato. Esto puede ser de gran utilidad tanto en estudios de monitorización de la contaminación del suelo como en la prospección minera (Ernst, 1993; Wittig, 1993). De todas formas, estos diferentes patrones de acumulación pueden presentarse con valores más o menos elevados de concentraciones externas e internas. Un caso extraordinario son las llamadas especies hiperacumuladoras de metales. Estas especies concentran altos niveles de metales en sus partes aéreas alcanzando concentraciones más de cien veces superiores a las normales (Tabla 4). Ejemplos ya clásicos con Thlaspi caerulescens con ecotipos capaces de hiperacumular Zn y Cd o Ni, las múltiples especies hiperacumuladoras de Ni del género Alyssum, o Minuartia verna que alcanza concentraciones de hasta 0.7% de Pb y 1.7% de Zn en tejido seco (Brooks, 1998). MECANISMOS DE ABSORCIÓN Y TRANSPORTE Para las plantas terrestres superiores la principal vía de entrada de metales pesados es la raíz. Las paredes celulares de las células de la rizodermis forman la interfase inmediata en equilibrio con el espacio de la rizosfera. Desde este punto de vista, una característica esencial en la composición y función de las paredes celulares (Barceló et al., 2001) es la presencia de diversos polímeros muy especializados (sustancias pécticas, hemicelulosas, celulosa, diversas proteínas estructurales y enzimáticas) muchos de los cuales llevan cargas, fundamentalmente negativas, como es el caso definitivo de los grupos carboxilo del ácido péctico.

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De otra parte, la estructura de la pared celular forma un medio poroso e hidrófilo que permite la fácil difusión e intercambio de los iones y corresponde a la entrada del apoplasto. Parte de estos cationes se fijarán a las cargas negativas de la pared celular, otros serán transportados radialmente vía apoplasto y, otra parte podrá atravesar el sistema de membrana (plasmalema, membranas de los orgánulos, tonoplasto), entrando así en el simplasto. En la estructura adulta bien diferenciada de la raíz (Barceló et al., 2001), la endodermis y, en cierto modo, la exodermis juegan un papel clave en la interrupción y desviación del apoplasto hacia el simplasto. Por el contrario, en las partes jóvenes apicales en crecimiento aún no se ha formado esta barrera y hay mayor facilidad de flujo apoplástico continuo hacia la zona vascular. Esta zona apical de la raíz coincide también con la de máxima exudación de mucílagos y otros componentes de significación para la nutrición y la defensa de la planta. De este modo, por difusión, flujo en masa, interceptación e intercambio catiónico, los metales disponibles alcanzan fácilmente la raíz para seguir las rutas del apoplasto y del simplasto. Los mecanismos específicos de absorción por las membranas de metales, sean estos esenciales, beneficiosos o tóxicos, son aún muy poco conocidos. No obstante, se dispone ya de toda una serie de estudios cinéticos e incluso de avances sobre su naturaleza molecular y genética, sobre todo referido al transporte en membrana del Fe y del Zn, entre los esenciales, y de algunas evidencias más puntuales, sobre todo para el Cd (Pence et al., 2000) y Al, entre los tóxicos. Este tipo de estudios indican transportadores de metales con diferentes afinidades (alta y baja) y posibles relaciones moleculares de valor evolutivo, sobre todo del tipo de la denominada familia ZIP (“ZRT, IRT-like Protein”) de transportadores de metales (Guerinot, 2000). Pero aún se requieren avances importantes para poder interpretar de forma más completa los mecanismos de transporte de estos metales y su posible regulación funcional. En todo caso, las características y propiedades de la pared celular y de la membrana celular juegan un papel central y bien diferenciado en los mecanismos de captación y de absorción y, también como veremos luego, en la resistencia a los metales. Los estudios referentes al transporte de metales a larga distancia, desde la raíz hasta las hojas a través del xilema, se han centrado fundamentalmente en la forma de transporte y el posible papel de la transpiración en este proceso. Técnicamente es difícil obtener datos fiables de la especiación de los metales en el jugo del xilema. Según los resultados disponibles parece que el Zn puede ser transportados como ion libre Zn2+ o en forma de complejo con citrato o malato (Longnecker y Robson, 1993). Los aminoácidos parecen jugar un papel como forma de transporte del Cu; la histidina (Krämer et al., 1996) ha sido identificada como ligando de la abundante cantidad de Ni transportada en especies hiperacumuladoras de este metal. Diversos estudios han mostrado que la transpiración influye la tasa de transporte xilemático de metales pesados. No obstante, los resultados indican que no se trata simplemente de un flujo en masa que arrastra desde la raíz hasta las hojas todo metal que haya penetrado en el xilema. Así metales transportados en forma catiónica, como p.ej. Cd2+ están sometidos a fenómenos de intercambio catiónico. Además, en diversos casos, se ha observado un importante transporte lateral de metales hacia células de transferencia lo que puede reducir significativamente la concentración de metales en el jugo del xilema.

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También poco conocidos son los mecanismos que intervienen en el transporte de los metales en el floema, la vía de transporte responsable no solamente de la acumulación de metales en los frutos y semillas sino también de la translocación sistémica de metales absorbidos por las hojas desde la atmósfera. El transporte de metales por las células vivas del flema es difícil debido al pH alcalino y la presencia de altas concentraciones de P, lo que favorece su insolubilización. No obstante, en el caso del Zn y probablemente del Cd, la formación de complejos con diversos aminoácidos o con la nicotinamida facilitaría el transporte por el floema. 5.6 EFECTOS DELETÉREOS CRECIMIENTO La toxicidad por metales traza (cadmio, plomo) tienen alterado el crecimiento y la nutrición mineral en la haya (Fagus sylvatica) (Breckle and Kahle, 1992). El crecimiento de plántulas de arce plateado estaban afectadas por cadmio. El Cd y Ni redujeron el crecimiento, ruta fotosintética y distribución de carbohidratos en plantas de arroz. En raíces de trigo con el crecimiento inhibido por aluminio fue revertido por citrato. En cebada, también, el crecimiento de raíces estaba inhibido por metales traza, y por lo tanto, este tipo de crecimiento puede ser considerado como un parámetro para medir la tolerancia a la toxicidad por metales traza. La cuantificación de los efectos inhibidores de los iones de metales, en la elongación de raíces cuando se suministra una solución salina de metales simples es el método más común usado para monitorizar el crecimiento. Las ventajas de este método son: simple, rápido y fácil de realizar. El índice de tolerancia derivado de la proporción entre datos para tratamientos y soluciones control, se calculan y usan para caracterizar un individuo de la población. La tolerancia de Agrostis tenuis Sibth. a la hora de crecer en zonas mineras fue investigado exponiendo cultivos a distintas concentraciones de metales en la solución de nutrientes. Un índice de tolerancia fue calculado comparando la longitud de raíces con especies crecidas en soluciones sin metales traza. Las plantas superiores crecidas en sustratos conteniendo Cd, muestran alteraciones en el balance del agua. Durante la exposición a Cd durante mucho tiempo; casi todos los procesos fisiológicos se ven afectados y el reconocimiento de efectos primarios sería casi imposible. Las especies de Agrostis tienen diferentes mecanismos de tolerancia a metales traza. La toxicidad de metales traza ha cambiado la ultraestructura de plantas. El Cd indujo cambios estructurado y ultraestructura en el sistema vascular de estructurales y ultraestructurales en el sistema vascular de Phaseolus vulgaris. Thlapsi ochroleucum sufrió cambios en la ultraestructura dado a la exposición de exceso de cobre. FOTOSÍNTESIS La fotosíntesis se ve afectado invariablemente al exceso de metales traza. El Cd tenía efectos directos e indirectos en la fotosíntesis de remolacha (Beta vulgaris). El aparato fotosintético de espinaca sensible al cobre expuesto a exceso de cobre fue investigado por Baszynski et al. (1982, 1988). Además, la deficiencia de cobre en el aparato fotosintético de plantas superiores también fue demostrado. Ha sido demostrado

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que los metales traza interfieren con el funcionamiento del aparato fotosintético de plantas superiores. La fotosínteis fue inhibido en maíz y girasol por plomo. El Cd redujo la fotosíntesis y transpiración en maíz y girasol. Sin embargo, el maíz y la soja mostraron diferentes grados de sensibilidad en fotosíntesis y transpiración con exceso de Pb. El Cd cambia las reacciones lumínicas del cloroplasto. En trébol y lucerna, el Cd y Pb indujeron varios cambios en el intercambio de gases y en las relaciones hídricas. Las hojas de trigo de diferentes grados de sensibilidad a Cd y Ni como una función de la fotosíntesis y relaciones hídricas. En Zea mays, el Cd alteró la fotosíntesis y enzimas de la ruta fotosíntesis de la asimilación de sulfato y nitrato. El Zn y Cd inhibieron la fijación fotosintética de CO2 y la actividad de cloroplasto aislados de espinaca. El Zn inhibió el transporte de electrones en fotosíntesis en cloroplastos aislados de cebada. En Phaseolus vulgaris, el Zn afectaba a la RubisCO . El Cu ejerce efectos tóxicos en el fotosistema II (PSII) de cloroplasto de espinacas. Variando concentraciones de Cu tuvo efectos limitantes en fotosíntesis en plantas de arroz. En los cotiledones de rábano, el Cd indujo cambios en la composición y estructura de la clorofila a/b para la absorción de la luz. El Cd alteró la fotosíntesis, transpiración y la respiración oscuridad de hojas de arce plateado. Weigel (1984, 1985) demostró la inhibición de la reacciones fotosintéticas en cloroplastos intactos aislados en las reacciones fotosintéticas del mesófilo de protoplastos por Cd. El Pb inhibe el PIS en cloroplasto aislados. El Cd influye en la ruta fotosintética del arroz. El Cd y Ni afectaron la fotosíntesis y a enzimas del ciclo de reducción de carbono en el guisante. La espectroscopia de fluorescencia ha sido empleado recientemente para estudiar la función tóxica de los metales traza en concentraciones bajas. Las reacciones fotoquímicas de cloroplasto se inhibieron en plántulas de maíz con bajas concentraciones de Cd cuando fueron investigados, analizando el trasporte de electrones y cambios en la producción de fluorescencia. Similarmente, la fluorescencia en hojas enteras fue usada como una técnica para mediera la tolerancia de las plantas a metales traza. En Phaseolus vulgaris, las funciones fotosintéticas fueron investigadas mediante análisis de fuorescencia. El Cd es un inhibidor efectivo en le metabolismo de la planta, particularmente de procesos fotosintéticos en plantas superiores (Tabla 5.5). La relación lineal entre la ruta fotosintética y la inhibición de la transpiración sugieren que la respuesta a Cd puede ser debido al cierre de estomas. El Cd inhibe la ruta fotosintética incrementando tanto la resistencia del estoma y mesófilo a la absorción de CO2. En plantas superiores, la ruta fotosintética es reducido por la acumulación de metales traza en las hojas. La capacidad de fijación de CO2 fotosintético de tipo A se redujo un 50% después de cinco minutos de incubación en mezclas conteniendo

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diferentes concentraciones de metales traza. Bazzaz and Gouindjee (1974) mostraron una inhibición del 50% de los electrones del PIS después de diez minutos de incubación de cloroplastos en oscuridad de Zea mays con 0,2 micrómetros de nitrato de cadmio.

Tabla 5.5 Efecto del Cd sobre características fotosintéticas, funciones de intercambio de gases y cloroplastos de angiospermas seleccionadas. En Zea mays la inhibición simultánea de fotosíntesis y transpiración por Ni, sugería que el principal efecto del metal debería ser en la función del estoma. El Cd primeramente afectó a la pigmentos fotosintéticos antes que a la función fotosintética. El Cd y el Pb decrementan la cantidad de clorofila a/b en plantas superiores. Generalmente las carotenoides fueron menos afectados por los metales traza, resultando en una más baja proporción entre clorofila y carotenoides en plantas superiores. Tanto el cierre de estomas permanente como el aumento de producción de etileno pueden ser responsables de la inducción de senescencia por Cd. El Cd inhibe al PSII, probablemente en el sistema de hidrólisis del agua en el nivel de manganoproteínas.. El Cd en bajas concentraciones también actúa como un inhibidor de la fotofosforilación en cloroplastos de espinacas. De acuerdo con Weigel (1985), el Cd afecta a la fotosíntesis por inhibición de distintas etapas de la reacción del ciclo de Calvin; y no por interactuar con reacciones fotoquímicas en la membrana tilacoidal. El principal sitio de acción de los metales traza era a nivel del sistema de rotura de agua en el lado de oxidación del PSII. Tripathy and Mohanty (1980) describieron el sitio de inhibición más cercano del centro de reacción de PSII y un sitio adicional de inhibición de plastoquinona. Los cationes bivalentes juegan un papel más importante en la activación de la RubisCO y en el equilibrio entre CO2 y O2 unido por esta proteína. La inhibición de la ruta de fijación de CO2 se observaron el Phaseolus vulgaris intactos después de tratamiento con Zn. Las reacciones fotosintéticas en la memebrana en

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protoplastos del mesófilo aislados no fueron dañados por la concentración de Cd, que drásticamente inhibieron la fijación de CO2. La fotofosforilación no cíclica era muy sensible a metales traza in vitro. La concentración tóxica era de 20 micromolares para Pb y de 5 micromolares para Hg. El Cu y Cd inhibieron la fotofosforilación cíclica y no cíclica en 1,7 micromolar y 45 micromolar, respectivamente. La exposición durante largo tiempo de una planta a Cd pueden afectar a la clorofila con consecuencias tanto para el desarrollo de cloroplastos en hojas jóvenes como en la inhibición de fotosíntesis en hojas adultas. En plantas tratadas con Cd, el decrecimiento del área de la hoja no se debía solamente al tamaño reducido de la célula. Casi todos los cloroplastos estaban intactos o ligeramente dañados, y algunas células desarrollaron cloroplastos hinchados con varios platos. El Cd redujo la tasa fotosintética, la clorofila, los pigmentos accesorios y el PSII; pero el PSI no estaba afectado. En cloroplastos aislados, el Pb inhibe el PSII. La fina estructura de cloroplastos en plantas tratados con Cd fue degenerada; similar a la respuesta de la senescencia marcada por el acontecimiento de grandes plastolóbulos y desorganización de la estructura lamelar. El Cd alteró el contenido del ácido graso trans-Δ3 fosfatidil glicerol, aceptado generalmente como un componente responsable de la oligomerización del complejo proteínico de clorofila. El desacoplamiento de la fotofosforilación no ocurre en presencia de Cd, ya que no se observa la disipación del gradiente de protones a través de la membrana. En arbustos, la clorosis no se observó en las hojas primarias, pero los estudios de microscopía electrónica revelaron alteraciones en la disipación y apilación de la membrana tilacoidal, ya que en cloroplasto de hojas trifoliadas estaban más afectados que los de hojas primarias. Poschenrieder et al. (1989) informó de un significante aumento del ácido absícico (ABA) en las hojas del arbusto tras 120 horas de exposición a Cd. El Cd inhibió la acumulación de ABA durante el secado de hojas. Los autores también concluyeron que los efectos directos de Cd en hojas pueden explicar tanto por el decrecimiento de la célula como el aumento de la resistencia estomática. El decrecimiento de la extensibilidad de la pared celular puede ser un motivo de la reducción de la expansión celular. Cataldo et al. (1981) investigaron la distribución del comportamiento de Cd en exudados del xilema y tejidos, eran sugestivas de cambios en la forma química que resulta del complejo con ligandos producidos por la planta que participan en el transporte y metabolismo. En plántulas de grano de soja el Cd interfiere con la respiración y actividad de varios enzimas con la respiración. ESTOMAS Los movimientos estomáticos proveen a la hoja una oportunidad de cambios de presión parcial de CO2 y el nivel de transpiración. Incremento en la resistencia estomática en plantas tratados con Cd han sido demostrado. Interferencia con el funcionamiento estomático es considerado como un modo de acción primaria de Cd y varios otros metales. La inhibición de la apertura estomática en plantas expuestas a Cd pueden depender tanto de la concentración de Cd como el tiempo de exposición, y también en el nivel de toxicidad sufrida por la planta. Un efecto directo del Cd sobre el ion y movimientos del agua en las células de la guardia todavía tiene que ser provocado por no estar excluído, particularmente en relación a K y Ca. Durante la absorción del Cd se

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retienen en las raíces solamente el 2% del Cd acumulado se transporta a las hojas, y el 8% es transportado a semillas durante el llenado de semillas. ENZIMAS Las enzimas tolerantes y sensibles a metales traza de Silene cucubalus y sus interacciones con algunos otros metales traza, in vitro e in vivo, han sido investigados. Cd, Ni y Cr se ha demostrado que alteran la actividad de enzimas hidrolíticas responsables de la movilización de reservas alimenticias en semillas de guisantes germinando. El Cd influyó en el nivel de respiración y actividad de varios enzimas en las plántulas de soja. Se sabe que el Cu interfiere con las enzimas oxidativas de la Avena (Avena sativa). El Zn inhibe la actividad de la RUBP carboxilasa sin afectar a la actividad oxigenasa. La fitotoxicidad del suelo es reflejado por el aumento en la actividad de enzimas tales como la enzima málica, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y la peroxidasa en la hoja. El Cd ejerce su toxicidad a través de daños en la membrana y la inactivación de enzimas posiblemente a través de la reacción con grupos SH de proteínas. Esta inactivación SH fue sugerida como explicación a los pequeños efectos inhibidores de Pb y Cd en la actividad de la enzima RUBP carboxilasa y la fosforribuloquinasa in vitro. La total inhibición de estas actividades enzimáticas sólo se observó en la presencia de concentraciones micromolares de metales. Los metales traza inhibe la actividad ATPasa y también interfiere con la integridad de la membrana. Sheoran et al. (1990) investigaron el efecto del Cd y Ni en fotosíntesis, y también enzimas del ciclo reductor del carbono (PCR) en granos de Cajanus cajan; concluyéndose que el Cd y Ni reducen la fotosíntesis indirectamente a través del decrecimiento del contenido en clorofila y afecta a la conductancia estomática y el transporte de electrones más que la enzima del ciclo PCR. La inducción de la peroxidasa fue observada en Glycine max y Phaseolus vulgaris. El Cd indujo actividades peroxidasa en raíces y hojas de arroz; las raíces mostraron de 10 a 20 veces más actividad que las hojas. La localización del Cd en vacuolas, en síntesis de fitoquelatinas (PCs), y unión a metales traza ocurre principalmente en raíces. La inducción peroxidasa es una respuesta general de plantas superiores a la absorción de cantidades tóxicos de metales tales como: Cd, Cu, Pb, Zn y Ni. Un aumento en la actividad peroxidasa de la hoja de algunas plantas silvestres fue atribuido al contenido de Pb de automóviles. En adición de peroxidasa, las actividades de otras enzimas también incrementa en Phaseolus vulgaris cuando son tratadas con Zn y Cd. La toxicidad de metales traza se manifiesta de varias maneras. La disrupción de la función de la membrana es una de los síntomas significativos de la toxicología de los metales traza. En Silene cucubalis tolerantes y sensibles fue demostrado con Cu, que actúa sobre la composición de ácido graso y peroxidación de lípidos en las raíces alterando la asimilación de agua y solutos. En arroz, el Cd y Ni actúan en la composición lipídica en la actividad y en la fluidez de la membrana plasmática. Daños de la membrana debido a la peroxidación lipídica causada por metales, es mediada por radicales de oxígeno activado; y pueden ser modificado por la inducción de enzimas específicas como peroxidasa, superóxido dismutasa y catalasa. El incremento de

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peroxidasa es generalmente considerado como una indicación del envejecimiento de la planta. Basado en el incremento de actividad de peroxidasa y enzimas hidrolíticas en Glycine max tratadas con Cd, se propuso que el Cd causa una respuesta de la senescencia anticipada. La concentración de almidón y azúcares en las hojas de dos zonas industriales de Suecia contaminados, indicando una inhibición de la hidrólisis de almidón y sacarosa. También se ha demostrado de que el cromium decrece la actividad de enzimas hidrolíticos: ribonucleasas, invertasas, etc, en germinación de la semilla del guisante. ESTRÉS HÍDRICO El Cd induce la disminución de la resistencia al estrés por agua en arbustos. El trébol cambiarán la relación hídrica dado el exceso de Cd y Pb. Cambios inducidos por el Cd en la economía del agua en las semillas fueron atribuidas en la involucración de etileno. Cd y Ni afectaron negativamente la relación de agua en hojas de trigo de diferentes niveles de inserción. El Cd generalmente decrece la tolerancia al estrés hídrico de las plantas causando pérdidas de turgencia en contenidos relativamente más altos de agua, que el potencial de agua en la hoja que en las plantas no tratadas. El Cd incrementa el volumen de elasticidad y por lo tanto disminuyó la elasticidad de la pared celular. Baja elasticidad de la pared celular es una importante causa de la baja tolerancia al estrés hídrico en plantas intoxicadas por Cd. Las plantas tratadas mostraban niveles de transpiración menores y de mayor resistencia estomática. La obstrucción del xilema de plantas inducidas por los productos de degradación de la pared celular han sido sugerida como la causa de menos transporte de agua. La marchitación de plantas tratadas con Cd se debe a la disminución del transporte de agua y probablemente a la reducción de la adsorción de agua ( principalmente por la reducción del crecimiento de raíces). Tanto el Pb como el Cd afectaba negativamente al nivel de agua y al intercambio de gases en lucerna y trébol. Sin embargo, los potenciales de agua medidos y el decrecimiento de la eficiencia del uso del agua calculada después del tratamiento con Pb; indicaban un gran cierre estomático. La transpiración era excepcional. Tratamiento con concentraciones similares de Pb y Cd en hojas reveló que el Pb produce un severo estrés hídrico; mientras que el Cd causó solamente un ligero estrés por agua. Bajas concentraciones de Cd en ciertos experimentos incrementaban la transpiración. Los niveles de transpiración cayeron como resultado de daños en las raíces debidos a la toxicidad del Cd. El comportamiento de transpiración indica que, el efecto de la presión de vapor de agua en el nivel de apertura estomática es pequeña. Bajo ciertas condiciones, algunos metales traza reducen la transpiración de plantas mediante interferencia directa con la regulación estomática. La luz tuvo un fuerte efecto en los niveles de transpiración de las plantas tratadas con Cd. El Cd influyó en la transpiración en plantas más a través de su efecto sobre el flujo de agua a través de raíces que sobre sus efectos en la apertura estomática. INFLUENCIA DE CATIONES La inactivación de las enzimas que participan en la permeabilidad selectiva de membrana tales como ATPasas, por el Cu fue demostrado por Veltrup (1982). También

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se ha informado que la permeabilidad de las membranas depende del nivel de la peroxidación lipídica. Se cree que el preceso de peroxidación lipídica se inicia con libres radicales, tales como radicales hidroxilos generado en la reacción Haber-Weiss y radicales peróxido producidos durante la descomposición de hidroperóxidos orgánicos.

5.7 MECANISMOS DE DEFENSA FITOQUELATINAS Y METALOTEÍNAS Las fitoquelatinas (PC) o poliglutamilcisteinil glicina juega un papel importante en la tolerancia frente a metales. Las plantas que crecen en un área de residuos mineros han sintetizado invariablemente los péptidos que secuestran a los metales. Quiere decir, que las PC son péptidos que se unen a metales traza de plantas, cuyo precursor es el glutatión y cuya reacción es catalizada por la glutamil cisteina dipeptidil transpeptidasa específica (PC sintasa). Un tipo de péptidos unificadores de metales traza de plantas están considerados como análogos a metaloteínas (MT). Fabales sintetiza homofitoquelatinas para secuestrar metales traza usando homoglutatión como precursor. En Poáceas, los péptidos inducidos por metales trazas son de hidroximetil fitoqueltina. El sulfito lábil son componentes esenciales en complejos de fitoquelatinas. Un estudio en gel de electroforesis fue desarrollado para detectar fitoquelatinas. En Datura innoxia, el precursor biosintético de la familia de poliglutamil cisteinil glicina fue experimentalmente establecido e implicado en la tolerancia a metales. La inducción del secuestro de metales por fitoquelatinas en cultivos de células fue demostrado. Las enzimas de las plantas intoxicadas por metales y las apoenzimas que requieren metales han sido reactivados por PCs. La síntesis de filoquelatinas y glutatión en respuesta de metales en células de tomate y raíz de maíz, establecieron una relación precusor-producto. Algunas dudas han sido expresadas sobre si las PCs están involucradas en diferentes tolerancias a metales, o si meramente reflejan la tensión a presión impuesta por el metal. La segunda reunión internacional de metaloteínas (MT) y proteínas de bajo peso molecular sugirió una revisada nomenclatura por metaloteínas. Los polipéptidos pueden ser determinados como metaloteínas cuando comparten varios de las siguientes características: bajo peso molecular, alto contenido en metales, alto contenido en cisteína con la ausencia de aminoácios aromáticos y histidina; una abundancia de secuencia Cys-X-Cys donde X es un aminoácido diferente de Cys. Fueron considerados también los siguientes polipéptidos con tioles: Clase 1: polipéptidos con localizaciones de cisteína emparentados con metaloteínas. Clase 2: polipéptidos con localizaciones de cisteínas con relación lejana a aquellas metaloteínas. Clase 3: atípico, no transladan tioles de polipéptidos. En las clases 1 y 2 pero no la 3, las metaloteínas han sido aisladas de una gran variedad de animales y algunos hongos; sin embargo más de 200 especies de plantas testadas hasta ahora, junto con algunas hongos se conocen con metaloteínas de clase 3. Algunas PCs fueron sintetizadas enzimáticamente por la enzima PC sintaza, una

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proteína de 25 KDa que traspasa un γ-glutamil cisteína de una molécula GSH y lo acepta a otra GSH en plantas superiores. Loffler et al. (1989) purificó la PC sintasa en cultivos de células de Silene cucubalus. Esta enzima cataliza la formación de péptidos que quelan metales de glutatión en presencia de iones de metales traza. La incubación de PCs bajo condiciones estándar en ausencia de iones de metales no llevan a la formación de los péptidos de PCs. Sin embargo, al adicionar Cd a la mezcla de incubación se reactiva la PC sintasa. Las PCs se consideran que tienen un importante papel en la homeostasis en la célula. La diamina oxidasa inactiva enzimáticamente y la anhidrasa carbónica fueron reactivados por complejos de Cu y Zn respectivamente. Cuando el metal quelante de dietil ditiocarbamato fue añadido a la purificación de diamina oxidasa, en plántulas de guisante, quitó los iones de Cu de la enzima. Sin embargo, la adición de varias concentraciones de sulfato de cobre a la enzima dio como resultado la máxima restauración de la actividad hasta un 80%. Las PCs también están implicadas en la detoxificación de metales pesados. La síntesis de PCs está inducida no solamente por metales traza sino también por una variedad de aniones tales como SeO42-, SeO32-, y AsO4-3. Las PCs han demostrado unir Cd y Cu directamente; y se cree que pueden unir Pb y Hg por competición con Cd. También se piensa que los metales traza causan la muerte de las células vegetales por interferir en la actividad de los enzimas y posiblemente con proteínas estructurales con grupos sensibles al metal como –SH o grupos histidina, llevando a la inactivación de proteínas catalíticamente activas. Por lo tanto, las plantas como estrategia adaptativa pueden haber desarrollado mecanismos bioquímicos y fisiológicos para tolerar la toxicidad de metales. Las PCs reducen la toxicidad citoplásmica a ciertas concentraciones de metales traza mediante complejación o unión. Ahora se cree que complejos PC-metal son menos tóxicos para el metabolismo celular de la planta que iones de metal libre. Pruebas directas hacia el papel que desempeña las PCs en la protección de las enzimas de la planta fueron presentados por Kneer and Zenk (1992) usando cultivos celulares en suspensión de Rasvolfia serpentina, tratándola con 100 micromolar de cloruro de cadmio y 100 microCi de cloruro de cadmio. Ellos confirmaron que una serie de enzimas de plantas sensibles al metal, tales como alcohol deshidrogenasa, glicerolaldehido 3-fosfato, nitrato reductasa, RubisCO y ureasa; toleran el Cd en forma de complejo con PCs en cantidades de 10 a miles de veces mayores de la que son toleradas si el Cd está como ion libre.

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Figura 5.10 Las PCs reactivaron la nitrato reductasa envenenada por metales in vitro miles de veces más que quelantes con glutatión y citrato, así probaron el extraordinario potencial de secuestro de las PCs. Se encontró que poblaciones de plantas sensibles y tolerantes al Cu producen PCs cuando se exponen a Cu. Sin embargo, el contenido total no proteínico de las raíces que respondían a la concentración externa de Cu eran dependiente de la población. Cuando poblaciones de Silene vulgaris son expuestas a su propia concentración sin efecto o a un 50% de concentración efectiva de Cu para crecimiento de raíces, tanto plantas tolerantes como no tolerantes, sintetizaran la misma cantidad de PCs en el ápice de la raíz. La raíz es la principal diana del Cu. Por lo tanto, se concluyó que las PCs no están definitivamente involucradas en la tolerancia diferencial al Cu en S. vulgaris. Variaciones en la producción de PCs-SH parece ser una mera consecuencia de variaciones en la tolerancia. La tolerancia diferencial al Cu en la planta parece depender de la producción de PCs. GLUTATIÓN Es el precursor de la síntesis de complejos de unión a metales. Se informa de que el Cd cambia al glutatión y las PCs en plántulas de maíz y guisante. El sulfato, cloruro y selenato bajo incubación durante poco tiempo en oscuridad, influyen en el contenido de glutatión en los discos de la hoja de espinaca. La regulación de los contenidos en tioles y alteración del pool de tioles en maíz expuestas a Cd puede ser regulado por FISIOLOGÍA VEGETAL AMBIENTAL

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intermediario y efectores de la síntesis de glutatión. Evidencias directas de la involucración de glutatión en la síntesis de PCs fue demostrado en las células de tomate. Recientemente, un nuevo homólogo de glutatión, ácido glutamil cisteinil glutámico fue descubierto en plántulas de maíz expuestos a Cd. El glutatión se agota debido a la inducción de PC por Cu, causando estrés oxidativo en Silene cucubalis.

5.8-RESPUESTAS DE LAS PLANTAS A LA TOXICIDAD DE LOS METALES PESADOS SÍNTOMAS VISIBLES La entrada y situación crítica de toxicidad en la planta se inicia en las células de la raíz. La inhibición del crecimiento longitudinal de la raíz es, por regla general, uno de los primeros síntomas externos del efecto tóxico y la medida de la tasa relativa de la elongación radicular suele usarse como indicador temprano (Índice de Tolerancia, IT) para diferenciar entre genotipos sensibles y tolerantes. Longitud raíz en medio con exceso de metal IT= 100 x Longitud raíz en medio control La elongación de las raíces se debe al conjunto coordinado de los procesos de división celular y alargamiento celular que se produce en la zona apical de las raíces. Es precisamente en esta zona apical donde se inicia el efecto tóxico de la mayoría de los metales. La inhibición de la división celular en el meristemo apical y/o de la elongación celular no solamente producen la reducción en la longitud total del sistema radicular sino en muchas ocasiones también inducen un engrosamiento radial y un estímulo en la producción de raíces laterales que debido al efecto tóxico del metal tampoco llegan a crecer longitudinalmente. El resultado de este patrón anómalo de crecimiento es un sistema radicular corto, achaparrado, sin apenas pelos radiculares. Este sistema radicular es poco eficiente en la exploración del suelo y tienen una capacidad muy restringida de absorción de agua y de nutrientes esenciales. Consecuencias indirectas de estas limitaciones son la mayor sensibilidad a la sequía y a la deficiencia mineral, especialmente de fósforo y de potasio de estas plantas. Sólo en casos excepcionales de contaminación atmosférica o de exceso de metales esenciales relativamente móviles como por ejemplo el Mn, los efectos primarios de toxicidad se originan inicialmente en la parte aérea. En todo caso, la rica diversidad de compartimentos y del metabolismo de la célula vegetal da lugar a una gran diversidad de respuestas biológicas, unas claramente tóxicas y degradativas y otras, como veremos después, en ciertas especies o genotipos, pueden tener una función de defensa. Posteriormente esta situación inicial de toxicidad celular podrá alcanzar, según las dosis y circunstancias, a los diversos órganos y causar así alteraciones más generales en las diversas funciones de la planta y en su regulación. Estos efectos secundarios o indirectos originan numerosos síntomas visuales de toxicidad que sólo en pocas ocasiones son lo suficientemente característicos para permitir un diagnóstico certero de semejantes a la inducida por deficiencia de hierro, manchas pardo rojizas de naturaleza fenólica en tallos, peciolos, hojas y necrosis foliar.

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En casos crónicos o de niveles muy críticos la toxicidad puede conducir a la senescencia de diversos órganos e, incluso, a la muerte de la planta. Así como los experimentos a corto plazo son esenciales para el conocimiento de los mecanismos primarios de toxicidad y las bases moleculares de los mecanismos de tolerancia, los estudios a largo plazo del comportamiento de las poblaciones son de gran interés desde el punto de vista ecológico, de la evolución de los genotipos y de los procesos de adaptación.

RESPUESTAS A NIVEL METABÓLICO Y CELULAR PARED CELULAR Las paredes celulares son el primer compartimento celular en contacto con los metales pesados y una proporción muy significativa de la cantidad total absorbida por las raíces se halla en este espacio apoplástico. No obstante, la mayor parte de esta fracción de iones está meramente absorbida de forma reversible a las cargas negativas de la pared y puede ser desplazada por tratamientos con soluciones de intercambio catiónico. Una proporción variable de la concentración total del metal puede hallarse en forma precipitada o en forma cristalina en las paredes de las células epidérmicas o del córtex exterior. Clásicamente se han intentado relacionar las paredes celulares con los mecanismos de defensa o de tolerancia a los metales tóxicos. Ello, sin embargo, no implica que alteraciones en las propiedades físico-químicas de las paredes celulares no puedan estar involucradas en la inhibición del crecimiento por el alargamiento celular de las raíces. El Cd y, especialmente, el Al reducen la extensibilidad y la elasticidad de las paredes celulares. Estos efectos negativos más que provocados por un entrecruzamiento directo de los iones metálicos con los grupos carboxilo de las sustancias pépticas de la pared (rigidez de la pared por “cross-linking”) podrían ser causados por trastornos enzimáticos en la biosíntesis de los constituyentes macromoleculares de la pared, por cambios en la distribución de cargas y en el ensamblaje de los polímeros, por cambios en la distribución de los microtúbulos y del sistema endomembranoso y/o cambios en la adhesión entre pared y membrana citoplasmática. MEMBRANAS LIPÍDICAS Y ESTRÉS OXIDATIVO A pesar de las múltiples posibilidades de interacción entre los iones metálicos y las paredes celulares, éstas no constituyen una barrera insuperable y los iones potencialmente tóxicos contactan seguidamente con la membrana citoplamática. El plasmalema no solamente juega un papel central en el control de la absorción de los metales pesaos hacia el interior de las células y, por ende, en los mecanismos de tolerancia, sino también es considerado el orgánulo clave en el síndrome tóxico. No obstante, la rotura incontrolada de las membranas y la pérdida de compartimentación celular no son, ni mucho menos, acontecimientos tempranos en el síndrome de toxicidad de todos los metales. La apoptosis y/o necrosis son, al igual que en otras

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situaciones de estrés excesivo y letal, el síntoma final de la muerte celular. Los efectos iniciales sobre la funcionalidad de la membrana citoplamática son mucho más sutiles y dependen largamente del tipo de ion tóxico y de la intensidad del estrés. Según la hipótesis de Kinraide, basada en el cálculo de las actividades iónicas en la superficie externa del plasmalema de las células radiculares de acuerdo con el modelo de Gouy-Stern (Kinraide, 1994), la interacción de los cationes metálicos con las cargas negativas del lado exterior del plasmalema parece jugar un papel importante en las fases iniciales del síndrome tóxico. Estas cargas negativas, en condiciones normales están ocupadas por una proporción equilibrada de cationes tales como Ca2+ y Mg2+ que contribuyen a la estabilidad de las membranas. La presencia de metales tóxicos, como por ejemplo Al3+, o incluso una excesiva acidez (toxicidad de H+, protones, a pH inferior a 4,1) desplazaría estos cationes esenciales desestabilizando las membranas y causando múltiples disfunciones. Esta hipótesis del desplazamiento mutuo de los cationes de lugares de unión en el lado externo del plasmalema explicaría, a su vez, el fenómeno frecuentemente observado que iones potencialmente tóxicos pueden aliviar, al menos transitoriamente, el efecto tóxico de otros cationes (p.ej. bajas concentraciones de Al3+ alivian el efecto nocivo de una exceso de H+) figura 5.11 También habla a favor de esta hipótesis el hecho que inicialmente la inhibición del alargamiento radicular causado por un exceso de protones o ciertos iones metálicos sea rápidamente reversible por la adición de Ca2+ u otros iones metálicos.

Figura 5.11 Crecimiento longitudinal de raíces de diferentes variedades de maíz en respuesta a exposición de 24h a H+ (pH 4,3) y Al3+ (actividad 8,8µM). La variedad BR 201 F es tolerante a H+ pero sensible a Al3+. En Adour 250 (sensible a H+ pero más tolerante a Al) el efecto tóxico de los protones es aliviado parcialmente por Al3+. Según Llugany el al. (1995) También cationes como los del Cu y del Hg parecen comprometer severamente la funcionalidad de las membranas según indica el fuerte aumente del eflujo de K+ y, en el caso específico del Hg, la rápida inhibición de los canales hídricos (acuaporinas). La alta afinidad de estos metales por los grupos sulfidrilo parece estar en la base del mecanismo tóxico. Efectivamente, este tipo de daños rápidos se observa típicamente en la toxicidad por Cu y Hg, cationes de la clase B con alta afinidad para grupos SH, pero no con niveles excesivos de Cd o Zn (Ernst, 1998) de menor índice covalente.

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Otras interacciones con mayor o menor especificidad, son las relacionadas con la inhibición competitiva o no de los canales iónicos y la inhibición por parte de metales tóxicos de las ATPasas-Mg2+ y H+. Los múltiples efectos tóxicos de los metales pesados sobre las membranas frecuentemente se han atribuido a la generación de radicales libres, lo que provocaría la peroxcidación de los lípidos de estas membranas. Sin embargo, la peroxidación de lípidos no siempre parece ser el mecanismo primario responsable de la disfunción de las membranas o de la inhibición del crecimiento, al menos en sistemas de experimentación con niveles de toxicidad significativos desde el punto de vista medioambiental. El estrés oxidativo que acompaña inevitablemente a los procesos de senescencia y muerte celular y que son efectos tardíos comunes a toda fase degenerativa de estrés, no hay que confundirlos con los fenómenos de estrés oxidativo inducidos de forma específica por algunos cationes de metales de transición como el Cu. Pueden distinguirse diversos mecanismos mediante los cuales los metales pesados pueden intervenir, de forma directa o indirecta, en la generación de radicales libres y de especies reactivas de oxígeno que, a su vez, pueden dañar severamente las membranas, los ácidos nucleicos y la fotosíntesis: transferencia directa de electrones, inhibición de la fotosíntesis y disminución de la capacidad antioxidante de las células.

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Figura 5.12 Peroxidación de ácido graso como reacción inicial de destrucción de membranas. Modificado según Elstner y Hippeli (1995). FOTOSÍNTESIS Múltiples mecanismos pueden estar implicados en la disfunción de la fotosíntesis bajo condiciones de estrés por metales pesados; y se ha observado inhibición de la asimilación de CO2 tanto por aumento de la resistencia estomática como de la resistencia mesofílica. Por regla general, plantas expuestas a concentraciones tóxicas de Cd, Al, Cu, Cr, Ni, Zn o Hg muestran cierre estomático. Aunque no se puede descartar la posibilidad de efectos directos de los iones tóxicos sobre los estomas, bajo la mayoría de las condiciones los efectos parecen debido más bien a un estrés por déficit hídrico inducido por los metales a causa de sus efectos tóxicos iniciales en las raíces y su interferencia con la absorción y translocación del agua. La importancia relativa de la reducción de la apertura estomática en la inhibición de la fotosíntesis inducida por metales pesados seguramente depende del tipo de metal. Cd y Al inhiben, con similar intensidad, la reducción en la eficacia del uso del agua, lo que sugiere que factores diferentes a los meramente relacionados con el cierre de estomas juegan un papel en la inhibición de la fotosíntesis por estos metales. El incremento de la resistencia mesofílica a su vez puede deberse a múltiples causas directas e indirectas: a) inhibición de la cadena de transporte de electrones a nivel de PSII (Cd, Co, Cu, Hg, Ni, Pb, y Zn), y del PSI (Cu, Pb, Zn) o por interacción con otros componentes intermedios; b) inhibición de enzimas del ciclo de Calvin tales como RubisCO (p.ej. Zn, Cu, Cd, Mn), PEP carboxilasa (p.ej. Cd, Ni, Cu, Zn), fructosa 6-fosfato-diquinasa; y c) inhibición de la síntesis de clorofila y alteraciones en la estructura de los cloroplastos. Las alteraciones en los cloroplastos pueden originarse por inhibición del desarrollo de los cloroplastos en tejidos jóvenes en formación (p.ej. por inducción de deficiencia de Fe o de otros nutrientes esenciales) o por procesos degradatorios relacionados con la inducción e senescencia prematura a causa de la formación acelerada de radicales libres o alteraciones hormonales como la inducción de formación de etileno. MECANISMOS DE RESISTENCIA Por regla general, las plantas adaptadas a suelos con alta disponibilidad de metales pesados muestran resistencia específica al metal o metales que se hallan en exceso en el suelo sobre el cual crecen. Los mecanismos implicados en esta resistencia parecen específicos para cada metal. Mientras que la resistencia simultánea a varios metales presentes en el sustrato (resistencia múltiple) es un fenómeno común en las metalofitas que han evolucionado sobre sustratos con elevadas concentraciones de varios metales, la corresistencia o resistencia cruzada (resistencia a un metal no presente, en abundancia en el sustrato de la procedencia de la planta, conferido por la resistencia a los presentes en exceso) suele ser poco frecuente. Como en otras situaciones de estrés, en el caso de exceso de metales pesados pueden distinguirse básicamente dos tipos de mecanismos de resistencia: prevención de

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la entrada o excreción de iones potencialmente tóxicos (concepto de “avoidance” o resistencia en sentido estricto según Levitt)(Levitt, 1980) y tolerancia a elevadas concentraciones internas. De todas formas, aquí la distinción entre mecanismos de prevención y tolerancia resulta algo artificial más si tenemos en cuenta que la unión de metales a diversos ligandos y la compartimentación subcelular implican a su vez la prevención de la toxicidad en el simplasto a pesar de concentraciones totales internas elevadas. 1. Mecanismos de prevención (permiten mantener una baja concentración en el simplasto): -Reducción de absorción de especies tóxicas mediante exudación de sustancias hacia la rizosfera. -Inmovilización en el apoplasto. -Secreción, volatilización y eflujo. 2. Mecanismos de tolerancia (permiten soportar altas concentraciones en el simplasto): -Formación de complejos con ligandos orgánicos (desintoxicación). -Acumulación en vacuola (compartimentación). -Enzimas tolerantes 5.9 FITORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR METALES PESADOS La persistencia extremadamente larga de la contaminación por metales pesados en los suelos hace necesario el desarrollo de eficientes métodos de restauración. El uso de plantas resistentes a metales pesados, junto con enmiendas adecuadas es esencial para una tecnología de restauración emergente conocida bajo el nombre de fitorremediación o fitorrestauración. En la fitorrestauración de suelos contaminados por metales pesados pueden distinguirse fundamentalmente cuatro modalidades (Saxena et al., 1999; Barceló, 2003): FITOEXTRACCIÓN Esta técnica consistente en la reducción de la concentración de metales pesados o de otros contaminantes que se hallan en exceso en el suelo mediante el cultivo de plantas capaces de acumular en sus partes aéreas grandes cantidades de estas sustancias. La fitoextracción requiere plantas que combinen alta capacidad de acumulación con elevada tolerancia y rápida producción de biomasa. Especies hiperacumuladoras de metales como por ejemplo Thlaspi caerulescens cumplen muy bien con los dos primeros requisitos, pero muchas desafortunadamente, crecen lentamente. Para ello, aquellas especies tolerantes pero no hiperacumuladoras que alcanzan menor concentración de metales pero producen mayor biomasa también pueden tener interés. RIZOFILTRACIÓN Esta técnica se basa en la limpieza de agua contaminada mediante la absorción de metales en las raíces u otros órganos sumergidos de plantas tolerantes. Las plantas empleadas con este fin deben tener gran superficie de absorción, ser tolerantes a los

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contaminantes en cuestión y soportar bien la hipoxia. Ejemplos prometedores son, entre otros, Phragmites australis y diversas especies de Salíx, Populus y Lemna. FITOVOLATILIZACIÓN La técnica se basa en el poder de absorción y volatilización de metales de algunos organismos. Ejemplos de esto son las especies de Astragalus para el Se o plantas de Nicotiana o Brassica transformadas con genes bacterianos para la volatilización del Hg. FITOESTABILIZACIÓN Consiste en el uso de plantas que gracias a sus raíces y exudados radiculares aumentan la fijación de los metales sobre los componentes matriciales del suelo. De esta forma se reduce la solubilidad y biodisponibilidad de los metales y se evita la contaminación de acuíferos por lixiviación. Todas estas modalidades de la fitorrestauración requieren de material vegetal que combine, en mayor o menor grado, rápido crecimiento con tolerancia y buena capacidad de absorción de metales muy diversos. Además estas plantas deben adaptarse a las condiciones climatológicas de la zona a restaurar. La fitorrestauración como tecnología aún experimental está estimulado, indudablemente, las investigaciones básicas en el campo de la respuesta de las plantas frente al estrés por metales pesados y su interacción con otros factores ambientales limitantes del crecimiento y desarrollo vegetal.

5.10-CONCLUSIONES Durante los últimos años, indiscutiblemente ha habido claros avances en el conocimiento de los mecanismos de toxicidad y tolerancia en las plantas de los metales pesados. No obstante, para poder interpretar adecuadamente el grado de especificidad de cada mecanismo para los diferentes metales y plantas se requiere aún de avances conjuntos fisiológico-genético-moleculares. El estudio comparativo con plantas transgénicas, pero también una exploración cada vez más exhaustiva de las poblaciones naturales de metalofitas, abrirán nuevas perspectivas en este campo. Las características de la especiación del metal y su forma activa dentro y fuera de la planta, son también conocimientos básicos y complejos a la hora de interpretar su comportamiento fisiológico. Metabolismo celular, compartimentación, intermediarios y transportadores son, a su vez, piezas fundamentales para este conocimiento. Pared celular y, sobre todo, membrana parecen ser el lugar primario de percepción y acción, que, rápidamente, pueden interferir con el balance celular y la homeostasis y, secundariamente, interferir las funciones y metabolismo de la planta. Especialmente importante es el conocimiento de la posible interacción y regulación génica por estos metales así como los mecanismos de adaptación y su base genética. Otros avances necesarios son los que permitan comprender las relaciones entre mecanismos de tolerancia y gasto energético, y las complejas interacciones entre vegetales tolerantes y otros componentes, microorganismos y animales, de los ecosistemas afectados por la presencia de niveles potencialmente tóxicos de estos metales.

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CUESTIONARIO BLOQUE 5 Responder con Verdadero o Falso

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