FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR (FS) •

Las técnicas de fraccionamiento subcelular (FS) fueron desarrolladas en la década del ‘50, como un resultado del desarrollo de las ultracentrífugas. Aunque el fraccionamiento de estructuras subcelulares también puede llevarse a cabo por otros procedimientos, la ultracentrifugación sigue siendo la técnica usada en la mayoría de los casos.

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Las técnicas de FS fueron instrumentos para el descubrimiento de varias organelas, particularmente lisosomas y peroxisomas. Estos descubrimientos resultaron en el otorgamiento de los premios Nobel a Palade, Porter y de Duve en 1974.

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La correlación encontrada respecto a que ciertas actividades enzimáticas sedimentan con una cinética similar a la de estructuras diferenciadas que pueden observarse al microscopio electrónico, fue la base más firme que condujo al descubrimiento de nuevas organelas.

RELEVANCIA DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR EN LA INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA

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Un tema importante en la investigación bioquímica es no solo resolver las reacciones bioquímicas, sino conocer y entender en que tipo de estructura celular ocurren, y como diferentes procesos bioquímicos son coordinados en diferentes regiones de la célula.

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A finales de las décadas del ’80 y ’90, el fraccionamiento subcelular dejó de ser “popular”. En esos momentos se puso de moda que las cuestiones biológicas debían ser resueltas sin destruir la célula, o simplemente debía limitarse la destrucción a la permeabilización de la membrana celular.

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Sin embargo, en este nuevo siglo emergió con mucha potencia la proteómica en general y la proteómica de las organelas en particular, entonces el fraccionamiento subcelular controlado comenzó a tomar relevancia nuevamente.

Sistema de endomembranas

La mitocondria y el cloroplasto

Las organelas pueden a su vez sub-fraccionarse MITOCONDRIA

Pasos a seguir en un fraccionamiento subcelular 1. Aislamiento de células o tejidos. En un primer momento los estudios de fraccionamiento subcelular se hicieron con órganos como hígado y riñon. Sin embargo, el hígado está formado por 4 tipos diferentes de células (hepatocitos, cél. endoteliales, cel. ‘Kupffer’ y de forma estrellada). Entonces, para estar seguros del origen de las actividades que se estudian, primero se tienen que separar las células, luego las organelas de cada tipo celular y luego ver con que organela está asociada la actividad.

2. Homogeneización 3. Separación de Organelas en fracciones 4. Análisis bioquímico

1. Aislamiento de células o tejidos.

2. Homogeneización. La homogeneización es el paso mas crítico en cada procedimiento. El obejtivo es abrir la mayoría de las células, pero manteniendo las organelas lo más intactas posible. Alcanzar el mejor compromiso entre los dos objetivos resulta en la mejor condición final que puede lograrse para el experimento

3. Separación de Organelas en fracciones 4. Análisis bioquímico

1. Aislamiento de células o tejidos. 2. Homogeneización. 3. Separación de Organelas en fracciones. La separación de organelas en fracciones se lleva a cabo generalmente por centrifugación diferencial, aunque existen otros métodos (centrifugación en gradientes de densidad, electroforesis, inmunoprecipitación)

4. Análisis bioquímico

Homogeneizador

Homogeneización. Algunas consideraciones 1.

Células de plantas y animales tienen entre 5 y 100 um de diámetro. Las bacterias tienen entre 1 y 2 um de largo. El mycoplasma, clasificado algunas veces como bacteria, tiene 300 nm de diámetro. Un ribosoma de bacteria tiene 20 nm.

2.

La regla general es: Cuanto más grande sea la célula es más fácil de romper. Menos fuerza es requerida.

3.

La homogeneización se lleva a cabo en general en un buffer isotónico con sacarosa y a pH neutro. El medio isotónico evita efectos osmóticos y protege la integridad de las organelas.

4.

Medio hipotónico. En algunas oportunidades es utilizado para romper la membrana de las células. Ello conduce al llenado de la célula, lo cual reduce la fuerza necesaria para su rotura.

Centrifugación Diferencial

Sedimentación durante la centrifugación

Centrifugación en gradiente de densidad

La densidad depende de la relación entre proteína y lípidos que tiene la muestra.

Distintos tipos de partículas usadas en los gradientes Sacarosa: Sustancia permeable a la membrana. El resultado es que tendrá la misma densidad en la solución del gradiente del tubo que dentro de la organela. Percoll: Es un medio de alto peso molecular basado en particulas de sílica. El medio del gradiente no penetra las organelas, la cual no alcanza la densidad del medio. Este tipo de partículas genera un gradiente por si mismo. Dado el tamaño de las partículas, el gradiente se genera durante la centrifugación y por lo tanto no debe ser generado antes de la corrida.

Gradientes lineales

Percoll: Un gradiente que se forma a si mismo durante la centrifugación

Preparación de un gradiente discontinuo

Tipos de rotores para el proceso de centrifugación

El gradiente es separado y las fracciones son recogidas por medio de un colector para su análisis bioquímico

Centrifugación isopícnica y zonal

• Centrifugación isopícnica: se lleva a cabo hasta que cada organela alcanza su propia densidad en el medio en que es centrifugada. • Centrifugación zonal: utiliza la propiedad de que algunas organelas alcanzan su densidad antes que otras durante la centrifugación en función de su tamaño y forma. Este es el mismo principio que la centrifugación diferencial. Después de la centrifugación, la ubicación de las organelas depende de un compromiso entre la densidad de las mismas y su tamaño.

Coeficientes de Sedimentación en unidades Svedberg. Un Svedberg (S) equivale a 10-13 seg y sirve para medir el tiempo de sedimentación de una proteína o macromolécula en condiciones normales (depende de su masa). Coef. Sedimentación (S) = Vel. sedimentación (m.seg) / aceleración (m.seg2). ‘S’ se mide en seg. Un S de 7 x 10-13 seg, se expresa 7S.

ALGUNAS DENSIDADES DE MACROMOLECULAS

La recuperación de la actividad biológica presente en una fracción es uno de los mayores desafíos en un fraccionamiento subcelular

CUIDADOS: 1.

Un órgano consiste de varios tipos de células. Cuando se homogeneiza un tejido, una actividad enzimática puede provenir de diferentes tipos de células y esto no se puede controlar a no ser que se separen los diferentes tipos de células previamente.

2.

En estudios de secuencias de reacciones que tienen lugar en una organela, puede ocurrir que uno o más pasos de esa reacción ocurren en otra organela. Recordar que uno cree que aisló una organela pero lo único que tiene es una fracción subcelular que en el mejor de los casos está muy enriquecida en esa organela. Por lo tanto, siempre contendrá contaminantes de otras fracciones subcelulares.

3.

Supongamos que una determinada actividad enzimática está presente en el extracto soluble (citosólico) luego de separar las organelas. Sin embargo, las roturas de las organelas pueden llevar a que actividades enzimáticas solubles en las organelas estén ahora contaminando la fracción citosólica.

La conversión de colesterol a bilis se lleva a cabo con actvidades enzimáticas que se encuentran en diferentes compartimentos subcelulares de un hepatocito

…del tamaño de un ribosoma.

ORGANIZACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO DE UN VIRUS

ALGUNAS ESTRUCTURAS DE VIRUS Las estructuras de las cápsides de los virus han sido determinadas por cristalografía de rayos X y se conocen con una resolución de orden atómico.

v del Virus mosaico del i tabaco r Los virus tienen un rango de huéspedes limitado

Formas y Microfotografías de Virus Virus de la rabia, ARN (-) ss, >150 especies

Virus de la gripe, ARN, MUY PELIGROSO el de la gripe aviaria H5N1

Muy poco patógeno. Algunos son oncolíticos. Se usan en terapia génica y anticancer. Virus de la vacuna contra la viruela. DNA ds.

Bacteriofago T4

cabeza

cuello

vaina cola

Fibras de cola espiculas Placa basal

Infección de una Bacteria por un Fago

La realidad es más compleja y fantástica que un esquema. Fago T4 transfiriendo su DNA (A) TEM (Microscopía Electrónica Transmisión) de un fago T4. La cabeza tiene el DNA que es inyectado por medio de la cola en la bacteria huésped.

(B) Sección de una bacteria con el T4 adherido a su superficie. Los elementos oscuros en el interior de la bacteria son nuevas cabezas de T4 en proceso de ensamblaje. Una vez maduros, la bacteria explota y libera los nuevos fagos.

Multiplicación del material genético de un Virus

Ciclos de vida de virus animales

Adquisición de la envoltura vírica. (A) Micrografía electrónica (TEM) de una célula animal en la que están gemando 6 partículas virales con su envoltura. (B) Esquema que representa el ensamblaje de la envoltura y la gemación. La bicapa lipídica que envuelve la cápside deriva de la MP de la célula huésped. Las proteínas verdes, en cambio, están codificads por el genoma del virus.

Virus dsDNA dsDNA, Herpesvirus

dsDNA, Viruela y Varicela

dsDNA, Hepatitis B (Hepatitis A es RNA+)

RETROVIRUS (virus RNA, Ej. HIV)