Universidad Nacional de Rosario Facultad de Ciencias Médicas

Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología

Área Injuria

Laboratorio de Habilidades 5 Métodos directos (IV) Inves gación molecular de ácidos nucleicos: Fundamentos. Biología molecular. Áreas de un laboratorio. Usos diagnós cos. Técnicas: PCR, real me PCR, mul plex, LCR, hibridización in situ, etc. Epidemiología molecular.

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Cátedra de Microbiología, Virología y Parasitología – Facultad de Ciencias Médicas UNR – Área Injuria - Laboratorio de Habilidades 5 - 2016

Laboratorio de habilidades Nº 5 Diagnóstico Clínico Molecular Introducción

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La biología molecular es una rama de la biología que estudia los fenómenos biológicos en términos moleculares. La introducción de técnicas moleculares como sustitución, complemento o ampliación de las técnicas tradicionales vistas hasta el momento, ha potenciado la capacidad diagnóstica del laboratorio microbiológico clínico.

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El principio básico de las pruebas del diagnóstico molecular microbiológico es la detección de moléculas de patógenos microbianos (material genético: ADN o RNA, proteínas, metabolitos, antígenos, etc.) como así también moléculas de la respuesta inmune del hospedero ante una infección (anticuerpos). La eficacia de estos métodos depende de su sensibilidad y especificidad para la detección de la presencia, indudable, de microorganismos o de su respuesta específica. Esto ha sido posibilitado por los progresos obtenidos conjuntamente con la biotecnología y el desarrollo de herramientas para la ingeniería molecular de reactivos tendiendo a la automatización de los procesos. En la actualidad la incorporación de la bioingeniería (robótica) posibilita la manipulación automatizada de cantidades muy pequeñas de reactivos, procesamiento de varias muestras a la vez y menor riesgo biológico para el operador. La introducción de estas técnicas ha sido muy importante en el diagnóstico de enfermedades como: meningitis, encefalitis, infecciones respiratorias, hepatitis virales, VIH, Infecciones en pacientes inmunodeprimidos (Virus JC, CMV, Pneumocystis jirovecii, etc.), infecciones de transmisión sexual (Chlamydia trachomatis, HPV, etc). El diagnóstico molecular a los fines prácticos lo podemos dividir en: “las omicas” y “las inmunológicas”. Las primeras las veremos en este laboratorio y las segundas en el Laboratorio de Habilidades Nº 6.

Objetivos

Al finalizar el encuentro el alumno debe ser capaz de:

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 Aproximarse a los fundamentos y aplicaciones de los principales recursos técnicos, metodológicos y estrategias empleadas en los campos de la microbiología.  Familiarizarse con las técnicas básicas que permiten el análisis del estudio microbiológico molecular.  Comprender las aplicaciones de métodos y técnicas en el estudio de distintos procesos infecciosos humanos.

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Mapa conceptual

Un poco de historia de la evolución de los estudios moleculares

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F. Griffith en 1928 identificó el "principio de transformación" que es lo que hoy en día conocemos como ácido desoxirribonucleico (ADN). Oswald T. Avery continuó con ello siendo uno de los primeros biólogos moleculares. En 1944, junto con su colaborador M. McCarty descubrieron que el ADN es el material del que los genes y los cromosomas están formados y que son capaces de trasmitir sus características a organismos receptores que carecían de dicha información (la herencia). Anteriormente, se creía que eran las proteínas portadoras de los genes. A. Hershey y M. Chase, continuaron este trabajo. En 1952 realizaron una serie de experimentos para confirmar que es el ADN la base del material genético (y no las proteínas). El 25 de abril de 1953, Francis Crick (36 años) y James Watson (25 años), describieron por primera vez en un estudio la estructura del ADN, molécula en forma de doble hélice que encierra el patrimonio genético de toda la vida. Con un artículo de sólo una página, publicado en Nature, revolucionaron el mundo de la biología y la genética. Pero si bien, éstos tenían una idea de los ladrillos que componen el ADN, no sabían qué es lo que los vincula ni el modo como se ensamblan en el espacio. Tenían algunas de las piezas del rompecabezas, pero no las instrucciones sobre cómo armarlo.

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Crick y Watson fueron los primeros en resolver el dilema y en proponer un modelo tridimensional del ADN, como una “estructura con dos cadenas complementarias, helicoidales, que se enrollan ambas en torno al mismo eje”, imaginando al mismo tiempo “un posible mecanismo de copia del material genético fiel de la información original” al replicarse dicha molécula. Las bases del ADN se leen de a 3 y 3 combinaciones de letras significan un aminoácido que formará parte de la proteína. Esto es el “código genético”.

En la década de 1980 Kary Mullis revoluciona la biología con la creación de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) una de las técnicas centrales en biología molecular, que Dogma Central De La Biología Molecular permite la amplificación de una región específica de ADN utilizando nucleótidos trifosfatados y enzimas termoestables (polimerasas) de ADN. Esto le valió el Premio Nobel de Química en 1993. Las técnicas de biología molecular pudieron ser desarrolladas gracias a los descubrimientos acerca de la molécula de ADN, cómo se duplica, cómo se transcribe a un mensajero, cómo se traduce ese mensajero y como se pliega el polipéptido recién desarrollado, permiten la detección de moléculas específicas. Su aplicación surge con la necesidad de poder detectar aquellos microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o de lento desarrollo o donde las técnicas inmunológicas no tienen suficiente sensibilidad y especificidad diagnóstica: Ag (antigeno), Ac (anticuerpo).

Las “Omicas”

Neologismo proveniente del inglés que en biología molecular se utiliza como sufijo para referirse al estudio de la totalidad o del conjunto de algo, como por ejemplo genes, proteínas, lípidos, metabolitos o incluso las relaciones entre ellos. Se valen para su desarrollo de otras especialidades como por ejemplo bioinformática, tecnologías rápidas, ingeniería de micromatrices y automatización.

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El término “omicas” hace referencia en microbiología a un nuevo “lenguaje” que da lugar hoy por hoy a 2 distintas disciplinas divididas en genómica funcional y genómica de expresión.

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ADN

Transcriptoma

ARN

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Genoma

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Genómica funcional

Proteoma

Metaboloma

Proteínas

Azúcares

Nucleótidos

Genómica de expresión

Aminoácidos

Lípidos (Lipidoma)

Metabolitos

Fenotipo/Función

A. Genómica funcional

Estudia productos de expresión de genes

 Transcriptómica No todo el genoma se transcribe y se traduce finalmente en proteínas, lo que ha dado lugar a debate. El desafío consiste en estudiar qué porción del genoma es transcrito a ARN mensajero. La transcriptómica consiste en cuantificar el nivel de expresión de genes, empleando técnicas que permiten analizar miles de moléculas de ARNm al mismo tiempo, mediante una técnica basada en micromatrices.

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 Metabolómica Es la disciplina que estudia y compara los metabolomas, es decir todos los metabolitos que intervienen en los diferentes procesos celulares. O sea estudia los perfiles metabólicos en muestras biológicas (fluidos, tejidos, cultivos, células, etc.) con la finalidad de descubrir enfermedades, factores de riesgo y determinar biomarcadores. El metaboloma es dinámico, cambia ante la menor señal física o química. Se emplean varios métodos para su análisis basado en la necesidad de separar primero los metabolitos (técnicas de cromatografía fase gaseosa, líquida ó electroforesis con capilares) y luego detectarlos (espectrometría de masa y resonancia magnética nuclear)  Proteómica (huella peptídica) Es el lenguaje de las proteínas. Es el estudio y caracterización cuali y cuantitativa del conjunto de proteínas expresadas por un genoma (proteoma). Se basa en técnicas de electroforesis o espectrometría de masas (MALDI TOF matrix-assisted laser desorption/ionization//Time of flight). Con esta última se obtiene una huella peptídica (conjunto de fragmentos peptídicos característicos de cada proteína al tratarla con una determinada enzima).

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Hay técnicas que acompañan este estudio como Yeast two hybrids o Phage display para estudiar interacciones entre proteínas. Permite averiguar con que proteína interaccionan una proteína incógnita o sonda. Se realiza en 4 pasos: 1) Aislamiento del microorganismo (colonia). Actualmente está en estudio poder hacerlo directamente de orina y sangre. 2) Realización de la Espectrometría de masas (EM): MALDI: Exposición de las proteínas intracelulares, vaporización e ionización química de las mismas (láser); TOF: viaje por cámara de vacío y espectro según carga-masa de cada fragmento 3) Cuantificación, análisis estadísticos-Comparación con la base de datos (bioinformática) 4) Entrega de resultados El uso de espectrometría para identificación es útil y resulta costo efectiva para laboratorios de gran número de muestras. Esta metodología no esta adaptada para la determinación de pruebas de sensibilidad antimicrobiana (PSA). En la EM, los patrones de proteínas son detectadas directamente de la bacteria intacta. La mezcla es aplicada a un plato de metal e irradiada con un láser. La matriz absorbe la luz láser y vaporiza en el proceso de ganancia de cargas (ionización). Los campos eléctricos luego guían los iones lo que los separa de acuerdo a su carga y a la masa y finalmente la cantidad de cada ion es determinada. Ejemplo: bacterias anaerobias, Gram positivas, Gram negativas, micobacterias y levaduras. Se piensa en un futuro estudiar con esta metodología determinación de resistencia antimicrobiana y factores de patogenicidad.

Actualmente existen métodos para analizar, además de las proteínas, biomacromoléculas (ácidos nucleicos, péptidos, lípidos, hidratos de carbono, etc.) apoyados en el desarrollo de otras especialidades como por ejemplo bioinformática, tecnologías rápidas, ingeniería de micromatrices y automatización.

Genómica de expresión

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Genómica (lenguaje de los genes). Estudia el genoma de los microorganismos. Incluye la secuenciación del ADN, análisis de la secuenciación y comparación con otras secuencias. Se basa en la detección de genes estables de las subunidades ribosómicas, generalmente 16S y sus espacios intergénicos. Este marcador está presente en todas las bacterias (housekeeping).Constituido por una familia de multigenes presentes en operones inmodificables con el tiempo que actúan como marcador de evolución.

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Diagnóstico clínico molecular

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La aparición de estas “ómicas” revolucionó el diagnóstico microbiológico clínico. Permitió mejorar marcadamente la sensibilidad de los procesos y trasladar las técnicas desde los laboratorios de investigación exclusivos a los de diagnóstico microbiológico clínico de alta complejidad en la práctica diaria. La gran utilidad de esto se debe a la identificación del origen de muestras de sangre o saliva (a los que recurre casi exclusivamente la ciencia forense), y la secuenciación de genes humanos o de otros organismos. Estas técnicas ha permitido también investigar la filogenia (historia evolutiva) de los microorganismos, comparando las secuencias genéticas de distintos linajes, que a su vez es el fundamento de un mundo de hipótesis científicas de máximo interés. Es una parte de la microbiología en constante desarrollo pero no sólo se utiliza en ella sino en otras especialidades tales como hematología, oncología, estudios prenatales, farmacogenética, etc. Las posibilidades de este nuevo recurso diagnóstico son infinitas y es posible que todavía ni nuestra imaginación hoy haya podido llegar. Ventajas del uso de las técnicas moleculares

1) Capacidad de multiplicar la porción de ácido nucleico buscada (106-9 copias) y detectarlas luego por técnicas de hibridación, ELISA, etc. que le otorgan gran sensibilidad. 2) Técnicas rápidas comparadas con las técnicas convencionales.

3) Poder utilizar diversidad de muestras biológicas. Se detecta presencia de AN sin necesidad de la viabilidad de los microorganismos. 4) Capacidad de cuantificar la cantidad de AN (por ejemplo: carga viral) Desventajas

1) No permite aislamiento de/los microorganismos para estudios de resistencia 2) Falsos positivos: contaminación con productos amplificados anteriores

3) Falsos negativos: presencia de inhibidores o inconvenientes en los distintos pasos de las técnicas. Necesidad de utilizar controles internos en todos los procedimientos.

¿Qué necesitamos para la realización de estas técnicas?

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1- Laboratorio con estructura adecuada Debe constar de 2 ó 3 áreas separadas y aisladas una de otras. Cada una tiene que tener sus materiales para trabajar y no pueden intercambiarse entre ellas. Poca circulación del personal. Equipamiento adecuado (algo más complejo que para diagnóstico convencional que hemos visto hasta ahora), materiales calibrados, estandarizados y sistemas de bioseguridad. Se circula en una dirección siempre empezando por el área 1 hacia el área 2 y por último la 3. Con superficies fáciles de limpiar y decontaminar antes de ser utilizadas. En cada área deben utilizarse distintos guantes para evitar la difusión de la contaminación. El trabajo debe ser muy pulcro y meticuloso a fin de no contaminar con ningún vestigio de ADN extraño a la muestra.

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 Área 1: Preparación de reactivos necesarios para todos los procedimientos. Se necesitan micropipetas, tubos, tapones, bandejas, bata y guantes sólo para esa área. De ser posible campana de aire aislado con luz ultravioleta.  Área 2: Preparación de las muestras, destinada a la extracción del material genético de las muestras biológicas en estudio. Debe evitarse al extremo la contaminación con aerosoles y trabajar con medidas de bioseguridad extremas.  Área 3: De amplificación y secuenciación-detección. Este área es utilizada para la amplificación de ADN extraído, utilizando procedimientos que evitan la contaminación del material por parte de los operadores y del ambiente. El ADN así amplificado es secuenciado mediante electroforesis para la obtención de las distintas fracciones. 2- Personal altamente entrenado Es de imperiosa necesidad contar con personal idóneo en los procedimientos a fin de evitar ó detectar los resultados falsos positivos. Esto se minimiza con el correcto flujo de circulación del personal y de la muestra, el uso adecuado de materiales y procedimientos tecnológicos, conjuntamente con la interpretación adecuada de los resultados. 3- Muestra clínica adecuada Las muestras a procesar deben recogerse, conservarse y trasladarse de acuerdo a la técnica que el laboratorio que la recibe va a emplear. Cada una depende de la patología a estudiar. Lo fundamental que el recipiente debe ser nuevo y estéril (no se admite nada reciclado).También se procesan cultivos puros bacterianos o fúngicos para identificar el microorganismo.

 

Cabina preparación mezcla de trabajo 

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Baño termostatizado 

  Termociclador 

Poniendo la mezcla de trabajo en termociclador 

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Micropipeta con tip 

Tubo de microcentrífuga 

 

Terminología empleada en técnicas genéticas Antes vamos a tener en cuenta algunos conceptos:

Sonda: es una secuencia de nucleótidos específica de AN (5 a 30 bases - oligonucleótido). Se puede sintetizar artificialmente en un laboratorio siendo complementaria de una secuencia de ADN específica.

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Cebadores o primers: son sondas que se utilizan para iniciar una reacción. Son específicos de una región complementaria de una cadena de ADN. En las reacciones se utilizan 2 cebadores para que se unan a los 2 extremos del ADN que se quiere estudiar.

Cebadores, primers ó sondas marcadas: Un oligonucleótido puede marcarse con sustancias fluorescentes o lumínicas. Son utilizadas para detectar, localizar e identificar un determinado fragmento de ADN. Desnaturalización: separación de 2 cadenas de ADN por medio de calor (90 ºC). Se rompen los puentes hidrógenos que las unen. También se lo llama templado ó melting. Hibridación: Técnica utilizada para unir 2 moléculas de polinucleótido complementarias. Polimerasa: es una enzima que no se inactiva con el calor puesto que proviene de un microorganismo termorresistente (por ej: Taq polimerasa de Thermus aquaticus).

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Electroforesis en gel de agarosa: distanciar moléculas a través de una matriz sólida sometida a un campo eléctrico que funciona como un filtro para separarlas de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica.

Cada día es más requerido en el diagnóstico microbiológico el empleo de estas técnicas, in

vitro.

1. Técnicas de hibridación

Primero se desnaturaliza el ADN por calor, luego se añade una sonda marcada complementaria de la secuencia específica buscada. Se enfría la mezcla y se produce la hibridación entre ambas. Al quedar unida a su blanco se puede detectar según el marcador utilizado. El inconveniente de esta técnica es que necesita que en la muestra haya mucha cantidad de ADN, son poco sensibles. Son muy utilizadas en la identificación de microorganismos aislados de cultivo, ya que en esa muestra se puede obtener gran cantidad de ADN.

2. Técnicas de amplificación

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Estas técnicas son las más utilizadas a partir de muestra clínicas. Tiene la ventaja sobre la de hibridación porque antes de detectar el ADN ó ARN del microorganismo, lo amplifican en la muestra, o sea repiten el ciclo un número definido de veces (30-40 veces o ciclos) logrando millones de copias del fragmento deseado. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más empleada, consiste en preparar ante todo una mezcla de trabajo: ADN de la muestra obtenido por lisis + 2 cebadores o primers para cada una de la fracción de ADN que se quiere estudiar + los 4 nucleótidos (adenina, guanina, citosina y timina) + una polimerasa termorresistente Se coloca en un termociclador donde se realizarán automáticamente 30-40 ciclos, cada ciclo radica en:  Desnaturalización del ADN por calor a 90 ºC  Hibridación a 50 ºC 9

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 Polimerización o elongación por acción de la enzima Taq polimerasa 70 ºC Una vez amplificada la fracción de ADN específica se procede al revelado. Se puede realizar por electroforesis en gel de agarosa, con posterior tinción con bromuro de etidio o sino utilizar antes un cebador o primers marcado con enzimas, fluoróforos, etc. Esto permite comprobar que hubo o no amplificación y conocer el tamaño o peso de las fracciones obtenidas.

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La técnica de PCR clásica se ha ido modificando con el fin de sumar ventajas. De ahí que hay PCR de varios tipos:  PCR anidada (Nested PCR) Consiste en amplificar primero una porción específica de ADN por la técnica de PCR clásica y luego volver a amplificar pero con otros cebadores, una zona interna de la antes amplificada. Se gana en sensibilidad y especificidad.

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 PCR multiple (Multiplex PCR) Co-amplificación en un mismo tubo. Es una PCR clásica pero en vez de colocar un par de cebadores para detectar un solo microorganismo se coloca en la mezcla de trabajo varios cebadores que con mayor frecuencia son causantes de una patología. EJ: Para detectar el agente etiológico de una meningitis se realiza una PCR múltiple en líquido cefalorraquídeo del paciente. Se introducen varios juegos de cebadores específicos de los más frecuentes. En una sola reacción se puede detectar el agente causante entre varios.  PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) (amplificación de RNA) Una hebra de RNA primero es retrotranscripta a ADN complementario (ADNc) usando una enzima transcriptasa reversa y el resultado se amplifica en una PCR clásica. Ej.: carga viral de HIV

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 PCR en tiempo real ( Real time PCR) Es una PCR clásica. Se diferencia de ésta porque se utilizan además, de los cebadores específicos para amplificar, sondas marcadas que a medida que se produce un ciclo va emitiendo una señal que es capturada en un revelador ó pantalla. Se gana en especificidad porque hay un doble control de unión (los cebadores y la sonda marcada) y además se va cuantificando en forma acumulativa el ADN formado. Menor tiempo de entrega de los resultados y menor contaminación al no tener el último paso del revelado donde puede haber contaminación.

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 PCR cuantitativa Este método se basa en la co-amplificación de la molécula de ADN a estudiar y cantidades definidas de un patrón de ADN interno (competidor) que portan los mismos sitios de unión del cebador. Dado que se conoce la cantidad de competidor inicial y que la eficiencia de la amplificación es la misma en los ADN competidor y en estudio, la proporción de las cantidades de los dos productos de la PCR, determinada por ejemplo mediante electroforesis en gel, es representativa de la proporción de los ADN a estudiar y competidor presentes en la mezcla de reacción antes de la amplificación. Los resultados solo pueden indicar un valor inferior, igual o superior a una concentración de patrón definida.

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3. Técnicas de secuenciación

La secuenciación del ADN es un conjunto de métodos y técnicas automatizadas rápidas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, G, C y T) en un oligonucleótido de ADN (fragmentos grandes). Actualmente se han secuenciado genomas completos. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable. Existen bancos de datos donde se guardan las secuencias de numerosos genes como Genbank, EMBL-Bank, etc.)

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Aunque  en  biología  molecular  existen  muchas  técnicas  para  detección  de  cambios  tanto  a  nivel  del  ADN  como  a  nivel  cromosómico,  el  secreto  está  en  seleccionar  la  más  adecuada  dependiendo  de  los  requerimientos  y  la  disponibilidad. 

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