Guía Práctica 5 Macrophomina phaseolina Enfermedad: Macrofomina, pudrición gris Contenido

Manejo del hongo en el laboratorio

Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol

Generalidades Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras B. Preparación del medio de cultivo PDA C. Aislamientos de M. phaseolina 1. Aislamiento del hongo 2. Cultivo monopicnidial D. Incremento de inóculo de M. phaseolina sobre arroz blanco E. Inoculación de las plantas 1. Preparación del inóculo 2. Inoculación en el invernadero F. Conservación y almacenamiento de M. phaseolina 1. Conservación en papel filtro a –20 °C 2. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a –20 °C G. Prueba de almacenamiento H. Recuperación del hongo almacenado a –20 °C 1. Conservado en papel filtro 2. Conservado a –20 °C en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa

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Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol

Generalidades Macrophomina phaseolina es un hongo que causa la enfermedad conocida principalmente como ‘macrofomina’ o pudrición gris de la raíz; recibe también los nombres de ‘mancha ceniza del tallo’, ‘pudrición carbonosa de la raíz’ y ‘tizón cenizo del tallo’. Este patógeno, que ataca los cultivos de frijol, soya, maíz, sorgo y alfalfa, se encuentra comúnmente en cultivos de frijol que padecen estrés por sequía y por altas temperaturas. Infecta tanto las plántulas como las plantas adultas:

Foto 1

•

En las plántulas se observan los primeros síntomas a la altura de los cotiledones (Foto 1); el patógeno avanza hacia el cuello de la raíz y poco después ocurre la muerte de toda la plántula.

•

En el campo, las plantas adultas muestran lesiones de color gris ceniciento en el tallo, el pecíolo y las vainas, que corresponden a estructuras de supervivencia del hongo conocidas como picnidios (Foto 2).

M. phaseolina es un patógeno que, en el frijol, se transmite por las semillas.

Foto 2

5-2

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Procedimientos A. Recolección y transporte de las muestras Para poder aislar el hongo Macrophomina phaseolina presente en plantas de frijol, es necesario obtener material vegetal que muestre los síntomas típicos de la enfermedad.

Materiales Para recolectar las muestras de tejido infectado en el campo, se necesitan tres elementos: toallas de papel, bolsas de papel y rótulos para identificar las muestras. •

Toallas de papel. La muestra de tejido de frijol infectado (de vainas o tallos) que se colecta se envuelve en una toalla de papel que sirve, además, para absorber su humedad. Si no hay toallas, pueden usarse materiales similares como servilletas, papel higiénico, pañuelos faciales y, en último caso, papel periódico.

•

Bolsas de papel. Las muestras de tejido infectado envueltas en algún papel absorbente se colocan en bolsas o sobres de papel. No se deben usar bolsas plásticas porque no son porosas y contribuyen, por ello, a la acumulación de humedad en su interior; esta humedad favorece el crecimiento de microorganismos saprofitos, los cuales dificultarán 5-3

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el aislamiento del patógeno que se hace a partir del tejido de frijol colectado. •

Rótulos para marcar las muestras. Es muy importante identificar claramente la muestra con la siguiente información: variedad (o genotipo) de frijol, tamaño y color de sus granos, lugar donde se toma la muestra (localidad, provincia, departamento, país), fecha de recolección de la muestra, nombre del recolector y, en lo posible, latitud y longitud (aproximadas) del lugar en que se hizo la recolección. El rótulo debe quedar bien adherido en cada muestra.

Pasos del proceso • Paso 1 Tomar la muestra de la parte enferma de la planta (vainas, tallo) que presente los síntomas causados por el patógeno. • Paso 2 Colocar la muestra (tejido enfermo) dentro de una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el rótulo respectivo (ver antes). • Paso 3 Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del hongo patógeno. Tener en cuenta dos recomendaciones: –

Nunca envíe las muestras dentro de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio (ver antes). 5-4

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No recolecte material vegetal húmedo; si está en esas condiciones, secarlo con toallas de papel antes de transportarlo. Una vez llegue al laboratorio, dejarlo al aire libre para que acabe de secarse (cuando no se procesa inmediatamente).

B. Preparación del medio de cultivo PDA Las siglas PDA corresponden a los componentes del medio: papa, dextrosa y agar.

Foto 3

Materiales – – –

PDA deshidratado Agua destilada Frascos erlenmeyer de 1000 ml

39 g/litro 1 litro 2

Preparación –

–

–

Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en un recipiente grande, que puede ser un vaso de precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada uno). Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA se esterilizan en autoclave. Esta máquina, con una presión de 20 libras y una temperatura de 121 °C, realiza el proceso total de esterilización en 40 minutos. El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri, a razón de 25 ml por caja (Foto 5). 5-5

Foto 4

Foto 5

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C. Aislamientos de M. phaseolina El protocolo de aislamiento de M. phaseolina es sencillo porque el tejido vegetal que este hongo patógeno coloniza está casi libre de saprofitos, lo que facilita su aislamiento y su purificación. Nota: Todos los procedimientos se deben ejecutar dentro de una cámara de flujo laminar; además, deben cumplirse todas las condiciones de asepsia y esterilidad que se exigen en un laboratorio. En otras palabras, se aplican siempre las buenas prácticas microbiológicas (BPM).

1. Aislamiento del hongo Materiales Foto 6

– –

Muestra de tejido vegetal con síntomas de la enfermedad Medio de cultivo PDA, servido en cajas petri

Pasos del proceso • Paso 1 Cortar varios pedazos del tejido enfermo de la muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6).

Foto 7

• Paso 2 Desinfectar los pedazos de muestra en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%, durante 3 minutos (Foto 7). 5-6

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• Paso 3 Lavar tres veces con agua destilada estéril los pedazos de muestra desinfectados. • Paso 4 Colocar los pedazos de muestra lavados sobre toallas de papel estériles durante 10 minutos para que se sequen (Foto 8). • Paso 5 Cuando las muestras estén secas, tomar los pedazos de tejido con una pinza estéril y ‘sembrarlos’ en una caja petri que contenga el medio de cultivo PDA; colocar tres pedazos por caja (Foto 9). Repetir el procedimiento con las demás muestras. Incubar las cajas a 28 °C durante 7 días, tiempo en que el hongo producirá micelio (Foto 10) y picnidios. Éstos se observan como puntos negros empleando un microscopio o un estereoscopio.

Foto 8

Foto 9

Ocho días más tarde, el patógeno aislado estará listo para ser incrementado, con el fin de producir inóculo suficiente para las pruebas que se harán en el invernadero o en el campo.

2. Cultivo monopicnidial Este cultivo comprende los pasos siguientes: –

Observar los picnidios en un cultivo de 8 días desarrollado en una caja petri (Foto 10), con la luz inferior del estereoscopio. 5-7

Foto 10

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–

–

Seleccionar el picnidio que se desea sacar del cultivo; enseguida, con un alfiler flameado, ‘repicar’ alrededor del picnidio para aislarlo con mayor facilidad. Sacar el picnidio aislado con la punta del alfiler y transferirlo a una caja petri que contenga medio de cultivo PDA.

El picnidio inicia su desarrollo en ese medio y se genera así un cultivo homogéneo de M. phaseolina.

D. Incremento de inóculo de M. phaseolina sobre arroz blanco Materiales – – – – Foto 11

–

Arroz blanco Agua destilada estéril Cajas petri (15 cm de diámetro) Una caja produce inóculo para 40 kg de suelo, aproximadamente Cultivo de M. phaseolina en medio de cultivo PDA (Foto 11)

50 g 50 ml

Pasos del proceso • Paso 1 Tomar 50 g de arroz blanco, depositarlo en una caja petri grande, de 15 cm de diámetro, y lavarlo una vez con agua corriente. 5-8

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• Paso 2 Una vez lavado el arroz en la caja petri, agregar 50 ml de agua corriente, envolver luego la caja, primero con papel aluminio y luego con papel kraft. • Paso 3 Autoclavar este material dos veces. • Paso 4 Hacer una suspensión del hongo cultivado (ver C., 2. Cultivo monopicnidial) en agua destilada estéril. Con una pipeta pasteur provista de un chupo de succión, tomar el agua y resuspender el hongo; luego aspirar la suspensión del hongo con la misma pipeta y depositar 15 gotas de ella en la caja petri que contiene el arroz estéril (Foto 12). • Paso 5 Incubar las cajas petri que contienen el arroz inoculado, a 28 °C durante 15 días y en total oscuridad. En ese tiempo, el hongo coloniza el arroz hasta que éste adquiere un color negro debido a los picnidios del hongo (Foto 13); el color es el indicador de que el crecimiento del patógeno en el medio ha sido exitoso. Si se presenta un color diferente al de la foto, es un indicador de que se contaminó el incremento de esa caja y se descarta. Destapar luego las cajas petri con el hongo y dejarlas durante 1 día en la misma incubadora para que se seque el exceso de humedad: así se facilita el macerado del hongo para preparar el inóculo. 5-9

Foto 12

Foto 13

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E. Inoculación de las plantas 1. Preparación del inóculo Se parte del incremento del hongo hecho en arroz blanco. Foto 14

Foto 15

Pasos del proceso • Paso 1 Pasados los 15 días de la incubación y el día de secado (Paso 5 anterior), picar en trozos el arroz colonizado por el hongo (Foto 14) los cuales, con la ayuda de un mortero, se maceran suavemente (Foto 15) hasta obtener un macerado fino. Si hay mucha humedad en los trozos iniciales, hay que reducirla colocando sobre ellos toallas de papel y haciendo presión con los dedos para que absorban el exceso de agua y así la muestra pueda secarse en 24 horas antes de macerarlos. • Paso 2 Esparcir el arroz ya macerado sobre una toalla de papel (Foto 16) y secarlo en una incubadora a 28 °C durante 24 horas.

Foto 16

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• Paso 3 Cuando el material esté completamente seco, macerar de nuevo en el mortero hasta convertirlo en un polvo fino de color negro (Foto 17). Este producto será el inóculo de M. phaseolina para hacer pruebas de patogenicidad del hongo o para caracterizar, en el invernadero, las reacciones de resistencia o de susceptibilidad del germoplasma de frijol.

2. Inoculación en el invernadero Materiales – – – –

Inóculo del hongo (ver antes: 1. Preparación del inóculo…) Semillas de frijol para inocular Suelo estéril Potes (para siembra)

Foto 17

Nota: Se pesa la cantidad de inóculo que se usará en el invernadero.

Pasos del proceso • Paso 1 Se mezclan 0.5 g de inóculo por 1 kg de suelo (siempre en esa proporción). Con esta mezcla se llenan los potes (o bandejas o recipientes) que se emplearán en la prueba de inoculación (Foto 18). Foto 18

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Resistentes

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• Paso 2 Sembrar en los recipientes las semillas de frijol de los genotipos que interesan en la prueba. • Paso 3 Pasados 14 días después de esa inoculación, realizar la primera evaluación. Si el genotipo de frijol es muy susceptible, no alcanza a germinar, reacción que también se tiene en cuenta en la prueba.

Fotos 19, 20, 21 Intermedias

Evaluar las plantas emergidas según una escala cuyos grados han sido representados visualmente en las siguientes fotos: 1 a 3: indica planta resistente (Fotos 19, 20 y 21) 4 a 6: indica planta de reacción intermedia (Fotos 22, 23 y 24) 7 a 9: indica planta susceptible (Fotos 25, 26 y 27) Fotos 22, 23, 24 Susceptibles

F. Conservación y almacenamiento de M. phaseolina Para conservar el hongo M. phaseolina se emplean dos métodos: en sobres de papel filtro y en una suspensión de sucrosa y peptona.

1. Conservación en papel filtro a –20 oC Este método permite conservar microorganismos durante períodos largos de tiempo. Fotos 25, 26, 27

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Materiales – – – – – – –

Papel filtro cortado en cuadritos Cultivo de M. phaseolina que ha crecido 10 días en PDA Pinzas Cajas petri Agua destilada estéril Pipeta Sobres de papel filtro estéril

Pasos del proceso • Paso 1 Colocar los cuadritos de papel filtro dentro de una caja petri o de un contenedor cerrado y esterilizarlos en autoclave. • Paso 2 Colocar 10 cuadritos de papel filtro esterilizado sobre el medio de cultivo PDA fresco contenido en las cajas petri (2-3 por caja). • Paso 3 Preparar una suspensión de picnidios y micelio de un aislamiento del hongo, de la siguiente manera: – –

Agregar agua destilada estéril sobre la caja petri con M. phaseolina de 10 días de crecimiento. Raspar toda la superficie del aislamiento con la punta de la pipeta para lograr una suspensión. 5 - 13

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Tomar un poco de esa suspensión con la pipeta y colocar una gota en cada cuadrito de papel filtro esterilizado (en las cajas petri del Paso 2). • Paso 4 Incubar las cajas a 24 °C durante 12 días. • Paso 5 Pasados los 12 días de incubación, retirar los cuadritos de papel filtro del medio de cultivo junto con el hongo que creció en ellos, usando una pinza estéril; cumpliendo con todas las condiciones de asepsia, depositarlos en una caja petri estéril vacía. Colocarlos invertidos (la cara en que está el hongo hacia abajo) para que no se enrollen al secarse. Secar los cuadritos de papel filtro durante 7 días a 24 °C. • Paso 6 Pasar los cuadritos secos (con una pinza estéril) a bolsitas de papel mantequilla estéril, las cuales se introducen, a su vez, en otra bolsa más grande del mismo material. – –

Colocar en las bolsitas toda la información referente al hongo, como la fecha de almacenamiento, el nombre de la cepa, etc. El hongo M. phaseolina se debe almacenar a –20 °C.

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2. Conservación como suspensión en solución de peptona-sucrosa, en papel filtro a –20 oC Materiales – – – – –

Peptona al 10% Sucrosa al 20% Cajas petri con hongo de 10 días de crecimiento Espátula Papel filtro esterilizado y cortado en cuadros de 0.5 cm2 (Foto 28)

Preparación de las soluciones de peptona y de sucrosa Se toman 10 g de peptona y se disuelven en 100 ml de agua destilada. Se prepara de igual modo una solución de sucrosa al 20%, disolviendo 20 g de este producto en 100 ml de agua destilada. Las dos soluciones, que se preparan por separado, se llevan al autoclave. Una vez esterilizadas, se mezclan partes iguales de cada una en un recipiente estéril para hacer una solución homogénea de peptona-sucrosa.

Foto 28

Pasos del proceso • Paso 1 Tomar una caja petri que contenga el hongo y agregarle 2 ml de la solución de peptona-sucrosa (Foto 29). 5 - 15

Foto 29

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• Paso 2 Raspar con una espátula estéril la caja petri para desprender los picnidios y el micelio del hongo (Foto 30). Dejar la suspensión en esa misma caja petri. Foto 30

• Paso 3 Colocar los cuadritos de papel filtro en la suspensión del hongo y asegurarse de que queden bien impregnados (Foto 30). • Paso 4 Retirar los cuadritos de papel filtro de la caja petri con una pinza estéril y colocarlos en una caja petri estéril con papel filtro en el fondo para que se sequen durante 7 días a 24 °C.

Foto 31

• Paso 5 Transcurrido ese tiempo, guardar los cuadritos en sobres estériles de papel mantequilla (Foto 31) para almacenarlos a –20 °C, escribiendo en ellos la información referente al hongo, como la fecha de almacenamiento, nombre de la cepa, etc. (Foto 32).

Foto 32

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G. Prueba de almacenamiento Esta prueba es la forma clara, práctica y confiable de garantizar que el hongo secado por 7 días está libre de contaminantes, viable y que puede ser almacenado.

Pasos del proceso • Paso 1 Tomar uno de los cuadritos de papel filtro que había sido impregnado con la suspensión del hongo M. phaseolina y que fue secado por 7 días. • Paso 2 Sembrar el cuadrito en medio de cultivo PDA. Después de 3 días, el patógeno debe haber iniciado su crecimiento en este medio de cultivo. • Paso 3 Observar el crecimiento del hongo en el estereoscopio. Si presenta agentes contaminantes, como otros hongos o bacterias, tanto la muestra observada como los demás cuadritos de papel filtro deberán desecharse, y se repetirá entonces el proceso de conservación.

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H. Recuperación del hongo almacenado a –20 oC El objetivo de esta metodología es reactivar el hongo que se conserva en almacenamiento.

1. Conservado en papel filtro Pasos del proceso • Paso 1 Trasladar, con una pinza estéril, uno de los cuadritos de papel filtro con el hongo —que habían sido almacenados en bolsitas (ver F., 1. Conservación en…, Paso 6)— a una caja petri (Foto 33) que contenga el medio de cultivo PDA. Incubar a 24 °C. • Paso 2 Pasados 3 días, observar el crecimiento del patógeno. Foto 33

2. Conservado a –20 oC en papel filtro de suspensión en peptona-sucrosa Para reactivar a M. phaseolina almacenado bajo este protocolo, se recomienda añadir solución de peptona-sucrosa al medio de reactivación: la solución le proporcionará más nutrientes al hongo, que promoverán su crecimiento.

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Pasos del proceso • Paso 1 Sacar de los sobres de papel mantequilla dos o tres cuadritos de papel filtro con el hongo, y sembrarlos en una caja petri que tenga el medio de cultivo PDA. Agregar luego dos gotas de la solución de peptonasucrosa a cada cuadrito sembrado. Repetir la misma operación si se trabaja con varios aislamientos. • Paso 2 Incubar las cajas petri a 24 °C. Pasados 3 días, el hongo reiniciará su crecimiento y 10 días más tarde estará listo para ser usado en diferentes procesos de laboratorio (inoculación, obtención de micelio para extracción de ADN, etc.)

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