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MANUAL DE LA SOCIEDAD INTERNACIONAL DE TRANSFERENCIA DE EMBRIONES SECCION IV Manipulación de embriones recolectados para la transferencia comercial

Prefacio El factor más importante en la formación de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS) fue la necesidad de proveer un foro para el intercambio y divulgación de nuevas ideas en la transferencia de embriones y tecnologías afines. Como es obvio que la transferencia embrionaria podría ser de valor en el comercio internacional, fue establecido el Comité de Importación y Exportación. Su propósito es la divulgación de información técnica y científica para permitir a aquellos interesados en las regulaciones sanitarias para el comercio internacional, delinear las pautas significativas para el movimiento de embriones. Uno de los incentivos para la redacción del Manual IETS fue la necesidad, por parte de la Sociedad y la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), de contar con una fuente actualizada de información en la manipulación sanitaria de embriones. El objetivo de esta sección es describir los procedimientos necesarios para asegurar que la transferencia de embriones no resulte un medio de transmisión de agentes patógenos, y evitar la identificación incorrecta de embriones. En un estudio de 1.682 nacimientos, resultantes del empleo de la transferencia de embriones (KING K.K., G.E. SEIDEL, Jr., y R.P. ELSDEN; 1985, Transferencia de embriones bovinos: 1. Porcentaje de aborto y características de las crías. J.Anim.Sci. 61: 747-757), la incidencia de anomalías congénitas no difería de aquellas encontradas en la población normal; demostrando que la transferencia embrionaria es un auxiliar eficaz y sin riesgos para la diseminación de genética superior. Además, la investigación indica que la transferencia de embriones bovinos, empleando técnicas sanitarias adecuadas de colección, manipuleo y transferencia, puede ser un medio seguro y efectivo para prevenir la propagación de agentes patógenos, motivo de preocupación en el movimiento internacional de semen y ganado. Estas técnicas se describen en los Capítulos I y II. El Capítulo III pone énfasis en uniformar los procedimientos para la identificación de embriones y archivo de datos, los cuales son esenciales para el registro de la descendencia y asegurar que la certificación sanitaria se corresponda adecuadamente con los embriones. Si bien se suministra una información concisa, se aportan suficientes detalles a fin de permitir al lector llevar a cabo los procedimientos descriptos. Se presenta una lista de referencias bibliográficas al final de cada capítulo, pero si se requiere información adicional puede ser obtenida de la IETS o por consulta directa con los autores. Se agradece la colaboración del Dr. L. Blajan, Director General del OIE y de los miembros del Código Zoosanitario y al Comité de Normas de la OIE. D.A. Stringfellow Contributing Editors R.A. CARMICHAEL Maplehurst Ova Transplants Rt. 1, Box 124 Keota, IA 52248 USA

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Animal Diseases Research Institute P.O. Box 11300, Station H Nepean, Ontario, Canadá K2H 8P9 R.J. MAPLETOFT Western College of Veterinary Medicine University of Saskatchewan Canadá S7N 0W0 C.A. MEBUS USDA, ARS, Plum Island Animal Disease Center Greenport, NY 11944 USA R.E. NELSON Holstein Association 1 South Main Brattleboro, VT 05 301 USA S.M. SEIDEL International Embryo Transfer Society 3101 Arrowhead Road La Porte, CO 80535 USA E.L. SINGH Animal Diseases Research Institute P.O. Box 11300, Station H Nepean, Ontario, Canadá K2H 8P9 D.A. STRINGFELLOW Auburn University College of Veterinary Medicine Auburn University, AL26849 USA M.P. THIEBIER Laboratoire pour le Controle des Reproducteurs 13 Rue Jouët 94703 Maisons-Alfort Cedex France Introducción La necesidad de mejorar y variar las líneas de sangre en la población de ganado ha sido resuelta tradicionalmente por medio de la importación de animales nacidos y más recientemente a través del uso de semen. La habilidad de colectar embriones antes de la implantación, conservarlos congelados durante extensos períodos, luego descongelarlos y transferirlos al tracto reproductivo de madres receptoras, provee una nueva alternativa a los medios convencionales de mejora genética. La investigación hoy en día ha demostrado que este método de movimiento de material genético puede ser un procedimiento valioso y seguro para la prevención de enfermedades infecciosas dentro de las poblaciones de ganado carentes de infecciones previas. Además de estos descubrimientos específicos, la determinación de factores epidemiológicos básicos relacionados con el proceso de transferencia de embriones conduce a la conclusión que el movimiento de embriones es un procedimiento más seguro que el de animales vivos. El embrión constituye un blanco poco probable para muchos agentes patógenos debido a su resistencia primaria proporcionada por la zona pelúcida y posiblemente el trofectodermo y factores de resistencia

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secundarios tales como estadios tempranos de desarrollo, tamaño pequeño, y movilidad limitada que sirven para reducir la exposición potencial del embrión. El hecho de que muchas bacterias y virus patógenos han demostrado ser demasiado grandes para penetrar la zona pelúcida y que algunos no sobreviven bien en los medios de cultivo embrionarios, reduce la posibilidad de transmisión de un agente infeccioso vía transferencia embrionaria. Los factores ambientales implicados en los procedimientos de transferencia embrionaria, son tal vez los más importantes de recordar porque están sujetos a inspección y control. De este modo, hay muchos ensayos específicos y posibilidades tecnológicas a fin de eliminar la propogación de la enfermedad. El medio ambiente de la donante limita la exposición a agentes infecciosos y proporciona la posibilidad de realizar pruebas diagnósticas antes, durante y después de la colección de embriones. Los resultados de estos tests pueden ser evaluados antes que los embriones sean efectivamente transportados y transferidos a las receptoras. Factores de dilución, lavado mecánico, agentes antimicrobianos y tratamientos con enzimas pueden ser aplicados al embrión en su ambiente in vitro. Además, el embrión puede ser examinado en su totalidad bajo el microscopio y la esterilidad del medio puede ser controlada. El animal receptor provée la defensa final desde que representa un nuevo alojamiento para el embrión transferido, y puede servir como centinela ante la presencia de cualquier agente infeccioso por el cual es testado. Condensado de D.A. STRINGFELLOW "El potencial de la transferencia de embriones bovinos para el control de enfermedades infecciosas", Mesa Redonda sobre problemas sanitarios relacionados con transferencia de embriones. París, 9 Dic. 1985, 859-866.

Capítulo I Transferencia de embriones en el ganado vacuno: Procedimientos sanitarios generales1 Introducción En este documento no se intenta dictar los procedimientos técnicos utilizados en la transferencia de embriones bovinos. Los procedimientos varían ampliamente con la raza del donante, estaciones del año, localidades geográficas, experiencia del staff, y el tipo de organización, por ej.: clínica especializada en transferencia de embriones versus en el campo o granja de origen de la donante (1, 2, 3, 7, 9, 14). De cualquier modo, el propósito de esta sección es destacar áreas de interés general para la mayoría de las operaciones de transferencia de embriones. Las recomendaciones pueden parecer obvias y demasiado simplificadas especialmente para el profesional experimentado. De todas formas, estas revisiones sobre las recomendaciones mínimas son importantes para los nuevos profesionales y para establecer alguna uniformidad en toda la industria.

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Información condensada en parte del programa de certificación de la Asociación América de Transferencia de Embriones (Association Bulding, 9th. Minesota, Hastings, NE 68901).

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El éxito en la transferencia de embriones bovinos depende de la propia habilidad para desarrollar con éxito una serie de pasos técnicos y en minimizar la influencia de factores que tienen un efecto negativo en los resultados finales, esto es, el nacimiento de descendencia viva (14). El proceso de la transferencia de embriones puede ser dividido en una serie de pasos, los cuales dependen de si el trabajo es realizado en una granja o en un centro de transferencia. La principal ventaja de un programa en un centro es que todos los aspectos del procedimiento están bajo el control directo del staff técnico de la compañía. Esto es importante cuando los embriones son obtenidos de donantes muy jóvenes, donantes seniles, o donantes con problemas reproductivos no genéticos. La empresa que opera con programas en clínicas tiene la responsabilidad de otorgar a sus clientes los medios, control y experiencia necesarios para aumentar la posibilidad de éxito de las donantes con problemas. Debido a los servicios extra que se otorgan, los programas en clínicas, comúnmente, comprenden mayores honorarios que los realizados en establecimientos (3). Estos últimos tienen las siguientes ventajas: 1) compromete al propietario más directamente, 2) permite que las vacas valiosas permanezcan en la granja para promoción y ventas, lo cual es de particular importancia en el caso de vacas lecheras con respecto al mantenimiento ininterrumpido de los registros de períodos de lactancia, 3) abarata directamente los gastos vía uso de recursos del mismo establecimiento. Cuando se establecen clínicas o centros de transferencia de embriones, los programas de pruebas sanitarias y vacunaciones son absolutamente necesarios. Un programa debe tener en cuenta las enfermedades frecuentes de la localidad. El ganado entrante debe ser aislado del resto del rodeo a su llegada. Los animales deben ser examinados por vía rectal para determinar posibles preñeces y sanidad reproductiva, aun si está garantizado. Un veterinario matriculado debe tomar muestras de sangre para pruebas serológicas de determinadas enfermedades infecciosas. El resultado de estos tests debe ser evaluado de acuerdo con la política de la empresa y la establecida por las autoridades nacionales de salud animal. Además deberán instituirse programas de vacunación. El personal implicado en la transferencia de embriones deberá estar bien informado y conciente de llevar a cabo los procedimientos para prevenir la transmisión de enfermedades de un animal a otro o de un establecimiento ganadero a otro. Todo el equipo, requerido para el manejo de los embriones, debe esterilizarse y nunca ser utilizado para más de un animal sin la apropiada re-esterilización. Los medios a utilizar deben ser los adecuados para manejar y mantener a los animales con un mínimo de esfuerzo y riesgo de lesiones. Estos deberán contar al menos con un cepo y manga cubiertos, como así también con varios corrales. El plan nutricional de donantes y recipientes a utilizar es de extremada importancia para las condiciones fisiológicas de todo el ganado, y para el éxito del programa de transferencia de embriones. El ganado debe ser alimentado de acuerdo con los requerimientos de nutrición recomendados por las normas nacionales. Cuando la transferencia de embriones se efectúa en el establecimiento, el cliente deberá asegurarse de la especial importancia de un buen programa sanitario para el éxito del tratamiento de superovulación, fecundación, viabilidad y condición de los embriones. También de la tasa de preñez y nacimiento que siguen a la transferencia. Se debe insistir en que el cliente establezca con su médico veterinario local un buen programa sanitario antes de comenzar un programa de transferencia de los embriones (7).

Selección de la donante y superovulación

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A la llegada de una donante a un centro de transferencia o antes de ser incorporada a un programa transferencia de embriones, el profesional experimentado deberá efectuar un amplio examen sanitario y reproductivo del animal (8). Se deberán aplicar las vacunas apropiadas antes de la superovulación. Todos los tests sanitarios necesarios para la exportación de embriones deberán realizarse antes de su recuperación. Las donantes deberán tener ciclos normales, y verificarse la presencia de un cuerpo lúteo normal por medio de palpación rectal antes de iniciarse el tratamiento de superovulación. Los procedimientos de transferencia no eliminan los problemas de reproducción, de este modo problemas tales como infección de útero, quistes ováricos, etc., deben ser tratados antes de intentar la recuperación de embriones. Cuando la recolección de los embriones se efectúa en el establecimiento ganadero, es importante que todas las hormonas a emplear (gonadotrofinas, prostaglandinas, etc.) sean distribuidas de acuerdo con las normas nacionales. Deberán ser controladas las fechas de vencimiento y todas las drogas deben ser administradas de acuerdo con los procedimientos establecidos. Deben suministrarse un número adecuado de agujas esterilizadas y jeringas. Finalmente se deberá suministrar al cliente instrucciones claras, concisas y fáciles de comprender por escrito a fin de poder ser comprendidos sin problemas por cualquier persona implicada en el programa. El profesional deberá tener cuidado de no recetar una sobredosis de gonadotrofina. La sobreestimulación a menudo da por resultado el fracaso en recuperar buena calidad de embriones y puede retardar el retorno al ciclo normal del estro del donante. El profesional deberá asumir la responsabilidad de determinar el status nutricional de la donante, la sincronización de las recipientes, los métodos de detección del estro y los planes de servicios de las donantes (4, 8, 16, 17). El semen utilizado en el programa de transferencia de embriones deberá ser almacenado por separado y evaluado por un laboratorio de semen de buena reputación antes de proceder a su uso. Las instrucciones por escrito sobre los servicios, considerando el horario, número de dosis y frecuencia, deberán ser incluidas conjuntamente con las instrucciones de superovulación. Es esencial inseminar a las vacas donantes (cuando fueron sometidas a un tratamiento superovulatorio) con adecuadas dosis de semen de alta calidad, a fin de asegurar altos porcentajes de fecundación. El profesional no deberá confiarse en la experiencia del dueño para la inseminación artificial, especialmente de vacas superovuladas.

Recolección de embriones La sujeción de la donante no deberá ser estresante o abusiva. Será necesario un control adecuado para consolidar la seguridad del staff y minimizar el movimiento excesivo durante la recolección de embriones. Los sedantes o tranquilizantes deberán ser suministrados prudentemente y de acuerdo con los procedimientos permitidos. La pulcritud será obligatoria en todas las fases de la transferencia. Más aún, se deberá usar el sentido común en este aspecto. Por ejemplo, no tiene sentido el pasar un catéter esterilizado a través de las heces al útero. Sea prudente con los desinfectantes. La mayoría de ellos son mucho más nocivos para los embriones, que los microorganismos que eliminan!.

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La vulva y la cola deberán ser frotadas con un antiséptico, y luego enjuagadas adecuadamente. La anestesia epidural deberá administrarse cuidadosamente, con particular atención de la zona de aplicación, anestésico a utilizar, concentración y dosis del mismo. Todo equipo de recolección de embriones, que está en contacto con la donante o con sus secreciones o excreciones, deberá ser desinfectado o de lo contrario utilizar un nuevo equipo para cada animal. En particular, los tubos, catéteres, placas y envases de recolección, etc., que tienen contacto directo con el medio uterino, no deberán usarse para más de un donante sin ser esterilización previa (Ver Cap. III). Deberá tenerse en cuenta la limpieza escrupulosa y la utilización de guantes plásticos descartables por parte del recolector y para cada donante, a fin de asegurar que no se transmita el material infeccioso a otra donante. De más está decir, que se deberá ser precavido durante el proceso de recolección para no dañar los órganos genitales de la donante. El exceso de inflado o llenado del balón del catéter de lavaje puede llegar a destruir el endometrio o desgarrar la pared del útero (7, 8). Asimismo, la excesiva manipulación del útero y/o la tracción sobre el catéter puede causar hemorragia uterina (3). Deberá registrarse el volumen del fluido vertido y el recobrado. El dejar de recobrar la mayoría del fluido indicaría aplicar una técnica incompleta y podría causar el fracaso de la recuperación de embriones. Si se utiliza la filtración directa de fluidos de lavaje para la extracción de embriones, los filtros deberán ser manejados con gran precaución, siguiendo las instrucciones específicas provistas por el fabricante del filtro (9).

Aislamiento de embriones y evaluación Es esencial, antes de la recolección de los embriones, una adecuada preparación del área de trabajo tanto en el caso de un laboratorio fijo, de uno móvil o el de un establecimiento ganadero. Con los programas en la estación de transferencia, el laboratorio debe estar diseñado y mantenido adecuadamente para disponer del control sobre la temperatura, saneamiento, circulación del aire, iluminación y circulación del personal. En el ámbito del establecimiento agropecuario es importante el sentido común para la selección del local más adecuado para la manipulación de los embriones. Será esencial evitar las áreas con polvo o humo tales como salones de comidas, establos o graneros. Los embriones frescos deberán ser protegidos de las temperaturas extremas. La temperatura óptima para los embriones mantenidos in vitro entre la recuperación y la transferencia es de 20 a 30ºC. El lavado o limpieza de todos los plásticos y cristalería que tienen contacto con los embriones también es de vital importancia para el éxito del programa (Ver Capítulo II). Toda la cristalería deberá ser esterilizada. Además se debe considerar la posible presencia en el material de vidrio de sustancias inorgánicas peligrosas y tóxicas para los embriones, tales como los metales pesados (plomo, hierro, mercurio, etc.). Si hubiera problemas o dudas referentes a los metales pesados que ingresan al laboratorio por medio del agua o del aire (polvo), deberán fomentarse y aumentarse los procedimientos de lavado destinados a eliminar la contaminación. La contaminación del aire con olores a establo, a desinfectantes, a spray, cloro, ácidos, iodo y humo de cigarrillo (para nombrar unos pocos), puede ser peligroso para los embriones y producir películas que se acumulan sobre el vidrio y permanecen en las superficies. No deberá permitirse fumar o circular excesivamente en el laboratorio de embriones o área de trabajo. Todos los elementos para manipular los embriones: placas, jeringas, pipetas, filtros, etc. deberán estar esterilizados y apropiadamente

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rotulados con la identificación de la donante antes de su utilización. Cada donante debe tener su propio equipo, a fin de evitar que se mezclen inadvertidamente los embriones de distintas donantes. Todos los medios a utilizar deberán filtrarse con membranas de 0,22 µm de de poro, inmediata-mente antes de su uso (9). Todos los embriones deben ser lavados minuciosamente (Ver Capítulo II) antes de la evaluación y clasificación para determinar su evolución y calidad de acuerdo con los procedimientos standard (Ver Capítulo III y 6.3).

Transferencia de embriones El primero, y tal vez el más importante paso en la transferencia de los embriones es la selección de la receptora de alta calidad. Las receptoras deben estar ciclando y ser sanas general- y reproductivamente (3, 7, 8, 18). Cuando se utilizan vaquillonas como receptoras, deben estar bien desarrolladas (por ejemplo: 400 kg para una vaquillona Holstein), y ganando peso. Tanto el ganado vacuno para producción de carne como para producción de leche pueden ser usados exitosamente si están sanos, ciclando y con un positivo balance energético. Los problemas de reproducción y de escasez de leche, en el ganado bovino para producción de carne, generalmente producen receptoras de baja calidad. El momento del estro de las receptoras debe ser sincronizado con el de la donante (18). La mejor receptora es aquella que está en celo el mismo día que la donante, o no más de 24 h antes o después que la donante. Los porcentajes de preñez se reducen si la asincronía es mayor. Los programas en los establecimientos, el celo de las receptoras es habitualmente sincronizado con el uso de prostaglandinas o progestágenos (7). Una rigurosa sincronización con cuidadosas y frecuentes observaciones del celo serán decisivas para el éxito del programa de transferencia. Las receptoras deberán ser ubicadas de forma que puedan ser manejadas fácil- y tranquilamente el día de la transferencia. El stress o tensión excesiva en la manipulación, inmediatamente antes de la transferencia, será perjudicial para los porcentajes de preñez. Actualmente, la transferencia de un embrión a la receptora puede hacerse quirúrgica- o no quirúrgicamente. Hasta el momento las transferencias quirúrgicas han resultado en porcentajes de preñez ligeramente más altos, pero demandan mucho más tiempo (3, 7). El uso de la transferencia no quirúrgica ha aumentado en un esfuerzo para reducir el costo y hacer más adaptable la transferencia a las condiciones de granja. Ambas técnicas de transferencia ofrecen ventajas. a) Transferencia quirúrgica: Una vez que las receptoras han sido palpadas para determinar la presencia de un cuerpo lúteo y la normalidad del aparato reproductor, se aplicará un sedante inyectable para que se mantengan quietas. Las receptoras deberán ser fijadas durante todo el tiempo que demore el procedimiento, especialmente en el caso particular de la transferencia quirúrgica. Las transferencias por medio de cirugía son mucho menos exitosas cuando la receptora se mueve en forma excesiva. Será mucho más fácil exteriorizar el aparato reproductor si las receptoras no reciben agua ni alimentos 24 h antes de la transferencia. El área quirúrgica, generalmente la fosa paralumbar, es rasurada y preparada para la cirugía del mismo lado del cuerpo lúteo. La fosa paralumbar es desensibilizada con anestesia local y se procederá a hacer una incisión de 15 a 20 cm sobre la piel y fascia. Generalmente después que los músculos son separados por divulsión, se aproxima el útero hacia el lugar donde se hizo la incisión y el embrión se transfiere al interior del útero por medio de una pequeña punción en su pared. La incisión del flanco será suturada para completar este procedimiento (3, 7). Cuando se efectúa bajo condiciones propicias la vía quirúrgica requiere aproximadamente 15 minutos para la transferencia. Los receptoras deberán mantenerse tranquilas y sin ser perturbadas por otro ganado, durante varias horas o durante la noche. Las suturas deberán sacarse 10 y 14 días después. b) Transferencia no quirúrgica: Este tipo de transferencia no deberá intentarse comercialmente, si el técnico de transferencia no es experto en pasar el catéter a través del cérvix (cuello del útero) y

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manipular el útero, ya que los porcentajes de preñez que siguen a este tipo de transferencia varían considerablemente con la experiencia y habilidad del técnico. Un novato deberá practicar hasta que alcance un promedio de preñez de al menos 40% antes de ofrecer un servicio comercial. Las receptoras deberán manejarse con cuidado y deberán ser fijadas en un cepo para asegurar una transferencia suave y prevenir una lesión de útero durante los movimientos súbitos. Será importante la anestesia epidural para obtener un resultado uniforme y, a diferencia de la transferencia quirúrgica, la manipulación será más fácil si las receptoras no están en ayunas. Si las instalaciones son adecuadas al temperamento de las receptoras, no será necesario el uso de sedantes. Una vez realizada la palpación rectal de la receptora, a fin de determinar el lado de la ovulación, se deberá la limpiar y desinfectar el área perineal (vulva y entrada de la vagina) para evitar la contaminación tanto como sea posible. El equipo de transferencia deberá estar limpio y estéril y además ser manejado en forma estéril de manera de reducir la posibilidad de contaminación. Antes de introducir el catéter de transferencia en la vagina, el técnico verificará que las burbujas de aire que mantienen ubicado el embrión en la pajuela, estén en su lugar para asegurar la descarga del embrión cuando se desplace el émbolo. El aparato de transferencia deberá ser suavemente insertado tan profundamente como sea posible en el cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo. Sin embargo, si se encuentra resistencia o dificultad en algún momento, generalmente se obtienen mejores resultados si el embrión es depositado sin mayores intentos de avanzar más profundamente en el cuerno uterino. El embrión deberá ser depositado mientras el aparato es suavemente retirado. Con buenos medios de manipulación y ayuda adecuada, un equipo experimentado puede completar una transferencia cada 5 minutos por varias horas, si fuera necesario (18).

Congelación y descongelación Los procedimientos de congelamiento deberán llevarse a cabo en un lugar limpio, bajo temperaturas controladas y libre de polvo. Existen muchos centros de transferencia de embriones que cuentan con un laboratorio especial únicamente destinado para el congelamiento de los embriones, ésto es alentador. Cuando se trata de un congelamiento realizado en granjas, y se efectúa en un laboratorio móvil o en instalaciones suministradas por el granjero, dichas condiciones deberán ser duplicadas tanto como sea posible. Si los embriones son destinados a la venta o la exportación, deberá advertirse al cliente acerca de los tests sanitarios adecuados y el tiempo en que deberán ser efectuados. Antes del congelamiento, los embriones deberán ser lavados (Ver Capítulo II). Un número de métodos podrán utilizarse para congelar embriones. Estos están bien descriptos en la literatura (5, 10, 11, 15). Sin necesidad de considerar qué método se utiliza, todo el equipo en contacto con los embriones deberá ser esterilizado. El mismo equipo nunca deberá usarse para más de un donante. Los embriones destinados a la congelación pueden envasarse en forma individual o en grupos. El envase del embrión congelado deberá ser identificado de acuerdo con el procedimiento aprobado por el IETS (Ver Capítulo III). El Certificado de congelación de embriones debe ser completado siempre que son congelados. Si se dejara de hacer ésto último, podría llegar a inhabilitarse la descendencia para su registro. La información concerniente a los formularios de registro podrán obtenerse en las respectivas oficinas de las asociaciones de criadores. Las condiciones de laboratorio para la descongelación son idénticas a aquellas para la congelación de los embriones. El área de descongelación deberá ser limpia, estar libre de polvo y con una temperatura

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constante de 20 a 30ºC. El método de descongelación deberá ser adecuado al método de congelamiento; las recomendaciones explícitas en el Certificado de Congelación de Embriones constituye la mejor guía. Los embriones deberán transferirse tan rápido como sea posible luego de su descongelación.

Referencias 1. ADAMS, C.E. (ed). 1982. Mammalian Egg Transfer. C.R.C. Press Inc., Boca Raton, FL USA. 2. BETTERIDGE, K.I. (ed). 1977. Embryo Transfer in Farm Animals. Monograph 16, Agriculture Canada, Ottawa, Ont., Canadá. 3. ELSDEN, R.P. 1980. Bovine embryo transfer. Proc. Soc. Therio., Omaha, NE USA. pp 101-133. 4. FOOTE, R.H. and ONUMA, H. 1970. Superovulation, ovum collection, culture and transfer: A Review. J. Dairy Sci. 53: 1681-1692. 5. LEIBO, S.P. 1983. Field trial of one-step frozen bovine embryos transferred non-surgically. Theriogenology 19: 139. 6. LINDNER, G.M. and WRIGHT, R.W. Jr. 1983. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology 20: 407-416. 7. MAPLETOFT, R.J. 1980. Embryo transfer for the practitioner. Proc. 13th Ann. Meet. Am. Assoc. Bovine Pract. Toronto, Canadá, pp. 154-162. 8. MAPLETOFT, R.J. 1982. Superovulation and recovery of ova from the bovine. Proc. Owners and Managers Workshop - VII Ann. Meet. IETS, Denver, CO USA, pp. 37-47. 9. MAPLETOFT, R.J. 1985. Embryo transfer in the cow: General procedures. Proc. Roundtable Meet. on Sanitary Problems Related to Embryo Transfer. Paris, 9 Dec. 1985, in press. 10. MAURER, R.R. 1978. Freezing mammalian embryos: A Review of the techniques. Theriogenology 9: 45-68. 11. SCHNEIDER, U. and MAZUR, P. 1984. Osmotic consequences of cryoprot ectan permeability and its relationship to the survival of frozen-thawed embryos. Theriogenology 21: 68-79. 12. SHEA, B.F. 1981. Evaluating the bovine embryo. Theriogenoloy 15: 31-42. 13. SEIDEL, G.E.Jr. and SEIDEL, S.M. 1981. The embryo transfer industry. En: New Technologies in Animal Breeding. B.G. Brackett, G.E. Seidel Jr., and S.M. Seidel (eds), Academic Press, New York, pp. 41-80. 14. SEIDEL, G.E.Jr. 1981. Superovulation and embryo transfer in cattle. Science 211: 351-358. 15. SEIDEL, G.E.Jr., ELSDEN, R.R., TAKEDA, T. and FARRAND, G.D. 1983. Field trials with cryopreserved bovine embryos. En: Fertilization of the Human Egg in Vitro. H.M. Beier and H.R. Lindner (eds), SpringerVerlag, Berlin, pp. 343-352. 16. UMBAUGH, R.E. 1949. Superovulation and ovum transfer in cattle. Am. J. Vet. Res. 10: 295-305. 17. WILLETT, E.L., BLACK, W.G., CASIDA, L.E., STONE, W.H. and BUCKNER, P.J. 1951. Successful transplantation of a fertilized bovine ovum. Science 113: 247. 18. WRIGHT, J.M. 1981. Non-surgical embryo transfer in cattle. Theriogenology 15: 43-56.

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CAPITULO II Recomendaciones para la manipulación Sanitaria de embriones Introducción El presente capítulo trata sobre la forma en que los embriones deben manipularse entre la colección y la transferencia, a fin de prevenir la posibilidad de transmisión de agentes patógenos. Durante estos procedimientos es importante la utilización de técnicas asépticas como el empleo de material y soluciones estériles. Como una medida de seguridad adicional, podrán usarse antibióticos en las soluciones que entren en contacto con el embrión. La membrana pelúcida es una barrera muy efectiva para los microorganismos. Las investigaciones han demostrado que, en la mayoría de las enfermedades de los bovinos, el lavado completo de los embriones incluidos en la zona pelúcida intacta eliminará completamente todo rastro de agentes patógenos (1, 5). En el caso de ciertos experimentos con unas pocas enfermedades virósicas específicas, en las que los embriones han sido expuestos a muy altos niveles virósicos, ha existido la tendencia a adherirse a la zona pelúcida tan firmemente como para hacer infeccioso el procedimiento de lavado. El tratamiento con tripsina podría ser necesario para tratar con este tipo de agentes específicos. Los embriones deberán examinarse utilizando un microscopio, para asegurar que la zona pelúcida esté intacta. Esta evaluación deberá tener lugar después del lavado y antes de la criopreservación de embriones. El congelamiento podría provocar lesiones en la zona pelúcida, por lo tanto, deberá ser eliminado cualquier agente patógeno antes de la criopreservación. Una vez que la zona pelúcida se ha roto y un virus ha ingresado a las células del embrión, el lavado ulterior no sería de ayuda alguna.

Preparación del medio Todo medio, solución, suero, enzima y agente crioprotector que entre en contacto con el embrión deberá estar libre de contaminantes y microorganismos vivos. A tal fin podrán adquirirse preparaciones estériles ya elaboradas o esterilizadas en laboratorio. Garantizar la esterilidad del componente proteico del medio puede presentar un problema. El uso tanto de albúmina de suero bovino (BSA, bovin serum albumin), fracción V o suero con radiación gamma serán suficientes para asegurar la esterilidad, de todas formas será necesario realizar una tarea adicional antes de que pueda ser usado confiadamente. Hasta que un producto universalmente aceptado esté disponible, el componente sérico utilizado en la recolección, cultivo y medios de lavado de embriones destinados a la exportación, deberá ser aprobado por el país importador. La mayoría de las soluciones biológicas activas deben ser esterilizadas por filtración a través de membranas. Si se filtraran grandes cantidades, es a menudo ventajoso prefiltrar la solución a través de una membrana con poros más grandes para evitar que se atasque el filtro de esterilización de 0,22 µm de poro. Se deberá usar preferiblemente presión positiva más que negativa a fin de prevenir la formación de espuma de la mayoría de las soluciones que contienen proteínas y un aumento excesivo del pH de las soluciones que bufferadas con bicarbonato. Soluciones salinas básicas pueden ser esterilizadas por medio de calor húmedo (esterilización al vapor). Deberán esterilizarse a una temperatura de 121ºC y a una presión de 104 kilopascal, por lo menos 30 minutos (16). Las tapas de rosca en todas las botellas deberán dejarse flojas durante la esterilización al vapor, y volúmenes mayores de 500 ml no deberán ser repartidos en cada botella a

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menos que se haya determinado que los volúmenes más grandes sean esterilizados bajo las condiciones empleadas.

Esterilización del equipo Todos los materiales no descartables que requieran esterilización deberán, en primer lugar, ser lavados con un detergente no tóxico, enjuagados muy bien con agua destilada, secados y posteriormente envueltos para su esterilización. Se dispone de un número de métodos para la esterilización, y la selección de éstos depende generalmente de la naturaleza del material que será esterilizado: 1) Calor seco: Los materiales que no son dañados por altas temperaturas podrán esterilizarse dejándolos durante 2 horas a 160ºC (6). Podrán señalarse con una pintura sensible al calor a fin de que indique la temperatura deseada. 2) Calor húmedo: (Esterilización al vapor). Deberá mantenerse una temperatura de 121ºC y una presión de 104 kilopascal por lo menos durante 30 minutos (6). A tal efecto pueden conseguirse indicadores que se colocan en/sobre el envase y que cambian de color cuando la esterilización se lleva a cabo adecuadamente. Los materiales a esterilizar deben ser envueltos en gasa o en otro material que permita que el vapor penetre y que más tarde permanezca impermeable a los microorganismos. 3) Vapor de óxido de etileno: (Esterilización con gas). Para asegurar la esterilización, los elementos deberán exponerse a un mínimo de 500 mg de óxido de etileno por 1000 cm3 (6). Los elementos a ser esterilizados deben limpiarse, secarse y ser desmontados a fin de permitir el fácil acceso del gas. El óxido de etileno penetra la mayoría de los materiales porosos y se disuelve en algunas sustancias plásticas y de goma. Después de la exposición al gas es esencial la adecuada ventilación2 de todos los materiales, para este proceso es de utilidad un aireador calefaccionado. Debe hacerse notar que el material utilizado para embalar los elementos a ser esterilizados con gas puede llegar a afectar tanto la absorción como la eliminación del gas. Únicamente aquellos materiales envueltos, que están siempre permeables al óxido de etileno podrán ser utilizados. 4) Antisépticos: Como por ejemplo el alcohol (70-90%) que es utilizado a menudo para desinfectar las superficies de los materiales. Será necesario ventilarlos un tiempo suficiente para permitir la evaporación del alcohol. Procedimientos de lavado de los embriones Ha sido demostrado que el lavado es efectivo para eliminar altos niveles de contaminación de la mayoría de los agentes patógenos (7) de los embriones. El procedimiento de lavado recomendado comprende el trasporte de embriones en grupos de 10 o menos, a través de 10 gotas con medio. Se utilizará una micropipeta estéril y nueva para a cada lavado, que deberá constituir una dilución 1:100 con respecto al lavado previo. Los embriones deberán ser agitados ligeramente en cada lavado y tan pronto como se haya efectuado esto, se pasará al lavado siguiente. Únicamente los embriones del mismo donante deberán lavarse juntos. Tratamiento con Tripsina En pruebas experimentales han sido expuestos embriones a elevadas concentraciones de varios virus y el lavado ha sido efectivo resultando embriones libres de agentes patógenos (1, 4). De todas formas, no sucede así en el caso en que los embriones son expuestos a otros virus: rinotraqueítis infecciosa bovina (8) y estomatitis vesicular (9). Los embriones expuestos a estos 2 virus requieren de un tratamiento con enzimas (tripsina) para asegurar que estén libres de infección (SINGH y THOMAS, no publicado).

2 Algunos materiales pueden requerir períodos de 30-40 dias (HAGELE y MAPLETOFT, no publicado)

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El siguiente método es recomendado para el lavado combinado y el tratamiento con tripsina de embriones: los embriones son lavados 5 veces en solución salina, buffer fosfatada (PBS), conteniendo antibióticos y 0,4% de BSA-V, y después a través de 2 gotas que contienen tripsina, pH. 7,6-7,8, por un tiempo total en la tripsina de 60-90 segundos. La tripsina estéril3 en una solución salina balanceada de Hanks sin Ca++ y Mg++, se utiliza a una concentración de 0,25%. Luego del tratamiento con tripsina, los embriones son sometidos a 5 lavados en una solución PBS conteniendo antibióticos y 2% de suero. Es importante reemplazar BSA fracción V por suero en el lavado, después del tratamiento con tripsina a fin de asegurar la inactivación de la tripsina.

Evaluación de los embriones para el control de enfermedades Todos los embriones deberán tener una zona pelúcida intacta y libre de material adherente. Para asegurar esto, cada embrión deberá examinarse en toda su superficie y a no menos de una ampliación de 50x. Los embriones se hacen rodar suavemente en el fondo de la placa de cultivo, de manera que toda la superficie de la zona pelúcida pueda examinarse. Esta evaluación tendrá lugar después del lavado y antes de la criopreservación del embrión. Examen de las muestras En este momento la presencia de microorganismos no podrá ser examinada directamente en el embrión antes de la transferencia a la receptora ya que los procedimientos del test destruirían a los embriones. El estado sanitario de los embriones deberá ser deducido del estado del estado sanitario de la donante y del progenitor, o por análisis de otras muestras. Las siguientes muestras han sido sugeridas como indicadoras de la sanidad del embrión: el líquido de recolección, el medio de lavado de los embriones, y todos los huevos sin fertilizar y embriones no transferibles de la misma donante. Si dichas muestras deben destinarse a un examen, deberán prepararse de acuerdo con las siguientes condiciones:

1. Fluidos de recolección: a. Método por gravitación de recuperación de embriones: El líquido de recolección deberá colocarse en un recipiente esterilizado, como por ejemplo una probeta, la cual deberá sedimentar (como mínimo 30 minutos). El material presente en la solución será entonces decantado. Después del aislamiento de los embriones, el líquido del fondo (100 ml) junto con cualquier desecho acumulado, será colocado en un recipiente estéril y conservado. b. Método de filtrado para la recuperación de embriones. Los medios de recolección deberán pasarse a través de un filtro para embriones a un cilindro estéril. El material de la solución deberá decantarse durante 30 minutos como mínimo. El filtro deberá lavarse bien con un nuevo medio para la recuperación de embriones. Luego que éstos han sido localizados y transferidos al primer envase de lavado, todos los medios que fueron utilizados para lavar el filtro deberán conservarse en un recipiente estéril, al cual deberán agregarse 100 ml del líquido de recolección (conjuntamente con cualquier resto de sedimentos extraídos del fondo del cilindro). Esos fluidos deben ser conservados.

2. Lavados:

3 Tripsina (1:250) tiene una actividad tal que 1g puede hidrolizar 250g de caseina a 25oC, pH 7,6 en 10 minutos.

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El medio utilizado para los últimos 4 lavados (7, 8, 9, 10) de embriones deberán ser agrupados y conservados. 3. Embriones y ovocitos sin fertilizar: Todos los embriones degenerados y ovocitos sin fertilizar, recolectados de la donante, deberán ser agrupados, lavados 10 veces y conservados. Antes del ensayo, deberán fragmentarse por medio de ultrasonido. Todas estas muestras (medios de recolección, de lavado como así también embriones/ovocitos) deberán conservarse a 4o C hasta el análisis. Si éste no pudiera llevarse al cabo de 24 horas, las muestras deberán que ser almacenadas a -70ºC. La razón para examinar el líquido de recolección es que éste da un indicio de los agentes patógenos a los cuales pueden haber estado expuestos los embriones en el tracto reproductivo de la donante (por ej.: es un indicador del estado de salud de la donante). Es importante que una muestra adecuada de la recolección de fluidos sea examinada a fin de que los resultados sean confiables. Si esto no fuera posible, entonces la porción sin examinar deberá centrifugarse y el sedimento resuspendido y analizado. Los agentes patógenos que se encuentran en el fluido de recolección pueden ser removidos por medio de un lavaje adecuado (4). Además, el motivo fundamental para el examen de los últimos lavajes es que proporciona algunas indicaciones sobre la forma en que la receptora estará expuesta cuando sea transferido el embrión. Si los lavajes son utilizados como un indicador de la salud del embrión, es importante que toda la muestra sea examinada. Además si cada lavado es de 2 ml y las últimas 4 tienen que ser examinadas, entonces todo el pool de 8 ml deberá examinarse. El examen de los embriones degenerados y ovocitos sin fertilizar, recolectados de la donante, aporta un indicio de si los embriones han sido expuestos a un agente patógeno y también si se ha llevado a cabo un lavado apropiado. El objetivo es evaluar la sanidad de los embriones a transferir indirectamente a través de las estructuras desechadas. Los experimentos, en la actualidad, con embriones y ovocitos bovinos sustentan esta hipótesis, por ej.: el virus de la rinotraqueitis bovina infecciosa se adhiere a la zona pelúcida de embriones y ovocitos, sin considerar su estado de desarrollo y/o calidad. Qué tipo de muestras deberán ser examinadas en reemplazo de las pruebas serológicas u otras de la donante y progenitor de los embriones, es una decisión de las autoridades veterinarias nacionales. Sería muy importante, de todas formas, examinar el fluido de recolección y/o el medio empleado para lavar embriones/ ovocitos si la donante fuera seropositiva para una enfermedad en particular. Referencias 1. BOWEN, R.A.; HOWARD, T.H.; ELSDEN, R.P. and SEIDEL, G.E.Jr. 1983. Embryo transfer from cattle infected with bluetongue virus. Am. J. Vet. Res. 44: 1625-1628. 2. SINGH, E.L.; EAGLESOME, M.D.; THOMAS, F.C.; PAP-VID, G. and HARE, W.C.D. 1982a. Embryo transfer as a means of controlling the transmission of viral infections. I. The in vitro exposure of preimplantation bovine embryos to akabane, bluetongue and bovine viral diarrhea viruses. Theriogenology 17: 437-444. 3. STRINGFELLOW, D.A.; SCANLAN, C.M.; BROWN, R.R.; MEADOWS, G.B.; GRAY, B.W.; YOUNG-WHITE, R.R. 1984. Culture of bovine embryos after in vitro exposure to Brucella abortus. Theriogenology 21: 10051012. 4. HARE, W.C.D.; MITCHELL, D.; SINGH, E.L.; BOUILLANT, A.M.P.; EAGLESOME, M.D.; RUCKERBAUER, G.M.; BIELANSKI, A. and RANDALL, G.C.B. 1985. Embryo transfer in relation to bovine leukemia virus (BLV) control and eradication. Can. Vet. J. 26: 231-234.

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5. MALLEK, Z.; GUERIN, B.; NIEBART, M.; PAREZ, M. and THIBIER, M. 1984. Consequences de la contamination in vitro des embryos de souris et de vaches par Brucella abortus. Bull. Acad. Vet. France 57: 479-490. 6. Sterilization Aids 1977. Prepared by the Education and Research Depts. of the American Sterilizer Co., Erie, Pennsylvania. 7. SINGH, E.L. 1984. Disease transmission: Embryo-pathogen interactions in cattle. Proc. 10th Int. Congr. Animal Reproduction and A.I. Urbana-Champaign. Vol. IV: IX-17 to IX-24. 8. SINGH, E.L.; THOMAS, F.C.; EAGLESOME, M.D.; PAP-VID, G. and HARE, W.C.D. 1982c. Embryo transfer as a means of controlling the transmission of viral infections. II. The in vitro exposure of preimplantation bovine embryos to infectious bovine rhinotracheitis virus. Theriogenology 18: 133-140. 9. LAUERMAN, L.H.; STRINGFELLOW, D.A.; SPARLING, P.H.; CAUB, L.M. and ROBERTS, C.S. 1985. Vesicular stomatitis virus attached to zona pellucida-intact bovine embryos. Proc. Conf. Research Workers in Animal Disease. Chicago, IL USA, 11-12 Nov. 1985 (Abstr.).

CAPITULO III Identificación, certificación y registro

Introducción En un esfuerzo para asegurar la identificación precisa de los embriones, de los hijos de transferencia de embriones y de los progenitores, para asegurar que los embriones puedan ser relacionados con precisión con los certificados sanitarios y para evitar un mínimo de confusión cuando los embriones son trasladados de un profesional a otro, o de un país a otro, se recomiendan ciertos procedimientos para la identificación y certificación. Las asociaciones de criadores, las agencias nacionales de regulación, las organizaciones nacionales de transferencia de embriones y profesionales son instados a seguir las siguientes pautas: Algunas asociaciones de criadores pueden requerir la tipificación sanguínea, la certificación o registro de las compañías de transferencias embrionarias y la previa autorización para reproducir y multiplicar una madre y un padre dados por transferencia embrionaria. El IETS recomienda que, como mínimo, sean determinados los grupos sanguíneos de los donantes madre y padre(s), antes de la recolección de los embriones. Cuando los embriones tengan que ser recolectados para exportación, también se recomienda que la empresa o el profesional a cargo de las transferencias, estén registrados por una agencia de regulación nacional y sean miembros reconocidos en la organización nacional de transferencia de embriones. Esto es a fin de asegurar que el personal sea profesional, técnicamente competente, e ilustrado en los procedimientos necesarios para el control de las enfermedades.

Certificación y registro de la información Los formularios de registro de transferencias de embriones recomendados por la IETS han sido adoptados por muchas organizaciones de criadores como sus registros oficiales usados en relación con la inscripción de los nacimientos resultantes en sus respectivos herd books. La IETS estimula a las asociaciones de criadores así como a los sistemas oficiales a seguir estas formas estandarizadas que incluyen: A. Certificado de recolección B. Certificado de transferencia C. Certificado de congelación

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D. Solicitud para exportación Los embriones recolectados deben ser protocolados en el certificado A, que debe ser llenado y firmado por el Veterinario que los obtuvo. Cuando son transferidos, el formulario B será completado por la persona que los transfiere. El formulario C será llenado y firmado por la persona encargada de la congelación. El formulario D, consiste en un formulario A modificado que incluirá la firma del vendedor y el nombre y dirección del comprador. La identificación de los embriones se hará como en el formulario C. También se incluirá la identificación del exportador. Este formulario será presentado a la correspondiente asociación de criadores del país exportador de manera tal que ella pueda certificar la identificación de los embriones y proveer información tal como tipo sanguíneo de las donantes para el herd book u organismo del país receptor. Los formularios serán llenados por triplicado quedando en el caso de A, B y C el original para el propietario, copia al Veterinario y la última copia para el comprador. La forma de llenado de estos certificados está por lo general descripta en la parte posterior de los mismos. Una copia de los certificados A y B deberá acompañar el movimiento de cualquier embrión o grupo de embriones. En los formularios A y B sólo se incluirán embriones de una colecta. La información consignada en los formularios debe coincidir con la identificación mostrada en la pajuela o ampolla que contenga cada embrión congelado. Se usan códigos estandarizados para describir el estado de desarrollo y calidad de los embriones que se pueden encontrar en el reverso de los formularios. También el código para calidad es numérico. Los formularios descriptos pueden requerirse normalmente en las asociaciones de criadores o en los organismos oficiales involucrados.

Identificación de los embriones A. Pajuela y ampollas La IETS recomienda un sistema estandarizado para rotular pajuelas y ampollas. La información puede ser impresa a mano o máquina en la pajuela o ampolla que contiene los embriones. También una etiqueta engomada puede ser adherida en un extremo o enrollada en una pajuela de 0,25 ml que se insertará luego dentro de otra de 0,5 ml. La rotulación estandarizada incluye: 1) Unidad de identificación básica Ej. 515 HO 12468713 en la que 515 Código del Profesional u Organización de TE Antes que un Profesional pueda rotular material congelado para su comercialización, deberá solicitar a la IETS un Nº de identificación. La IETS asignará un número y mantendrá un registro permanente de sus declaraciones. El código consta de 3 dígitos que podrá expandirse a 4 al incrementarse el número de inscriptos. Una lista actualizada de los códigos puede ser solicitada a la IETS a través del pago correspondiente. HO Código de la raza Se usa un sistema de código de dos letras para identificar la raza que ha sido estandarizado en EE.UU. y que es aceptado por las asociaciones de criadores y por las autoridades gubernamentales. El código se encuentra en el reverso de los formularios. 12468713 Número de registro de la donante

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La donante es identificada con su número de registro siguiendo el código que identifica la raza el cual a su vez es seguido por el código que identifica al profesional o empresa. 2) Fecha de congelación La fecha de congelación es indicada con dos numerales para el año, dos letras para el mes y dos números para el día en ese orden. El código para los meses se encuentra en el reverso de los formularios. Esta fecha es esencial para reunir a un embrión con los formularios A, B y C. Esta fecha es crítica para recuperar embriones recuperados de una misma donante en diferentes fechas. 3) Número de embriones Cada pajuela o ampolla deberá tener indicado cuántos embriones contiene. Cuando hay más de un embrión se debe tratar de combinar a aquellos de las mismas características. 4) Información adicional de la donante y del toro La marca, nombre común, caravana o tatuaje se agrega en el rótulo a continuación (pero separado) del número de identificación. Puede ser seguido por la identificación del toro (número, nombre o código de la cabaña). Esta identificación es opcional. 5) Número propio de la pajuela o ampolla Cada pajuela/ampolla tendrá un número propio dentro de su respectiva fecha de colecta y congelación. El o los números permitirán distinguir entre ampollas/pajuelas de una misma colecta o congelación. Este número debe ser mostrado en el formulario D con el número de la caña en que está alojado. Esta identificación es necesaria para poder seguir sus antecedentes de origen en el momento de ser transferido o al registrar al animal que nazca posteriormente. Este número es colocado en el extremo de la pajuela de manera que sea lo primero que se ve de ella al ser extraída del nitrógeno líquido. Leyendo de izquierda a derecha, el rótulo en la pajuela deberá observarse como se muestra a continuación: Pajuela Nº

2

Código del Profesional

515 HO 88

raza

donante Nº

12468713 JA

14

Nombre donante

Corry

Nº o nombre del toro (opcional)

1234567

1 embrión

Año Mes Día Nº embrión envasado Fecha de congelación de la pajuela Se recomienda usar dos líneas para rotular pajuelas y 4 ó 5 para rotular ampollas. B. Rotulado de gobelets Cada gobelet deberá tener lo siguiente en su rótulo: 1) El Nº de la caña donde está alojado 2) El Nº de código de la IETS identificando el Profesional 3) Fecha de congelación como en la pajuela 4) Nombre y número de identificación de la donante 5) Nombre y número de identificación del toro C. Rotulado de las cañas

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1) La cabeza de la caña será rotulada siempre con un Nº propio que puede incluir el tatuaje, nombre común, etc. de la donante. Cuando es movido de su termo inicial, su Nº propio deberá ser acompañado del Nº de identificación de la IETS. El Nº propio y la identificación de la IETS son los números que deben estar grabados en forma indeleble y que serán exigidos. 2) El costado de la caña será rotulado como sigue: a. Nº propio de la caña b. Nombre o Nº de la donante y nombre del toro c. Nº de embriones en el gobelet d. Si es reacondicionado para movimientos, se agregará un sufijo A, B, C, etc. al Nº de la caña. Registros a conservar Si bien los formularios descriptos previamente (si son llenados completos y rápidamente) pueden constituir los registros mínimos para el propietario de la donante, el propietario de la receptora y el Veterinario, a continuación se hace un listado de los registros que se consideran esenciales. A. Un registro escrito de inseminación para cada embrión recuperado debe ser conservado. Este registro incluye el nombre y número de inscripción, código de la cabaña y fecha o código de la colecta. El Veterinario usará el registro escrito de inseminación cuando complete los formularios requeridos por la Asociación de Criadores. B. Un registro de todas las donantes de las que se recuperaron embriones detallando: 1. Nº y nombre de inscripción de la donante 2. Fecha de colecta 3. Nombre y Nº de inscripción y código de la cabaña de cada macho cuyo semen haya sido utilizado. Se incluirá la fecha de congelación del semen 4. Nº de embriones transferibles, incluyendo estado y calidad como establece la IETS 5. Identificación de las receptoras transferidas 6. Registro de los embriones divididos (si los hubiere) C. Un registro de todos los embriones congelados debe ser llenado en un formulario como es requerido por la respectiva Asociación de Criadores o la oficina de registro. 1. Los embriones congelados serán rotulados y clasificados de acuerdo con el procedimiento estandarizado por la IETS. 2. Un inventario de los embriones congelados y almacenados deberá ser conservado. 3. Un registro de los embriones divididos será conservado de manera tal que los animales que resulten de estos embriones puedan ser identificados en las solicitudes para su correspondiente inscripción. 4. La aptitud de todos los embriones recuperados deberá ser documentada. D. Los registros de IA, obtención de embriones, procesamiento, distribución, transferencia e inventario deberían ser conservados como un registro permanente. E. Las donantes serán identificadas en registros con sus nombres y números completos de inscripción. Los embriones no serán recolectados hasta disponer de una correcta identificación de la donante. F. Registro de la recolección de embriones, la transferencia a las receptoras e identificación de los embriones con certificación como requiera la Asociación de Criadores o la Agencia de Registros.

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G. Los médicos veterinarios u otros que compren o vendan embriones deberán conservar registros completos de las transacciones de todos los embriones identificados de acuerdo con normas de IETS. El registro de todas las ventas de embriones deberá consignar el nombre y dirección del comprador y la fecha de venta. H. Un registro de la identificación permanente de las receptoras con la identidad del embrión transferido será hecho en el momento de la transferencia. 1. La raza será indicada y se usarán los códigos para raza cuando sea apropiado 2. Si no estuviera inscripta, la receptora deberá ser identificada por uno o más de los siguientes métodos: a. numeración de organismo oficial en caravana b. número de una caravana plástica visible. Este número es único dentro del rodeo donde están las receptoras c. tatuaje d. marca I. Una organización o veterinario que posea un rodeo de receptoras identificará a éstas de acuerdo con el parágrafo anterior y mantendrá los siguientes registros: a. fecha de compra del animal b. nombre y dirección de la persona o firma a quién se compró c. registro oficial de salud (por ejemplo número de vacunación contra brucelosis) d. registro de evaluación sanitaria, vacunaciones y tratamiento antiparasitario mientras el animal estuvo en posesión de la organización o el Veterinario e. registro de la fecha en que cada embrión fue transferido y la fecha en que la receptora salió de la propiedad con el nombre y dirección de persona o firma que recibió dicha receptora. Estos registros indicarán la identidad del embrión.

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