MICROBIOLOGIA GENERAL TRABAJO PRACTICO Nº 2 CRECIMIENTO MICROBIANO CURVA DE CRECIMIENTO

Bibliografía

Capítulos 5 y 6

Objetivos Analizar el crecimiento bacteriano en distintas condiciones de cultivo y utilizando distintas técnicas de uso frecuente en el laboratorio de microbiología. ¾Analizar el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica y mediante el recuento de colonias a distintos tiempos de incubación. ¾Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva de crecimiento para cada cultivo. ¾Curva de crecimiento diaúxica. ¾Correlacionar temporalmente el crecimiento diaúxico con los eventos que ocurren a nivel molecular en la regulación del operón lac.

Crecimiento microbiano Temperatura Oxígeno pH Osm. Aw Presión Radiación

-Macro y micro nutrientes

Condiciones Ambientales

Prod. de E

Nutrientes -Aportados por el medio de cultivo

Síntesis macromolé macromoléculas

Crecimiento celular

Divisió División celular

Crecimiento de la población

Curva de crecimiento

Las cuatro fases de la curva de crecimiento Fase de crecimiento exponencial

Parámetros matemáticos para evaluar el crecimiento microbiano

Tasa de crecimiento (k):

Tiempo de generación (g):

Ejemplo: Cultivo bacteriano que pasa de 1 x 103 a 1 x 109 en 10 horas. Calcular k y g.

Medición del crecimiento microbiano

Diauxie (crecimiento diaúxico) • Patrón de crecimiento microbiano bifásico que tiene lugar cuando hay presentes dos sustratos diferentes que pueden ser utilizados como fuente de carbono (por ejemplo, glucosa y lactosa). • Este tipo de crecimiento microbiano es debido a la utilización secuencial de las distintas fuentes de carbono. • El metabolismo del microorganismo es selectivo para uno de los sustratos: primero utiliza el sustrato que permite un crecimiento más rápido y cuando este se agota comienza a metabolizar el otro.

Curva de crecimiento diaúxica

glucosa + lactosa: primero utiliza la glucosa y luego lactosa; notar la fase lag interna o intermedia.

Jacques Lucien Monod (February 9, 1910 – May 31, 1976). J. L. Monod acuñó el término francés “diauxie” en el año 1941 para describir el crecimiento de Escherichia coli y Bacillus subtilis en un medio definido conteniendo una mezcla de distintos azúcares. Posteriormente, basándose en el modelo de crecimiento diaúxico de E. coli propuso el modelo de regulación de expresión del operón lac. Recibió el premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1965 (compartido con François Jacob y Andre Lwoff).

Transcripción: “the players”

-RNA polimerasa -Promotor -Proteínas reguladoras--reguladores positivos y negativos -Secuencia Shine-Dalgarno sobre el transcripto (traducción)

Inducción / inhibición • Aumento/reducción de la expresión génica como consecuencia de un cambio en el ambiente (por ejemplo; nutrientes en el medio, temperatura, osmolaridad, fase de crecimiento). – Sustrato-----> expresión de las proteínas requeridas para el metabolismo (por ejemplo, lactosa). – Concentración de un metabolito esencial (por ejemplo. Fe+3; aminoácidos) regula la expresión de las proteínas necesarias para incorporarlos o sintetizarlos. Reducción o inhibición de la expresión cuando la concentración es alta e inducción cuando es baja. – Expresión de factores de virulencia inducida por contacto con el hospedador.

Regulación coordinada • La expresión de varios genes puede ser controlada en forma simultánea. • Operón: dos o más genes que se transcriben a partir del mismo promotor y cuya expresión es controlada por las mismas proteínas reguladoras. • Regulón: set de genes (y/o operónes) que se transcriben a partir de distintos promotores, pero su expresión es controlada por las mismas proteínas reguladoras.

Gen, operón, regulón…...

Operón:

lac, trp

Regulón:

fur

Ejemplo: operón lac Regulación transcripcional

Genes: metabolismo lactosa

Operador: sitio donde se une la proteína reguladora, en este caso el producto del gen lacI; generalmente se superpone con el promotor impidiendo de esta manera la unión de la ARN polimerasa.

Ejemplo: operón lac

Elementos regulatorios • Proteínas de control negativo (inhibidores): reducción de la transcripción. • Proteínas de control positivo (activadores): inducción de la transcripción.

Elementos regulatorios • Dos proteínas reguladoras alostéricas regulan la expresión del operón lac: LacI ------ alolactosa: regulador negativo CRP ------ AMPc: regulador positivo

Control negativo Control Negativo: la unión de la proteína inhibitoria LacI asegura la inhibición de la expresión del operón lac cuando no hay lactosa disponible. -La unión de LacI al operador (O) bloquea la unión de la ARN polimerasa al promotor (P) inhibiendo la transcripción del operón lac. -La proteína LacI (codificada por el gen lacI) tiene 4 subunidades idénticas. La unión a LacI al efector alostérico alolactosa (derivada de la lactosa) disminuye la afinidad de unión de LacI al operador (O). -LacI se une al sitio O cuando no hay lactosa presente (y, por lo tanto, tampoco alolactosa). Resultado, no hay transcripción del operón lac. -Cuando hay lactosa disponible, la alolactosa se une a LacI produciendo un cambio conformacional de la proteína regulatoria y esta ya no se une al sitio operador. Resultado, se transcribe el operón lac.

alolactosa

galactosa-(β1-4)-glucosa

galactosa-(β1-6)-glucosa

La lactosa, una vez en el citoplasma bacteriano, es transformada en alolactosa por la β-galactosidasa.

Control positivo Control positivo: asegura que la transcripción del operón lac se mantenga en un nivel muy bajo (basal) cuando hay glucosa disponible. •

La proteína reguladora, CRP (Catabolite Regulatory Protein; or the Catabolite Activator Protein or CAP) es un regulador global que afecta la expresión de varios promotores. Su unión depende de la concentración del efector, AMPc.

•

La concentración de AMPc es baja cuando hay glucosa disponible (el transporte de glucosa inhibe la enzima adenilato ciclasa, PTS transport system), y alta cuando no hay glucosa.

•

La unión del complejo proteína CRP:AMPc facilita la unión de la ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción de varios operónes, incluido el operón lac, que codifican para las proteínas necesarias para el metabolismo de distintos azúcares.

Sistema de fosfotransferencia dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS)

-El transporte de glucosa modula la concentración interna de AMPc. -El complejo CRP:AMPc activa la expresión del operón lac (y otros). -Azúcares incluídos: glucosa, fructosa, manosa, galactitol, manitol, sorbitol, xilitol y N-acetilglucosamina.

El operón lac y sus elementos de control

Resumiendo