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CALIDAD DE SEMILLAS EN PARTIDAS COMERCIALES DE RAIGRÁS PERENNE (Lolium perenne L.) EN LA ARGENTINA COMPARADAS POR LOS TESTS DE FLUORESCENCIA Y DE PREFOLIACIÓN1 MABEL N. COLABELLI2, ANNA PERETTI3, SILVINA SAN MARTINO4 Y MARIA G. CENDOYA5

RESUMEN - En la Argentina, el raigrás es la tercera gramínea forrajera más importante. Las partidas comerciales de semillas de Lolium perenne L. (raigrás perenne) están generalmente contaminadas con semillas de Lolium multiflorum Lam. (raigrás anual), lo que disminuye su valor agronómico y económico. La identificación rápida de las dos especies por la morfología de sus semillas no ha sido posible hasta el presente. En los Laboratorios de Análisis de Semillas del país se utiliza habitualmente el test de fluorescencia en plántulas. Pero este test posee limitantes debido a que no todos los cultivares de raigrás, ni los híbridos entre estas especies, reaccionan de las misma manera bajo la luz ultravioleta. La prefoliación, sin embargo, es una característica válida para diferenciar las dos especies en estado de plántula. Este estudio determinó la calidad de las semillas en muestras comerciales de raigrás perenne y la confiabilidad del test de fluorescencia para identificarlas, contrastando estos resultados con aquellos del test de prefoliación. Se analizaron 89 muestras de partidas comerciales de semillas de raigrás perenne para determinar: pureza físicobotánica, germinación, peso de 1000 semillas y test de fluorescencia y análisis de prefoliación en plántulas. El 48% de las muestras cumplió con las tolerancias oficiales establecidas para todos los parámetros de calidad. En la identificación de raigrás anual y perenne, el acuerdo entre ambos tests fue de 81%. El test de prefoliación ofrecería resultados más confiables que el test de fluorescencia en la identificación de las especies de raigrás; se sugiere su uso sólo ó como procedimiento alternativo al test de fluorescencia. Términos para indización: semillas, valor cultural, fluorescencia, prefoliación, raigrás. QUALITY OF COMMERCIAL SEED LOTS OF PERENNIAL RYEGRASS (Lolium perenne L.) IN ARGENTINA COMPARED THROUGH FLUORESCENCE AND VERNATION TESTS ABSTRACT - Ryegrasses are the third most important forage grasses grown in Argentina. Commercial seed lots of Lolium perenne L. (perennial ryegrass) are generally contaminated with seeds of Lolium multiflorum Lam. (annual ryegrass), which diminish their agronomic and economic values. The rapid identification of the species by morphological observation of the seeds is very difficult. Fluorescence test in seedling root is usually used in Seed Testing Labotatories in our country. But this test presents limitations since not all the ryegrass cultivars, nor all the hybrids between these species, show the same reaction under ultra violet light. Vernation, however, is a useful character to differentiate the two species at seedling stage. This study determined the seed quality in commercial samples of perennial ryegrass and the reliability of fluorescence test to identify them, contrasting their results with those of leaf vernation test. Eighty nine samples of commercial seed lots of perennial ryegrass were analyzed according to: purity analysis, standard germination and fluorescence test and vernation analysis in seedlings. Forty eight percent of the

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Aceito para publicação em 15.12.2001. Ing. Agr., D.E.A. de Biologie, Prof. Adjunto. Facultad de Ciencias AgrariasUniversidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP); RN 276 km 73.5 (7620) Balcarce, Argentina; [email protected] Licenciada, Maitrise, Prof. Titular, Facultad de Ciencias Agrarias/UNMdP.

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Profesora de Matemática, MSc., Prof. Adjunto, Facultad de Ciencias Agrarias/UNMdP. Licenciada en Matemática, MSc., Jefe de Trabajos Prácticos; Facultad de Ciencias Agrarias/UNMdP.

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samples complied with the levels officially established for all the quality parameters. In the identification of perennial and annual ryegrass, the agreement between both tests was of 81%. Vernation test should offer more reliable results that fluorescence test in identification of ryegrass species; it is suggested its use on its own or as alternative proccedure to fluorescence test. Index terms: seeds, crop value, fluorescence, vernation, ryegrass.

INTRODUCCIÓN En la Argentina, festuca, cebadilla y raigrás (RG) son las gramíneas forrajeras más importantes. La producción de semillas de raigrás perenne (RG perenne), Lolium perenne L., está limitada al sudeste de la provincia de Buenos Aires, donde son sembradas alrededor de 650.000 has con esta especie. La demanda interna de semillas está cubierta, en su mayor parte, con producción nacional certificada, estimada en 1000 tons anuales, y con aproximadamente 500 tons importadas (Argentina, 1999). El Instituto Nacional de Semillas (ex INASE) estableció oficialmente los valores de calidad para semillas forrajeras (Argentina, 1988). Aunque los semilleros declaren que su producción cumple con estos valores, es conveniente confirmar los parámetros de calidad. Estudios anteriores en el país mostraron que más del 50% del stock de semillas de gramíneas certificadas presentes en el mercado de forrajeras fueron de calidad inferior, y solamente 44% de las muestras de raigrás perenne (RG perenne) cumplieron con los requerimientos oficiales de calidad (Peretti & Escuder, 1990). Peretti et al. (1995) registraron también que el 66% de partidas de semillas de RG presentaba un alto grado de mezcla de las especies perenne y anual. Al estar las partidas comerciales de semillas de RG perenne contaminadas con semillas de RG anual (L. multiflorum Lam.), se disminuye su valor agronómico y económico. Para determinar fehacientemente su calidad, es necesario verificar el grado en el cual el RG anual contamina los lotes de RG perenne. La identificación rápida de las dos especies por la morfología de las semillas en el análisis de pureza físicobotánica no ha sido posible hasta el presente. Por lo tanto, en los Laboratorios de Análisis de Semillas, en el país, se utiliza habitualmente el test de fluorescencia en plántulas (Colbry, 1963), operativamente fácil, económico y rápido. Al realizar ese test, se acepta que, en general, plántulas de RG anual presentan raicillas fluorescentes y plántulas de RG perenne, raicillas no fluorescentes (ISTA, 1996). Este test posee limitantes debido a que no todos los cultivares perennes, ni anuales, ni los híbridos entre estas especies, reaccionan de la misma manera bajo la luz ultravioleta (ISTA, 1996 y Oregon

Seed Certification Service, 2000). Esta situación es conocida desde hace tiempo. Los primeros trabajos sobre la respuesta de fluorescencia de RG y los hábitos de crecimientos anual y perenne se deben a Gentner (1929), Nilsson (1930), Linehan & Mercer (1933). En 1960, la Association of Official Seed Analysts (Justice, 1962) encomendó un estudio sobre la confiabilidad del test de fluorescencia en RG, para diferenciar semillas de las especies anual y perenne. Como resultado de ello, Graham Copeland (1962) informó que variedades puras de RG anual, mayoritariamente fluorescentes, reportaron un bajo nivel de no fluorescencia (0% a 6,7%) y que variedades puras de RG perenne, mayoritariamente no fluorescentes, reportaron fluorescencia en 0% hasta 18,7%. Por otra parte, Nyquist (1963) encontró que no existe ligamiento genético entre la fluorescencia y las características del RG anual. Ulteriores estudios en USA han permitido caracterizar los cultivares de RG según el nivel de fluorescencia (VFL= Varietal Fluorescence) propio de cada uno, cuya lista actualizada periódicamente se publica en el AOSCA National Grass Variety Review Board (AOSCA, 1999). Ese dato es utilizado como control en los cálculos para la determinación del porcentaje de RG anual y perenne de una muestra (Oregon Seed Certification Service, 2000). En la Argentina, la determinación de las especies por fluorescencia se realiza según ISTA (1996), que admite que cultivares de RG perenne pueden desarrollar alguna respuesta de fluorescencia en plántulas (respuesta no típica para la especie). No existe una lista de VFL para los cultivares locales, ni se requiere consignar el nivel de fluorescencia en los descriptores de cultivares de RG, tal como en USA. Por lo tanto, para el cálculo de la “anualidad/perennidad” no se toma en cuenta, como control, el comportamiento de cada variedad en el test de fluorescencia. Esto aumenta la posibilidad de interpretar equivocadamente las plántulas fluorescentes (es decir, de identificar al RG perenne fluorescente como RG anual). La precisión en la determinación de la especie puede ser mejorada analizando la prefoliación (disposición de cada hoja al desplegarse desde la yema). El tipo de prefoliación fue utilizado por Cabrera (1970) para clasificar las especies de RG, presentando el RG anual prefoliación convoluta, y el RG perenne, prefoliación conduplicada. Más recientemente,

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Grabe (1998) reconociendo esta característica como válida para diferenciar las dos especies en estado de plántula, propuso el test de prefoliación como complementario al test de fluorescencia. Coincidiendo con este autor el ISTA Variety Workshop (ISTA, 1998) recomendó este método sólo ó como test alternativo al test de fluorescencia. Okora et al. (1999) demostraron que este test clasifica a las especies de RG de acuerdo con las demás características fenológicas que definen a las especies. En el presente estudio se ha tomado al test de prefoliación como referente con respecto al test de fluorescencia. Los objetivos del trabajo fueron evaluar la calidad de las semillas en muestras comerciales de RG perenne y comparar las clasificaciones de semillas de RG perenne obtenidas por los tests de fluorescencia y de prefoliación.

Para caracterizar la información relacionada a la calidad de las semillas, se utilizaron métodos descriptivos (medidas de posición, variación y gráficos de caja) (Jobson, 1991 y Montgomery & Runger, 1994). La proporción de plántulas fluorescentes, en cada cultivar, fue estimada en forma puntual y mediante intervalos del 95% de confianza (Montgomery & Runger, 1994). Para analizar la homogeneidad de la presencia de semillas de RG perenne en diferentes muestras de un mismo cultivar se utilizó un test de homogeneidad de proporciones (Conover, 1971 y Jobson, 1992). Los resultados de los tests de fluorescencia y de prefoliación fueron confrontados a través de una tabla de contingencia de 2x2; se calculó una medida acuerdo que mide la concordancia entre las dos formas de clasificación denominada K (Bishop et al., 1975), siendo

MATERIALES Y MÉTODOS Durante dos años, (1996-1997), se analizaron 89 muestras de semillas de raigrás perenne declaradas como RG perenne, provenientes de productores, semilleros y acopiadores del sudeste de la provincia de Buenos Aires. Estas muestras correspondieron a partidas comerciales ofrecidas en el mercado de semillas forrajeras, comprendiendo los cultivares Nui (11 muestras) y Quichua (11 muestras), cultivares no identificados (61 muestras) y poblaciones naturales (seis muestras). Todas fueron procesadas para determinar: pureza físicobotánica, germinación y peso de 1000 semillas (ISTA, 1996). El valor cultural fue determinado como (porcentaje de pureza x porcentaje de germinación) / 100. Los resultados fueron analizados teniendo en cuenta los valores estándar de calidad admitidos por el Instituto Nacional de Semillas (Argentina, 1988), que estableció, para semillas identificadas: valor mínimo de pureza (92%), valor mínimo de germinación (80%), valor máximo de 8% para la materia inerte y de 5% para las semillas de otros cultivos. Para cada muestra, se sembraron 8x50 semillas, en germinación estándar. Las plántulas normales fueron sometidas a los 14 días al test de fluorescencia (Colbry, 1963), utilizando una lámpara ultravioleta de onda larga, UVSL-58, 220 volts, 12 AMS. Fueron transplantadas en diferentes macetas, para cada repetición, aproximadamente 75 plántulas normales por muestra. Las macetas fueron ubicadas en “screen-house” y la prefoliación de las plántulas fue evaluada en el estado de 4-5 hojas. El test de prefoliación consistió en evaluar visualmente cada plántula para determinar si la prefoliación fue convoluta ó conduplicada.

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K=

Σ p -Σ (p . p ) 1 - Σ (p . p ) i

ij

i+

i

i

i+

+i

+i

donde pij es la probabilidad de que una plántula sea clasificada en la celda ij (es decir clasificada en la categoría i por el test de fluorescencia y en la categoría j por el test de prefoliación), mientras que pi+ y p+i son las probabilidades marginales de cada test. Valores de K inferiores a 0,4 indican un bajo acuerdo, valores entre 0,4 a 0,8 muestran un moderado acuerdo y valores superiores a 0,8 indican un excelente acuerdo. El estimador se calculó reemplazando las probabilidades teóricas por las proporciones observadas y se realizó el test correspondiente, con un nivel de significación del 0,05. Todos los análisis fueron realizados usando el sistema SAS (SAS Institute, 1990). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las medidas descriptivas relativas a las variables de calidad registradas se consignan en la Tabla 1. El 86,50% de las muestras superó el estándar oficial para germinación y solamente el 56,0% superó el valor mínimo para pureza. Sin considerar la especie de RG, el valor promedio de pureza fue 88,6%. Esto puede ser debido a la presencia relativamente grande de semillas de otros cultivos (47,0%) y de materia inerte en las muestras (34,0%); por ello, solamente 73,2% y 72,3% de las muestras superaron las tolerancias admitidas para germinación y pureza. El peso promedio de 1000 semillas fue de 2,03g, con una desviación relativamente alta (0,53g).

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TABLA 1. Medidas descriptivas de semillas de raigrás perenne (mínimo, máximo, media, mediana y desviación estándar) para pureza (pureza), germinación (germinación), semillas de otros cultivos (otros cultivos), materia inerte (inerte) y valor cultural (y. cultural), todos ellos expresados en porcentajes) y peso de 1000 semillas en gramos (peso), de todas las muestras analizadas. Porcentaje de muestras que cumplieron con el estándar oficial1. Mínimo Máximo Pureza (%) Germinación (%) V. cultural (%) Peso (g.) Inerte (%) Otros cultivos (%) 1

44,0 23,0 22,8 1,34 0,0 0,0

100,0 99,0 98,5 4,76 34,0 47,0

Media 88,6 89,2 79,2 2,03 6,6 5,2

Mediana Desviación 95,0 93,0 84,5 1,91 4,0 0,9

13,97 12,71 17,84 0,53 7,37 9,34

Muestras (%) que superaron el estándar oficial 56,0 86,5 – – 72,3 73,2

Tolerancias admitidas por el Instituto Nacional de Semillas (INASE) para raigrás: mínimo de pureza = 92%, mínimo de germinación = 80%, máximo de materia inerte = 8% y máximo de semillas de otros cultivos = 5%.

El 74% de las partidas comercializadas presentó un alto Para determinar el porcentaje de semillas de RG perenne valor cultural (superior a 73,6%), obtenido por registros de presentes en cada muestra, las plántulas fueron sometidas al pureza y germinación superiores a los mínimos oficiales. test de fluorescencia. Si las partidas son declaradas como L. Mientras, solamente 48% de las muestras superó los valores perenne, se esperaría una respuesta negativa al test. Cerca de estándar establecidos oficialmente para todos los parámetros 88% de las muestras presentó plántulas fluorescentes, con de calidad. Los datos registrados permiten inferir que en el porcentajes de fluorescencia variando de 1% a 97%. Se analizó mercado de semillas forrajeras el valor de germinación es la variación de la fluorescencia entre las muestras de cada considerado el dato más válido, y que los productores no cultivar y de las poblaciones naturales (Tabla 2), destacándose otorgan importancia a los otros parámetros que definen la el bajo porcentaje de fluorescencia en Quichua (5,56%) y los calidad. Estos resultados coinciden con los de Peretti & Escuder (1990) y Peretti et al. (1995), sobre la calidad de semillas forrajeras en el sudeste de la provincia de Buenos Aires. Los valores de calidad para los cultivares y las poblaciones son presentados en forma comparativa en los gráficos de caja (Figura 1). En esta figura, la medida de variación está dada por el largo de la caja (rango intercuartil, IQR) y por el largo de las líneas verticales (whiskers). Puede verse que las muestras de Quichua y Nui mostraron valores de pureza, germinación y valor cultural uniformes, generalmente dentro de los límites establecidos oficialmente, mientras que la mediana asimétrica y los "whiskers" mostraron valores bajos para germinación y para el valor cultural más extremos que los valores altos. Los cultivares no identificados mostraron una mayor dispersión FIG. 1. Diagramas de caja para valores de pureza, germinación, valor cultural, materia inerte, semillas de otros cultivos, clasificados para que los cultivares identificados, con muchos cada cultivar y poblaciones naturales y sus limites de tolerancias valores por fuera de los "whiskers" en todas oficiales. las variables, mientras que las poblaciones Leyenda: Tolerancias establecidas por INASE para raigrás: Mínimo para pureza 92% ( −); mínimo para 80% (− −); máximo para materia inerte 8% (……); máximo para semillas de otros cultivos naturales presentaron un alto porcentaje de germinación 5% (- - -); *Valores extremos lejanos; ° Valores extremos no lejanos; Distancia intercuartil (IQR), Ι Máximos datos por fuera de los límites de tolerancias. y mínimos no extremos.

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TABLA 2. Estimación puntual e intervalos del 95% de confianza estimados para el porcentaje de plántulas fluorescentes, en cada cultivar de semillas de raigrás perenne y en poblaciones naturales. Cultivar

Estimación fluorescencia (%)

Intervalos del 95% de confianza

Quichua Nui Perennes no identificados Naturales

5,56 23,12 32,46 7,23

(5,2%; 5,9%) (21,7%; 24,4%) (31,8%; 33,1%) (6,9%; 7,6%)

elevados valores en Nui (23,12%) y en las muestras de origen no identificado (32,46%). Por el test de homogeneidad de proporciones, se detectó heterogeneidad (p