ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary. MICROBIAL ANTAGONISM AGAINST Phytophthora infestans (Mont) de Bary. Héctor Lozoya-Saldaña1, Manuel H. Coyote-Palma2, Ronald Ferrera-Cerrato3 y M. Encarnación Lara-Hernández3 1 Fitotecnia, 2Parasitología Agrícola. Universidad Autónoma Chapingo. 56230. Chapingo, Estado de México. ([email protected]). 3Edafología. Campus Montecillo. Colegio de Posgraduados. 56230. Montecillo, Estado de México.

RESUMEN

ABSTRACT

Los suelos del Valle de Toluca son supresivos contra Phytophthora infestans, agente causal del tizón tardío de la papa (Solanum tuberosum L.) y del jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.). Para explicar este fenómeno, se determinó la efectividad antagónica de cepas bacterianas y de Trichoderma aisladas en el mismo Valle contra el oomiceto en follaje de papa. En hojas desprendidas todas las bacterias, individualmente y mezcladas, tuvieron efecto inhibitorio sobre la infección por P. infestans. En 2001, tanto en invernadero como en campo, la mezcla de las cepas de Pseudomonas (Ps) fue la más efectiva en la supresión del patógeno. En siembra directa en campo, en 2002, la mezcla PsBurkholderia (Ps-Bu) indujo la mayor inhibición del área bajo la curva de progreso de la enfermedad, mientras que en maceta, también en campo, el mismo efecto fue ejercido por Ps-BuStreptomyces (Ps-Bu-St), asi como con la mezcla de Trichoderma. Los antagonistas ejercieron mejor su efecto en invernadero que en campo, y aunque como tratamientos únicos no lograron el mismo control que los fungicidas químicos, es posible su uso en áreas confinadas, o en regiones con menor presión de la enfermedad que el valle de Toluca, en combinación con otras medidas de manejo de P. infestans.

The soils of the Toluca Valley are suppressive against Phytophthora infestans, the causal agent of late blight in potato (Solanum tuberosum L.) and tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). To explain this phenomenon, the antagonistic effectiveness was determined of bacterial strains and of Trichoderma isolated in the same Valley against the oomycyte in potato foliage. In detached leaves, all of the bacteria, individually and mixed, had an inhibitory effect on the infection by P. infestans. In 2001, both in the greenhouse and in the field, the mixture of strains of Pseudomonas (Ps) was the most effective in suppressing the pathogen. In direct sowing in the field, in 2002, the mixture PsBurkholderia (Ps-Bu) induced the highest inhibition of the area under the disease progress curve, whereas in pots, also in the field, the same effect was exerted by Ps-Bu-Streptomyces (Ps-BuSt), as well as with the mixture of Trichoderma. The antagonists exerted their effect better in the greenhouse than in the field, and although as unique treatments they did not achieve the same control as the chemical fungicides, their use is possible in confined areas, or in regions with less pressure of the disease than in the Toluca Valley, in combination with other management measures of P. infestans.

Palabras clave: Control biológico, tizón tardío, papa.

Key words: Biological control, late blight, potato.

INTRODUCCIÓN

INTRODUCTION

E

P

l tizón tardío de la papa, causado por Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es el principal factor limitativo en la producción de papa en áreas productoras bajo condiciones de temporal (Niederhauser, 1956) o de riego por aspersión. No obstante, en el valle de Toluca se ha observado que cuando las variedades susceptibles son atacadas, la infección de tubérculo es limitada y no corresponde en severidad a la del follaje (Reddick, 1932; LozoyaSaldaña y Hernández-Vilchis, 2001a), a pesar de la presencia del patógeno (Fernández-Pavía et al., 2004), lo que sugiere la posibilidad de la supresividad del suelo para dicho patógeno. Varios microorganismos

otato late blight, caused by Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is the main limitative factor in potato production in areas under rainfall conditions (Niederhauser, 1956) or with sprinkle irrigation. However, in the Toluca Valley it has been observed that when the susceptible varieties are attacked, the infection of the tubers is limited and does not correspond in severity to that of the foliage (Reddick, 1932; Lozoya-Saldaña and Hernández-Vilchis, 2001a) despite the presence of the pathogen (Fernández-Pavía et al., 2004), which suggests the possibility of suppressiveness of the soil for this pathogen. Various microorganisms have been identified as possible causes of the suppressive effect in vitro (personal communication4). As a follow up to these studies, the

Recibido: Abril, 2005. Aprobado: Mayo, 2006. Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 40: 491-499. 2006.

491

AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2006

han sido identificados como posibles causantes del efecto supresivo in vitro (comunicación personal4). En seguimiento de estos estudios, se planteó el presente trabajo con el objetivo de cotejar dicha supresividad in vivo, en follaje de papa, bajo condiciones de cámara húmeda, invernadero y campo, y cuantificar su potencial para el control biológico de P. infestans.

MATERIALES

Y

MÉTODOS

Cepas de P. infestans y de los microorganismos antagónicos Las cepas de Phytophthora infestans 98a 22/1 (A1); 98a 10/2 (A2) y 98b 1/1 (A1) utilizadas como inóculo en el laboratorio e invernadero, fueron proporcionadas por el Programa Internacional Cooperativo del Tizón Tardío de la Papa (PICTIPAPA, A. C.), y se incrementaron como se describe en Grünwald et al., 2001. Los microorganismos bacterianos antagónicos los proporcionó el Área de Microbiología de Suelos del Instituto de Recursos Naturales del Colegio de Posgraduados, Montecillo, Edo. de México (Cuadro 1). Las cepas de Trichoderma se obtuvieron del valle de Toluca y de chinampas, aislándolas de la rizosfera, rizoplano, caulosfera o filosfera de las variedades de papa Alpha (susceptible a P. infestans), Norteña y Rosita (resistentes) en el Campo Experimental ICAMEX/INIFAP/ PICTIPAPA, en Metepec (valle de Toluca) durante los ciclos de cultivo de 1998 y 1999 (Alarcón, A. y Ferrera-Cerrato, R., comunicación personal). Activación y preservación de microorganismos antagónicos Las cepas bacterianas seleccionadas se activaron en placas de agua-agar (AA) y las de los hongos en papa dextrosa agar (PDA). Los incrementos se obtuvieron en caldo nutritivo de estos mismos medios, primero en agitación, en frascos Erlenmeyer de 75 mL colocados en un agitador incubador horizontal (New Brunswick, Scientific-Edison) a 160 rpm a 28 °C en oscuridad por 72 h. Posteriormente, 5 mL de una suspensión de 109 unidades formadoras de colonias (UFC) se sembraron en un fermentador, consistente en 500 mL de medio líquido en matraces erlenmeyer de 1000 mL conectados en serie con oxigenación de una bomba de pecera, a temperatura y luminosidad del ambiente interior del laboratorio. A los cinco días se cuantificaron en promedio 81.3×106 UFC mL−1. Evaluación del antagonismo en laboratorio con hojas desprendidas Se hicieron enfrentamientos de dos grupos de antagonistas, individuales y en mezcla, contra dos tipos de inóculo del patógeno, esporangio o zoospora, para un total de cuatro ensayos, considerando a cinco folíolos de cada hoja como unidad experimental, en un diseño completamente al azar con seis repeticiones. Dos ensayos fueron con los primeros seis antagonistas de la columna de la 4

Abato, Z. M.; Alarcón, A.; Ferrera-Cerrato, R.; Torres, L. J. M.

492

VOLUMEN 40, NÚMERO 4

present work was carried out with the purpose of comparing this suppressiveness in vivo, in potato foliage, under conditions of moist chamber, greenhouse and the field, and to quantify its potential for the biological control of P. infestans.

MATERIALS

AND

METHODS

Strains of P. infestans and of the antagonistic microorganisms The strains of Phytophthora infestans 98a 22/1 (A1); 98a 10/2 (A2) and 98b 1/1 (A1) used as inoculum in the laboratory and the greenhouse, were provided by the Programa Internacional Cooperativo del Tizón Tardío de la Papa (PICTIPAPA, A.C.), and were increased following Grünwald et al., 2001. The antagonistic bacterial microorganisms were provided by the Área de Microbiología de Suelos of the Instituto de Recursos Naturales of the Colegio de Posgraduados, Montecillo, State of México (Table 1). The strains of Trichoderma were obtained from the Valley of Toluca and from chinampas, isolating them from the rhizosphere, rhizoplane, caulosphere or phylosphere of the potato varieties Alpha (susceptible to P. infestans), Norteña and Rosita (resistant) in the ICAMEX/ INIFAP/PICTIPAPA Experimental Station, in Metepec (Toluca Valley) during the growing seasons of 1998 and 1999 (Alarcón, A. and Ferrera-Cerrato, R., personal communication). Activation and preservation of antagonistic microorganisms The selected bacterial strains were activated in plates of wateragar (WA) and those of the fungi in potato dextrose agar (PDA). The increases were obtained in nutritive broth of these same media, first in agitation, in 75 mL Erlenmeyer flasks placed in a horizontal incubator agitator (New Brunswick, Scientific-Edison) at 160 rpm at 28 °C in darkness for 72 h. Next, 5 mL of a suspension of 109 colony formation units (CFU) were sown in a fermenter, consisting of 500 mL of liquid medium in Erlenmeyer flasks of 1000 mL connected in series with oxygenation from an aquarium pump, at room temperature and light of the laboratory. After five days, they were quantified with an average of 81.3×106 CFU mL−1. Evaluation of the antagonism in the laboratory with detached leaves Confrontations were made with two groups of antagonists, individual and mixed, against two types of inoculum of the pathogen, sporangia or zoospore, for a total of four assays, considering five leaflets of each leaf as experimental unit, in a completely randomized design with six replicates. Two assays were with the first six antagonists of the column to the left of Table 1 or Series A, of eight treatments (six individual confrontations, plus one of the mixture and a control without antagonists). Another two assays included 15 treatments (12 individual confrontations of the antagonists of the

ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

Cuadro 1.Cepas de bacterias antagónicas a P. infestans seleccionadas para el presente estudio. Table 1. Strains of bacteria antagonistic to P. infestans selected for the present study. Procedencia Cepa A1 A18 A23 A38 A44 A46 P14 P15 P21 P54 P61 P98

Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp.

Variedad de papa

Zona de aislamiento

Alpha Alpha Alpha Norteña Norteña Norteña Norteña Norteña Norteña Alpha Alpha Rosita

Tallo Tallo Tallo Tallo Hoja Hoja Rizoplano Rizoplano Rizoplano Tuberosfera Rizosfera Tuberosfera

izquierda del Cuadro 1 o Serie A, de ocho tratamientos (seis enfrentamientos individuales, más uno de la mezcla y un testigo sin antagonistas).Otros dos ensayos incluyeron 15 tratamientos (12 enfrentamientos individuales de los antagonistas de la columna de la derecha del Cuadro 1, más una mezcla de los seis primeros, RG1, y otra de los seis últimos, RG2, y el testigo). Hojas de papa de la variedad Alpha, libres del patógeno, desprendidas de plantas cultivadas en invernadero, de dos meses de edad, se inocularon con aspersión al envés con 40 mL−1 de 109 UFC mL−1 de las cepas antagónicas. Una vez escurridas y secas, se asperjaron con 100 mL−1 de una suspensión con 20×103 esporangios mL−1, o con zoosporas obtenidas a partir de igual cantidad de esporangios (160 000 mL−1) de la mezcla de los tres aislamientos de P. infestans, como ensayo preliminar para identificar tipo de inóculo del patógeno más infectivo. Las hojas se incubaron en cajas Petri como cámara húmeda a temperatura ambiente (15-20 °C) en luz difusa del interior del laboratorio, en agar-agua como cámaras húmedas. Siete días después se evaluó visualmente el porcentaje de infección respecto al total del área foliar inoculada. Evaluación de los antagonistas en condiciones de invernadero Este experimento tuvo seis tratamientos. 1) mezcla A (primeras seis cepas de la columna de la izquierda del Cuadro 1), 1010 UFC mL−1; 2) mezcla P (las seis últimas cepas de la columna de la izquierda del Cuadro 1), 1010 UFC mL−1; 3) mezcla de Trichoderma, 50.3×105 UFC mL−1; 4) producto biológico comercial Biopak–F®, 2 g L−1 de agua (cuatro especies de Trichoderma, 20 de bacterias, ácidos húmicos, extracto de algas y yuca); 5) mezcla de los fungicidas dimetomorf y metalaxil, 5 g L−1 de cada uno; 6) testigo absoluto sin tratamiento. El diseño experimental fue completamente al azar con seis repeticiones, siendo una maceta con una planta la unidad experimental. Se hicieron cinco aspersiones al follaje, iniciándose 30 días después de la siembra (dds) con intervalos de siete d entre cada aplicación. Conjuntamente las plantas fueron inoculadas en tres ocasiones (intervalo de 15 d, intercaladas entre las semanas 1, 3 y 5 de

Procedencia Cepa R5 R11 R16 R17 R19 R29 R33 R34 R35 R38 R44 R51

Pseudomonas sp Burkholderia Burkholderia Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Steptomyces Burkholderia Streptomyces Burholderia Streptomyces

Variedad de papa

Zona de aislamiento

Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Norteña Norteña

Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano

column on the right of Table 1, plus a mixture of the first six, RG1, and another of the last six, RG2, and the control). Potato leaves of the Alpha variety, free of the pathogen, detached from plants grown in the greenhouse, two months of age, were inoculated at the underleaf with 40 mL−1 of 109 UFC mL−1 of the antagonistic strains. Once drained and dry, they were sprayed with 100 mL−1 of a suspension with 20×103 sporangia mL−1, or with zoospores obtained from the same amount of sporangia (160 000 mL−1) of the mixture of three isolates of P. infestans, as a preliminary assay to identify the most ineffective type of inoculum of pathogen. The leaves were incubated in Petri plates as moist chamber at room temperature (15-20 °C) in diffused light of the interior of the laboratory, in agar-agar as moist chambers. Seven days later, a visual evaluation was made of the percentage of infection with respect to the total of the inoculated foliar area. Evaluation of the antagonists under greenhouse conditions This experiment included six treatments: 1) mixture A (first six strains of the column to the left of Table 1), 1010 UFC mL−1; 2) mixture P (the last six strains of the column to the left of Table 1), 1010 UFC mL−1; 3) mixture of Trichoderma, 50.3×105 UFC Ml−1; 4) commercial product Biopack-F®, 2 g L−1 of water (four species of Trichoderma, 20 of bacteria, humic acids, extracts of algae and yucca); 5) mixture of the fungicides dimetomorf and metalaxyl, 5 g L−1 of each; 6) absolute control without treatment. The experimental design was completely randomized with six replicates, with one pot containing one plant as the experimental unit. Five sprayings were applied to the foliage, beginning 30 days after planting (dap) with intervals of seven d between each application. All together, the plants were inoculated on three occasions (15 day interval, interspersed among weeks 1, 3 and 5 of the spraying of the treatments) with 20×103 sporangia mL−1 of the mixture of the three isolates of P. infestans. Relative humidity was higher than 90% and the temperature fluctuated from 15 to 25 °C in natural light cycles (12 h light/ darkness). To quantify the number of sporangia produced by P.

LOZOYA-SALDAÑA et al.

493

AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2006

la aspersión de los tratamientos) con 20×103 esporangios mL−1 de la mezcla de los tres aislamientos de P. infestans. La humedad relativa fue superior a 90% y la temperatura fluctuó de 15 a 25 °C en ciclos naturales de luz (12 h luz/oscuridad). Para contabilizar el número de esporangios producidos por P. infestans, seis folíolos de cada tratamiento con esporulación evidente se agitaron en 30 mL−1 de agua destilada estéril por dos min, luego se hizo el conteo de esporangios en un hematocitómetro (French y Hebert, 1982). La severidad de la enfermedad se calculó mediante lecturas semanales de porcentaje de infección en el follaje, de acuerdo con la escala de Henfling (1987). Con esta variable se estimó el Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (ABCPE), mediante la fórmula:

infestans, six leaflets of each treatment with evident sporulation were agitated in 30 mL−1 of sterile distilled water for two min, then the sporangia count was made in a hematocytometer (French and Hebert, 1982). The severity of the disease was calculated through weekly readings of percentage of the infection in the foliage, according to the Henfling scale (1987). With this variable, the Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC) was estimated, with the formula: ABDPC = Σ [(Yi+1+ Yi/2) (ti+1−ti)], where Yi is the reading of the infection and t is the lapse in days between readings (Fry, 1977). Both sporulation and severity were statistically analyzed with the S.A.S.® statistical program.

ABCPE = Σ [(Yi+1+ Yi/2) (ti+1−ti)], Evaluation of antagonism in the field donde Yi es la lectura de infección y t es el lapso en días entre las lecturas (Fry, 1977). Tanto la esporulación como la severidad se analizaron estadísticamente con el programa estadístico S.A.S.® Evaluación del antagonismo en el campo Durante los ciclos agrícolas de 2001 y 2002 se establecieron experimentos en el campo experimental del ICAMEX/PICTIPAPA/ INIFAP en Metepec, Toluca, Estado de México, bajo condiciones naturales de infección. En ambos ciclos se utilizó papa de la variedad Alpha y el diseño experimental fue completamente al azar con diez repeticiones por tratamiento. La unidad experimental fue de diez plantas. 2001: se establecieron los mismos seis tratamientos que se utilizaron previamente en el invernadero (mezclas A, P y TR, Biopak F®, dimetomorf-metalaxil y testigo sin protección). La agresividad del patógeno permitió cuatro aplicaciones de los tratamientos antes de acabar con el follaje. 2002: se incluyeron siete tratamientos: mezcla RG1; mezcla RG2, ambas a 1010 UFC mL−1; mezcla TR, 50.3×105 UFC mL−1; BiopakF®, 2g L−1; dimetomorf, 5g L−1; metalaxil, 4 mL/L−1; y el testigo absoluto. La agresividad natural del patógeno sólo permitió tres aplicaciones antes de matar a la planta. La única variable cuantificada en ambos experimentos fue la severidad de la enfermedad, mediante las lecturas semanales de daño foliar (Henfling, 1987), con la estimación posterior del área bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE). No se evaluó esporulación porque la infección múltiple natural es por dispersión de esporangios por el viento, y no permite precisar el efecto de los tratamientos sobre esta variable. Tampoco se obtuvo rendimiento de tubérculo porque el patógeno, al destruir al follaje en las etapas tempranas de desarrollo, no permitió a la planta llegar a su etapa fenológica de tuberización. Antagonistas en maceta-campo, 2002. En un tercer ensayo con el mismo diseño y tratamientos que en la siembra directa en campo, también en 2002, pero anticipando la epidemia, se sembraron tubérculos en macetas en invernadero, donde las plantas fueron mantenidas libres del ataque de P. infestans 42 d.

494

VOLUMEN 40, NÚMERO 4

During the agricultural cycles of 2001 and 2002, experiments were established in the ICAMEX/PICTIPAPA/INIFAP experimental Station in Metepec, Toluca, State of México, under natural conditions of infection. In both cycles, potato of the Alpha variety was used, and the experimental design was completely randomized with ten replicates per treatment. The experimental unit was of ten plants. 2001: the same six treatments were established that were previously used in the greenhouse (mixtures A, P and TR, Biopak F®, dimetomorf-metalaxyl and unprotected control). The aggressiveness of the pathogen allowed four applications of the treatments before the foliage was destroyed. 2002: seven treatments were included: mixture RG1; mixture RG2, both at 1010 UFC mL−1; mixture TR, 50.3×105 UFC mL−1; Biopack F® 2 gL−1; dimetomorf, 5 g L−1; metalaxil, 4 m L L−1; and absolute control. The natural aggressiveness of the pathogen only allowed three applications before killing the plant. The only variable quantified in both experiments was the severity of the disease, through the weekly readings of foliar damage (Henfling, 1987), with the posterior estimation of the area under the disease progress curve (AUDPC). Sporulation was not evaluated, because the natural multiple infection is by dispersion of sporangia by the wind, and it does not allow definition of the effect of the treatments on this variable. Tuber yield was not obtained either, because the pathogen destroyed the foliage in the early stages of development and did not allow the plant to reach its phenological stage of tuberization. Antagonists in pot-field, 2002 In a third assay with the same design and treatments as in the direct planting in the field, also in 2002, but anticipating the epidemic, tubers were planted in pots in the greenhouse, where the plants were maintained free from the attack of P. infestans 42 d. During this period, they were sprayed on two occasions with the respective treatments as preventive protection. Later, they were taken to the field, without removing them from the pots, and were subjected to four more applications, given that, as in the direct planting experiment, the severity of the disease did not allow the later development of the plants. The foliar damage was quantified.

ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

Durante este período se les asperjó en dos ocasiones con los tratamientos respectivos como protección preventiva. Posteriormente fueron llevadas al campo, sin sacarlas de las macetas, y se sometieron a cuatro aplicaciones más, ya que, al igual que en el experimento de siembra directa, la severidad de la enfermedad no permitió el desarrollo posterior de las plantas. Se cuantificó el daño foliar.

RESULTADOS

Y

DISCUSIÓN

Hojas desprendidas Hubo diferencias significativas (p≤0.05) entre cepas de la serie A respecto al porcentaje de infección. La presencia de las cepas A38 y A23 (Pseudomonas aisladas de tallo de las variedades de papa Alpha y Norteña, respectivamente) permitieron infecciones por P. infestans inferiores a 50% respecto al testigo, pero no hubo diferencia estadística con el tratamiento de la mezcla (52% de infección) aunque sí con el resto de los tratamientos al inocular con esporangios (Cuadro 2). Al inocular las hojas con zoosporas del patógeno, la cepa antagónica A44 (Pseudomonas sp. proveniente de hoja de la variedad Norteña) ejerció la mayor inhibición, permitiendo solamente 21.74% de infección, con similitud estadística con dos cepas y la mezcla, pero diferente al testigo. La cepa A38 fue la mas consistente en inhibir al patógeno, independientemente del tipo de inóculo, al permitir solo un 17 y un 26% de infección (Cuadro 2). La efectividad antagónica de las cepas fue mayor al aplicarse individualmente que en mezcla. La inoculación del tizón con zoosporas o con esporangios tuvo poca diferencia a favor de éstos últimos en cuanto a infección, a pesar de que la ausencia de pared celular de la zoospora la hace mas frágil al medio externo (Stanghellini y Miller, 1997). Con base en estos resultados, y considerando que en la naturaleza los esporangios son las unidades mas comunes de dispersión de Phythophthora (Ristaino y Gumpertz, 2000), los ensayos posteriores en el invernadero y en el campo sólo fueron inoculados con estas estructuras. Las cepas de la serie R ejercieron diferente grado de inhibición de la infección derivada de los dos tipos de inóculo. Inocular con esporangios R16 permitió la menor, seguida por R34, R35 y R38, mezcla RG1 y la R29; aunque no tuvieron diferencias significativas entre ellas, las cepas mencionadas si fueron estadísticamente diferentes al testigo. Al inocular con zoosporas, las mejores cepas para inhibir al patógeno fueron R5, mezcla RG2 y la cepa R11, seguidas por la R51 y la mezcla RG1 (Cuadro 2). La mezcla RG1 fue la única con igual grado de inhibición al enfrentarla a los dos tipos de inóculo.

RESULTS

AND

DISCUSSION

Detached leaves There were significant differences (p≤0.05) among strains of Series A with respect to the percentage of the infection. The presence of the strains A38 and A23 (Pseudomonas isolated from stems of the potato varieties Alpha and Norteña, respectively) allowed infections by P. infestans lower than 50% with respect to the control, but there was no statistical difference with the treatment of the mixture (52% infection), although there was statistical difference with the rest of the treatments when inoculating with sporangia (Table 2). When the leaves were inoculated with zoospores of the pathogen, the antagonistic strain A44 (Pseudomonas sp. from leaves of the Norteña variety) exerted the highest inhibition, permitting only 21.74% infection, with statistical similarity with two strains and the mixture, but different from the control. Strain A38 was the most consistent in inhibiting the pathogen, independently of the type of inoculum, permitting only 17 and 26% infection (Table 2). The antagonistic effectiveness of the strains was greater when applied individually than in mixture. The inoculation of the blight with zoospores or with sporangia had little difference in favour of the latter with respect to infection, despite the fact that the absence of the cell wall of the zoospore makes it more fragile to the external medium (Stanghellini and Miller, 1997). Based on these results, and considering that in nature sporangia are the most common units of dispersion of Phytophthera (Ristaino and Gumpertz, 2000), the later assays in the greenhouse and in the field were only inoculated with these structures. The strains of Series R exerted a different degree of inhibition of the infection derived from the two types of inoculum. To inoculate with R16 sporangia permitted the lowest, followed by R34, R35 and R38, mixture RG1 and R29; although there were no significant differences among them, the abovementioned strains were statistically different from the control. When inoculated with zoospores, the best strains for inhibiting the pathogen were R5, mixture RG2 and the strain R11, followed by R51 and the mixture RG1 (Table 2). The mixture RG1 was the only one with an equal degree of inhibition when confronted with the two types of inoculum. Evaluation of the antagonists under greenhouse conditions The mixtures A, TR and P, and Biopak-F, were statistically equal in their effectiveness against the pathogen, although the maximum control was obtained

LOZOYA-SALDAÑA et al.

495

AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2006

Evaluación de los antagonistas en condiciones de invernadero Las mezclas A, TR y P, y Biopak-F, fueron estadísticamente iguales en su efectividad contra el patógeno, aunque el máximo control se obtuvo con la mezcla de fungicidas (Cuadro 3). Los mejores tratamientos biológicos contra esporulación fueron la mezcla P y el producto Biopak F, ya que permitieron el menor número de esporangios y ninguno alcanzó la esporulación del testigo. Evaluación de los antagonistas en campo. 2001 Los agroquímicos comerciales fueron los que mejor controlaron al patógeno bajo condiciones naturales, aunque aún con ellos hubo infección, como se ha reportado previamente (Lozoya-Saldaña y HernándezVilchis, 2001b; Schwinn, 1983). El único tratamiento biológico estadísticamente diferente correspondió a la mezcla P, que en los primeros 37 dds mostró una tendencia más estable en el control del tizón tardío en campo. Los otros tres biológicos fueron estadísticamente iguales al del testigo sin protección, lo que demostró su ineficacia para controlar la enfermedad (Cuadro 3). El efecto antagónico de los microorganismos fue menor en campo que en el invernadero, pues en éste hubo inoculaciones limitadas y controladas en plantas protegidas del exterior, mientras que en el campo las infecciones son múltiples y continuas (Ristaino y Gumpertz, 2000). Además, bajo condiciones naturales, generalmente el antagonismo se identifica más en el suelo que en el follaje. Muchos antagonistas de este estudio fueron aislados de rizoplano. Antagonistas en campo. 2002 Siembra directa Se encontraron diferencias significativas entre tratamientos para el ABCPE (p≤0.05). La mezcla RG1 indujo la mayor supresión entre los biológicos (ABCPE de 686). Los otros tres tratamientos permitieron mayor daño y no presentaron diferencias estadísticas entre ellos ubicándose en un grupo independiente (letras ab, Cuadro 4). Los fungicidas químicos, aunque presentaron las medias más bajas, permitieron enfermedad, lo que indica la agresividad del patógeno y la posible generación de resistencia a los productos, mayormente al metalaxyl que es muy usado en México (Sujkowski et al., 1995).

496

VOLUMEN 40, NÚMERO 4

Cuadro 2. Infección por P. infestans en hojas desprendidas, con dos tipos de inóculo, en presencia de bacterias antagonistas. Table 2. Infection by P. infestans in detached leaves, with two types of inoculum, in the presence of antagonistic bacteria. Tratamientos

Inoculación con esporangios

Inoculación con zoosporas

Cepas bacterianas

Severidad (%) de infección

Severidad (%) de infección

Serie 2001 A1 A18 A23 A38 A44 A46 Mezcla a testigo

69.57 a† 65.22 a 43.48 ab 17.39 b 60.87 a 73.91 a 52.17 ab 100 a

69.57 73.91 43.48 26.09 21.74 60.87 43.48 100 a

ab† a abc bc c ab abc

Serie 2002 R5 R11 R16 R17 R19 R29 R33 R34 R35 R38 R44 R51 Mezcla RG1 Mezcla RG2 Testigo

73.91 86.96 26.09 65.22 47.83 43.48 60.87 34.78 34.78 39.13 56.52 52.17 43.48 60.87 100 a

30.43 34.78 52.17 60.87 47.83 60.87 56.52 60.87 52.17 52.17 73.91 43.48 43.48 30.43 100 a

c c bc abc bc abc abc abc bc bc ab bc bc c

abc ab e abcd bcde cde abcd de de cde bcde bcde cde abcd

†

Cifras con la misma letra no son estadísticamente diferentes (Tukey, p≤0.05).

with the mixture of fungicides (Table 3). The best biological treatments against sporulation were the mixture P and the product Biopak F, given that they allowed the least number of sporangia, and none achieved the sporulation of the control. Evaluation of the antagonists in the field, 2001 The commercial agrochemicals were those that best controlled the pathogen under natural conditions, although even with these there was infection, as has been previously reported (Lozoya-Saldaña and Hernández-Vilchis, 2001b; Schwinn, 1983). The only biological treatment that was statistically different corresponded to the mixture P, which in the first 37 dap showed a more stable tendency in the control of late blight in the field. The other three biological treatments were statistically equal to the unprotected

ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

Cuadro 3. Progreso del tizón tardío por efecto de los tratamientos durante el ciclo agrícola 2001. Table 3. Progress of late blight from the effect of the treatments during the 2001 agricultural cycle. Invernadero Tratamientos ABCPE Mezcla A Mezcla P Mezcla TR BIOPAK F DIMET-MET Testigo

448.58 a† 313.25 c 373.33b c 366.33b c 104.42 c 770.0 a

Esporangios por mL−1 59 37 49 37 12 76

500 500 667 000 333 500

a† ab ab ab b a

Campo ABCPE 1700.3 a† 1172.5 b 1570.8 a 1620.5 a 239.8 c 1698.2 a

†

Cifras con la misma letra no son estadísticamente diferentes, Tukey (p≤0.05). ABCPE = Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad. Unidades relativas al % de severidad en el tiempo.

Antagonistas en campo. 2002 En maceta La mezcla RG2 fue el tratamiento antagonista que mejor controló la enfermedad, al permitir la menor expansión del área bajo la curva de progreso de la enfermedad entre las mezclas de microorganismos, con diferencia estadística respecto a los otros tres tratamientos biológicos, que a su vez fueron estadísticamente iguales entre si y al testigo absoluto, aunque cabe señalar que ninguno de los anteriores superó a los agroquímicos (Cuadro 4). La edad del hospedante ayudó al control por los antagonistas e influyó en el retraso del ataque del tizón tardío, pues las plantas llegaron sanas al campo en su fase intermedia de desarrollo, por lo que la epifita se retrasó. La relación de la madurez del follaje y el ataque del tizón está ampliamente documentada (Visker, 2005). No se cuantificó tuberización porque el confinamiento en maceta no reflejaría el rendimiento de una siembra directa. Además, con excepción de los tratamientos con agroquímicos, la tuberización fue mínima por muerte prematura del follaje por el tizón en el resto de los tratamientos. La supresión de enfermedades mediante agentes de biocontrol se sustenta en las interacciones entre la planta, el patógeno, los agentes biocontroladores y el ambiente (Guetsky et al., 2002; Bao y Lazarovits, 2001). En nuestros estudios, la mayor inhibición de P. infestans con los tratamientos biológicos se observó en hojas desprendidas y después en invernadero, mientras que en el campo no se tuvo el mismo efecto, que concuerda con Lindow et al. (1996), quienes indican que comúnmente el control biológico de enfermedades en el campo muchas veces es menor y mas variable que bajo

Cuadro 4. Progreso de la enfermedad por efecto de los tratamientos en el campo. Ciclo agrícola 2002. Table 4. Progress of the disease from the effect of the treatments in the field. 2002 agricultural cycle. Siembra Directa

Trasplante

ABCPE

ABCPE

686 b† 801.5 ab 803.25 ab 830.2 ab 16.10 c 20.65 c 907.2 a

650.65 a† 520.80 b 621.6 a 692.3 a 12.25 c 9.45 c 716.1 a

Tratamientos Mezcla RG1 Mezcla RG2 Mezcla TR Biopak F Dimetomorf (Acrobat®) Metalaxil (Ridomil Gold®) Testigo absoluto

† Cifras con la misma letra no son estadísticamente diferentes, Tukey (p≤0.05). ABCPE = Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad.

control, which demonstrates their ineffectiveness for controlling the disease (Table 3). The antagonistic effect of the microorganisms was lower in the field than in the greenhouse, given that in the latter, there were limited and controlled inoculations in plants protected from the exterior, whereas in the field, the infections are multiple and continuous (Ristaino and Gumpertz, 2000). Furthermore, under natural conditions, the antagonism is identified more in the soil than in the foliage. Many antagonists of this study were isolated from the rhizoplane. Antagonists in the field, 2002 Direct planting Significant differences were found among treatments for the AUDPC (p≤0.05). The mixture RG1 induced the highest suppression among the biological treatments (AUDPC of 686). The other three treatments allowed greater damage and did not present statistical differences among each other, placing themselves in an independent group (letters ab, Table 4). The chemical fungicides, although they presented the lowest means, allowed disease, which indicates the aggressiveness of the pathogen and the possible generation of resistance to the products, especially to metalaxyl, which is frequently used in México (Sujkowski et al., 1995). Antagonists in the field, 2002 In pots The mixture RG2 was the antagonist treatment that best controlled the disease, as it allowed the least expansion of the area under the disease progress curve

LOZOYA-SALDAÑA et al.

497

AGROCIENCIA, JULIO-AGOSTO 2006

condiciones controladas o de confinamiento. Una explicación para esto en nuestro caso, fue que algunos antagonistas se aislaron del suelo y se aplicaron al follaje, en un ambiente desfavorable para ellos. Trichoderma, por ejemplo, es efectivo contra patógenos del suelo (Benhamou y Chet, 1993), pero no en follaje. No obstante, los antagonistas incluidos en el presente estudio podrían ser una alternativa para reducir el uso de fungicidas en invernaderos, en combinación con otras medidas, como el uso de variedades resistentes y reducción de humedad en el ambiente (Berger et al., 1996; Guetsky et al., 2002).

CONCLUSIONES Se demostró la actividad antagónica de los aislamientos bacterianos y fúngicos sobre el desarrollo de la enfermedad causada por Phytophthora infestans en hojas desprendidas y en plantas de papa en invernadero, aunque no se evitó la epifitia en el campo. Los antagonistas incluidos en el presente estudio tienen potencial para uso en ambientes controlados, o en regiones de menor presión de la enfermedad que el valle de Toluca, en combinación con otras prácticas de manejo, para el control del tizón tardío de la papa.

LITERATURA CITADA Bao, J. R., and G. Lazarovits. 2001. Differential colonization of tomato roots by nonpathogenic and pathogenic Fusarium oxysporum strains may influence Fusarium wilt control. Phytopathology 91: 449-456. Benhamou N., and I. Chet. 1993. Hyphal interactions between Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani: Ultrastructure and gold cytochemistry of the mycoparasitic process. Phytopathology 83: 1062-1071. Berger, F., H. Li, D. White, R. Frazer, and C. Leifert. 1996. Effect of pathogen inoculum, antagonist density, and plant species on biological control of Phytophthora and Pythium damping-off by Bacillus subtilis Cot1 in high-humidity fogging glasshouses. Phytopathology 86: 428-433. Fernández-Pavía, S. P., N. J. Grünwald, M. Díaz-Valasis, M. Cadena-Hinojosa, and W. E. Fry. 2004. Soilborne oopores of Phytophthora infestans in Central México survive winter fallow and infect potato plants in the field. Plant Dis. 88:29-33. French, E. R., y T. T. Hebert 1982. Métodos de investigación patólogica. Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura. San José, Costa Rica. pp: 168-211. Fry, W. E. 1977. Integrated control of potato late blight. Effect of polygenic resistance and techniques of timing fungicide applications. Phytopathology 67:415-420. Grünwald, N. J., W. G. Flier, A. K. Sturbaum, E. Garay-Serrano, T. B. M. van den Bosch, Ch. D. Smart, J. M. Matuszak, H. Lozoya-Saldaña, L. J. Turkensteen, and W. E. Fry. 2001. Population Structure of Phytophthora infestans in the Toluca Valley Region of Central México. Phytopathology 91:882-890. Guetsky, R., D. Shtienberg., Y. Elad., E. Fischer, and A. Dinoor. 2002. Improving biological control by combining biocontrol agents each with several mechanisms of disease suppression. Phytopathology 92: 976-985.

498

VOLUMEN 40, NÚMERO 4

among the mixtures of microorganisms, with statistical difference with respect to the other three biological treatments, which in turn were statistically equal among each other and the absolute control, although it should be pointed out that none of the above were superior to the agrochemicals (Table 4). The age of the host helped the control because of the antagonists, and influenced in the retardation of the attack of late blight, as the plants arrived healthy to the field in their intermediate development phase, thus the epiphyte was retarded. The relationship between the maturity of the foliage and the attack of the blight has been widely documented (Visker, 2005). Tuberization was not quantified because the confinement in pots would not reflect the yield of a direct planting. Furthermore, with the exception of the treatments with agrochemicals, tuberization was minimal due to the premature death of the foliage from the blight in the rest of the treatments. The suppression of diseases by means of biocontrol agents is based on the interactions among the plant, the pathogen, the biocontrol agents and the environment (Guetsky et al., 2002; Bao and Lazarovits, 2001). In our studies, the highest inhibition of P. infestans with the biological treatments was observed in detached leaves and then in the greenhouse, whereas in the field the same effect was not present, which coincides with Lindow et al. (1996), who indicate that biological disease control in the field is often lower and more variable than under controlled or confined conditions. One explanation for this in our case, was that some antagonists were isolated from the soil and applied to the foliage, in an environment that was unfavourable to them. Trichoderma, for example, is effective against pathogens in the soil (Benhamou and Chet, 1993), but not in foliage. However, the antagonists included in the present study could be an alternative for reducing the use of fungicides in greenhouses, in combination with other measures, such as the use of resistant varieties and the reduction of moisture in the environment (Berger et al., 1996; Guetsky et al., 2002.

CONCLUSIONS The antagonistic activity of the bacterial and fungal isolations on the development of the disease caused by Phytophthora infestans was demonstrated on detached leaves and in potato plants in the greenhouse, although epiphytia was not prevented in the field. The antagonists included in the present study have potential for use in controlled environments, or in regions of lower pressure of the disease than in the Toluca Valley in combination with other management practices, for the control of potato late blight.

ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

Henfling, J. W. 1987. Late blight of potato Phytophthora infestans. Technical Information Bulletin 4. International Potato Center, CIP, Lima, Perú. 25 p. Lindow, S. E., G. McGourty, and R. Elkins. 1996. Interactions of antibiotics with Pseudomonas fluorescens strain A506 in the control of fire blight and frost injury to pear. Phytopathology 86: 841-848. Lozoya-Saldaña, H., and A. Hernandez-Vilchis. 2001a. Postharvest decay of potato tubers in moist chamber and in two types of soil. Revista Mexicana de Fitopatología 19: 140-146. Lozoya-Saldaña, H., and A. Hernández-Vilchis. 2001b. Registered and section 18 compounds for control of late blight (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) in potatoes in Toluca, México. Agrociencia 35: 451-458. Niederhauser, J. S. 1956. The blight, the blighter, and the blighted. Agricultural Journal of the Rockefeller Foundation 19: 55-63. Reddick, D. 1932. Some diseases in wild potatoes in Mexico. Phytopathology 22: 609-612.

Ristaino, B. J., and M. L. Gumpertz. 2000. New frontiers in the study of dispersal and spatial analysis of epidemics caused by species in the Genus Phytophthora. Annu. Rev. Phytopath. 38: 541-576. Schwinn, F. J. 1983. New developments in chemical control of Phytophthora. In: Phytophthora its Biology, Taxonomy, Ecology, and Pathology. D. C. Erwin, S. Bartnicki-García, and P. H. Tsao (Eds). The American Phytopathological Society. APS PRESS. pp: 327-334. Stanghellini, M. E., and R. M. Miller. 1997. Biosurfactants. Their identity and potential efficacy in the biological control of zoosporic plant pathogens. Plant Dis. 81: 4-12. Sujkowski, L. S., B. A. Fry, R. J. Power, S. B. Goodwin, T. L. Peever, R. A. Halmen, and W. E. Fry. 1995. Sensitivity of Mexican isolates of Phytophthora infestans to chlorothalonil, cymoxanyl, and metalaxyl. Plant Dis. 79: 1117-1120. Visker, M. 2005. Association between late blight resistance and foliage maturity type in potato. Physiological and genetic studies. Wageningen University, the Netherlands. 160 p.

LOZOYA-SALDAÑA et al.

499