CAPÍTULO 2.2.2.

ENFERMEDAD DE AUJESZKY

RESUMEN La enfermedad de Aujeszky o seudo rabia porcina está causada por un alfaherpesvirus que infecta el sistema nervioso central y otros órganos, como el tracto respiratorio, en prácticamente todos los mamíferos excepto el hombre y los monos sin cola. Se asocia inicialmente con los cerdos, que representan su hospedador natural, en los que permanece latente después de la recuperación clínica. La enfermedad se controla por aislamiento de las piaras infectadas y mediante el uso de vacunas y la eliminación de los animales con infección latente. El diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky se realiza por detección del agente (aislamiento del virus, reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) y mediante la detección de una respuesta serológica en animales vivos. Identificación del agente: El aislamiento del virus de la enfermedad de Aujeszky se puede lograr inoculando en una línea celular susceptible, como la de riñón porcino (PK-15) o SK6, o en células de riñón de cultivo primario o secundario, un extracto de tejido, por ejemplo de cerebro y amígdalas, o de material recogido de la nariz/garganta. La especificidad del efecto citopático se comprueba por inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa o neutralización con un antisuero específico. También puede identificarse el virus usando PCR, pero esta técnica es aún muy novedosa. Pruebas serológicas: La presencia de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Aujeszky se demuestra por neutralización del virus, aglutinación en látex o enzimoinmunoensayo (ELISA). Se encuentran comercialmente disponibles varios tipos de ensayos ELISA por todo el mundo. Un suero internacional estandarizado por la OIE define el límite inferior de sensibilidad para pruebas rutinarias en los laboratorios que llevan a cabo el diagnóstico serológico de la enfermedad de Aujeszky. Desde 1990 es posible distinguir entre los anticuerpos producidos por la infección natural y los originados después de vacunación mediante el uso de vacunas con genes eliminados. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas, bien sean por virus vivos modificados o por antígenos de virus inactivados, deben evitar o al menos limitar la excreción de virus por parte de los cerdos infectados. Recientemente, estas vacunas convencionales se han visto reforzadas por la aparición de vacunas con virus vivos de la seudo rabia que llevan genes eliminados mediante ADN obtenido por transcripción inversa (rADN) o por virus naturales con genes incompletos. Los virus usados en estas nuevas vacunas, a veces denominadas vacunas marcadoras, carecen de una glicoproteína específica (gG, gE o gC).

A. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Aujeszky, también llamada seudo rabia porcina, está causada por un alfaherpesvirus de la familia Herpesviridae. El virus infecta el sistema nervioso central y otros órganos, como el tracto respiratorio, en prácticamente todos los mamíferos excepto el hombre y los monos sin cola. Se asocia inicialmente con los cerdos, que representan su hospedador natural, en los que permanece latente después de la recuperación clínica. La enfermedad se controla por aislamiento de las piaras infectadas y mediante el uso de vacunas y la eliminación de los animales con infección latente.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

Aunque el aislamiento del virus de la seudorrabia (PRV) supone una ayuda en el diagnóstico provisional en el caso de formas letales de la enfermedad de Aujeszky o en su manifestación clínica en cerdos, se requieren otras técnicas y pruebas serológicas para diagnosticar las infecciones latentes. Sin embargo, excepto los cerdos, muchos animales infectados no viven lo suficiente como para producir una respuesta serológica notable.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

a)

Aislamiento del virus El diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky puede confirmarse en cerdos vivos por el aislamiento del PRV en el flujo buco-faríngeo, fluidos nasales (frotis) o biopsias de las amígdalas, o en muestras de cerdos muertos, o después de la aparición de síntomas clínicos tales como encefalitis en herbívoros o carnívoros. Las muestras de cerebro y de amígdalas son las más adecuadas para el aislamiento post-mortem de PRV. En el ganado bovino, la infección se caracteriza normalmente por la aparición de prurito, en cuyo caso puede ser necesario disponer de una muestra de la correspondiente sección de la médula espinal para el aislamiento del virus. En cerdos con infección latente, el ganglio trigémino es el sitio más apropiado para aislar el virus, aunque el virus latente es por lo general difícil de cultivar. Las muestras se homogenizan en solución salina normal o en medio de cultivo celular con antibióticos y la suspensión que resulta se clarifica por centrifugación a baja velocidad, a 900 g por 10 minutos. El sobrenadante se usa para inocular cualquier sistema de cultivo celular que resulte sensible. Muchos tipos de líneas celulares o de cultivos celulares primarios son sensibles al PRV, pero se suele emplear una línea celular de riñón de cerdo (PK-15). El medio para el cultivo debe contener antibióticos (como: 200 UI/ml de penicilina; 100 µg/ml de estreptomicina; 100 µg/ml de polimixina; y 3 µg/ml de fungizona). PRV produce un efecto citopático (ECP) que suele aparecer en 24-72 horas, pero el cultivo celular debe incubarse por 5-6 días. La monocapa presenta acumulaciones de células refringentes, a las que sigue una separación completa de la placa de toda la capa celular. También se desarrollan sincitios, que son variables en forma y tamaño. En caso de ausencia de ECP visible, se aconseja hacer un pase a otros cultivos. Se puede obtener una evidencia adicional mediante tinción con hematoxilina y eosina de cultivos infectados en cubres para demostrar las inclusiones acidófilas intranucleares características de los herpesvirus con marginación de la cromatina. La identidad del virus debe confirmarse por inmunofluorescencia, por inmunoperoxidasa, o por neutralización con un antisuero específico. El aislamiento del PRV confirma la enfermedad de Aujeszky, pero la falta de aislamiento no garantiza la ausencia de infección.

b)

Identificación del virus por la reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede utilizarse para identificar la presencia de genomas del PRV en secreciones o en muestras de órganos. Como esta técnica es aún nueva, todavía no es posible especificar un procedimiento estandarizado. Solamente se suministra alguna información general al respecto. La técnica de PCR se basa en la amplificación selectiva de una parte determinada del genoma usando dos cebadores localizados en cada uno de los extremos de la secuencia seleccionada. En un primer paso, se aísla el ADN completo por métodos estándar (por ejemplo, mediante digestión con proteinasa K y extracción con fenol-cloroformo). Mediante ciclos de desnaturalización de ADN que originan moldes de ADN de cadena única, por hibridación de los cebadores, y por síntesis de las secuencias complementarias utilizando una ADN polimerasa termoestable, las secuencias elegidas se pueden amplificar hasta un millón de veces. Los cebadores se deben diseñar de modo que amplifiquen una secuencia que sea común a todas las cepas de PRV, por ejemplo se han usado partes de los genes gB o gD, que codifican glicoproteínas esenciales del virus. Se puede identificar el producto amplificado por su peso molecular, que se determina por su desplazamiento en geles de agarosa, y cuando es posible mediante posterior confirmación por hibridación de tipo Southern usando una sonda complementaria. Hay técnicas más recientes que implican hibridación en medio líquido usando sondas marcadas con enzimas, que dan una reacción coloreada después de incubación con el substrato adecuado. Una mejora de la técnica, conocida como “PCR combinada”, utiliza dos tipos de cebadores, uno de los cuales se localiza dentro de la secuencia amplificada por el primer tipo de cebadores. Mediante temperaturas adecuadas de hibridación en una reacción de dos pasos, se puede mejorar la sensibilidad y la especificidad de la PCR.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

En todos los casos, la principal ventaja de la PCR es su rapidez en comparación con las técnicas convencionales de aislamiento del virus, pues se puede completar una identificación preliminar en un día y confirmar el producto de la PCR al día siguiente. Con los equipos más modernos, todo el proceso se puede completar en un día. Sin embargo, debido a la naturaleza de la prueba, es necesario tomar muchas precauciones para evitar la contaminación de los ensayos con ADN extraño procedente de ensayos previos o de la contaminación general ambiental del laboratorio (ver Capítulo I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en materiales biológicos). Esto puede limitar el valor de la prueba en muchos laboratorios, y por consiguiente la técnica no se recomienda por completo para diagnósticos de rutina, aunque existen disponibles métodos que evitan la contaminación por ADN ambiental (por ejemplo, el sistema dUTP-UNG [d-uracil trifosfato/uracil-N-glicosilasa]). Muchos laboratorios de diagnóstico deberían limitar el uso de la PCR a la detección de la infección latente.

2.

Pruebas serológicas

Cualquier prueba serológica debe ser lo suficientemente sensible como para dar un resultado positivo con el Suero Estándar de Referencia Internacional de la OIE. Este suero se puede obtener del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Enfermedad de Aujeszky en Francia (ver Cuadro de la Parte 3 de este Manual) y antes de uso debería reconstituírse siguiendo las instrucciones de la hoja de datos. A efectos del mercado internacional, la prueba debería de ser lo suficientemente sensible para detectar el suero estándar diluido 1/2. La neutralización del virus (NV) es un método de referencia reconocido para serología (4,27), pero para diagnóstico general ha sido ampliamente reemplazado por el enzimoinmunoensayo (ELISA) a causa de su adecuación para ensayos a gran escala (2, 11, 15,17). Las pruebas se pueden realizar con extracto de carne o con suero. También se ha desarrollado una prueba de aglutinación en látex que puede usarse para la detección de anticuerpos. Existen preparaciones comerciales de la prueba disponibles.

a)

Neutralización del virus (una prueba prescrita para el mercado internacional) En cultivo celular, la prueba NV se puede realizar de varios modos, dependiendo de la duración de la incubación de las mezclas virus/suero (por ejemplo, 1 hora a 37°C o 24 horas a 4°C) y de la presencia o ausencia de complemento. La mayoría de los laboratorios usan un período de reacción de 1 hora a 37°C en ausencia de complemento porque resulta fácil y rápido. No obstante, la sensibilidad resulta mejorada aumentando el tiempo de incubación a 24horas a 4°C, lo cual facilita la detección de niveles de anticuerpo 10-15 veces menores que los detectados por el método de 1 hora. En el caso del mercado internacional, el método debe ser validado para que sea lo suficientemente sensible para detectar el Suero Estándar de Referencia de la OIE a una dilución 1/2. No se puede usar la prueba NV para diferenciar los anticuerpos debidos a vacunación de los debidos a una infección natural. Es una de las dos pruebas disponibles que satisfacen el requisito que la OIE establece en el capítulo Código de Salud de Animales Terrestres cuando se refiere a “una prueba diagnóstica para el virus completo”. Células: Se usan células susceptibles a la infección por PRV; pueden ser líneas celulares (por ejemplo PK15, SK6) o cultivos celulares primarios o secundarios. Medio de cultivo celular: El medio depende del tipo de células. Por ejemplo, el medio para células PK-15 es el medio mínimo esencial de Eagle (MEM) + 10% de suero fetal bovino y antibióticos (100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, o alternativamente, 50 µg/ml de gentamicina). Mantenimiento de las células: Las células se cultivan en recipientes para cultivos celulares de, por ejemplo, 75 cm2. Se subcultivan semanalmente una o dos veces por tripsinización. En caso de una tripsinización semanal, las células se cultivan en 50 ml de medio, con un índice de multiplicación de 5. En caso de dos tripsinizaciones a la semana, las células se cultivan en 30 ml de medio, con un índice de multiplicación de 3. Para la tripsinización, se elimina el medio de crecimiento una vez que la monocapa celular está completa. La monocapa se lava con unos 5 ml de una solución recientemente descongelada de tripsina/ácido etilén diamino tetra-acético (EDTA) (0.25%). Se elimina el líquido de lavado y la preparación se lava de nuevo, dejando solo unas cuantas gotas de la solución de tripsina. El recipiente se coloca en un incubador a 37°C por 5-10 minutos hasta que las células se separen. Una vez que la monocapa se haya separado y las células estén bien aisladas, se suspenden en 90 ml de medio de crecimiento, y esta suspensión se distribuye en tres botellas de 75 cm2 para cultivo celular.

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Virus: Se mantiene a una temperatura de –70°C o inferior, o en forma liofilizada a 4°C, una cepa adecuada de PRV, como la cepa Kojnok o la cepa NIA-3. Preparación de una suspensión stock de virus: Se elimina el sobrenadante de una botella de cultivo celular que contenga una monocapa en completa confluencia. Se añade 1 ml de una suspensión de virus de título conocido (aproximadamente 107 DICT50/ml [dosis infectiva media en cultivo de tejidos]) y la botella se incuba a 37°C por 1 hora. Luego, se añaden 30 ml de medio de cultivo y se incuba de nuevo la botella a 37°C. Se examina frecuentemente la botella hasta que presente cerca de un 75% de destrucción celular (después de unas 36-48 horas). A continuación se congela a una temperatura de –20°C o inferior para romper las células. La botella se descongela después y se agita vigorosamente. Se recoge el medio y se centrifuga a 1.500 g por 15 minutos. El sobrenadante se divide en porciones (de unos 0,5 ml) en tubos pequeños que se marcan (con la fecha y el virus de referencia) antes de almacenarse a una temperatura de –70°C o inferior hasta su uso. Titulación de la suspensión stock de virus: La titulación de la suspensión stock de virus se realiza por el método de Reed & Muench o el de Karber, y el título se expresa por 50 µl y por ml. La prueba NV requiere un suero de control interno de calidad con un título conocido de anticuerpos neutralizantes frente a PRV (que debe ser calibrado contra un suero estándar internacional o un estándar secundario preparado de dicho suero), y un suero como control negativo (de un cerdo que no contenga anticuerpos específicos, por ejemplo de una piara oficialmente libre de la enfermedad de Aujeszky). Los mismos sueros de ensayo deben de ser de buena calidad. El suero debe ser separado del coágulo sin retraso, para evitar toxicidad. Existen procedimientos cualitativos y cuantitativos para la prueba NV, que se describen a continuación. •

Técnica cualitativa

i)

Se destruye el complemento del suero calentando en un baño de agua a 56°C durante 30 minutos.

ii)

Cada suero sin diluir se coloca en tres pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos para cultivo celular, poniendo 50 µl por pocillo.

iii)

A cada pocillo se añaden 50 µl de una suspensión del virus que contenga 100 DICT50/50 µl (o 2 x 103 TCDI50/ml), obtenida mediante dilución con MEM de la suspensión stock de virus de título conocido.

iv)

Se agita la placa y se coloca en un incubador durante 1 hora a 37°C (la presencia de CO2 es opcional).

v)

Se añade a cada pocillo 150 µl de suspensión celular que contenga aproximadamente 150.000 células/ml.

vi)

La placa se cubre (para incubación en CO2) o se sella cuidadosamente por los bordes de la placa con un plástico (para incubación en aire). La placa se agita suavemente para favorecer una distribución uniforme de las células en el fondo de los pocillos, y se coloca en el incubador a 37°C (la presencia de CO2 es opcional).

vii)

Controles: cada placa debe incluir los siguientes controles: Control de virus: Tiene como objeto comprobar la cantidad de virus realmente usada en la prueba. La dosis de virus usada para neutralización por suero (diana viríca con titulación de 100 DICT50/50 µl) se diluye 1/10, 1/100 y 1/1.000 con MEM. Se añaden 50 µl de cada dilución en al menos ocho pocillos, a los que se añaden 50 µl de medio antes de incubar los pocillos por 1 hora a 37°C. La suspensión celular se añade del mismo modo que para el suero ensayado. Control de células: En al menos dos pocillos se colocan 150 µl de suspensión celular y 100 µl de medio. Control de suero positivo: Se usa un suero de título conocido de anticuerpos neutralizantes frente a PRV. Se preparan cinco diluciones del mismo modo que para el suero ensayado: una dilución que corresponda al título del suero, diluciones dobles y cuádruples, y diluciones a ½ y ¼ (equivalente a T, T/2, T/4, 2T y 4T, donde T es el título del suero, es decir, suero sin diluir para la prueba cualitativa). A 50 µl de las diluciones de suero positivo control se añaden 50 µl de la suspensión de virus que contiene100 DICT50/50 µl. Los pocillos se incuban y se añade la suspensión celular como en el caso de los sueros ensayados. Control del suero: Tiene como objeto comprobar la ausencia de un efecto tóxico sobre las células debida a los sueros. Los pocillos que contienen 50 µl de cada suero se incuban durante 1 hora a 37°C

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en presencia de 50 µl de medio. Luego se añaden 150 µl de suspensión celular como en el caso de los sueros ensayados. Control de suero negativo: Se realiza como en el caso de los sueros ensayados. viii) Lectura de los resultados: Para examinar los pocillos en cuanto a efecto tóxico y ECP después de 48 y 72 horas, se usa un microscopio de imagen invertida (x 100). Para que la prueba sea válida, los controles deben dar los siguientes resultados: Control de virus: El título de la suspensión viral debe estar entre 30 y 300 DICT50/50 µl. Control de células: la monocapa de células debe aparecer intacta Control de suero positivo: El título obtenido debe coincidir con el previsto, dentro de una dilución. Control de suero: El examen para ECP debe tener en cuenta un posible efecto tóxico sobre las células. Control de suero negativo: Debe evidenciarse ECP. ix)

En los sueros ensayados pueden encontrase los siguientes resultados: Presencia de ECP en tres pocillos = resultado negativo; ausencia de ECP en tres pocillos a los 3 días = resultado positivo; presencia de ECP en un pocillo pero no en los otros dos = resultado dudoso, la prueba debe repetirse; pequeñas calvas indicando ECP a los 3 días = resultado dudoso, la prueba debe repetirse; toxicidad en los pocillos de suero control y de ensayo = resultado no concluyente, la prueba debe repetirse (cambiar el medio con medio fresco después de 16 horas de incubación puede reducir la toxicidad sin afectar al título de anticuerpo específico).

x)

Interpretación de los resultados: Esta prueba es capaz de detectar la presencia o la ausencia de anticuerpos neutralizantes frente a PRV. Es incapaz de distinguir entre animales vacunados y animales infectados. La técnica descrita (NV por 1 hora a 37°C) puede dar resultados negativos falsos y resultados positivos falsos. Se puede aumentar su sensibilidad (reduciendo la aparición de negativos falsos) adoptando un método de neutralización de 24 horas de contacto entre el virus y el suero a 4°C, antes de la adición de las células. Una técnica cualitativa como ésta, que emplea suero sin diluir (dilución final ½), puede originar en algunos casos un resultado positivo falso debido a neutralización inespecífica del virus. Este problema puede superarse realizando una prueba confirmativa mediante la técnica cuantitativa (ver a continuación).

•

Técnica cuantitativa

Es similar al procedimiento cualitativo, pero cada suero se utiliza tanto sin diluir como en diluciones seriadas. Dependiendo de la precisión deseada, del propósito de la prueba y del título esperado, se usan uno o más pocillos para cada dilución de suero, y un mayor o menor intervalo de diluciones. Teóricamente, el procedimiento puede describirse para un intervalo de diluciones que alcance un máximo inicial de 1/256, con tres pocillos para cada dilución.

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i)

Se destruye el complemento de las muestras de suero por calentamiento en un baño de agua a 56°C por 30 minutos.

ii)

En una placa de microtitulación para cultivos celulares de 96 pocillos se añaden 50 µl de MEM a los pocillos A3 hasta A6.

iii)

A los pocillos A1 a A3 se añaden 50 µl de suero no diluido, y se continúa con los pocillos de las filas B, C, etc., con muestras de otros sueros.

iv)

Usando una pipeta múltiple, se mezcla el contenido de los pocillos de la fila 3, y se transfieren 50 µl a la fila 4, y así hasta la fila 6 o más hasta una fila predeterminada, usando las mismas boquillas de la pipeta. Las porciones de 50 µl que quedan después de la última fila se desechan.

v)

Se establecen los controles como se indica en la técnica cualitativa.

vi)

A la fila 1 se añaden 50 µl de MEM en vez de virus: esta es una fila control de sueros. En las otras filas se deposita la suspensión de virus en los pocillos. Las manipulaciones que siguen son las mismas que se indican en la técnica cualitativa.

vii)

Lectura de los resultados: El título neutralizante de un suero se expresa como el denominador de la dilución más alta que lleva a cabo una neutralización completa del ECP en el 50% de los pocillos. La neutralización se considera positiva a cualquier dilución (incluso sin diluir, equivalente a una dilución final de ½). Si el suero solo muestra neutralización cuando no está diluido (con crecimiento del virus y aparición de ECP a dilución ½ y subsiguientes diluciones), se aconseja usar pruebas alternativas

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

(ELISA o aglutinación por látex) para confirmar el resultado, o solicitar otra muestra del animal, al menos 8 días después de la primera.

b)

Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional) La sensibilidad de las técnicas ELISA suele ser superior a la de la prueba NV usando 1 hora de neutralización sin complemento. Algunos sueros débilmente positivos son detectados más fácilmente por pruebas de tipo NV cuando se usa neutralización por 24 horas, mientras que otros resultan más fáciles de detectar por técnicas ELISA. Para medir los niveles de anticuerpo, las preparaciones ELISA que están en el mercado usan técnicas indirectas o competitivas. Difieren en el modo de preparación del antígeno, del conjugado, o del substrato, por el tiempo de incubación y por la interpretación de los resultados. Una ventaja general es que permiten un rápido procesamiento de gran número de muestras. Esto puede automatizarse y que los resultados sean analizados por ordenador. Algunas de estas preparaciones comerciales permiten diferenciar entre animales vacunados o infectados naturalmente cuando se usan con una vacuna “a juego” (6, 20, 21). Alternativamente, se pueden adoptar protocolos ELISA no comercializados (2,17) con tal de que sean capaces de detectar como positivo el Suero Estándar de Referencia Internacional de la OIE a una dilución de ½ (sensibilidad mínima a efectos de mercado internacional). Se recomienda usar una preparación comercial o casera que haya sido validada por este estándar mediante pruebas externas de control de calidad realizadas por un laboratorio independiente. A continuación se presenta un protocolo adecuado de ensayo para anticuerpos frente a virus completos (17). •

Preparación del antígeno

i)

Se usa una línea celular sensible a PRV, como la PK-15 o células testiculares de cerdo fetal. Debe estar libre de virus exógenos, como el virus de la diarrea bovina vírica. Las células deben dividirse para subcultivo y sembrarse en recipientes nuevos de 75 cm2 el día antes de la inoculación. Para cubrir al cultivo se usa un medio adecuado como el MEM, sin suero.

ii)

A lo largo del procedimiento se procesan en paralelo recipientes inoculados con virus y otros no inoculados como control. Se usa una cepa PRV apropiada y bien caracterizada, como la cepa Kojnock. Cuando se desarrolla una monocapa celular confluente (hacia las 24 horas después de la siembra), se inocula con 108 DICT50 de PRV en 5 ml de medio; y se añaden 5 ml de medio (sin virus) a los recipientes control. Los cultivos se dejan 30 minutos a 37°C para que ocurra la adsorción, y luego se recubren con 20 ml de medio.

iii)

En el momento que comienza a aparecer el ECP, se retira el medio sobrenadante y se añaden 4 ml de KCl (solución 4 mM) y perlas de vidrio. Los frascos se agitan suavemente para separar las células.

iv)

Las células se lavan tres veces mediante centrifugación a 770 g en KCl 4 mM. El precipitado se resuspende en 4 mM de KCl con 0.2% de Triton X-100 (1 ml por recipiente) mediante 60 golpes en un homogenizador de vidrio.

v)

El homogenizado celular se coloca sobre una solución de sacarosa 0.25 mM en KCl 4 mM y se centrifuga por 10 minutos a 770 g.

vi)

El precipitado se resuspende en tampón de dilución del antígeno, pH 9,6 (0,1 M de Tris, 2 mM de EDTA, 0,15 mM de NaCl) hasta 1/50 del volumen original del medio de cultivo. Después puede guardarse a –70°C en pequeñas alícuotas. En esta forma el antígeno es estable durante 2 años.

•

Recubrimiento de las placas de microtitulación

i)

El antígeno vírico y el control (sin virus) s diluyen en tampón de dilución, pH 9,6 (ver arriba) hasta una dilución predeterminada en titulaciones de doble entrada por el método del tablero de ajedrez.

ii)

En cada pocillo de una placa para ELISA de 96 pocillos se ponen 200 µl de antígeno, recubriendo filas alternadas con antígeno PRV positivo y con control de antígeno. Se incuba por 18 horas a 4°C,

iii)

Las placas se lavan tres veces con solución de lavado (Tween 20, 0,5ml/litro).

iv)

Las placas recubiertas se guardan a –20°C o a –70°C. Son estables durante varios meses.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Las muestras de los sueros de ensayo se diluyen 1/30 en tampón PBS/Tween, pH 7,2 (137 mM de NaCl, 9,5 mM de tampón fosfato, 0,5 ml/litro de Tween 20)

ii)

A los pocillos recubiertos con antígeno vírico y con control de antígeno se añaden las muestras diluidas, y se incuba a 37°C por 30 minutos.

iii)

Las placas se lavan tres veces con solución de lavado (0,5 ml/litro de Tween 20).

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

iv)

Se añade a todos los pocillos el conjugado proteína A/peroxidasa a una dilución predeterminada en tampón PBS/Tween, pH 7,2 (ver arriba) suplementado con la fracción V de seroalbúmina bovina (10 g/litro), y las placas se incuban a 37°C por 30 minutos.

v)

Las placas se lavan tres veces con solución de lavado (0,5 ml/litro de Tween 20).

vi)

Se añade a cada pocillo de la placa una mezcla apropiada de cromógeno/substrato, tal como tetra metil benzidina (TMB)/peróxido de hidrógeno.

vii)

La reacción se detiene con 2 mM de ácido sulfúrico. Se lee la absorbancia a 492 nm.

La prueba debe ser validada por completo usando sueros negativos y positivos, y calibrada frente al Suero Estándar de Referencia Internacional de la OIE. Todos los ensayos deben incluir controles internos positivos y negativos, incluyendo uno débilmente positivo que, cuando se diluya ala dilución apropiada para el ensayo, tenga una actividad equivalente a la dilución ½ del Suero Estándar de Referencia Internacional de la OIE. Para más detalles, véase la referencia 17 y el Capítulo I.1.3. Principios de validación para pruebas diagnósticas de enfermedades infecciosas. Los equipos comerciales de ELISA también tienen que ser validados en el rango en el que van a ser usados. Además de para el ensayo de sueros, los métodos ELISA se pueden adaptar a ensayos en disco de papel de filtro que han sido impregnados de una pequeña cantidad de sangre obtenida por punción de una vena superficial. Esta técnica es adecuada para recoger muestras de sangre de un número elevado de cerdos (3,18). Los discos se secan al aire antes de enviarlos al laboratorio. Varias autoridades responsables del control han definido los requisitos para la detección de anticuerpos frente a gE por ELISA en cerdos destinados al sacrificio, que van a ser introducidos en zonas libres de la enfermedad de Aujeszky. El Código Internacional de Salud Animal de la OIE especifica las circunstancias en las que pueden usarse pruebas específicas para gE. Las técnicas ELISA para gE también se pueden adaptar para ensayos de sangre sobre discos de papel de filtro.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO La enfermedad de Aujeszky se puede controlar usando vacunas que contienen virus vivos modificados o antígenos víricos inactivados. Recientemente, estas vacunas convencionales se han suplementado con vacunas vivas recombinantes derivadas de PRV cuyo ADN presenta genes eliminados o con vacunas vivas de PRV con delecciones naturales. Estas nuevas vacunas, a veces denominadas vacunas marcadoras, están hechas con un virus que carece de una glicoproteína específica (normalmente la gE, aunque también se han descrito vacunas carentes de la gG o gC). Al menos una vacuna disponible comercialmente tiene delecciones dobles. Respecto a las vacunas convencionales con virus completo, estas vacunas marcadoras con genes eliminados tienen la ventaja de que es posible distinguir a los animales vacunados no infectados de aquellos otros con una infección natural. Esto se hace mediante pruebas para anticuerpos dirigidos contra la proteína codificada por el gen eliminado, que estarán ausentes en cerdos no infectados vacunados con vacunas marcadoras pero presentes en cerdos con infección natural. Por tanto, en países con cerdos infectados, donde se planee la erradicación de la enfermedad de Aujeszky, estas vacunas marcadoras son las vacunas de elección. Se describen las normas estándar aplicables a la producción de vacunas con virus vivos e inactivados. En lo que respecta a vacunas marcadoras, las pruebas deben incluir la demostración en cerdos vacunados de la ausencia de una respuesta serológica a la proteína codificada por el gen eliminado, y además la demostración de respuesta a la misma proteína en cerdos vacunados que están infectados por el virus natural. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de la producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 tratan de ser de naturaleza general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo Las vacunas se producen mediante un sistema de lotes de inóculo en que se prepara un inóculo de virus original (MSV) a partir de una cepa adecuada del virus de la enfermedad de Aujeszky. Para la producción de vacunas se usan varias cepas. En una vacuna inactivada el antígeno puede ser una de las muchas cepas de tipo natural, o el virus Bucharest con delecciones naturales, o virus con genes eliminados a través de ADN recombinante. Las vacunas vivas convencionales con virus modificado y las vacunas con virus con ADN modificado por ingeniería genética usan muchas cepas, como la Bartha (8-10, 14, 16, 22,26), o derivan del aislamiento original de Aujeszky o de otros aislamientos naturales, como la cepa NIA-3.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

Se recomienda que para diferenciar entre animales vacunados e infectados deberían usarse cepas con delecciones. En la elaboración del MSV se debe realizar una prueba de identidad del virus (usando una prueba de anticuerpo fluorescente, una prueba de neutralización [método de suero constante/virus decreciente], o cualquier otra prueba de identidad adecuada). El MSV debe estar libre de micoplasmas, bacterias, hongos, virus citopatogénicos o hemadsorbentes, parvovirus porcino, pestivirus ovinos y bovinos citopáticos y no citopáticos, y otros agentes ajenos, como circovirus, según se determina por cultivo y por procedimientos de anticuerpo fluorescente, o por otros métodos como PCR.

b)

Método de cultivo La mayor parte de las líneas celulares que se usan para propagar el PRV son líneas continuas, como la línea PK-15. Se establece un stock original de células (MCS) a un nivel determinado de número de pases. El MCS y el nivel más alto de pases (MCS x n) que se usa en la preparación de un producto biológico se detalla en un Diseño de Producción. Tanto MCS como MCS x n se controlan de varios modos para caracterizar la línea celular y para asegurar que está libre de agentes exógenos. Las células porcinas se ensayan para citomegalovirus porcino, para el virus de la diarrea bovina/virus de la fiebre porcina clásica, virus de la rabia, fiebre porcina africana, influenza porcina, síndrome respiratorio y reproductivo porcino, y estomatitis vesicular. Esta lista se puede modificar si el país de origen de las células está exento de una enfermedad determinada. El MCS se debe controlar en cuanto a la especie original. Debe examinarse un mínimo de 50 células mitóticas tanto en el MCS como al nivel de pases MCS x n. El número modal en el MCS x n no debe superar el 15% del número modal del MCS. Cualquier marcador cromosómico en el MCS debe estar también presente después del número más alto de pases celulares. Si existe evidencia de que la línea celular puede inducir daño en la especie para la cual está dirigido el producto, se prueba la línea celular en cuanto a capacidad tumoral y oncogenicidad.

c)

Validación como vacuna i)

Pureza El MSV debe estar libre de micoplasmas, bacterias, hongos, virus citopatogénicos o hemadsorbentes, parvovirus porcino, pestivirus ovinos y bovinos citopáticos y no citopáticos, y otros agentes ajenos, como circovirus, según se determina por cultivo y por procedimientos de anticuerpo fluorescente, o por otros métodos como PCR.

ii)

Pruebas de estabilidad Deben realizarse pruebas para comprobar la caducidad propuesta por el fabricante. Estas pruebas deben estar basadas siempre en estudios de tiempo real; deben hacerse sobre un número suficiente de lotes (al menos tres) que se produzcan siguiendo el proceso de producción descrito y sobre los productos almacenados en el recipiente final, y normalmente comprenden pruebas sobre la estabilidad biológica y fisicoquímica. El fabricante debe suministrar los resultados de los análisis que apoyan la caducidad propuesta en todas las condiciones de almacenamiento previstas. Por lo general, la caducidad propuesta corresponde al período en que el producto se mantiene estable menos tres meses.

iii)

Pruebas de seguridad Se deben examinar reacciones locales y generales. Cuando se emplea una vacuna viva, es necesario diferenciar las propiedades exactas de seguridad de la cepa vacunal de aquellas otras del producto final si éste contiene un adyuvante. En general, la seguridad se prueba inicialmente en condiciones experimentales. Cuando se conocen los resultados de esta prueba preliminar, es necesario incrementar el número de animales vacunados para evaluar la seguridad de la vacuna bajo condiciones prácticas.

•

Pruebas de laboratorio Todas las pruebas se deben realizar en cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Aujeszky o contra una fracción del virus. a.

Efectos generales

1.

Vacunas vivas

Las pruebas intranasales y la vacunación de lechones de 3-5 días son muy útiles para determinar el grado de seguridad de una vacuna. Deben usarse al menos cinco lechones.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

Especialmente en el caso de las vacunas vivas, también resulta importante determinar las propiedades de una vacuna en los animales a los que va dirigida bajo condiciones normales de uso y a la edad más temprana a la que se pretende vacunar; por ejemplo, en cerdos para engorde, que normalmente se vacunan cuando tienen una edad entre 9 y 12 semanas, y en cerdas preñadas hay que determinar cuándo se recomienda este uso de la vacuna por el fabricante y si este uso está autorizado. Después de la vacunación no se deberían observar síntomas clínicos, incluyendo reacciones térmicas significativas. Estos ensayos tienen que realizarse en al menos diez cerdos vacunados, usando cerdos no vacunados como control. Se debe examinar la reversión de la virulencia después de pases seriados. La vacunación inicial se hace por la ruta intranasal. Se realiza al menos una serie de cinco pases en lechones. Si fuera necesario, el organismo se propaga in vitro entre cada dos pases in vivo. En cada pase se deben utilizar no menos de dos animales susceptibles. El objeto de estas pruebas es determinar la estabilidad genética de las cepas de la vacuna viva. Las pruebas son menos necesarias cuando se emplea una cepa viva modificada genéticamente, en especial si contiene genes eliminados. Se recomienda comprobar la posible excreción de la cepa vacunal. A estos efectos, un mínimo de 14 lechones de 3-4 semanas reciben una dosis individual de vacuna por la ruta recomendada y en el sitio adecuado. Se mantienen cuatro lechones no vacunados como control de contacto. Se realizan pruebas individuales de sensibilidad apropiada para detectar el virus en las secreciones nasales y orales del modo siguiente: se toman diariamente frotis nasales y orales desde el día anterior a la vacunación hasta 10 días después de la vacunación. Las cepas vacunales que se aíslen de las secreciones nasales u orales obtenidas de los cerdos en los que la vacuna se administra por vía parenteral no son recomendables. La capacidad de la cepa de PRV presente en la vacuna para extenderse de un cerdo vacunado a otro no vacunado (difusión) debe probarse usando la ruta de administración recomendada que presente el mayor riesgo de extensión. Como este fenómeno es difícil de detectar, se hace necesaria la repetición (cuatro veces) de los ensayos. Cada vez se deben usar cuatro lechones para vacunación y colocarlos en contacto, al día siguiente, con dos lechones no vacunados. También puede resultar necesario examinar la difusión de la cepa a otras especies no relacionadas que puedan ser susceptibles a la cepa vacunal. Las vacunas vivas atenuadas se prueban respecto a sus efectos generales administrando diez veces la dosis de trabajo a lechones de 5-10 días de edad. La administración de esta superdosis hace posible detectar reacciones que no se producen en condiciones normales de uso. Tales reacciones se pueden producir accidentalmente cuando se vacunan muchos animales. 2.

Vacunas inactivadas

Es importante probar las vacunas inactivadas en los animales a los que van dirigidas bajo condiciones normales de uso para cerdos y cerdas cuando este uso es el pretendido por el fabricante y está autorizado (25). Como se ha descrito antes, es fundamental utilizar criterios objetivos y cuantificables para detectar y medir reacciones adversas en grupos vacunados y grupos control, como cambios en la temperatura, rendimiento en el peso, tamaño de las camadas, capacidad reproductora, etc. Las pruebas deben realizarse por administración de la vacuna a la dosis recomendada y por la ruta apropiada de inoculación en los cerdos a la que va dirigida. Los cerdos y las cerdas se suelen mantener en observación y sometidos a examen hasta que cualquier reacción haya desaparecido. El período de observación no debe ser menor de 14 días desde la administración. Dicho período se extiende cuando, por ejemplo, se usa la vacuna en cerdas preñadas y resulta necesario determinar los posibles efectos de la vacuna en la capacidad reproductora. En tal caso, el período de observación dura todo el embarazo. Las autoridades de control generalmente exigen una vacunación con dosis doble de modo que las reacciones adversas, que pueden estar bajo el límite de detección cuando se administra una dosis simple, resulten más fácilmente detectadas. b.

Reacciones locales

Las reacciones locales se asocian a menudo con el uso de vacunas inactivadas, ya que estos efectos laterales pueden inducirse por la presencia de adyuvante, en particular por adyuvantes lipídicos (23). No obstante, algunas vacunas vivas contra la enfermedad de Aujeszky se mezclan con adyuvantes diferentes, lo que modifica lo que se observó en el pasado. Las reacciones locales son fundamentalmente inflamatorias y más o menos complicadas (necróticas o supurativas) dependiendo de la naturaleza del adyuvante usado y de las condiciones asépticas de la vacunación. Los adyuvantes con aceite pueden provocar una variedad de efectos que incluyen degeneración muscular, granuloma, fibrosis y formación de abscesos. Además de la naturaleza del aceite usado (la intensidad de la reacción se reduce cuando en la vacuna se emplean aceites metabolizables), el tipo de la emulsión empleada (agua/aceite, aceite/agua, agua/aceite/agua) provoca

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

una mayor o menor extensión de estas reacciones. En consecuencia, es necesario observar el lugar de la inyección no solo desde fuera, sino también por disección después del sacrificio, en especial en el caso de cerdos para productos finales. •

Pruebas de campo Todas las pruebas deben hacerse con cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Aujeszky o contra una fracción del virus, aunque algunas pruebas se pueden realizar usando animales con inmunidad materna. Las pruebas de campo son necesarias para determinar la seguridad de la vacuna contra la enfermedad de Aujeszky en un gran número de cerdos o cerdas . En Europa (7), las pruebas se deben hacer en cada categoría de animales a los que se intenta vacunar (cerdas, cerdos de engorde). Se usan al menos tres grupos con no menos de 20 animales cada grupo, y el grupo control correspondiente de al menos 10 animales. En el momento de la vacunación, y 24 y 48 horas después, se mide la temperatura rectal de cada animal. En el sacrificio, se debe examinar para reacciones locales el sitio de la inyección. Si la vacuna se usa en cerdas, debe registrarse la capacidad reproductora. Los ensayos de campo se suplementan con estudios de laboratorio sobre la existencia de correlación entre eficacia y potencia de la vacuna.

iv)

Pruebas de eficacia

•

Ensayos de laboratorio Todas las pruebas deben hacerse con cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Aujeszky o contra una fracción del virus, aunque algunas pruebas se pueden realizar usando animales con inmunidad materna. a.

Determinación de inmunidad pasiva

Para probar la eficacia de las vacunas, es importante reflejar las condiciones naturales de la infección (1). La infección por PRV origina pérdidas importantes de lechones en cerdas no inmunizadas. Por tanto, cuando se vacunan cerdas de vientre, el principal objetivo es proteger a los lechones mediante la inmunidad pasiva a través del calostro que se ingiere después del nacimiento, junto con el objetivo secundario de evitar abortos. Se han desarrollado modelos experimentales para medir esta inmunidad pasiva y la protección inducida en cerdas por la vacunación. Las cerdas se vacunan durante el embarazo siguiendo el procedimiento vacunal, Cuando, por ejemplo, los lechones tienen 6-10 días se les expone a una cepa virulenta de PRV por vía intranasal. Es preferible usar una cepa cuya titulación se exprese en dosis letales medias (LD50). Cada cerdo debe inocularse por la ruta nasal con 1 ml que contenga 102 LD50 para cerdo. La eficacia de la vacuna se determina comparando síntomas clínicos, y lo que es además más importante, la mortalidad en lechones de cerdas no vacunadas respecto a la observada en lechones de cerdas vacunadas. Los lechones de cerdas vacunadas pueden tener un 80% de protección contra la mortalidad en comparación con los de cerdas control. Para que los resultados sean significativos se recomienda usar ocho cerdas vacunadas y cuatro cerdas control (dependiendo de un número satisfactorio de lechones por cada cerda). b.

Determinación de la inmunidad activa

1.

Protección clínica

Para medir la inmunidad activa inducida en cerdos por vacunación se pueden seguir varios criterios. Por lo general, los cerdos se vacunan al principio del período de crecimiento, es decir, cuando tienen de 9 a 12 semanas de edad. Los ensayos de laboratorio se hacen mediante estímulos de desafío en cerdos al final del período terminal, cuando pesan entre 80 y 90 kg. En general, para estimar la protección clínica de los cerdos después de la vacunación y el estímulo de desafío se usan al menos tres criterios, tales como las temperaturas rectales, las pérdida de peso y los síntomas clínicos (5). Los títulos de anticuerpos tienen poco valor en la predicción de la eficacia de las vacunas. La pérdida de peso comparativa entre grupos vacunados y grupos control suele ser el parámetro más repetitivo y fiable cuando las condiciones del estímulo de desafío están bien estandarizadas. La medida de la diferencia en ganancia o pérdida de peso entre los dos grupos de cerdos, y el intervalo temporal transcurrido desde el desafío (día 0 y día 7) tiene un valor de predicción muy bueno para la eficacia de la vacuna (13). Se pueden obtener resultados importantes cuando se comparan los rendimientos en peso de un grupo de al menos ocho cerdos vacunados con otro grupo control de ocho cerdos no vacunados. En la prueba de desafío, normalmente se prefiere usar una cepa virulenta de elevado título, pues esto hace posible obtener diferencias más marcadas entre los cerdos vacunados y los cerdos control. Sobre la base de trabajos previos, puede ser suficiente una dosis de estímulo con al menos 106 DICT50/ml de cepa virulenta que no haya tenido más de tres pases en células primarias, pero se

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky recomienda un título mayor (107.5 DICT50/ml). Se debe usar la ruta buco-nasal para el estímulo de los cerdos introduciendo la cepa virulenta en un volumen alto apropiado (> 4 ml). Este método de evaluar la eficacia de las vacunas con PRV está en la actualidad bien probado y ha permitido establecer un índice objetivo para determinar la eficacia de una vacuna. Tal índice, que compara la pérdida relativa de peso entre cerdos vacunados y cerdos control, puede también ser usado para probar la potencia de los lotes antes de su distribución y para la prueba de eficacia de los lotes. Sin embargo, el valor del índice de corte será diferente si las condiciones del ensayo no son idénticas. La influencia de la inmunidad adquirida pasivamente por anticuerpos derivados de la madre debe de ser evaluada de modo adecuado. 2.

Excreción de virus virulento

Además, es deseable que las vacunas eviten o al menos limiten la excreción de virus en los cerdos infectados (12, 19, 24). Cuando un programa de control de la enfermedad de Aujeszky se basa en la vacunación a gran escala, es esencial escoger las vacunas o el esquema de vacunación que mejor limite la multiplicación del virus virulento en cerdos infectados. A este respecto se han realizado varios ensayos para comparar las vacunas. Generalmente los cerdos se vacunan y se estimulan después a diferentes edades. Lo mejor, pero lo más laborioso en términos de tiempo, es infectar a los cerdos al final del tiempo del mantenimiento. Para medir la excreción de virus, se toman diariamente de cada cerdo frotis nasales (tomados a 10 cm de profundidad en la nariz) desde el día anterior a la estimulación de desafío hasta al menos doce días después. Los bastoncillos de algodón se pueden pesar antes del muestreo e inmediatamente después para calcular el peso exacto del mucus recogido. Se añade luego medio a cada tubo que contiene la muestra de frotis. El virus se titula a partir del medio después de congelación y descongelación. Se pueden utilizar diferentes índices arbitrarios para expresar la cantidad de virus virulentos excretados por los cerdos, teniendo en cuenta la duración y el nivel de la excreción de virus, y el número de cerdos que excretan virus virulentos. 3.

Duración de la inmunidad

Se recomienda que cualquier afirmación en cuanto a la aparición y duración de la inmunidad esté apoyada por datos de ensayos. La determinación de la duración de la inmunidad puede basarse en ensayos de estímulos de desafío o, en la medida de lo posible, en pruebas inmunológicas y serológicas. •

Ensayos de campo En términos generales, resulta muy difícil determinar la eficacia de una vacuna en poblaciones animales. Para hacer esto sería necesario vacunar a los animales en ausencia del patógeno contra el que protege la vacuna, esperar luego al momento de la infección y comparar los efectos de la infección en los animales vacunados (o en la descendencia de cerdas vacunadas) con los efectos en los no vacunados de la misma edad, en el mismo edificio y del mismo lote que los animales vacunados (o los protegidos por inmunización pasiva). Como todas estas condiciones son difíciles de lograr en el campo, los ensayos de campo son más apropiados para pruebas de seguridad que para pruebas de eficacia.

2.

Método de producción

Como inóculo para un producto vacunal solo se puede usar un MSV que se haya establecido que es puro. Las células del MCS se propagan en medios muy diversos. Todos los lotes de vacuna deben proceder de entre el primer y el vigésimo pase del MCS.

3.

Control interno

Es necesario realizar pruebas en cada una de las fases críticas del proceso de producción. Las pruebas de control se realizan también sobre productos intermediarios en la idea de comprobar la solidez del proceso de producción y del producto final.

4.

Control de lotes

Resulta importante diferenciar las pruebas llevadas a cabo de modo rutinario para distribuir los lotes de producto final de aquellas que se realizan para definir las propiedades biológicas de una vacuna. Los ensayos para distribución de los lotes no son los mismos que los efectuados para determinar la eficacia y seguridad de una vacuna. Los controles de los lotes para distribución son siempre ensayos a corto plazo, tan baratos como sea posible, y no siempre realizados en cerdos. Su principal finalidad es asegurar la reproducibilidad de la calidad del producto acabado, que tiene que coincidir con la calidad definida inicialmente en la solicitud para autorización de la publicidad.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

a)

Pruebas de esterilidad y pureza Se deben hacer pruebas de esterilidad y ausencia de contaminación (ver Capítulo I.1.5.) Cada lote de vacuna con PVR debe ensayarse para comprobar la ausencia de virus ajenos. La cepa viva de la vacuna se neutraliza con una mínima cantidad de antisuero monoespecífico y se inocula en cultivos celulares que sean sensibles a virus patógenos para el cerdo. No se debería detectar ECP ni agentes con propiedades de hemadsorción. Las vacunas deben estar exentas de pestivirus.

b)

Inactivación En las vacunas inactivadas se debe comprobar la inactivación efectuando dos pases en el mismo tipo de cultivo celular que se usó en la producción de la vacuna. Se pueden realizar pruebas vacunando animales susceptibles tales como conejos.

c)

Identidad Cuando sea necesario, se debe realizar una prueba específica de identificación del virus.

d)

Seguridad En las vacunas vivas la seguridad se prueba administrando diez dosis de vacuna reconstituida por la ruta mencionada en la hoja de instrucciones a por lo menos dos lechones de la edad mínima recomendada para vacunación y que estén libres de anticuerpos frente a PRV. Se mantienen dos lechones del mismo origen y edad como control. No deberían ocurrir reacciones locales anormales ni sistémicas. La curva de peso de los lechones vacunados no debería diferir mucho de la de los controles. En las vacunas inactivadas, la seguridad se prueba inyectando dos dosis a lechones en las mismas condiciones que las descritas anteriormente.

e)

Potencia Se debe demostrar la potencia de la vacuna utilizando un método apropiado, cuyo resultado tiene que correlacionarse con las pruebas de eficacia descritas anteriormente. El punto más difícil de esta clase de prueba es determinar un umbral de aceptabilidad para usar o rechazar el lote de acuerdo con los resultados obtenidos. Las pruebas sobre el contenido en virus deberían realizarse usando al menos tres recipientes distintos. Se debe determinar el título del virus en la vacuna y, en general, no debería de ser superior a 1/10 de la dosis empleada para comprobar que la vacuna era segura ni inferior al título mínimo de distribución.

f)

Conservantes Si el producto final no contiene conservantes, el fabricante debe demostrar que el producto permanece aceptable durante el período de uso recomendado después de abrir el vial. Debe demostrarse la eficacia de los conservantes en recipientes multidosis de vacuna. También debe comprobarse la concentración del conservante en la vacuna final completa y su persistencia durante el período de caducidad.

g)

Precauciones (riesgos) Toda información sobre posibles reacciones adversas provocadas por la vacuna debe indicarse. Cualquier riesgo potencial para la salud humana en caso de que el usuario reciba accidentalmente una pequeña cantidad del producto tiene que indicarse. El fabricante debería señalar todas las condiciones de uso de la vacuna: mezcla, reconstitución, almacenamiento, asepsia, longitud de la aguja, ruta de administración y estado sanitario de los animales vacunados.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Seguridad Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a seguridad, como se describe en la Sección C.4.d.

b)

Potencia Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a potencia, como se describe en la Sección C.4.e.

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Capítulo 2.2.2. — Enfermedad de Aujeszky

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* * *

NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Aujeszky (véase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consulte la página Web de la OIE para una lista más actualizada: www.oie.int).

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