CEA Enzyme immunoassay for the quantitative determination of CEA in human serum or plasma Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von CEA in humanem Serum oder Plasma Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de CEA en suero o plasma humano

Only for in-vitro diagnostic use English: Deutsch: Espanol:

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2 to 6 7 bis 12 13 a 18

Bibliography/ Literatur/ Bibliografía

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Summary of Test Procedure/ Kurzanleitung/ Resumen de la técnica

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________________________________________________________________ Product Number: DNOV060 (96 Determinations) ________________________________________________________________

ENGLISH 1. INTRODUCTION Carcinoembryonic antigen (CEA) is a glycoprotein, with a molecular weight of 180 kDa, involved in cell adhesion. It is normally produced during fetal development, but the production of CEA stops before birth. Therefore, it is not usually present in the blood of healthy adults, although levels are raised in heavy smokers. CEA was identified in human colon cancer tissue extracts . It was later found that serum from individuals with colorectal and other carcinomas had higher levels of CEA than healthy individuals and can be used to monitor the response to colon cancer treatment. CEA and related genes make up the CEA family belonging to the immunoglobulin superfamily. The most frequent cancer which causes an increased CEA is cancer of the colon and rectum. Others include cancers of the pancreas, stomach, breast, lung, and certain types of thyroid and ovarian cancer. Benign conditions which can elevate CEA include smoking, infections, inflammatory bowel disease, pancreatitis, cirrhosis of the liver, and some benign tumors in the same organs in which an elevated CEA indicates cancer. Chemotherapy and radiation therapy can cause a temporary rise in CEA due to the death of tumor cells and release of CEA into the blood stream. Benign tumours do not usually cause an increase above 10 ng/ml.

2. INTENDED USE Immunoenzymatic colorimetric method for quantitative determination of CEA in human serum or plasma.

3. PRINCIPLE OF THE ASSAY In this method, CEA standards, patient specimens and/or controls containing the native antigen are first added to streptavidin coated wells. Biotinylated monoclonal and horseradish peroxidase (HRP) labelled antibodies are added and the reactants are mixed. The different types of antibodies used have high affinity and specificity and are directed against distinct and different epitopes of CEA. Reaction between the various CEA antibodies and native CEA occurs in the microwells without competition or sterics hindrance forming a soluble sandwich complex. The interaction is illustrated by the following equation: Ka E-Ab + AgCEA + BtnAb (m)

E-Ab-AgCEA-BtnAb(m) K-a

BtnAb(m) Biotinylated Monoclonal Antibody (Excess Quantity) AgCEA Native Antigen (Variable Quantity) E-Ab enzyme labelled Antibody (Excess Quantity) HRP-Ab(p)-AgCEA-BtnAb(m) Antigen-Antibodies Sandwich Complex Ka Rate Constant of Association K-a Rate Constant of Dissociation Simultaneously, the complex is fixed to the well through the high affinity reaction of streptavidin and biotinylated antibody. This interaction is illustrated below: E-Ab- AgCEA -BtnAb (m)+Streptavidin CW

Immobilized Complex

Streptavidin CW Streptavidin immobilized on well. Immobilized Complex Antibodies-Antigen sandwich bound. After equilibrium is attained, the antibody-bound fraction is separated from unbound antigen by aspiration. The native antigen concentration is directly proportional to the HRP activity in the antibody-bound fraction. The activity of the conjugated HRP is quantitated by reaction with TMB substrate to produce blue colour. The reaction is terminated by adding stop solution which turns the blue colour into yellow. The absorbance is measured on a plate reader.

4. MATERIALS 4.1. Reagents supplied Coated Wells: 12 breakapart 8-well snap-off strips coated with streptavidin; in aluminium foil. Conjugate: 1 bottle containing 13 ml of horseradish peroxidase labelled anti- CEA antibodies and biotinylated monoclonal mouse anti-CEA antibodies. TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0.26 g/l) (avoid any skin contact). Wash solution 50x conc.: 1 bottle containing 20 ml (NaCl 45 g/l, Tween-20 55 g/l) 2

Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml sulphuric acid, 0.15 mol/l (avoid any skin contact). Standards: 6 bottles containing 1 ml standard solution. They are human serum based and were calibrated using a reference preparation which was assayed against the 1st IRP 73/601. They have approx. the following concentration: Standard 0 Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5

0 ng/ml 5 ng /ml 10 ng /ml 25 ng /ml 50 ng /ml 250 ng /ml

4.2. Materials supplied 1 Strip holder 1 Cover foils 1 Test protocol 1 Distribution and identification plan

4.3. Materials and Equipment needed ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450 nm Manual or automatic equipment for rinsing wells Pipettes to deliver a volume of 100 µl Distilled water Timer

5. STABILITY AND STORAGE The closed reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at 2...8 °C in the dark. Opened reagents are stable for 60 days when stored at 2...8 °C.

6. REAGENT PREPARATION It is very important to bring all reagents, samples and standards to room temperature (22…28°C) before starting the test run and mix well prior to use.

6.1. Coated Snapp-off strips The ready to use break apart snap-off strips are coated with streptavidin. Store at 2…8 °C. Open the bag only when it is at room temperature. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2…8° C.

6.2. Conjugate The conjugate is ready to use.

6.3. CEA Standards The standards are ready to use. Once opened, the standards are stable 6 months at 2 – 8° C.

6.4. TMB Substrate Solution The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at 2...8°C in the dark. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into blue, it may have become contaminated and should be thrown away.

6.5. Stop Solution The bottle contains 15 ml 0.15 M sulphuric acid solution (R 36/38, S 26). This ready to use solution has to be stored at 2...8°C.

6.6 Wash Solution Dilute contents of wash buffer concentrate 50x to 1000 ml with distilled water in a suitable storage container. For smaller volumes respect the 1:50 ratio. The diluted wash solution is stable for 30 days at 2…8°C.

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7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The specimens shall be human serum and plasma and the usual precautions in the collection of venipuncture samples should be observed. For accurate comparison to established normal values, a fasting morning serum sample should be obtained. The blood should be collected in a plain redtop venipuncture tube without additives or anti-coagulants. Allow the blood to clot. Centrifuge the specimen to separate the serum from the cells. Samples may be refrigerated at 2÷8°C for a maximum period of 5 days. If the specimen(s) cannot be assayed within this time, the sample(s) may be stored at temperatures of –20°C for up to 30 days. Avoid repetitive freezing and thawing. Patient specimens with CEA concentrations above 250 ng/ml may be diluted with Standard 0 and re-assayed. When assayed in duplicate, 0.050ml of the specimen is required.

7.1. Precaution Avoid the exposure of TMB substrate to direct sunlight, metal or oxidants. Do not freeze the solution. Maximum precision is required for dispensation of the reagents. This method allows the determination of CEA from 5.0 to 250 ng/ml.

8. ASSAY PROCEDURE 8.1. Test Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve. Please allocate at least: 1 well 2 wells 2 wells 2 wells 2 wells 2 wells 2 wells

e.g. A1) (e.g. B1+C1) (e.g. D1+E1) (e.g. F1+G1) (e.g. H1+A2) (e.g. B2+C2) (e.g. D2+E2)

for blank for standard 0 for standard 1 for standard 2 for standard 3 for standard 4 for standard 5

It is recommended to determine standards and patient samples in duplicate. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each standard and each patient sample. 1.

Dispense 25 µl standards and samples (and controls) into their respective wells.

2.

Dispense 100 µl conjugate in each well. Cover with a foil.

3.

Incubate for 60 min at room temperature (22 – 28°C).

4.

When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300µl diluted wash solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between each wash cycle should be >5sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step! Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values.

5.

Dispense 100 µl TMB Substrate Solution into all wells.

6.

Incubate for 15 min at room temperature (+22…+28°C) in the dark.

7.

Dispense 100 µl Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate Solution. Shake the microplate gently. Any blue colour developed during the incubation turns into yellow.

8.

Measure the absorbance of the specimen at 450 nm within 30 min after addition of stop solution against blank.

9. QUALITY CONTROL Each laboratory should assay controls at normal, high and low levels range of CEA for monitoring assay performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical methods should be employed to ascertain trends. The individual laboratory should set acceptable assay performance limits. Other parameters that should be monitored include the 80, 50 and 20% intercept of the standard curve for run-to-run reproducibility. In addition, maximum absorbance should be consistent with past experience. Significant deviation from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents. Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations. If computer controlled data reduction is used to calculate the results of the test, it is imperative that the predicted values for the calibrators fall within 10% of the assigned concentrations. 4

10. RESULTS 10.1. Note The optical densities (O.D.) of some standards and samples may be higher than 2.0, in such a case, they could be out of the measurement range of the microplate reader. It is therefore necessary, for O.D.s higher than 2.0, to perform a reading at 405 nm (= wavelength of peak shoulder) in addition to 450 nm (peak wavelength) and 620 (reference filter for the subtraction of interferences due to the plastic). For microplate readers unable to read the plate at 3 wavelengths at the same time, it is advisable to proceed as follows: - Read the microplate at 450 nm and at 620 nm. - Read again the plate at 405 nm and 620 nm. - Find out the wells whose ODs at 450 nm are higher than 2.0 - Select the corresponding ODs read at 405 nm and multiply these values at 405 nm by the conversion factor 3.0 (where OD 450/OD 405 = 3.0), that is: OD 450 nm = OD 405 nm x 3.0. Warning: The conversion factor 3.0 is suggested only. For better accuracy, the user is advised to calculate the conversion factor specific for his own reader. The OD of standard 5 should be ≥ 1.3.

10.2. Calculation of results Calculate the mean absorbance for each point of the standard curve and each sample. Use the 4 Parameter Logistic or smoothed cubic spline function as calculation algorithm. Interpolate the values of the samples on the standard curve to obtain the corresponding values of the concentrations expressed in ng/ml.

10.3. Reference values Non-smoker Smoker

< 5 ng/ml < 10 ng/ml

11. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 11.1. Sensitivity The lowest detectable concentration of CEA that can be distinguished from the standard 0 is 0.11 ng/ml at the 95 % confidence limit.

11.2. Specificity In order to assess the specificity of the antibody pair used for the CEA Elisa assay, massive doses of related analytes were spiked in a pool of patient sera: Analyte

Concentration

Cross Reaction

CEA β-HCG AFP CA-125 PSA CA 19-9

250 ng/ml 5000 ng/ml 1000 U/ml 1000 ng/ml 1000 U/ml

100 % ND ND ND ND ND

11.3. Precision Intra Assay Variation Within run variation was determined by replicate determination (16x) of three different control sera in one assay. The within assay variability is ≤ 5.8%. Inter Assay Variation Between run variation was determined by replicate measurements (20x) of three different control sera in different lots. The between assay variability is ≤ 9.9%.

11.4. Correlation with RIA The NovaTec CEA ELISA was compared to another commercially available CEA assay. 167 serum samples were analysed according in both test systems. The linear regression curve was calculated y = 1.019* x – 0.200 r2 = 0.992 y = CEA Predicate kit x = CEA NovaTec kit 5

11.4. Accuracy The recovery of amounts of 10 - 20 - 40 ng/mL of CEA added to samples gave an average value (±SD) of 100.7% ± 7.2% with reference to the original concentrations.

12. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. CEA has a low clinical sensitivity and specificity as a tumour marker. Clinically an elevated CEA value alone is not of diagnostic value as a test for cancer and should only be used in conjunction with other clinical manifestations (observations) and diagnostic parameters. There are patients with colorectal cancer that do not exhibit elevated CEA values and elevated CEA values do not always change with progression or regression of disease. Smokers demonstrate a higher range of baseline values than non-smokers.

13. PRECAUTIONS AND WARNINGS In compliance with article 1 paragraph 2b European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the testkits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. Only for in-vitro diagnostic use by professional persons. Not for internal or external use in Humans or animals. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-HIV 1+2 antibodies, anti-HCV antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious. Do not interchange reagents or strips of different production lots. No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label. Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware. Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination. Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to further use. To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense conjugate without splashing accurately to the bottom of wells. Samples microbiologically contaminated, highly lipemic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. Some reagents contain small amounts of Proclin 300R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. This method allows the determination of CEA from 5.0 to 250 ng/ml. Avoid contact with reagents containing hydrogen peroxide, sulphuric and preservatives, which may be toxic if ingested. Do not pipette by mouth. WARNING:

Sulphuric acid irritates eyes and skin. Keep out of the reach of children. Upon contact with the eyes, rinse thoroughly with water and consult a doctor!

13.1. Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste.

14. ORDERING INFORMATION Prod. No.:

DNOV060

CEA (96 Determinations)

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DEUTSCH 1. EINLEITUNG Das carcino-embrionale Antigen (CEA) ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 180 kDa, das in die Zelladhäsion involviert ist. Es wird während der fetalen Entwicklung produziert. Die Produktion stoppt vor der Geburt. Im Blut von Erwachsenen ist es daher normalerweise nicht nachweisbar, obwohl der Level bei Rauchern erhöht sein kann. CEA wurde in humanen Kolonkrebsextrakten identifiziert. Später wurde entdeckt, dass Personen mit verschiedenen Karzinomen höhere CEA Gehalte im Serum aufweisen als gesunde Individuen. Daher kann der CEA Wert zum Monitoren des Therapieerfolges verwendet werden. CEA und verwandte Gene, die die CEA Familie bilden, gehören zur Immunglobulin Superfamilie. Die häufigsten Krebsarten, die zu einem Anstieg des CEA Gehaltes führen sind Dick- und Enddarmkrebs. Weiterhin steigt der CEA Level bei Pankreas-, Magen-, Brust-, Lungen- und bestimmten Typen von Schilddrüsen- und Eierstockkrebs. Gutartige Bedingungen, die den CEA Wert erhöhen können sind: Rauchen, Infektionen, entzündliche Darmerkrankungen, Leberzirrhose und einige gutartige Tumoren in den gleichen Organen in denen ein erhöhter CEA Wert Krebs anzeigt. Chemotherapie und Bestrahlung können zu einem temporären Anstieg des CEA führen, ausgelöst durch den Tod der Tumorzellen und die damit verbundene Freisetzung von CEA in den Blutkreislauf. Gutartige Tumoren erzeugen in der Regel keinen CEA Anstieg auf Werte über 10 ng/ml.

2. VERWENDUNGSZWECK Immunoenzymatische kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von CEA in humanem Serum oder Plasma.

3. TESTPRINZIP CEA Standards, Patientenproben und/oder Kontrollen, die alle das native Antigen enthalten, werden zuerst in die mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend werden biotinylierte monoklonale und mit Meerrettichperoxidase (HRP) markierte Antikörper zugegeben und gemischt. Die verwendeten Antikörper haben eine hohe Affinität und Spezifität und sind gegen unterschiedliche distinkte Epitope des CEA gerichtet. Die Reaktion zwischen den verschiedenen CEA Antikörpern und dem nativen CEA findet in der Mikrotiterplatte ohne Kompetition oder sterische Behinderung statt. Es entsteht ein löslicher Sandwich Komplex. Die Interaktion wird durch die folgende Gleichung illustriert: Ka E-Ab + AgCEA + BtnAb (m)

E-Ab-AgCEA-BtnAb(m) K-a

BtnAb(m) Byotinylierte monoklonal Antikörper (Überschuss) AgCEA Natives Antigen (unterschiedliche Menge) E-Ab Enzymmarkierte Antikörper (Überschuss) HRP-Ab(p)-AgCEA-BtnAb(m) Antigen-Antikörper Sandwich Komplex Ka Assoziationskonstante K-a Dissoziationskonstante Gleichzeitig bindet der Komplex aufgrund der hohen Affinität von Streptavidin und Biotin an die Mikrotiterplatte. Diese Interaktion wird durch die folgende Gleichung dargestellt: E-Ab- AgCEA -BtnAb (m)+Streptavidin CW

Immobilized Complex

Streptavidin CW Streptavidin immobilisiert an der Mikrotiterplatte Immobilized Complex Antikörper-Antigen Sandwich Bindung Nachdem sich ein Gleichgewicht eingestellt hat, wird die gebundene Antikörperfraktion durch Absaugen vom ungebundenen Antigen getrennt. Die Konzentration des nativen Antigens ist direkt proportional zu der HRP-Aktivität in der Antikörper-gebundenen Fraktion. Die Aktivität der konjugierten HRP wird über die Farbentwicklung der TMB Reaktion quantifiziert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Stopplösung beendet wodurch die blaue Farbe gelb wird. Die Absorption wird mit einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen.

4. MATERIAL 4.1. Mitgelieferte Reagenzien Beschichtete Mikrotiterplatte: 12 teilbare 8er-Streifen, beschichtet mit Streptavidin; in Aluminiumbeutel.

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Konjugate: 1 Flasche mit 13 ml HRP markierten anti- CEA Antikörpern und biotinylierten monoklonalen Maus antiCEA Antikörpern. TMB Substrat Solution: 1 Flasche mit 15 ml 3, 3´, 5, 5´-tetramethylbenzidine (H2O2-TMB 0.26 g/l) (Hautkontakt vermeiden). Waschlösung 50x konz.: 1 Flasche mit 20 ml (NaCl 45 g/l, Tween 20 55 g/l) Stopplösung: 1 Flasche mit 15 ml Schwefelsäure, 0.15 mol/l (Hautkontakt vermeiden). Standards: 6 Flaschen mit je 1 ml Standardlösung. Die auf Humanserum basierenden Standards wurden mit einer Referenzpräparation kalibriert, die gegen den 1 IRP 73/601 gemessen wurde. Sie haben ungefähr folgende Konzentration: Standard 0 Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5

0 ng/ml 5 ng /ml 10 ng /ml 25 ng /ml 50 ng /ml 250 ng /ml

4.2. Mitgeliefertes Zubehör 1 selbstklebende Abdeckfolie 1 Rahmenhalter 1 Arbeitsanleitung 1 Ergebnisblatt

4.3. Erforderliche Materialien und Geräte Photometer mit Filtern 450 nm Manuelle oder automatische Waschvorrichtung Mikropipette mit Einmalspitzen (100 µl) Aqua dest. Timer

5. STABILITÄT UND LAGERUNG Die original verschlossenen Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfalldatum haltbar, wenn sie bei +2…+8°C im Dunkeln gelagert werden. Geöffnete Reagenzien sind bei +2…+8°C 60 Tage haltbar.

6. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Alle Reagenzien, Proben und Kontrollen sind vor ihrer Verwendung auf Raumtemperatur (22…28°C) zu bringen!

6.1. Mikrotiterplatte Die abbrechbaren Streifen sind mit Streptavidin beschichtet. Die gebrauchsfertigen Vertiefungen sind bei 2...8°C aufzubewahren. Den Aluminiumbeutel nur öffnen, wenn er Raumtemperatur hat. Nichtverbrauchte Vertiefungen im Aluminiumbeutel zusammen mit dem Trockenmittel sofort wieder verschließen und bei 2...8° C lagern.

6.2. Konjugat Das Konjugat ist gebrauchsfertig.

6.3. CEA Standards Die Standards sind gebrauchsfertig. Nach dem ersten Öffnen 6 Monate haltbar bei 2-8° C.

6.4. TMB Substratlösung Das Fläschchen enthält 15 ml eines Tetramethylbenzidin/Wasserstoffperoxidgemisches. Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8°C vor Licht geschützt aufzubewahren. Die Lösung ist leicht hellblau. Sollte die TMB-Substratlösung dunkelblau sein, ist sie kontaminiert und kann nicht im Test verwendet werden.

6.5. Stopplösung Das Fläschchen enthält 15 ml 0.15 M Schwefelsäure (R36/38, S26). Die gebrauchsfertige Lösung ist bei 2...8°C aufzubewahren.

6.6 Waschlösung Verdünne die konzentrierte Waschlösung mit destilliertem Wasser auf 1000 ml. Für kleinere Volumina das 1:50 Verhältnis beachten. Die verdünnte Waschlösung ist bei 2…8°C 30 Tage haltbar.

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7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG DER PROBEN Als Probenmaterial muss humanes Serum oder Plasma verwendet werden, das unter Beachtung der üblichen Vorsichtsmaßnahmen gewonnen wurde. Für einen genauen Vergleich mit den etablierten Normalwerten ist es wichtig, dass der Patient bei der morgendlichen Probennahme nüchtern ist. Das Blut sollte durch Punktion einer Vene in einem einfachen Probengefäß mit rotem Deckel ohne Zusatz von Additiven oder anti-Koagulantien gewonnen werden. Das Blut gerinnen lassen. Abtrennung der Zellen vom Serum durch Zentrifugation. Die Proben können bei 2…8°C für maximal 5 Tage im Kühlschrank gelagert werden. Falls eine Bearbeitung in dieser Zeit nicht möglich ist, können die Proben bei -20°C für bis zu 30 Tage gelagert werden. Wiederholtes einfrieren und auftauen ist zu vermeiden. Patientenproben mit CEA Konzentrationen über 250 ng/ml können mit dem Standard 0 verdünnt und erneut gemessen werden. Bei Doppelbestimmung werden 0,050 ml Probe benötigt.

7.1. Vorsichtsmaßnahmen TMB Substrat keinem direkten Sonnenlicht, Metall oder Oxidantien aussetzen. Das Substrat nicht einfrieren. Das Rekonstituieren und Pipettieren der Reagenzien erfordert maximale Präzision Diese Methode erlaubt die Bestimmung von CEA von 5.0 – 250 ng/ml.

8. TESTDURCHFÜHRUNG 8.1. Testvorbereitung Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die Arbeitsanleitung genau zu befolgen. Die folgende Testdurchführung ist für die manuelle Methode validiert. Vor Testbeginn auf dem mitgelieferten Ergebnisblatt die Verteilung bzw. Position der Patientenproben und Standards auf den Mikrotiterstreifen genau festlegen. Die benötigte Anzahl von Mikrotiterstreifen (Kavitäten) in den Streifenhalter einsetzen. Das Pipettieren der Proben sollte maximal 10 Minuten dauern um einen Drift innerhalb des Testes zu vermeiden. Wenn mehr als eine Mikrotiterplatte gemessen wird, wird empfohlen für jede Platte eine Standardkurve zu erstellen. 1 Vertiefung 2 Vertiefungen 2 Vertiefungen 2 Vertiefungen 2 Vertiefungen 2 Vertiefungen 2 Vertiefungen

(z.B. A1) (z.B. B1+C1) (z.B. D1+E1) (z.B. F1+G1) (z.B. H1+A2) (z.B. B2+C2) (z.B. D2+E2)

Blank für Standard 0 für Standard 1 für Standard 2 für Standard 3 für Standard 4 für Standard 5

Prinzipien der Qualitätssicherung in der Laboratoriumsmedizin erfordern zur höheren Sicherheit für Kontrollen und Patientenproben mindestens Doppelbestimmungen. Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung durchführen. Für jeden Pipettierschritt der Kontrollen und Proben saubere Einmalspitzen verwenden. 1.

Dispensiere 25 µl Standards und Proben (und Kontrollen) in die entsprechenden Vertiefungen.

2. 3.

Dispensiere 100 µl Konjugat in jede Vertiefung. Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken.. Inkubiere für 60 min bei Raumtemperatur (22 – 28°C).

4.

Nach der Inkubation die Folie entfernen und den Inhalt der Die Streifen mit der mitgelieferten Abdeckfolie bedecken. Absaugen und jede Vertiefung dreimal mit 300µl verdünnter Waschlösung waschen. Überfließen von Flüssigkeit aus den Vertiefungen vermeiden. Intervall zwischen Waschen und Absaugen sollte mindestens 5 sec betragen. Nach dem Waschen die Teststreifen mit den Öffnungen nach unten kurz auf Fliesspapier ausklopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Beachte: Der Waschvorgang ist wichtig, da unzureichendes Waschen zu schlechter Präzision und falsch erhöhten Messergebnissen führt!

5. 6.

100µl TMB-Substratlösung in alle Vertiefungen pipettieren. Inkubiere für 15 min bei Raumtemperatur (22 – 28°C) im Dunkeln.

7.

In alle Vertiefungen 100 µl Stopplösung in der gleichen Reihenfolge und mit den gleichen Zeitintervallen wie bei der TMB-Substratlösung Zugabe pipettieren. Die Mikrotiterplatte leicht schütteln. Während der Inkubation gebildete blaue Farbe schlägt in gelb um.

8.

Die Extinktion der Lösung in jeder Vertiefung bei 450/620 nm innerhalb von 30 min. nach Zugabe der Stopplösung messen

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9. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Labor sollte Kontrollen im normalen, hohen und niedrigen Bereich für CEA messen, um die Leistungsfähigkeit des Testes zu überprüfen. Diese Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt und bei jedem Testlauf mitbestimmt werden. Qualitätskontrollaufzeichnungen sollten geführt werden, um die Performance der gelieferten Reagenzien zu überwachen. Um Trends erkennen zu können, sollten angemessene statistische Methoden etabliert werden. Jedes Labor sollte Annahmekriterien für die Testperformance aufstellen. Andere Parameter, die überwacht werden sollten, schließen den 80, 50 und 20% Abschnitt der Standardkurve für die Interassay Reproduzierbarkeit ein. Zusätzlich sollte die maximale Absorption mit früheren Messungen konsistent sein. Signifikante Abweichungen von der etablierten Leistungsfähigkeit können ein Indikator sein für unbemerkte Veränderungen der experimentellen Bedingungen oder Instabilität von Kitreagenzien. Um die Ursache der Abweichung zu ermitteln sollten frische Reagenzien verwendet werden. Wenn Computer-gestützte Datenverarbeitung für die Berechnung der Ergebnisse benutzt wird, ist es zwingend, dass der erwartete Wert für die Standards innerhalb von 10% der angegebenen Konzentration liegt.

10. ERGEBNISSE 10.1. Hinweis Die optische Dichte (OD) von einigen Standards und Proben könnte oberhalb von 2.0 liegen, wodurch sie außerhalb des messbaren Bereiches des Mikrotiterplatten Readers liegen könnten. Daher ist es für ODs > 2,0 notwendig eine Messung bei 405 nm (= Wellenlänge der Peakschulter) zusätzlich zu der Messung bei 450 nm (Peak-Wellenlänge) und 620 nm (Referenzfilter für die Subtraktion von plastikabhängigen Interferenzen) durchzuführen. Für Mikrotiterplatten-Photometer die nicht drei Wellenlängen gleichzeitig messen können, wird empfohlen wie folgt zu verfahren: - Messe die Mikrotiterplatte bei at 450 nm und 620 nm. - Messe die Mikrotiterplatte erneut bei 405 nm und 620 nm. - Ermittle die Vertiefungen die bei 450 nm eine OD > 2,0 zeigen - Wählen Sie das entsprechende Ergebnis bei 405 nm aus und multiplizieren Sie den Wert mit dem Konversionsfaktor 3,0 (wobei OD 450/OD 405 = 3.0), d. h.: OD 450 nm = OD 405 nm x 3,0. Warnung:

Der Konversionsfaktor 3,0 ist nur eine Anhaltspunkt. Für mehr Genauigkeit wird empfohlen den Konversionsfaktor des jeweiligen Gerätes zu berechnen.

Die OD von Standard 5 sollte ≥ 1.3 sein.

10.2. Berechnung der Ergebnisse Berechne den Mittelwert der Absorption jedes Punktes der Standardkurve und jeder Probe. Verwende vorzugsweise den 4 Parameter Fit oder die cubic spline Funktion als Auswertealgorythmus. Interpoliere die Werte der Proben anhand der Standardkurve, um die zugehörige Konzentration in ng/ml zu erhalten.

10.3. Referenzwerte Nichtraucher Raucher

< 5 ng/ml < 10 ng/ml

11. TESTMERKMALE 11.1. Sensitivität Die niedrigste nachweisbare Konzentration an CEA, die vom Standard 0 unterschieden werden kann ist 0,11 ng/ml bei 95% Konfidenzintervall.

11.2. Spezifität Um die Spezifität der im Test verwendeten Antikörper zu bestimmen, wurde ein Pool von Patientenproben mit hohen Dosen verwandter Analyte versetzt. Analyt CEA β-HCG AFP CA-125 PSA CA 19-9

Konzentration

Kreuzreaktivitä

250 ng/mL 5000 ng/mL 1000 U/mL 1000 ng/mL 1000 U/mL

100 % ND ND ND ND ND

10

11.3. Präzision Intraassay-Varianz Die Variation innerhalb eines Testlaufs wurde durch die wiederholte Bestimmung (16x) von drei verschiedenen Kontrollseren in einem Test ermittelt. Die Intraassay-Varianz beträgt ≤5,8%. Interassay-Varianz Die Variation zwischen verschiedenen Testläufen wurde durch die wiederholte Bestimmung (20x) von drei verschiedenen Kontrollseren in verschiedenen Lots ermittelt . Die Interassay-Varianz beträgt ≤ 9,9%.

11.4. Korrelation mit RIA Der NovaTec CEA ELISA wurde verglichen mit einem anderen kommerziell erhältlichen CEA Test. 167 Serumproben wurden in beiden Systemen gemessen. Die lineare Regressionskurve wurde berechnet. y = 1.019* x – 0.200 r2 = 0.992 y = CEA Predicate Kit x = CEA NovaTec Kit

11.4. Genauigkeit Die Wiederfindung von 10 – 20 – 40 ng/ml zugegebenem CEA ergab einen durchschnittlichen Wert (±SD) von 100,7% ± 7,2 % im Verhältnis zur Originalkonzentration.

12. GRENZEN DES VERFAHRENS Kontamination der Proben durch Bakterien oder wiederholtes Einfrieren und Auftauen können zu einer Veränderung der Messwerte führen. CEA hat eine geringe Sensitivität und Spezifität als Tumormarker. Klinisch erhöhte CEA Werte allein reichen für eine Diagnose nicht aus. Die Diagnose einer Tumorerkrankung darf nicht allein auf der Basis des Ergebnisses einer Bestimmung gestellt werden. Die anamnestischen Daten sowie die Symptomatologie des Patienten müssen zusätzlich zu den serologischen Ergebnissen in Betracht gezogen werden. Es gibt Patienten mit kolorektalem Krebs ohne erhöhte CEA Werte und erhöhte CEA Werte verändern sich nicht immer mit dem Fortschreiten oder Zurückgehen der Erkrankung. Raucher haben eine höhere Basislinie als Nichtraucher.

13. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE Gemäß Art. 1 Abs. 2b der EU-Richtlinie 98/79/EG legt der Hersteller die Zweckbestimmung von In-vitro-Diagnostika fest, um deren Eignung, Leistung und Sicherheit sicherzustellen. Daher sind die Testdurchführung, die Information, die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung strikt zu befolgen. Bei Anwendung des Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich. Der Hersteller haftet für falsche Ergebnisse und Vorkommnisse aus solchen Gründen nicht. Auch für falsche Ergebnisse aufgrund von visueller Auswertung wird keine Haftung übernommen. Nur für in-vitro-Diagnostik durch Fachpersonal, welches die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht. Alle verwendeten Bestandteile menschlichen Ursprungs sind auf Anti-HIV-AK, Anti-HCV-AK und HBsAG nichtreaktiv getestet. Dennoch sind alle Materialien als potentiell infektiös anzusehen und entsprechend zu behandeln. Reagenzien unterschiedlicher Chargen nicht untereinander austauschen. Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden. Nicht nach Ablauf des Verfallsdatums verwenden. Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen. Flaschen sofort nach Gebrauch fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach dem ersten Öffnen Konjugat- und Standardfläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen. Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falsch erhöhten Resultaten Patientenproben und Konjugat sorgfältig in die Kavitäten pipettieren. Mikrobiologisch kontaminierte Proben sollten nicht verwendet werden. Entsprechendes gilt für hoch lipämische oder hämolytische Proben. Miktrotiter Photometer messen vertikal. Der Boden der Mikrotiterplatte sollte daher nicht berührt werden. Einige der Reagenzien enthalten geringe Mengen an Proclin 300®. Das TMB Substrat enthält einen Reizstoff, der schädlich sein kann beim Inhalieren, Verschlucken oder Hautkontakt. Zur Vermeidung von Verletzungen sollte die Inhalation, das Verschlucken sowie Haut- und Augenkontakt vermieden werden. Die Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Schwefelsäure ist giftig und korrosiv und kann beim Verschlucken toxisch wirken. Zur Vorbeugung von chemischen Verbrennungen sollte der Kontakt mit Haut und Augen vermieden werden. 11

Durch die Zugabe des TMB Substrates wird eine chemische Reaktion gestartet, die durch die Zugabe der Stopplösung beendet wird. Daher sollten das TMB Substrat und die Stopplösung in der gleichen Reihenfolge zugegeben werden, um jegliche Zeitunterschiede während der Inkubation zu vermeiden. WARNUNG:

Schwefelsäure reizt Augen und Haut. Nach Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser spülen und einen Arzt aufsuchen.

13.1. Entsorgungshinweise Chemikalien und Zubereitungen sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde informiert über die Entsorgung von Sonderabfällen.

14. BESTELLINFORMATION Produktnummer:

DNOV060

CEA (96 Bestimmungen)

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ESPANOL 1. INTRODUCCIÓN Antígeno carcinoembrionario (CEA) es una glicoproteína con un peso molecular de 180 kDa, que participa en la adhesión celular. Es normalmente producido durante el desarrollo fetal, pero la producción de CEA se detiene antes del nacimiento. Por lo tanto, no están por lo general presentes en la sangre de los adultos sanos, aunque los niveles han crecido en grandes fumadores. CEA fue identificado en extractos de tejido de cáncer en el colon humano. Más tarde se descubrió que el suero de individuos con carcinoma colon rectal y otros, tenían mayores los niveles de CEA que los individuos sanos y pueden ser utilizados para monitorear la respuesta al tratamiento del cáncer de colon.CEA y los genes relacionados constituyen a la familia de CEA que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas. El cáncer más frecuente que provoca un aumento del CEA es el cáncer del colon y recto. Otros incluyen el cáncer del páncreas, estómago, mama, pulmón y ciertos tipos de tiroides y cáncer de ovario. Las condiciones benignas que pueden elevar el CEA incluyen el tabaquismo, las infecciones, la enfermedad inflamatoria intestinal, pancreatitis, cirrosis del hígado y algunos tumores benignos en los mismos órganos en que un nivel elevado de CEA indica cáncer. La quimioterapia y la radioterapia pueden causar un aumento temporal del CEA, debido a la muerte de células tumorales y la liberación del CEA en el torrente sanguíneo. Los tumores benignos no suele causar un aumento por encima de 10 ng/ml.

2. USO Método inmunoenzimático colorimétrico (ELISA) para la determinación cuantitativa de CEA en el suero o plasma humano.

3. FUNDAMENTO DE LA PRUEBA En este método, los calibradores, muestras de paciente y / o los controles que contiene el antígeno nativa son añadidos a los pozos cubiertos con estreptavidina. Anticuerpos monoclonal biotinilado y etiquetados con peroxidasa de rábano (HRP) se agregan y se mezclan los reactivos. Los diferentes tipos de anticuerpos utilizados tienen una alta afinidad y especificidad, y se dirigen contra epítopes distintos y diversos de la CEA. La reacción entre varios anticuerpos de la CEA y la CEA nativa ocurre en los micropocillos sin competencia que forman un complejo tipo sándwich soluble. La interacción es ilustrada por la siguiente ecuación:

BtnAb(m) AgGH HRP-Ab(p) HRP-Ab(p)-AgGH-BtnAb(m) Ka K-a

Anticuerpo Monoclonal Biotinilado (Cantidad en exceso) Antigeno Nativo (Cantidad Variable) HRP Anticuerpo marcado (Cantidad en exceso) Complejo sandwich antigeno-anticuerpo Tasa constante de Asociación Tasa constante de Disociación

Simultáneamente, el complejo se fija en el pozo a través de la reacción de alta afinidad de la estreptavidina y biotina de anticuerpos. Esta interacción se ilustra a continuación:

Streptavidin CW Immobilized Complex

Estreptavidina inmovilizada en el pocillo. Anticuerpo-Antigeno Sandwich.

Después se alcanza el equilibrio, la fracción del anticuerpo-limite es separada del antígeno desatado por la aspiración. La concentración de antígeno nativo es directamente proporcional a la actividad HRP en la fracción de anticuerpo-limite. La actividad del conjugado con HRP es cuantificada por la reacción con el sustrato TMB para producir el color azul. La reacción se termina por la adición de la solución de parada que convierte el color azul a amarillo. La absorbancia se mide en un lector de placas.

4. MATERIALES 4.1. Reactivos suministrados Pozos recubiertos: 12 tiras de 8 pozos separables. Los pozos están recubiertas con Estreptavidina y vienen empacados en una bolsa de papel de aluminio resellable. Conjugado: 1 vial que contiene 13 ml de anti-CEA marcada con peroxidasa de rábano picante y anticuerpos de ratón biotinilados anti-CEA

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Solución de sustrato TMB: 1 vial con 15 ml de 3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (H2O2-TMB 0,26 g/l) (evite cualquier contacto con la piel). Solución de lavado concentrada 50x: 1 vial con 20 ml (NaCl 45 g/l, Tween 20 55 g/l) Solución de parada: 1 vial con 15 ml de ácido sulfúrico 0,15 mol/l (evite cualquier contacto con la piel). Estándares: 6 botellas 1 ml cada una, Estos son sueros humanos basados y calibrados con un preparación de referencia, que se ensayó primero contra el 1st IRP 73/601 estos tienen aproximadamente. las siguientes concentraciones: Estándar 0: Estándar 1: Estándar 2: Estándar 3: Estándar 4: Estándar 5:

0 5 10 25 50 250

ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml

4.2. Materiales suministrados 1 Soporte para tiras 1 Lámina sellante 1 Protocolo de procesamiento 1 Plan de distribución e identificación

4.3. Materiales y equipos necesarios Lector de de ELISA equipado para medir absorbancia a 450 nm Equipo manual o automático para el lavado de los pozos Pipetas para agregar volumen de 100 µl Agua destilada Temporizador

5. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a 2...8 °C en oscuridad. Los reactivos abiertos son estables por 60 días cuando se almacenan a 2…8 °C.

6. PREPARACION DE LOS REACTIVOS ¡Es muy importante que todos los reactivos, muestras y estándares se encuentren a temperatura ambiente (22…28 °C) antes de iniciar la ejecución de la prueba!

6.1. Tiras recubiertas rompibles Las tiras vienen listas para ser usadas y se rompen para separar los pozos. Están recubiertas con estreptividina. Se deben conservar a una temperatura entre 2...8 °C. Abra la bolsa sólo cuando ésta se encuentre a temperatura ambiente. Inmediatamente después de retirar las tiras que va a utilizar, asegúrese de guardar las tiras que no van a ser usados dentro de la bolsa de aluminio resellable junto con el desecante suministrado y almacenarla a una temperatura entre 2...8 °C; las tiras son estables hasta la fecha de caducidad.

6.2. Conjugado El conjugado viene listo para usar.

6.3. CEA Estándares Los estándares vienen listos para usar. Una vez abiertos, los estándares permanecen estables 6 meses conservados a 2-8° C.

6.4. Solución de sustrato TMB El frasco contiene 15 ml de un sistema de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno. El reactivo viene listo para ser usado y debe ser almacenado a 2...8 °C en oscuridad. La solución debe estar incolora o puede tener un ligero tinte azul. Si el sustrato se torna azul, esto indica que puede haberse contaminado y por lo tanto debe desecharse.

6.5. Solución de parada El frasco contiene 15 ml de solución de ácido sulfúrico 0,15 M (R 36/38, S 26). Esta solución viene lista para ser usada y debe ser almacenada a 2...8 °C.

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6.6. Solución de lavado Diluir la solución de lavado concentrada 50 X en un 1.000 ml con agua destilada usando un contenedor adecuado. Para volúmenes más pequeños, asegúrese de respetar la relación de 1:50. La solución de lavado diluida es estable durante 30 días si se almacena a 2...8 °C.

7. RECOLECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS En la recogida de muestras de sangre, suero por venopunción hay que tener en cuenta las precauciones habituales. Para la comparación exacta de los valores normales establecidos, se debe obtener una muestra de suero de la mañana en ayunas. Para la preparación del suero, la sangre se debe recoger en un tubo de venopunción sin aditivos o anti-coagulantes. Permitir que la sangre se coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero de las células. Las muestras se pueden refrigerar de 2... 8 ° C por un período máximo de cinco (5) días. Si la muestra (s) no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra (s) puede almacenarse a temperaturas de -20ºC durante un máximo de 30 días. Evite congelar y descongelar. Muestras de los pacientes con concentraciones de CEA por encima de 250 ng / ml puede diluirse con estándar 0 y volver a analizarse. Cuando analice en duplicado 0.050ml del espécimen es requerido.

7.1. Precauciones Evitar la exposición del substrato TMB a la luz solar directa, metal u oxidantes. Non congelar la solución. La máxima precisión es necesaria al momento de dispensar los reactivos Este método permite la determinación de CEA a partir de 5.0 a 250.0 ng/ml.

8. PROCEDIMIENTO 8.1. Preparación para la prueba Por favor, lea detenidamente el protocolo de la prueba antes de realizar el ensayo. La confiabilidad de los resultados depende del seguimiento estricto del protocolo de la prueba tal cual se describe en el inserto. Se recomienda el uso de los controles internos en cada ensayo. Antes de comenzar el ensayo, se debe establecer cuidadosamente la distribución e identificación de las muestras y los estándares en la hoja de resultados suministrada con el kit. Seleccione el número necesario de tiras de microtitulación o pozos e insértelos en el soporte. El pipeteo de muestras no debe tomar más de diez minutos para evitar la deriva del análisis. Si utiliza más de una placa, se recomienda repetir la curva dosis-respuesta para cada placa. Por favor, destinar al menos: 1 pozo (por ejemplo, A1) 2 pozos (por ejemplo, B1+C1) 2 pozos (por ejemplo, D1+E1) 2 pozos (por ejemplo, F1+G1) 2 pozos (por ejemplo, H1+A2) 2 pozos (por ejemplo, B2+C2) 2 pozos (por ejemplo, D2+E2)

para el blanco para el estándar 0 para el estándar 1 para el estándar 2 para el estándar 3 para el estándar 4 para el estándar 5

Se recomienda determinar estándares y muestras de los pacientes por duplicado. Realice todos los pasos del ensayo en el orden indicado y sin retrasos apreciables entre los pasos. Debe usar una punta desechable limpia para la dosificación de cada estándar y cada muestra. 1. Agregue 25 µl de estándares y muestras ( y controles )en sus respectivos pozos. 2. Agregue 100 µl de conjugado a cada pozo. Cubra los pozos. 3. Incube durante 60 minutos a temperatura ambiente (22...28 °C). 4. Cuando se complete el tiempo de incubación, retire la lámina sellante, aspire el contenido de los pozos y lave cada pozo tres veces con 300 µl de solución de lavado diluida. Evite desbordamientos entre los pozos de reacción. El tiempo de remojo entre cada ciclo de lavado debe ser >5 seg. ¡Al finalizar, retire con cuidado el líquido sobrante golpeando las tiras sobre una toalla de papel antes de seguir al siguiente paso! Nota: ¡El lavado es crítico! Un lavado insuficiente resulta en una mala precisión y valores de absorbancia falsamente elevados. 5. Agregue 100 µl de solución de sustrato TMB en todos los pozos. 6. Incube durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente (22...28 °C) en oscuridad. 7. Agregue 100 µl de solución de parada en todos los pozos en el mismo orden y a la misma velocidad a la que agregó la solución de sustrato TMB. Mezcle suavemente la placa. Cualquier color azul desarrollado durante la incubación se convertirá en amarillo. 8. Mida la absorbancia de la muestra a 450 nm dentro de 30 minutos después de haber adicionado la solución de parada contra el blanco.

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9. CONTROL DE CALIDAD Cada laboratorio debe evaluar controles normal, alto y bajo que correspondan a niveles dentro del rango de CEA para monitorear el desempeño del ensayo. Estos controles deben ser tratados como muestras desconocidas y se deben determinar sus valores cada vez que se realice el ensayo. Se deben llevar gráficas de éstos controles de calidad para hacerle seguimiento al desempeño de los reactivos. Se deben emplear los métodos estadísticos pertinentes para verificar las tendencias. Cada laboratorio debe establecer los límites aceptables de desempeño para el ensayo. Otros parámetros que se deben monitoreados son los interceptos al 80, 50 y 20% de la curva estándar para evaluar la reproducibilidad intercorrida. Además, la absorción máxima debe ser consistente con la experiencia del laboratorio. Una desviación significativa del desempeño establecido puede indicar un cambio en las condiciones experimentales o la degradación de los reactivos. Deben usarse reactivos frescos para determinar la razón de dichas variaciones. Si se emplea una reducción controlada de los datos por computador para calcular los resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los calibradores se encuentren dentro del 10% de las concentraciones asignadas.

10. RESULTADOS 10.1. Nota Las densidades ópticas (DO) de algunos estándares y de las muestras pueden ser superiores a 2,0 podría estar fuera del rango de medición de algunos lectores de microplacas. Por lo tanto, necesario, para las DOS superior a 2,0, se realice una lectura a 405 nm (longitud de onda = pico de hombro), además de 450 nm (pico de longitud de onda) y 620 nm (filtro de referencia para la sustracción de interferencias debidas a las de plástico). Para los lectores de microplacas no puede leer la placa a tres longitudes de onda al mismo tiempo, es aconsejable proceder de la siguiente manera: - Lea las microplacas a 450 nm y 620 nm. - Vuelva a leer la placa a 405 nm y 620 nm. - Descubra los pozos cuya DO a 450 nm es mayor de 2,0 - Seleccione la correspondiente lectura DO a 405 nm y se multiplican estos valores a 405 nm por el factor de conversión 3,0 (en DO 450/OD 405 = 3.0), es decir: DO 450 nm = DO 405 nm x 3,0 Advertencia: El factor de conversión 3,0 es el sugerido. Para mayor precisión, se advierte al usuario para el cálculo de la conversión factor específico para su lector. La DO del estándar 5 debe ser > 1,3

10.2. Cálculo de los resultados Calcule la absorbancia media para cada punto de la curva estándar y cada muestra. Utilice 4 parámetros logísticos o función cúbic spline como algoritmo de cálculo. Interpolar los valores de las muestras en la curva estándar para obtener los valores correspondientes a las concentraciones expresadas en ng/ml.

10.3 Valores de referencia No fumadores Fumadores

< 5 ng/ml