Estudio de las enfermedades desatendidas transmitidas por vectores en Panamá (principalmente leishmaniasis, encefalitis equina y fiebre amarilla)

PERFIL DEL PROYECTO

INVESTIGADORES: Juan Miguel Pascale, M.D, Ph.D. Sandra López Vergès, Ph.D. Blas Armién, MD, MSc (PH) Anayansi Valderrama, Ph.D. Lorenzo Cáceres, Ph.D. Néstor Sosa, MD, FACP Azael Saldaña, Ph.D.

FEBRERO DE 2014 INSTITUTO CONMEMORATIVO GORGAS DE ESTUDIOS DE LA SALUD Calle 35 y 36 Ave. Justo Arosemena, Corregimiento de Calidonia

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

ÍNDICE I.

INTRODUCCIÓN

3

II.

TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN

5

III.

ANTECEDENTES

5

IV.

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

8

OBJETIVO GENERAL

10

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

10

VII.

JUSTIFICACIÓN

11

VIII.

BENEFICIARIOS

12

LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO

12

METODOLOGÍA

14

RESULTADOS y LOGROS ESPERADOS

22

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

23

V. VI.

IX. X. XI. XII. XIII.

CRONOGRAMA

XIV.

PRESUPUESTO

2

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

I.

INTRODUCCIÓN

El tránsito de personas por las áreas de acceso de Panamá (Canal, aeropuertos, fronteras Colombia-Panamá-Costa Rica), puede representar un riesgo de transmisión de enfermedades desatendidas transmitidas por vectores, según la clasificación de OMS. Un adecuado sistema de vigilancia epidemiológica por los sistemas de salud, ayudaría, en gran medida, a actuar de forma oportuna ante un brote epidémico.

El estudio propuesto cumplirá con un plan de investigación integral, de manera que se obtenga evidencia científica para mejorar el diagnóstico clínico y de laboratorio, que ayudará a ampliar nuestro conocimiento sobre el ciclo de transmisión de estas enfermedades emergentes, lo que contribuirá a desarrollar un sistema de vigilancia y prevención más eficiente y eficaz, que incluya los reservorios y vectores de estas enfermedades (leishmaniasis, encefalitis equina fiebre amarilla, entre otras). Este proyecto permitirá también la caracterización de Los riesgos de potencial epidémico de estas enfermedades para el resto del país.

Presentamos primero, en los antecedentes, los conocimientos generales de las enfermedades principales de este proyecto: fiebre amarilla, encefalitis equina y leishmaniasis, para luego enfocarse en el problema actual de estas enfermedades en nuestro país. El objetivo general es fortalecer lo existente y desarrollar nuevas técnicas de vigilancia, diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades, así como obtener conocimientos científicos integrales y evidencias para tomar decisiones oportunas que ayuden a prevenir, controlar y tratar estas enfermedades. El documento continúa con la justificación, y la presentación de los beneficiarios, que serán, indirectamente, todos los panameños ya que estas enfermedades desatendidas tienen, probablemente, un alto potencial epidémico. Se presentará el costo y el financiamiento del proyecto, así como la metodología de estudio y el enfoque escogido para responder a los objetivos.

3

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Las muestras recolectadas en las unidades de investigación se analizarán por el personal del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud (ICGES), a través de técnicas moleculares y de serología para determinar las causales de los diferentes síndromes febriles indiferenciados, hemorrágicos, ictérico y los diferentes agentes infecciosos, así como nuevas técnicas para describir la respuesta inmune contra estos patógenos.

Finalmente en esta propuesta se presentan los resultados y logros esperados de la primera fase para el primer año de financiamiento. A largo plazo esperamos con ello desarrollar guías de información a nivel de intercambio internacional y a su vez obtener recursos sustentables para mantener la vigilancia y atender situaciones con potencial epidémico.

4

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

II.

TÍTULO DE LA INVESTIGACIÓN

Estudio de las enfermedades desatendidas transmitidas por vectores en Panamá (principalmente leishmaniasis, encefalitis equina, fiebre amarilla).

III.

ANTECEDENTES

La leishmaniasis es una enfermedad producida por un Trypanosomatidae del género Leishmania y es una de las tantas enfermedades que más aquejan a la población rural de Panamá. Es considerada por la Organización Mundial de la Salud una de las enfermedades emergentes con brotes endémicos en zonas tropicales y sub-tropicales.

La enfermedad es zoonótica porque ocurre en la naturaleza entre poblaciones de animales silvestres, siendo los mamíferos los reservorios primarios de la Leishmania. En Panamá, Choelopus hoffmanni (perezoso) es el principal reservorio de la Leishmania (Vianna) panamanesis y el vector es un flebótomo del género Lutzomyia conocido popularmente como chitra.

Los números de casos de la leishmaniasis van en aumento, hasta tres mil nuevos casos diagnosticados en un año; 90 % de estos casos provienen de zonas endémicas de las provincias de Bocas del Toro, Coclé, Panamá Oeste, Colón y Panamá Este, lo que hace necesaria la evaluación de los factores que están influyendo en el ciclo epidemiológico e incremento de los números de casos.

Es importante informar a las personas de las áreas afectadas y al personal de salud, de como ocurre el ciclo epidemiológico de la leishmaniasis, porque aún se mantienen mitos y leyendas sobre su transmisión, dificultando su control.

5

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Los virus de las encefalitis equinas del este (VEEE) y venezolana (VEEV) pertenecen a la familia Togaviridae: Alphavirus, y junto con otros arbovirus como el virus del Nilo occidental y el virus de la encefalitis japonesa, pertenecientes a la familia Flaviviridae: Flavivirus (como el virus de la Fiebre amarilla) son agentes etiológicos importantes causantes de encefalitis y enfermedades febriles en las Américas. VEEV se desarrolla en un ciclo selvático, entre roedores y mosquitos y a su vez puede infectar humanos en áreas vulnerables. Se han detectado mutaciones en el virus que permiten adaptarse a equinos o mosquitos que amplifican cepas epizoóticas que causan epidemias mayores.

En Panamá, VEEV fue asociado por primera vez a un caso fatal humano en 1960, y desde esa fecha han surgido casos esporádicos, como los dos casos registrados en el 2013 provenientes del personal de SENAFRONT. Sin embargo, casos de encefalitis en equinos causados por VEEV nunca han sido descritos aunque haya una circulación enzoótica por todo el territorio, probablemente porque las cepas panameñas ID y IE son avirulentas para los equinos.

A la inversa, VEEE ha causado brotes en equinos en Panamá desde 1930, pero nunca había sido asociado con enfermedad en humanos en nuestro territorio a pesar que se ha aislado el virus en mosquitos y se haya realizado vigilancia en humanos durante los brotes en equinos. En Norte América, las infecciones anuales en humanos por VEEE son en promedio 5-6 al año y más casos ocurren en equinos y en otros animales domésticos, expandiéndose a partir de los ciclos aves-mosquito en los pantanos, con una tasa de letalidad >50% en humanos y equinos.

En América Latina, VEEE en equinos es común, pero sólo tres casos en humanos habían sido reconocidos, a pesar de la exposición extensiva al ciclo enzoótico y la vigilancia activa durante los brotes en varios países de la región. Estudios en laboratorio sugieren una diferencia en la virulencia entre las cepas de VEEE de

6

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Norte y Sur América relacionada con la habilidad de inhibir la repuesta inmune, así como la diferencia de tropismo celular y la eficiencia de traducción.

Por otro, lado la fiebre amarilla también es una enfermedad causada por un arbovírus (del inglés arthropod borne virus = virus transmitido por artrópodo), el virus de la fiebre amarilla de la familia Flaviviridae: Flavivirus, representa una importante causa de morbilidad y letalidad en zonas de las regiones tropicales de África y las Américas. Esta enfermedad es transmitida por mosquitos Aedes aegypti, Aedes albopictus, que transmiten el virus de la fiebre amarilla principalmente a humanos, y Haemagogus spp y Sabethes spp, responsables de la transmisión de la fiebre amarilla selvática y estos vectores están presentes en Panamá.

La fiebre amarilla es una enfermedad endémica encontrada en regiones tropicales desde África a América del Sur. África es donde tiene mayor diseminación y es endémica en 34 países. Aunque no se ha reportado ningún caso de fiebre amarilla urbana desde 1942, más de 1900 casos de fiebre amarilla selvática han sido notificados en América del Sur, en los últimos 17 años. Su ocurrencia ha sido registrada en varios países como: Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, Guyana Francesa, Perú y Venezuela. En esos países, característicamente, la virosis ocurre en Amazonía y pré-Amazonia.

Las áreas de las costas de América del Sur mantienen los índices de la enfermedad. El hecho de que la fiebre amarilla haya sido reportada en Colombia en regiones boscosas cercanas a nuestra frontera, indica la posibilidad del riesgo de que esta enfermedad esté circulando en el país, poniendo en riesgo las poblaciones civiles que viven en esas regiones como personas que van a esas regiones por placer (turismo) o trabajo (SENAFRONT, personal del MINSA, MIDA y los guarda bosques de la ANAM).

7

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

IV.

PROBLEMA

Panamá por ser un país tropical, tiene todas las condiciones adecuadas para el establecimiento de varios vectores artrópodos que pueden transmitir diversas enfermedades virales y parasitarias, las cuales producen una alta tasa de morbilidad o mortalidad en zonas determinadas.

Lamentablemente muchas de ellas no son prioridad de investigación en salud, pero Panamá necesita promover estas investigaciones con la finalidad de tener las bases para diseñar, desarrollar e implementar una política de vigilancia y control de estas enfermedades y disminuir el riesgo de aparición de brotes, principalmente por ser un país de tránsito a nivel internacional a través del canal de Panamá o en las zonas limítrofes, como en el caso de la región oriental.

El

movimiento

poblacional

en

las

áreas

de

la

Provincia

del

Darién,

específicamente las zonas limítrofes entre Panamá y Colombia, hace difícil mantener las localidades inmediatas a estas fronteras, libres de enfermedades como la leishmaniasis cutánea (LC), encefalitis equina (EE), fiebre amarilla (FY), entre otras.

Esta situación convierte a la región vulnerable al tránsito de personas o animales que podrían estar infectadas con enfermedades de alto riesgo epidemiológico y propiciar la introducción de enfermedades emergentes en nuestro territorio. Estas condiciones se incrementan con las barreras culturales en las áreas indígenas, quienes impiden en algunos casos la toma de muestras de sangre para diagnósticos, tratamientos terapéuticos y los rociados residuales intra-domiciliares, como medidas preventivas de epidemias.

En cuanto a la leishmaniasis, enfermedad que no registra tasa de mortalidad, pero si una tasa de morbilidad en un área determinada, se ha notado desde el 2000 un incremento de tres mil nuevos casos por año a nivel nacional y solo el 17% de los 8

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

casos provienen de la región oriental. Sin embrago, la tendencia epidemiológica de la leishmaniasis va en aumento y expansión debido a la deforestación para actividades antropogénicas, alterando la ecología de las poblaciones silvestres tanto del vector como de los reservorios. Esta situación está permitiendo la migración de las especies de vectores y reservorios a los domicilios situados en áreas intervenidas o dentro de los bosques fragmentados, aumentando el riesgo de transmisión.

De las enfermedades desatendidas observamos que en mayo 2010, se reportaron casos de encefalitis humana en la provincia de Darién, y casos equinos fueron reportados en la misma región así como en las provincias de Panamá y Colón hasta finales de agosto. Se pudo determinar que este brote fue causado por los virus de las encefalitis equinas del este (VEEE) y venezolana (VEEV), que se detectaron en los casos humanos (en total 25 casos: 11 de VEEV, 13 de VEEE y una confección) y equinos (50 casos de VEEE, 8 VEEV y 13 confecciones), mostrando por primera vez que la cepa de VEEE de Sur América podía causar enfermedad y casos graves de encefalitis con secuelas severas en humanos.

En Panamá en el año de 1974 se registraron los últimos casos de fiebre amarilla selvática procedentes del área del Bayano indicándose desde entonces la vacunación rutinaria en la región de Panamá Este, Darién y Guna Yala a toda la población a partir del año de edad y cada 10 años. Además se estableció el sistema de vigilancia de la presencia de primates no humanos y la muerte de estos por causas no traumáticas en las mencionadas regiones que ha perdurado a la fecha.

Sin embargo esta vigilancia pasiva para detectar la presencia de la fiebre amarilla en estas regiones del país no han sido suficiente para demostrar a la OPS/OMS que el virus no está circulando por lo cual Panamá está en la lista de países con fiebre amarilla enzoótica lo que puede traer repercusiones negativas en diferentes sectores económicos como el turismo. 9

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

V.

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar las enfermedades desatendidas transmitidas por vectores en Panamá (principalmente Fiebre amarilla, las encefalitis equinas y Leishmaniasis), considerando el espectro de la enfermedad, su distribución geográfica, manejo clínico, así como su patógeno y la respuesta inmune y la ecología (reservorios, vectores y factores bióticos y abióticos); generar las evidencias científicas necesarias para la toma de decisiones, fortalecer nuestras políticas de salud, además diseñar y desarrollar estrategias de intervención que faciliten la prevención, el control, manejo preventivo y proactivo, de pacientes así como robustecer el sistema de vigilancia epidemiológica.

VI.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a. Población humana

1. Mejorar el diagnóstico clínico temprano en las instalaciones de salud así como fortalecer la vigilancia virológica y parasitológica de las enfermedades desatendidas transmitidas por vectores en Panamá.

2. Mejorar el manejo terapéutico de los pacientes diagnosticados con leishmania para ofrecerles los tratamientos adecuados.

3. Caracterizar a nivel molecular y genético las variaciones de los virus y parásitos causantes de estas enfermedades en el país. 4. Diseñar, desarrollar e Implementar estudios de investigación que permitan determinar la respuesta inmune y la patogénesis de estas enfermedades. 5. Implementar un estudio de febriles con los casos que presenten síntomas similares a VEEV, EEEV y FA, y las que sean negativas, a través de un

10

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

diagnóstico diferencial, identificar y caracterizar el agente etiológico responsable. b. Ecología

6. Determinar la distribución e identificar nuevas especies de reservorios y vectores.

7. Comprender mejor el ciclo de transmisión, las especies vectores y reservorios asociados a la transmisión de estas enfermedades en las zonas donde se reportan una alta incidencia.

8. Implementación del uso de animales centinelas para determinar la aparición de la enfermedad en zonas sin reportes de casos. Implementación de vigilancia de primates no humanos para la fiebre amarilla.

VII.

JUSTIFICACIÓN

En Panamá se hace necesario investigar las variables que propician el surgimiento de los brotes de enfermedades tropicales emergentes y desatendidas transmitidas por vectores. La influencia de las modificaciones del clima, topográfica y vegetación, así como el comportamiento humano, sobre estas variables. Los procesos biológicos en la relación patógena (virus o parasito), mosquitos, hospederos

y

humanos,

que

potencializan

la

enfermedad.

El

impacto

socioeconómico en la densidad poblacional, la pobreza y la integración del sistema de salud entre el diagnóstico y tratamiento eficaz.

De no actuarse ahora con el desarrollo de investigaciones que generen evidencias que permitan diseñar intervenciones adecuadas y costo efectivas de nada servirá la bonanza económica pues, Panamá es y sería, un destino de mucho riesgo para la salud de los nacionales, de los que nos visitan o los que deseen invertir ya que

11

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

el escenario es y sería terrible de no establecer las medidas necesarias en términos de salud pública que no se justifica.

VIII.

BENEFICIARIOS

Directos:  Población del Darién.  Personal del SENAFRONT y

SENAN (Servicio Nacional Aéreo

Naval).  Personal del Sistema de Salud, Agropecuario entre otros.

Indirectos:  Turistas  Comerciantes  Científicos  Visitantes temporales  Servidores Públicos  Todos los residentes del territorio nacional

IX.

LOCALIZACIÓN DEL PROYECTO Primera Fase (Panamá Oriental) Segunda Fase (Panamá Centro) Tercera Fase (Panamá Occidental)

Fase I: Panamá Oriental La parte oriental de Panamá nos referimos específicamente al área geográfica que comprende la región este de Panamá (Chepo, Chiman), la provincia del Darién, las Comarcas Gunas (3) y Emberá-Wounaan (2). La provincia de Darién, con una superficie de 16 803 km2, está ubicada en el extremo oriental limítrofe a la La región Oriental del país está habitada por una mezcla de grupos étnicos, como son 12

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

las poblaciones originales (Emberá, Wounaan, Guna, afro descendientes, mestizos y descendientes de europeos provenientes del interior del país). Población del área de estudio del proyecto CHEPO CHIMÁN COMARCA EMBERÁ DARIÉN GUNA YALA TOTAL

2000 35,500 4,086 8,246 40,284 32,446 120,562

2010 46,139 3,343 10,001 48,378 33,109 140,970

Fuente: Contraloría General de la República: año 2010

Las precipitaciones pluviales alcanzan de 1 700 a 2 000 mm anuales, con un marcado período de sequía entre los meses de enero a abril. La temperatura varía entre 17° y 35°C, determinando un clima tropical húmedo. Los distintos tipos de suelos y su aptitud de uso están principalmente asociados a sus variaciones topográficas y a los materiales geológicos generadores La población de la provincia de Darién se caracteriza por ser escasa, dispersa y heterogénea, y está localizada en numerosos centros poblados pequeños vinculados a los cursos de agua. Se registran permanentemente flujos migratorios muy significativos desde y hacia la provincia.

El Mapa 1 muestra la localización de la región

13

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

El territorio de Darién está dividido en dos distritos: Chepigana y Pinogana, y cuenta con un total de 19 corregimientos. El esquema resultante se caracteriza por la dispersión y muy baja integración espacio-funcional, tanto de las unidades productivas como de las de autoconsumo y de los centros poblados existentes.

Las principales vías de comunicación corresponden a los cursos fluviales, y el asentamiento humano está localizado en sus riberas y a orillas del Golfo de San Miguel,

formando

pequeños

poblados

y

explotaciones

agropecuarias

frecuentemente migratorios.

Los principales centros poblados, La Palma, Yaviza, Garachiné, El Real, y Sambú han generado áreas de influencia no muy bien definidas, relacionándose fundamentalmente en forma directa con la Ciudad de Panamá. La Palma constituye un centro a nivel provincial en cuanto a funciones políticoadministrativas, y Yaviza se está perfilando con igual importancia provincial en cuanto a funciones económicas.

X.

De

METODOLOGÍA

manera

general,

independientemente

del

patógeno

se

realizarán

capacitaciones para el diagnóstico clínico y de laboratorio de estas enfermedades, así como para la recolección de muestras: 

Con relación a la leishmaniasis se desarrollarán cursos de capacitación para mejorar el diagnóstico clínico y tratamientos a médicos y enfermeras. En el área de laboratorio: se capacitarán a tecnólogos médicos para la implementación del diagnóstico microscópico y molecular (2do año). Adicional se intentará aislar, cultivar y caracterizar las cepas de leishmania.



Con relación a la fiebre amarilla y a las encefalitis equinas se presentará un programa de vigilancia de febriles y se capacitará a personal de laboratorio

14

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

para la colecta de muestras necesarias para el diagnóstico de estos agentes virales.

A partir de las muestras de pacientes, de reservorios y de vectores, se tratará de cultivar y caracterizar por métodos moleculares los virus que se aíslen o los parásitos de Leishmania. Para estas tres enfermedades se harán estudios de reservorios y vectores.

Para encefalitis equina capacitaremos a personal del MIDA y los apoyaremos en el diagnóstico virológico y serológico de la enfermedad.

En cuanto a encefalitis equina, fiebre amarilla y otras enfermedades emergentes se harán encuestas serológicas en sujetos con cuadros febriles usando técnicas de ELISA, tomando en cuenta el registro de vacunas.

Para fiebre amarilla se harán monitoreo y capturas de primates no humanos y de vectores, buscando la presencia o exposición del virus.

Metodología más detallada:

Estudios de los Aspectos Clínicos de Leishmaniasis:

Los pacientes que se presenten con lesiones cutáneas o mucosas sugestivas de Leishmaniasis se le realizará un raspado superficial de las úlceras. Esta muestra será revisada en un microscopio para detectar la presencia del parásito.

Adicionalmente, parte de la muestra será enviada al Instituto Gorgas para realizarle cultivo y Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR) para consolidar el diagnóstico e identificar la especie de Leishmania afectando a los pacientes. Se comparará la eficacia del diagnóstico con raspado versus la intradermo reacción de Montenegro. 15

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Se registrará en forma prospectiva todas las características clínicas de los casos de Leishmaniasis: número y tamaño de las lesiones, localización anatómica, compromiso de las mucosas.

Se registrará el sitio (geográfico) específico donde ocurrió la infección, si se puede. Se hará una correlación entre la presentación clínica y la especie de Leishmania identificada, en caso de reportarse especies o sub-especies nuevas. Se hará un registro detallado del tratamiento: tipo, dosis, duración, efectos o eventos adversos.

Se tabularán los tratamientos tradicionales empleados por los pacientes previo a su inclusión. De ser posible, algunos pacientes que califiquen podrían participarán en otras investigaciones sobre el desarrollo de un nuevo tratamiento tópico contra la Leishmaniasis cutánea que se está realizando en el Instituto Gorgas. Los que no califiquen para la terapia tópica, serán tratados con el tratamiento convencional (Antimonio Pentavalente, Glucantime) por vía Intramuscular (IM). Adicionalmente, usaremos la vía intravenosa (IV) que causa menos complicaciones y molestias al paciente.

Para esto se capacitarán a médicos y enfermeras en las indicaciones, monitoreo previo, uso y cálculo de la dosis óptima y en el seguimiento de los pacientes que reciban Antimonio Pentavalente. De esta forma, no solo exploraremos nuevas formas de tratamiento sino que lograremos que el tratamiento estándar sea aplicado con mayor eficiencia.

16

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Transferencia

de

Tecnología

y Capacitación

en

el

Diagnóstico

de

Leishmaniasis:

Como parte del trabajo investigativo, se realizará una transferencia de la capacidad para realizar el raspado de la lesión y la identificación de la Leishmania al personal médico, paramédico y técnico que labora en la Región.

Se

tiene

contemplado,

además

de

la

demostración

y

explicación

del

procedimiento, la revisión de un video instruccional sobre esta técnica.

Adicionalmente, se realizará, al final de la capacitación, una prueba de proficiencia al personal que ha recibido su entrenamiento para que puedan recibir una certificación por parte del Instituto Gorgas.

Equipamiento para el Diagnóstico de Leishmania:

Una vez completada la capacitación en la Región, se dejará instalado en los laboratorios el equipo necesario para la realización del raspado y revisión microscópica de las muestras. Esto incluye: instrumental para el raspado, laminillas, microscopios, reactivos para tinciones especiales, tubos para PCR y cultivo.

Se instalará una campana o gabinete de bioseguridad para la manipulación de las muestras de forma adecuada para llevar a cabo aislamiento y cultivo del parásito y tinciones especiales.

Colectas de artrópodos:

Las colectas de las especies de chitras que podrían estar incriminadas en la transmisión de la leishmaniasis, así como de mosquitos que podrían ser incriminados en la transmisión de las encefalitis equinas, la fiebre amarilla y otros 17

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

arbovirus, se realizarán mediante el uso de trampas de CDC durante la noche, las cuales se distribuirán aleatoriamente en las diferentes comunidades. Para este muestreo se considera el área del peridomicilio adyacente a vegetación arbustiva o de galería, de las casas donde se ubicarán las trampas.

El diseño experimental será el de estratificación aleatoria, con la ayuda de imágenes satelitales se determinará el uso del suelo, luego se establecerán parcelas imaginarias (polígonos de thiessen) procederemos a dividir el área en cinco sub-parcelas de igual tamaño.

Mediante el uso del GPS, podremos integrar la información generada en cada parcela estudiada, a través del sistema de información geográfico. Lo cual nos permitirá realizar sobré posiciones de las variables geográficas y entomológicas de los sitios estudiados. Así podremos realizar las correlaciones y asociaciones espaciales necesarias.

Se utilizarán 20 trampas de CDC por área específicamente en la vegetación circundante donde se ha reportado los casos de las enfermedades a investigar. Las mismas se distribuirán en el área experimental, colocándolas en las plantas a 2 m de altura, con una distancia aproximada de 50 m.

Las trampas de CDC funcionarán durante 12 horas iniciando a las 6:00 PM y retirándolas a las 7:00 AM. Los especímenes se colocarán en envases y se trasladarán a la unidad de investigación. Allí identificarán las especies hematófagas y se cuantificará el número de individuos por especie.

Las especies de chitras y mosquitos colectados en las trampas se preservarán en etanol al 70% y luego se procederá a extraer el DNA con fenol cloroformo en un pol de 10 individuos de las mismas especies.

18

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Colectas de reservorios:

Los principales reservorios de la Leishmania tegumentaria en nuestro país han sido ampliamente documentados correspondiendo principalmente a animales silvestres propios de los bosques tropicales como el perezoso de dos y de tres dedos (Choleopus hoffmani y Bradypus infuscatus, respectivamente), el mono nocturno y el titi (Aotus trivisgatus y Saguinus geoffrogyi, respectivamente), además de una variedad de roedores. Sin embargo, la leishmaniasis es una zoonosis en la que el hombre y, por lo tanto, sus animales domésticos, se han introducido en el ciclo biológico de la enfermedad como un ciclo zooantroponótico en el que participan como reservorio del parásito los animales domésticos susceptibles, entre ellos el perro.

Durante el día, en cada local a se realizarán colectas de sangre de los mamíferos domésticos (perros, caballos y vacas), además de los mamíferos silvestres que estén en los alrededores, las cuales se utilizará las trampas tipo Sherman y Tomahawk adecuadas para las capturas de roedores y mamíferos de mediano tamaño, durante la noche. A cada individuo se le extraerá 5 ml de sangre para realizar detecciones del parasito o de los virus mediantes técnicas moleculares y serológicas.

Los principales reservorios de las encefalitis equinas parecen ser principalmente roedores silvestres y que viven en las áreas peridomicilarias. Estos virus también son capaces de infectar animales domésticos, principalmente equinos (caballos, burros, mulas) como su nombre lo indica.

Para la fiebre amarilla, expertos internacionales vendrán a capacitar personal de investigación, del MIDA, de la ANAM y de SENAFRONT para la toma de muestra de sangre de primates no-humanos sin poner en peligro la vida de estos.

19

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Detecciones del parasito Leishmania en muestras de artrópodos y sangre:

Un pool de 5 a 10 individuo será macerado con nitrógeno líquido y homogenizado en tampón de extracción basado en sales y SDS 5%. La extracción proteica se realizará con fenol-cloroformo-isoamilico y la precipitación del ADN con acetato de sodio y etanol absoluto frío. Este mismo procedimiento se realizará para las muestras de sangre.

Con los cebadores que amplifican las regiones conservadas del kinetoplasto, la pequeña unidad del ribosoma (SSU) y la región del espaciador interno transcriptor (ITS1-ITS2), detectaremos la presencia de las diversas especies de Leishmania circulante en la región. Las temperaturas y ciclos de amplificación están descritas en Cruz (2001) para los cebadores SSU y Kuhl (2005) para ITS-1, ITS-2.

Para establecer los reservorios de la enfermedad existen métodos indirectos que pueden ser igual de productivos que las técnicas tradicionales, entre ellos los marcadores moleculares del gen citocromo b es el más usado en la identificación de fuentes alimenticias con el fin de determinar el espectro de vertebrados a analizar para una posterior búsqueda de Leishmania en la mastofauna (Haouas et al, 2007; Paternina, 2012).

Mediante la PCR múltiple diseñados de alineaciones del gen mitocondrial citocromo b, se podrá identificar la procedencia de la sangre ingerida de diversas especies de mosquitos (Ngo y Kramer, 2003; Kent y Norris, 2005). En este caso las secuencias muestran un polimorfismo suficiente para distinguir entre el ser humano, vaca, ovejas, pollo, y cobayos (Oshaghi et al, 2006).

20

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

Detección de los diferentes virus en muestras de artrópodos, suero, líquido cefalorraquídeo o tejidos: En el caso de los mosquitos, se harán “pool” de 20 mosquitos de la misma especie. Luego, serán triturados en un pulverizador, y para evitar el deterioro de la muestra se usará un amortiguador que contendrá PBS, pH7.4 con 30% de suero fetal y agentes microbicidas. La suspensión centrifugada será cultivada sobre células Vero (células de mono verde) y C6/36 (células de mosquito) e incubadas a 37ºC o 28ºC; examinadas diariamente por evidencia de efecto citopático

(ECP).

Los

aislados

serán

identificados

con

pruebas

de

inmunofluorescencia, además se realizará la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa reversa (RT-PCR). Para detectar la fiebre amarilla se realizará una RT-PCR con cebadores genéricos para los Flavivirus seguida de una digestión enzimática RFLP para diferenciar fiebre amarilla, el virus de la encefalitis de San Luis, el virus del Nilo Occidental y dengue (Ortiz A. et al, 2012).

Para detectar los virus de las encefalitis equinas, se realizará la RT-PCR con cebadores genéricos para los Alfavirus (Sanchez-Seco MP et al, 2001) o cebadores específicos para VEEV (Quiroz E et al, 2009) y VEEE (Arrigo NC et al, 2010). Las muestras amplificadas podrán ser confirmadas por secuenciación. Además si las muestras son positivas para los cebadores que amplifican virus de los generos Flavivirus o Alphavirus pero no son amplificadas por cebadores específicos, se secuenciarán para identificar el virus; igualmente se secuenciarán los aislados virales no identificados por RT-PCR.

A las muestras de suero, líquido cefalorraquídeo y tejidos de pacientes o de reservorios, se les probará contra distintos antígenos virales para determinar la presencia de anticuerpos contra arbovirus. Para llevar a cabo esta determinación usaremos la técnica de ELISA, y para la confirmación de los resultados se les analizaran con la prueba de neutralización (PRNT). Para las muestras agudas

21

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

(menos de 3 días de síntomas), se realizará aislamiento viral en células Vero y C6/36 y los aislados serán identificados como descrito en el párrafo anterior.

Caracterización de la respuesta inmune en suero, líquido cefalorraquídeo o tejidos:

En el suero y el líquido cefalorraquídeo se detectará por ELISA o por arreglos la expresión de citocinas, moléculas necesarias al desarrollo de la respuesta inmune contra el patógeno, igualmente se podrá detectar otras proteínas y moléculas que tienen un rol en la patogénesis de enfermedades similares. De la sangre se separarán las células blancas que podrán ser caracterizadas por Citometría si hay suficientes células o se podrá analizar el transcriptoma que indicará qué genes son inducidos durante la infección en las células inmunes permitiendo una mejor comprensión de la respuesta del paciente.

En los tejidos por imunohistoquímica se podrán detectar antígenos de los patógenos así como identificar qué células del sistema inmune (B. T, NK, macrófagos o dendríticas) están en las zonas infectadas y en las zonas con mayor deterioro del tejido o con signos de apoptosis.

XI.

RESULTADOS Y LOGROS ESPERADOS PARA 2017

1. Iniciar con la etapa de operación del Centro de Diagnóstico del ICGES en Metetí Darién, para realizar los análisis de laboratorio en un periodo corto de tiempo y así poder generar un diagnóstico más temprano. Esto incluye un espacio completamente equipado, contratación del personal de recursos humanos y contar con los reactivos necesarios para los análisis. 2. Capacitación al equipo del sistema de salud de Darién, en la toma, embalaje y envío de muestras colectadas, en personas reportadas con casos de enfermedades desatendidas, para que sean analizadas en el Centro de Diagnóstico de Metetí Darién y en el ICGES. 22

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

3. Fortalecimiento institucional en Metetí y el ICGES a

través del

establecimiento del Centro de Diagnóstico. 4. Obtención de los permisos del comité de CIUCAL y vida silvestre de la ANAM para la obtención de muestras de animales hospederos 5. Capacitación de personal de control de vectores del MINSA a la captura e identificación de los vectores 6. Capacitación de personal veterinario, guarda bosques y SENAFRONT para la captura de reservorios (pequeños mamíferos) 7. Continuar con las giras a Darién para la obtención de muestras de vectores y reservorios. 8. Seguir con la identificación y análisis de laboratorio de las muestras en los laboratorios de entomología y virología del ICGES

XII.

REFERENCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

DE

INVESTIGADORES

DEL

GORGAS EN ESTOS TEMAS.

1. Carrera JP, Forrester N, Wang E, Vittor A, Haddow AD, López-Vergès S, Abadía I, Castaño E, Sosa N, Báez C, Estripeaut D, Díaz Y, Beltrán D, Cisneros J, Cedeño H.G, Travassos da Rosa A, Hernandez H, MartínezTorres AO, Tesh R., and Weaver SC. Eastern Equine Encephalitis in Latin America. N Engl J Med 369: 8. 2013

2. Quiroz E, Aguilar PV, Cisneros J, Tesh RB, Weaver SC. Venezuelan Equine Encephalitis in Panama: Fatal Endemic Disease and Genetic Diversity of Etiologic Viral Strains. PLoS Negl Trop Dis 3(6): e472. 2009

3. Obaldia N, Dutary B, Clavel F. Encefalomielitis equina del este, epizootic de 1986 en Panamá. Notas Veterinarias. Assoc Panameña de Médicos Veterinarios 1:4-7. 1991

23

ESTUDIO DE LAS ENFERMEDADES DESATENDIDAS EN PANAMÁ

4. Trapido H, Galindo P, Carpenter S. A survey of forest mosquitoes in relation to sylvan yellow fever in the panama isthmian area. Am J Trop Med Hyg 4:3. 1955

5. Dutary BE and Leduc J W. Transovarial transmission of yellow fever virus by a sylvatic vector, Haemagogus equinus. Trans Roy Soc Trop Med Hyg; 75 (1):128. 1981

6. Sosa N, Capitán Z, Nieto J, Nieto M, Calzada J.E, Paz H., Carmenza Spadafora, Mara Kreishman-Deitrick, Karen Kopydlowski, Diane Ullman, William F. McCarthy, Janet Ransom, Jonathan Berman, Charles Scott, and Max Grogl. Randomized, Double-Blinded, Phase 2 Trial of WR 279,396 (Paromomycin and Gentamicin) for Cutaneous Leishmaniasis in Panama. Am. J. Trop. Med. Hyg., 89(3): 557–563. 2013. 7. Saldaña A, Luis F. Chaves, Rigg C, Wald C, Smucker J.E, and Calzada, JE. Short Report: Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi Abundance in Trinidad de Las Minas, Western Panamá. Am. J. Trop. Med. Hyg. 88(3): 572–574. 2013. 8. Valderrama A, Tavares MG, Andrade Filho DJ: Anthropogenic influence on the distribution, abundance and diversity of sandfly species (Diptera: Phlebotominae: Psychodidae), vectors of cutaneous leishmaniasis in Panama. Mem. Inst Oswaldo Cruz 106: 1024-1031. 2011.

24