Revista Alergia México 2009;56(1):13-17

Artículo original Evaluación de la respuesta inmunológica in vitro en una población joven expuesta a la contaminación atmosférica de Guadalajara Miguel Ángel Hernández Urzúa,* Everardo Moreno Ramírez,** Galina Zaitseva,** Mary Fafutis Morris***

RESUMEN Antecedentes: los contaminantes atmosféricos provocan alteraciones en la salud de las personas expuestas al ambiente urbano. Objetivo: evaluar la respuesta inmunológica in vitro en la población joven expuesta a diferentes niveles de contaminación atmosférica. Participantes y métodos: se realizó el estudio en dos grupos de jóvenes, uno de Guadalajara y otro de Tlajomulco. Los voluntarios debían estar sanos y sin antecedentes de atopia familiar. Las respuestas inmunológicas estudiadas en las células mononucleares de sangre periférica fueron: índice de estimulación por incorporación de timidina, expresión de CD25 por citometría de flujo, y producción de citocinas IL-2 e IL-4 por técnica de ELISA. Los parámetros atmosféricos monitoreados fueron: NO2, O3, SO2, CO y PM10. Resultados: en Guadalajara las concentraciones de NO2 y PM10 se rebasaron 30 y 40%, respectivamente, según los índices establecidos por la OMS. El índice de estimulación de las células mononucleares de sangre periférica de los jóvenes de Guadalajara fue de 18 ± 4, mientras que el de los voluntarios de Tlajomulco fue de 23 ± 3. La expresión de CD25 no mostró una diferencia significativa entre los grupos estudiados. Las concentraciones de IL-2 e IL-4 fueron similares entre los jóvenes de la ciudad y los del área rural. Conclusión: la contaminación ambiental en Guadalajara no modificó significativamente la proliferación, la expresión de CD25, ni la secreción de IL- 2 e IL-4 en las células mononucleares de sangre periférica. Lo anterior demuestra que los jóvenes sanos son menos susceptibles que otros grupos a las alteraciones causadas por la exposición a niveles moderados de contaminantes atmosféricos. Palabras clave: contaminación atmosférica, CD25, índice de estimulación, citocinas.

ABSTRACT Background: Atmospheric pollutants may cause alterations on health of persons exposed to urban environment. Objective: To evaluate in vitro immunological response in young population exposed to different levels of atmospheric pollution. Participants and methods: The study was performed in two groups of young men, one from Guadalajara, and the other from Tlajomulco. The volunteers had to be healthy and without precedents of atopia. The immunological responses studied on PBMC were: stimulation index by timidin incorporation, CD25 expression by flow citometry, and production of citokines IL-2 and IL-4 by ELISA test. Atmospheric parameters monitored were: NO2, O3, SO2, CO and PM10. Results: In Guadalajara the concentrations of NO2 and PM10 exceeded in 30% and 40%, respectively, the index established by WHO. Stimulation index of PBMC of the young men to Guadalajara was 18 ± 4, whereas that of the volunteers from Tlajomulco was 23 ± 3. Expression of CD25 did not show a significant difference between studied groups. IL-2 and IL-4 levels were similar between the young men of the city and those from the rural area. Conclusion: The environmental pollution in Guadalajara did not modify in a significant way proliferation, CD25 expression, nor secretion of IL-2 and IL-4 on PBMC. This demonstrates that healthy young men are less susceptible than other groups to the alterations caused by exposure to moderate levels of atmospheric pollutants. Key words: atmospheric pollution, CD25, stimulation index, cytokines.

* ** ***

Academia de Disciplinas Morfofuncionales, Facultad de Medicina, Universidad Guadalajara Lamar. Departamento de Biología Molecular, Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias. Centro de Investigación en Inmunología y Dermatología. Universidad de Guadalajara.

Correspondencia: Academia de Disciplinas Morfofuncionales, Universidad Guadalajara Lamar. Av. Vallarta 3273-2, colonia Vallarta Poniente, CP 44110, Guadalajara, Jalisco. Correo elec-

Revista Alergia México

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trónico: [email protected], [email protected] Recibido: diciembre, 2008. Aceptado: diciembre, 2008. Este artículo debe citarse como: Hernández UMA, Moreno RE, Zaitseva G, Fafutis MM. Evaluación de la respuesta inmunológica in vitro en una población joven expuesta a la contaminación atmosférica de Guadalajara. Rev Alerg Mex 2009;56(1):13-17. La versión completa de este artículo también está disponible en: www.revistasmedicasmexicanas.com.mx

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a exposición a riesgos ambientales provoca hasta 24% de la morbilidad mundial. Las infecciones de las vías respiratorias inferiores, producidas en gran medida por la contaminación del aire en espacios exteriores e interiores, representan 41% de los casos registrados en todo el mundo.1 En numerosos estudios se relaciona la exposición a los contaminantes atmosféricos con alteraciones en el sistema respiratorio, el cardiovascular, el hematológico, el neurológico, el reproductor y el inmunológico.2,3 El sistema inmunológico actúa rápidamente ante los cambios medioambientales. En un trabajo se reportó que durante una exposición aguda a niveles altos de PM10 se elevan las concentraciones séricas de IL-6, además, hay inflamación sistémica y local en las vías respiratorias.4 En jóvenes sanos de 26 años de edad, la exposición aguda a una concentración moderada de PM2.5 no modificó la cuantificación de CD3+, CD4+, CD8+ y CD56+ en las células de sangre periférica.5 En un estudio encontramos concentraciones ligeramente menores de los anticuerpos séricos IgG, IgA e IgM en personas de la ciudad de Guadalajara, aunque no se encontró diferencia significativa cuando se compararon con las cantidades de los jóvenes que vivían en una zona rural.6 En México, los ensayos acerca del efecto de la contaminación atmosférica sobre la salud de sus habitantes son escasos.7 Este estudio evalúa la respuesta inmunológica in vitro en la población joven expuesta a diferentes concentraciones de contaminación atmosférica. PARTICIPANTES Y MÉTODOS Individuos

Este estudio descriptivo y comparativo consideró dos regiones con diferentes niveles de contaminación atmosférica: la zona centro de la ciudad de Guadalajara y un área rural no industrializada del municipio de Tlajomulco de Zúñiga. Se seleccionaron 20 estudiantes de la Preparatoria 1 de la Universidad de Guadalajara y 20 alumnos del Instituto Tecnológico Agropecuario de Tlajomulco. Los individuos eran hombres sanos, de 18 a 21 años de edad, no fumadores, sin antecedentes de atopia; quienes dieron su consentimiento por escrito para donar una muestra sanguínea. La toma de la sangre se realizó en los meses de mayor índice de contaminación

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atmosférica, según el Instituto de Astronomía y Meteorología. También se les realizaron pruebas de biometría hemática, reacciones febriles, química sanguínea y examen general de orina. Monitoreo ambiental

Las concentraciones de los contaminantes atmosféricos de la zona rural se obtuvieron de una estación móvil de monitoreo ambiental, del Instituto de Astronomía y Meteorología de la Universidad de Guadalajara. Los datos de los contaminantes atmosféricos en la zona metropolitana de Guadalajara se obtuvieron de la estación automática de monitoreo medioambiental de la Secretaría del Medio Ambiente, ubicada en el centro de la ciudad, durante los meses de junio, julio, noviembre y diciembre de 1999; marzo de 2000 y mayo y junio de 2001. Evaluación inmunológica

Por cada sujeto, se colectaron 10 mL de sangre venosa en tubos estériles vacutainer con heparina y las células mononucleares de sangre periférica fueron separadas por rotación en una centrífuga Beckman T J-6 sobre un gradiente de Ficoll- Hypaque. Para determinar el índice de estimulación, las células mononucleares de sangre periférica se estimularon mitogémicamente con fitohemaglutinina, se incubaron durante 48 horas y se midió la incorporación de timidina tritiada al ADN, con un contador de centelleo de radiaciones beta (Beckman USA, LS 60000SE).8 Para determinar la expresión del marcador de activación CD2S, las células mononucleares de sangre periférica se estimularon con fitohemaglutinina y se incubaron durante 24 horas. Las células fueron cosechadas, lavadas y resuspendidas en una solución buffer de fosfatos. Posteriormente se les adicionó anticuerpo anti-CD2S, y se realizó la lectura en el citómetro de flujo EPICS XL-MCL de Beckman Coulter.8 La medición de la concentración de IL-2 e IL-4 se realizó mediante el ensayo inmunoenzimático de ELISA. Se usaron estuches comerciales de Mannheim Boehringer (Mannheim, Alemania) y se siguió el procedimiento del instructivo. La lectura se realizó en un estuche comercial de ELISA (Microwell Strip Reader Model EL301, BiotekR Instruments, Inc.).

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Los resultados se representaron como media ± error estándar. Se aplicó la prueba de la t de Student para muestras con variables independientes. Los valores con p < 0.05 se consideraron significativos. En Guadalajara, los índices establecidos por la OMS para PM10 se rebasaron en 40% de las ocasiones y para NO2 en 30% (datos no mostrados). El resto de los contaminantes atmosféricos monitoreados no superó los límites de inocuidad. El promedio del índice de estimulación de las células mononucleares de sangre periférica extraídas de los individuos de Guadalajara fue de 18, mientras que en el caso de los jóvenes de Tlajomulco fue de 23. Es decir, en la proliferación no se encontró diferencia significativa. El porcentaje de expresión de la molécula CD25 en las células mononucleares de sangre periférica de ambos grupos, después de la estimulación con fitohemaglutinina, fue similar. En los jóvenes de la ciudad fue de 23% y en los individuos del campo fue de 19% (cuadro 1). Las concentraciones de las citocinas IL-2 e IL-4 no mostraron diferencias estadísticas significativas entre los dos grupos estudiados. La concentración de IL-2 detectada en los sobrenadantes de las células mononucleares de sangre periférica pertenecientes a los voluntarios de Guadalajara y de Tlajomulco fue de 685 ± 149 pg/mL y de 725 ± 76 pg/mL, respectivamente (figura 1). La cantidad de IL-4 detectada fue de 10 ± 1 pg/mL en los sobrenadantes de las células mononucleares de los individuos de la ciudad, y de 9 ± 2 pg/mL en los cultivos de las células de los sujetos del área rural (figura 2).

700 IL-2 (pg/mL)

Análisis estadístico

600 500 400 300 200 100 0 Tlajomulco Medio

Guadalajara Fitohemaglutinina

Figura 1. Cuantificación de las concentraciones de IL-2 en sobrenadante de células mononucleares de sangre periférica de jóvenes expuestos a diferentes niveles de contaminación ambiental.

DISCUSIÓN La exposición a la contaminación ambiental constituye un grave peligro para la población que vive en las grandes ciudades del mundo. La Organización Mundial de la Salud estableció límites de 50 μg/m3 para PM10 y de 200 μg/m3 para NO2, con la finalidad de garantizar la calidad del aire.9 En la ciudad de Guadalajara, encontramos que los índices establecidos para PM10 se rebasaron en 35% de las ocasiones y para NO2 en 25%. Las principales fuentes de contaminación atmosférica se atribuyen al transporte (73.5%), suelo (21.2%), servicios (4.2%) e industria (1.1%).10 La planeación ambiental debe incluir consideraciones sobre riesgos a la salud, sobre todo cuando hay partículas que provocan un daño significativo.

Cuadro 1. Determinación del índice de estimulación y expresión de CD25 en las células mononucleares de sangre periférica de jóvenes expuestos a diferentes niveles de contaminación ambiental Población Guadalajara

Tlajomulco

Estímulo

Índice de estimulación

CD25

Medio de cultivo

0

9±1

Fitohemaglutinina

18 ± 4

21 ± 3

Medio de cultivo

0

12 ± 2

Fitohemaglutinina

23 ± 3

19 ± 2

Los datos representan: media (X) ± error estándar de 20 experimentos separados realizados dos veces.

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IL-4 (pg/mL)

10 8 6 4 2 0

Tlajomulco Medio

Guadalajara Fitohemaglutinina

Figura 2. Cuantificación de las concentraciones de IL-4 en sobrenadante de células mononucleares de sangre periférica de jóvenes expuestos a diferentes niveles de contaminación ambiental.

El sistema inmunológico nos defiende contra las incontables sustancias extrañas presentes en el aire que respiramos.11 No obstante, cuando existe un exceso de algún contaminante atmosférico se producen alteraciones en estos mecanismos protectores.3,4 En este estudio encontramos que la exposición a la contaminación atmosférica no afectó la proliferación inducida por fitohemaglutinina en las células mononucleares de sangre periférica de los individuos de Guadalajara; las condiciones ambientales no redujeron su respuesta inmunitaria celular. Los resultados del índice de estimulación de los voluntarios de Tlajomulco se designaron controles por el bajo nivel de contaminación de esa zona rural. Estos datos coinciden con ensayos anteriores en los que no hallamos alteración en la proliferación linfocitaria de jóvenes sanos expuestos a diferentes niveles de contaminación atmosférica.6 La exposición a material particulado atmosférico (PM10) no alteró la expresión de CD25 inducida por el mitógeno en las células mononucleares de sangre periférica extraídas de los voluntarios de la ciudad. Tampoco se apreció un aumento en la manifestación del marcador de activación en las células mononucleares de sangre periférica sin estímulo de los jóvenes sanos de Guadalajara, en comparación con los jóvenes de Tlajomulco. Estos datos difieren de los de un estudio que mostró una expresión incrementada de CD25 en los linfocitos T de sujetos sanos, después de la exposición a partículas ultrafinas.12 La discrepancia entre estos resul-

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tados podría deberse a la diferencia entre el tamaño de las partículas reportadas; ya que las partículas ultrafinas pueden viajar más profundamente en los pulmones y, por estar compuestas por elementos muy tóxicos, provocan efectos más intensos a la salud que las partículas de mayor diámetro. La atopia es una predisposición individual a padecer enfermedades alérgicas en respuesta a alérgenos medioambientales. Gracias a las investigaciones en ratones y humanos es posible identificar a las citocinas Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) como las principales responsables de padecer asma y alergia.13 En este ensayo la contaminación ambiental no indujo la producción de IL-2 o IL-4, ni afectó su secreción inducida por el mitógeno en las células mononucleares de sangre periférica extraídas de jóvenes de Guadalajara. Al igual que otros trabajos,5 los resultados indican que la contaminación atmosférica no modifica los parámetros inmunológicos de sujetos sanos. Sin embargo, no puede descartarse el riesgo potencial en niños y enfermos, quienes sufren varias enfermedades debido al deterioro del sistema inmunológico cuando son sometidos a grandes niveles de contaminación urbana.14,15 Proponemos la realización de nuevas investigaciones con niños, personas asmáticas y trabajadores ocupacionales para evaluar la influencia de los contaminantes atmosféricos en las respuestas inflamatorias e inmunológicas de la población en general. Agradecimientos

Agradecemos el apoyo del CONACYT, SIMORELOS y de la Universidad de Guadalajara para realizar este proyecto. Gracias al Dr. Luis Santoscoy y a la Dra. Cecy del Toro por la asesoría técnica, al Ing. Rogelio Troyo por las recomendaciones estadísticas y a la QFB Ana María Soto Morales del Centro de Salud núm. 3, Secretaría de Salud de Jalisco.

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