NOTAS DE CLASE

EXPRESIÓN ANALÍTICA DE LOS COMPONENTES DE LOS ALIMENTOS

Preparado por GLADYS RAMÍREZ LÓPEZ Q.F. Sp. en Análisis Bromatológico y Toxicológico Profesora

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA DEPARTAMENTO DE FARMACIA Revisado 2008

EXPRESIÓN ANALÍTICA DE LOS COMPONENTES DE LOS ALIMENTOS Generalidades Desde 1886, en la estación experimental de Weende (Alemania) se estandarizó un método conocido como Weende, análisis proximal, método general de análisis de los alimentos o análisis bromatológico, para analizar los componentes más abundantes en los alimentos: agua, grasas, proteínas, cenizas, fibra y carbohidratos; con ligeros cambios, el método es aún hoy ampliamente utilizado aunque con aparatos más modernos y rápidos. Los métodos generales de análisis de alimentos incluyen: Porcentaje de: agua, grasa total o bruta, (más conocida como extracto etéreo), proteína total o bruta, fibra bruta o cruda, cenizas. El porcentaje de sustancias extraíbles no nitrogenadas se determinan restando de 100 la suma de los demás componentes. El término bruta o cruda, indica que se trata de sustancias más o menos próximas y no de compuestos individuales. Es necesario seguir con precisión las condiciones del análisis para no introducir mayor error, pues los métodos son en su mayoría empíricos y datan de finales del siglo XIX. Determinación del contenido de agua. Ordinariamente casi todos los alimentos contienen agua en cantidades variables. Se dice que la cantidad de agua presente es la humedad, es decir, esta es una medida de la concentración de agua presente en un alimento. La determinación del contenido da humedad es uno de los ensayos más importantes y usados en el procesamiento y análisis de los alimentos. Dado que, la cantidad de materia seca en un alimento se relaciona inversamente con la cantidad de humedad que contiene, el porcentaje de humedad tiene importancia económica directa tanto para el procesador como para el consumidor. De gran significado es el efecto de la humedad, tanto en la estabilidad como en la calidad de los alimentos. El grano que contiene mucha agua, está sujeto a una rápida deterioración y al crecimiento de hongos, calentamiento, daño por insectos y podredumbre. Pequeñas diferencias en el contenido de humedad han sido responsables de inesperados casos de alteración en granos almacenados comercialmente. La velocidad de pardeamiento de vegetales deshidratados y de frutas, o la absorción de oxígeno por los huevos en polvo, aumenta con un incremento en el contenido de humedad. La determinación del contenido de agua es importante para resolver muchos problemas de la industria, por ejemplo en la evaluación de balance de materiales o en los procesos de pérdidas. Es necesario conocer el contenido de humedad de un alimento y a veces su distribución, para poder realizar un óptimo procesamiento ya sea en la molienda de cereales, el mezclado de la pasta para lograr una buena consistencia y producir pan con la mejor textura y retención de frescura. El contenido da humedad debe conocerse para poder determinar el valor nutritivo de un alimento, expresando los resultados de las determinaciones analíticas en una base uniforme, con el fin de poder comparar los resultados obtenidos con estándares de composición. La cantidad de agua presente en los alimentos varía considerablemente: la leche líquida contiene entre 87-91%, la leche en polvo un 4%, los quesos contienen valores entre 40-75%, la mantequilla un 15-16%, la crema de leche 60-70% y helados y sorbetes alrededor de 65%, los aceites y las grasas prácticamente

no contienen agua pero algunos derivados son ricos; la margarina y la mayonesa un 15%, aderezos para ensaladas 40%, frutas alrededor de 90%, melones entre 92-94%, guayaba 81%, olivas 72-75%. Después del secado las frutas pueden contener hasta un 25% de agua. Los cereales se caracterizan por su humedad baja; granos sanos, guardados durante largo tiempo alcanzan entre 10-12% de agua, los cereales instantáneos 4%, macarrones 9%, harina 10-15%, huevos frescos 74% y secos 5% máximo. El agua se puede encontrar en los alimentos al menos en tres formas. Una cierta cantidad puede estar como agua libre en el espacio intergranular y entre los poros del material. Dicha agua mantiene sus propiedades físicas y sirve como agente dispersante de las sustancias coloidales y como solvente para compuestos cristalinos. Parte del agua es absorbida sobre la superficie de los coloides macromoleculares (almidones, pectinas, celulosa y proteínas); esta agua está cercanamente asociada con las macromoléculas retenidas por fuerzas de absorción que son atribuidas a fuerzas de Van der Walls o a la formación de puentes de hidrógeno. Finalmente, una cierta cantidad del agua se encuentra en forma enlazada, en combinación con varias sustancias, como agua de hidratación, por ejemplo, e incluye el agua fijada en lugares específicos, tales como moléculas de DNA. La clasificación anterior, bien que conveniente, no deja de ser arbitraria. Tentativas para determinar cuantitativamente la cantidad, de las varias formas de agua en los alimentos han sido infructuosas. A diferencia de algunos compuestos inorgánicos, que muestran una isoterma discontinua de sorción, de varios niveles de agua de cristalización, la isoterma de sorción de agua en los alimentos muestra un espectro continuo de los tipos de agua ligada. Consecuentemente, los términos; libre, absorbida, y combinada son relativos y como el verdadero contenido de humedad es desconocido las condiciones seleccionadas para la determinación de la humedad son arbitrarias. Así:  En frutas y legumbres frescas, debido a sus altos contenidos de humedad, deben tomarse uno 20 g, calculando que el residuo final sea apreciable.  En alimentos secos, tomar entre 5 y 10 g para un residuo final de 3 a 4 g.  Con respecto a los alimentos líquidos, medir 50 ml y concentrarlos inicialmente al fuego moderado, luego llevarlos a la estufa;  Para otros, tomar entre 2 y 5 g y en caso necesario, añadir arena p.a. (exactamente pesada), para lograr una mejor superficie de secado Métodos de análisis. Los métodos para la determinación de humedad pueden dividirse en: Métodos de secado, procedimientos de destilación, ensayos químicos, procedimientos físicos. Al realizar la selección del método se deben tener en cuenta factores relacionados con la muestra como son: • Valores altos de humedad • Descomposición de compuestos orgánicos. • Volatilización de sustancias diferentes al agua. • Compensación de pérdidas de sustancias volátiles, bajo las condiciones experimentales fijadas, por incompleta remoción del agua fuertemente absorbida. Los factores relacionados con el método son: • Simplicidad y rapidez • Aparatos apropiados • Reproducibilidad

La exactitud es de gran significación en el establecimiento de condiciones que regulen la estabilidad del alimento, no es tan importante en las determinaciones de rutina. Las siguientes etapas son comunes a todos los métodos de análisis: • Obtención de una submuestra representativa del lote (el material debe haber sido perfectamente homogeneizado). • Conversión de los componentes en una forma que permita el análisis (moler, triturar, etc.). • Realización del ensayo o determinación cuantitativa. • Cálculos e interpretación de los datos. En un análisis, es muy importante determinar las características físicas y organolépticas, ya que ahorran dinero y ensayos analíticos costosos. Métodos de secado Muy utilizados en los alimentos. El material es calentado cuidadosamente bajo condiciones específicas, y la pérdida de peso es tasada, como una medida de la humedad contenida por la muestra. Esta determinación implica una selección empírica del tipo de horno, de la temperatura y del tiempo de secado, por lo tanto, los valores obtenidos dependen de las condiciones arbitrariamente seleccionadas. Algunos de los métodos proporcionarán entonces, más que valores exactos, aproximaciones. Ventajas: rápidos, simples y permiten analizar simultáneamente una gran cantidad de muestras. Un proceso de secado ideal, es aquel que implica una rápida y cuantitativa volatilización, solamente del agua. En la práctica, el calentamiento de una sustancia húmeda, causa también la volatilización de otros materiales absorbidos, y formación de productos gaseosos por descomposiciones térmicas irreversibles de compuestos orgánicos. Además, cambios de peso resultantes de fenómenos de oxidación pueden ocurrir (por ej. en los aceites). Estos cambios no empiezan a temperaturas fijas o especificadas, y pueden ocurrir a todas las temperaturas, en una gran variedad de rangos. La velocidad a la cual, la humedad puede extraerse de la superficie de una fase sólida, es función de la presión de vapor y de la temperatura de secado. El agua puede determinarse a cualquier temperatura, con tal de que la presión de vapor en el aire, alrededor de la fase sólida, sea más baja que la presión de vapor del agua en la muestra. Así es como se puede obtener un secado térmico por debajo del punto de congelación del agua, como es el caso de la liofilización. Para obtener una medida más exacta de la humedad, la tendencia es secar el alimento a la temperatura más baja posible. Factores que afectan la exactitud de la determinación: • La temperatura de secado. • La temperatura y humedad relativa de la cámara de secado. • El movimiento del aire y de la humedad relativa en la estufa. • El vacío en la cámara de secado. • El espesor y tamaño de las partículas. • La construcción de la estufa. • El número y posición de las muestras en el horno. La rata da evaporación del agua es más elevada si se utiliza un disco de aluminio en vez de uno de porcelana o de vidrio; además, es más alta en una estufa de vacío que en una estufa de aire y más alta en discos poco profundos. El rango de temperatura de secado va de 70 a 115°C y el tiempo de secado de 1 a 6 h o aún más, y se terminará cuando la pérdida de peso sea de poca importancia (2mg/5g de muestra

en 1 hora). Se ha demostrado en algunos alimentos descomposición a 80°C midiendo el CO 2 liberado durante el secado, lo cual hace que se disminuya el peso, igual problema puede presentarse en azúcares como la fructosa que puede liberar agua, en estos alimentos se recomienda utilizar la estufa de vacío o agentes desecantes. Es común, que durante el secado se forme una costra que impide la evaporación de la humedad del centro de la muestra; si ella es rica en azúcar, el efecto de la costración se puede reducir humectando con agua y luego mezclando con arena o asbesto, para aumentar la superficie expuesta, o con calentamientos altos de capas delgadas bajo lámpara con calor infrarrojo.

Método de la estufa de aire Los criterios principales para escoger la estufa son: • Precisión del control de temperatura (±0.5°C). • Uniformidad de la temperatura en las diferentes posiciones. El método de secado en estufa de aire es el más antiguo, es usado ampliamente y consiste en la determinación gravimétrica de las pérdidas sufridas por la muestra, al ser sometida a temperaturas cercanas al punto de ebullición del agua. No se diferencian en este caso, como ya se habla explicado, entre el agua y los materiales volátiles además no es aplicable a sustancias térmicamente inestables. Otros equipos, además de calefacción eléctrica, regulación de temperatura, bomba de vacío o circulación de aire traen balanza de lectura automática. Las variaciones de temperatura, pueden minimizarse por circulación mecánica de aire en el horno. Las estufas especiales como la semiautomática de Brabender, usa un pequeño ventilador para hacer circular el aire y una balanza automática, se pueden analizar simultáneamente 10 muestras de 10,0 g cada una, pesadas en discos planos tarados. Después del tiempo especificado, cada disco es pesado (sin remover ni enfriar) y la humedad se indica en una escala iluminada. También se utiliza la estufa de Carter - Simon que sirve para determinar la humedad en cereales a 155°C por 15 min, se pueden ensayar tres muestras. Todos estos instrumentos requieren atención constante y validación de todos sus parámetros, además, debe disponerse de un método de referencia para la determinación del agua, el cual sirva para comparar o calibrar otros métodos más o menos empíricos pero muy usados porque ofrecen numerosas ventajas. Principio: la humedad libre se expulsa por medio de aire caliente en circulación. La temperatura se regula para efectuar un último secado y un mínimo de pérdida de sustancias volátiles. Este es un método indirecto para la determinación de la humedad. Materiales y aparatos • Estufa con sistema para circulación de aire caliente. • Cápsulas de porcelana limpias, secas y taradas. • Balanza de precisión con cuatro cifras decimales. Procedimiento: • Homogeneizar bien la muestra, después de reducirla de tamaño si fuere necesario. • Pesar con exactitud entre 2 y 5 g en una cápsula apropiada, y colocarla en la estufa a una temperatura entre 100 y 110°C. • Secar durante 2 h.

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Retirar la cápsula cuidadosamente, utilizando una pinza apropiada. Enfriar en desecador y pesar. Colocar nuevamente la cápsula con su contenido, en el mismo sitio de la estufa que ocupo inicialmente y secar por 30 min. Retirar, enfriar y pesar. Continuar el secado hasta peso constante. (La diferencia entre dos pesadas sucesivas nunca será mayor de 2 a 5 mg por cada 5 g de muestra).

Cálculos

% humedad = (Peso de muestra total - peso de muestra seca) x 100 Peso de muestra total 100 - % Humedad = % MS (materia seca) Notas: • •

Es necesario usar exactamente el procedimiento seleccionado cada vez que se vaya a realizar el análisis, con el fin de obtener resultados reproducibles. La materia seca comprende la materia orgánica (proteínas, lípidos y carbohidratos, ácidos orgánicos) y la materia inorgánica (cenizas). Esta cantidad de materia seca es inversamente proporcional a la cantidad de agua.

Método de la estufa de vacío Las determinaciones en estufa de vacío, son generalmente los procedimientos más exactos para analizar la humedad en muchos alimentos, ya que sus resultados son generalmente más reproducibles. Este método es específico y se debe utilizar cuando en la muestra hay presentes sustancias volátiles o térmicamente inestables. La velocidad de secado se aumenta, bajando la presión de vapor en al aire usando vacío aunque es necesario hacer pasar una pequeña cantidad de aire seco durante el ensayo, con el fin de eliminar el vapor de agua que se pueda concentrar dentro de la estufa, disminuyendo la eficiencia del vacío. La estufa debe estar equipada con una bomba de vacío que rinda una presión de 100 mm de Hg o menos (son preferibles 25 a 50 mm de Hg). La temperatura de secado variará entre 70°C y 100°C dependiendo de la sustancia analizada. (Frutas: 50 mm Hg y 70°C). En este tipo de hornos es mejor usar como portamuestra, papel de aluminio para una mejor transferencia de calor. Principio: El uso de vacío permite extraer la humedad a bajas temperaturas. Esto evita pérdidas de material volátil y reacciones interferentes. Materiales y aparatos • Estufa de vacío y bomba que rinda baja de presión de 100 mm de Hg o menos. • Cápsulas de aluminio de unos 50 mm de diámetro y no más de 60 mm de profundidad, preferiblemente con tapa. • Balanza analítica de precisión con cuatro cifras decimales. Procedimiento

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Homogeneizar la muestra después de reducirla de tamaño si es necesario. Pesar con exactitud aproximadamente 2 g de muestra en la cápsula limpia y previamente tarada. Colocar la cápsula en la estufa de vacío, dejando la tapa entreabierta. Reducir la presión hasta 100 m de Hg y llevar la temperatura hasta 70°C por una1hora Abrir la estufa y cerrar la cápsula colocándole la tapa. Llevar a un desecador, enfriar y pesar. Llevar la muestra hasta peso constante. Reportar la pérdida de peso como % de humedad.

% humedad = 100 - Peso muestra seca x 100 = Peso muestra original o también: % humedad = (Pmi - Pmf) x 100 Pmi

Método de la lámpara infrarroja El secado en la balanza de lámpara infrarroja, es muy efectivo ya que implica la penetración del calor dentro da la muestra. Con esta lámpara puede acortarse el tiempo de secado entre 1/3 a 1/8 del requerido usando un sistema convencional. La lámpara tiene de 250 a 500 W. Su filamento desarrolla temperaturas de 2.000 a 2.500°K; 1.000°K son buenos para secar material animal y vegetal. La distancia desde la fuente de radiación infrarroja hasta el material en análisis, es un parámetro crítico, ya que si se aproxima demasiado puede descomponerlo. Se aconseja que la distancia sea de 10 cm; el espesor del material no debe ser mayor de 10 a 15 mm. Los tiempos de secado bajo condiciones óptimas, son de unos 20 minutos para productos cárnicos, 25 minutos en productos de panadería, 10 minutos para granos molidos. La cantidad de muestra a utilizar debe estar entre 2,5 y 10 g dependiendo del alimento, contenido de humedad y tipo de balanza. Los instrumentos de secado infrarrojo están equipados con ventilación forzada o conectada a una balanza de torsión con escalas indicadoras que proporcionan inmediatamente el contenido de humedad. La radiación infrarroja tiene la propiedad de volatilizar el agua a una temperatura máxima de 70°C. Principio: Eliminación de la humedad debido a la radiación infrarroja que penetra profundamente dentro de la muestra. Materiales y aparatos • Balanza de lámpara infrarroja. • Pesa sustancias de aluminio propio de la balanza, limpio y seco. Procedimiento • Encender la lámpara media hora antes de su utilización. • Colocar el plato de aluminio propio de la balanza y tararlo.

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Pesar exactamente 10,0 g de muestra debidamente homogeneizada teniendo en cuenta que la escala está graduada tanto en gramos como en % de humedad. Programar las condiciones adecuadas a la muestra. Colocar la unidad calentadora sobre la muestra, cerrando la tapa. Presionar la tecla start. Realizar lecturas cada minuto, del % de humedad para hacer la gráfica. Realizar la lectura final tanto en % de humedad como en % de sólidos totales. Graficar los valores de tiempo y % de humedad.

Si los porcentajes de humedad son traducidos gráficamente, como se muestra en la figura 1, los valores pueden ser leídos directamente una vez que la curva ha alcanzado un máximo y se ha vuelto a nivelar. Una vez que la curva ha alcanzado su nivelación, se determina el tiempo necesario para secar el material analizado, en futuros análisis, simplemente se fija el timer en el tiempo obtenido, al finalizar se verifica que la muestra esté completamente seca. Para una mejor operación, las curvas de secado deben ser trabajadas a diferentes temperaturas, tratando de evitar temperaturas demasiado altas que causarían secados excesivos.

Figura 1: Lámpara infrarroja y curva de humedad. (http://www.balances.com/ohaus/mb45.html) Métodos de destilación Estos métodos han sido usados casi por 100 años. La destilación con un líquido hirviendo proporciona un medio efectivo de transferencia de calor, el agua se remueve rápidamente, y el ensayo se hace en una atmósfera inerte que minimiza el peligro de oxidación. Los métodos de destilación, causan menos descomposición en algunos alimentos que las temperaturas de secado excesivo. Sin embargo, las reacciones químicas producidas por el calor son minimizadas pero no eliminadas. Los efectos adversos debidos al calentamiento pueden reducirse, seleccionando solventes orgánicos con un punto de ebullición más bajo que el agua, por ejemplo el benceno, pero se aumenta el tiempo de destilación. Existen dos tipos de destilación: • Destilación del agua contenida en un líquido inmiscible de alto punto de ebullición en el cual la muestra, suspendida en un aceite mineral que tiene un punto rayo mucho más bajo que el punto de ebullición del agua, se calienta a una temperatura determinada en un aparato apropiado. El

agua que destila, se condensa y es medida en un cilindro apropiado.

Dean y Stark

Bidwel - Sterling

Figura 2: Diferentes tipos de recolectores o trampas. •

La mezcla del agua de la muestra y un solvente inmiscible que puede ser metil xileno (p.e. 100°C), tolueno (p.e. 110°C), benceno (p.e. 80°C), xileno (137-140°C), tetracloruro de carbono (77°C), destilan conjuntamente y caen a un aparato de medida llamado colector o trampa (ver figura 2), donde el agua se separa del solvente por densidad y se lee el volumen. El solvente retorna, por rebosamiento, al matraz de destilación. Este es el método más usado y se conoce como método de la “trampa o de destilación y arrastre”. El solvente debe ser insoluble en agua, el punto de ebullición no debe ser muy alto ya que muchas muestras se descomponen por calentamiento, liberando agua.

Dificultades del método • Calibración de colectores poco exacta. • Problemas en la lectura del menisco. • Adherencia de gotas de agua al vidrio (por lo tanto todo el material debe ser limpio). • Se puede llegar a sobrecalentamiento usando por ej. 3 - xilol. • Miscibilidad de agua con e1 solvente. • Incompleta destilación del agua. • Formación de emulsiones (se rompen adicionando alcohol amílico o isobutílico). • El método no es adaptable a ensayo de rutina.

químicamente

Método de la trampa o de destilación y arrastre Principio: destilación azeotrópica a reflujo de la humedad de una muestra, con un líquido inmiscible en agua, la cual se recoge en un colector graduado (Ver figura 2). No hay pérdida de sustancias volátiles. Materiales y aparatos • Trampa • Balanza analítica • Baño de aceite Reactivos • Benceno p.a.

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Alcohol amílico p.a.

Procedimiento • Pesar con precisión entre 50 y 200g de muestra dependiendo de la cantidad de agua esperada en el balón del equipo. • Adicionar 50 a 100 ml de benceno o tolueno (hasta cubrir la muestra) y 4 a 6 ml de alcohol amílico. • Ensamblar el equipo y colocar un tapón de algodón en la parte superior del refrigerante. • Calentar a ebullición, sobre una placa eléctrica o manta, regulando la temperatura. • Destilar a una velocidad de una o 2 gotas por segundo, hasta que haya recogido en la trampa la mayor parte de agua. • Aumentar entonces, la velocidad de destilación, a unas 4 gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya destilado toda el agua (permanece constante) y la capa del solvente va quedando transparente, lavar el condensador con 5 ml del disolvente por la parte superior, para arrastrar las gotas de agua que pudieran haber quedado adheridas. • Continuar destilando otros 5 min. • Enfriar a temperatura ambiente y leer el volumen de agua con una precisión de 0,01.

Cálculos Se realizan teniendo en cuenta el volumen destilado de agua y relacionándolo con la cantidad de muestra pesada. El resultado se expresa en porcentaje. Métodos químicos Método de Karl Fisher Es uno de los métodos químicos para el análisis de humedad. Es aplicable a alimentos sensibles al calor o al vacío, y es el método de elección para el análisis de alimentos (u otras sustancias) con bajos contenidos de humedad tales como frutas secas y vegetales, caramelos, chocolates, café tostado, grasas y aceites. Sirve para analizar alimentos ricos en azúcares y en azúcares reductores y proteínas, también se utiliza en alimentos con humedad intermedia como pasta para panadería, tortas mixtas ricas en grasa, y alimento con alto contenido de aceites volátiles. El método de Karl Fischer es basa en la reacción descrita por Bunsen en 1853, e implica la reducción del yodo por el dióxido de azufre, en presencia de agua. 2H20 +SO2+ I2H2S04 + 2HI En 1935, Karl Fischer modificó el procedimiento y estableció las condiciones para realizar la cuantificación. Se adicionaron metanol y piridina y las reacciones que tiene lugar son las siguientes: C5H5 N.I2 + C5H5N. S02+ C5H5N +H20  2C5H5N. HI + C5H5N. S03 C5H5 NSO3+ CH30H  C5H5N(H). S04CH3 Se observa que por 1 mol de agua se requiere 1 mol de yodo, 1 mol de metanol y 3 moles de piridina. En la práctica se usa un exceso de S02, piridina y metanol y la fuerza del reactivo depende de la concentración de yodo. El final de la reacción, cuando el yodo no encuentra más agua con que reaccionar, produce un color

pardo de la solución que puede observarse visual o fotométricamente. En soluciones muy coloreadas se utiliza le valoración electrométrica siguiendo la técnica dead-stop que se basa en que, aplicando una pequeña diferencia de potencial a 2 electrodos de platino iguales, inmersos. en un sistema redox, el potencial formado por polarización es compensado y el flujo de corriente se interrumpe. Durante la última fase de la titulación redox (en el punto final), ocurre una completa despolarización o polarización de ambos electrodos. Este cambio es acompañado por una gran deflexión de la aguja del galvanómetro. Técnicamente, el reactivo de Karl Fischer, puede usarse para la determinación de líquidos, gases y sólidos. Básicamente el método puede considerarse como un método de estándar primario para determinar el contenido de agua. Se puede usar para determinar humedad en materiales biológicos y compuestos orgánicos aunque hay algunas excepciones, por ej.: el ácido ascórbico se oxida cuantitativamente a dehidroáscorbico liberando agua que también es valorada; muchos compuestos carbonilos interfieren, aldehídos y cetonas tienden a reaccionar con el metanol del reactivo, formando acetales y liberando agua. Las interferencias pueden enmascarar el punto final y pueden provocarse por mercaptanos, diacilperóxidos, tioácidos y hidrazinas. Los compuestos inorgánicos que afectan la titulación del agua incluyen, óxidos metálicos hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, cromatos, dicromatos, boratos y sulfuros. Los compuestos alimenticios que pueden analizarse incluyen: cereales y similares con partículas de 5 mm de diámetro, hojuelas de maíz, harina, leche en polvo, huevos secos, leche condensada, alcoholes, etc. Realización del ensayo Principio: reducción del I2 en presencia de agua por el SO2, usando una base que neutralice el ácido formado y metanol como solvente. Detección del punto final electrométricamente. Materiales y aparatos • Equipo automático de Karl Fischer con agitador. Ver figura 3. • Pesa-sustancias apropiadas y jeringas. • Balanza analítica. Reactivos • Reactivo de Karl Fisher. • Metanol anhidro. • Agua destilada Procedimiento 1. Valoración del Reactivo de Karl Fischer: puede realizarse por dos métodos, ya sea utilizando un reactivo químico o agua pura (este último es el usado en el laboratorio)

a. Con tartrato sódico dehidrato C4H4Na206 H20. Este es un patrón primario que se caracteriza por una gran constancia del agua de cristalización. • •

Transferir al vaso de reacción 15 ml de metanol o la cantidad necesaria para cubrir la punta del electrodo y valorarlo con el reactivo de Karl Fischer, para neutralizar el agua que pueda estar presente. Es necesario tener en cuenta este volumen. Agregar al mismo vaso entre 150 y 300 mg de tartrato sódico dehidrato pesado exactamente y agitar. Valorar con el reactivo de Karl Fischer y hallar su título con la siguiente fórmula:

Título = 2 (18,02/230,08) x P V Donde: 18,02 = pm del H20 230,0 = pm del C4H4Na206 .H20 P = peso en mg del tartráto sódico dihidrato V = volumen en ml del reactivo K.F. usado en la valoración b. Con agua destilada • Proceder como en a), usando como sustancia de referencia el agua, la que se adiciona desde una microjeringa, previamente pesada, al vaso de referencia. Por diferencia de peso se conocerá el peso del agua. • Titular con el reactivo de Karl Fischer y anotar el volumen. Título = mg de agua/ ml de solución de Karl Fischer En una solución nueva, un ml del reactivo comercial valora 5 mg de agua. 2. Valoración de la muestra • Después de haber neutralizado el metanol y hallar el título del reactivo, ya sea con el patrón primario o el agua, proceder a introducir en el vaso de reacción entre 100 y 300 mg de muestra (pesados en el portamuestras), dependiendo del contenido de humedad. • Adicionar rápidamente la muestra al vaso, cuidando de no engrasar el porta-muestras y pesarlo nuevamente. Por diferencie se obtendrá el peso de la muestra. • Titular con el reactivo de Karl Fischer la cantidad de agua que posee la muestra. Anotar el volumen. • Calcular la cantidad de humedad de la muestra en %. • Realizar el análisis por duplicado. Nota: En el laboratorio la estandarización se realizará con agua destilada. Cálculos % de Agua = V (ml) del Reactivo x Titulo Reactivo x 100 mg muestra Manejo del titulador automático TitroLine alpha1 Este titulador es un computador de titulación independiente, el cual permite, por medio de su procesador y su hardware, una amplia variedad de titulaciones, una de ellas la de humedad de un producto. Es un equipo delicado y es necesario documentarse bien antes de utilizarlo. El sistema es cerrado consistente en buretas de llenado automático, electrodos de platino y un agitador magnético conectado a un aparato electrométrico. Este aparato consiste de un circuito eléctrico que deja pasar una corriente de 5 a 10 u amperios de una corriente directa entre un par de electrodos de platino 1

http://www.metrohm.fr/titration/karl_fischer/volumetre_870.php

sumergidos en una solución que va a ser titulada. En el punto final de la titulación un ligero exceso del reactivo incrementa el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios por 30 segundos de más, dependiendo de la solución que está siendo titulada

Figura 3. Ttulador Karl Fischer www.metrohm.fr/titration/karl_fischer/volumetre_870.php

Tal como se indicó anteriormente el reactivo de Karl Fisher debe ser siempre valorado para hallar su título. Después de introducir al aparato los datos del título y el peso de la muestra, se mostrará automáticamente en la pantalla, el resultado. Para realizar el cálculo manual: • Peso del agua • Volumen del titulante • Peso de la muestra • Volumen del titulante • Comparar el resultado manual contra el dado por el aparato. Determinación de cenizas totales La determinación de cenizas en los alimentos es importante bajo algunos aspectos. Por ejemplo: En los azúcares, gelatina, pectina y almidón se busca en la fabricación obtener productos de muy bajo contenido en cenizas, lo que es un indicio de su pureza. En otros casos esta determinación es indicativo de la naturaleza de un alimento que puede variar según su origen. El verdadero vinagre de frutas se puede distinguir del obtenido por destilación porque en este, el % de ceniza es mucho menor. Además el contenido de cenizas es un excelente índice de la calidad de una harina de trigo y en las cenizas se investigan no solamente las sustancias minerales agregadas a los alimentos para adulterarlos sino los metales nocivos que pueden encontrarse en los alimentos enlatados y en los que han sido tratados con insecticidas ( cereales, aceites, legumbres, etc. ). En las cenizas vegetales predominan los derivados del potasio y en los animales los del sodio

Los elementos minerales se encuentran formando parte de compuestos orgánicos e inorgánicos. Es muy difícil determinarlos tal como se presentan en los alimentos La incineración para destruir la materia orgánica cambia su naturaleza: Las sales metálicas de los ácidos orgánicos se convierten en óxidos o carbonatos o reaccionan durante la incineración para formar fosfatos, sulfatos, o haluros. Algunos como el S y los halógenos pueden perderse por volatilización La temperatura es esencial así: el carbonato potásico se volatiliza a 700º y se pierde casi completamente a 900º El carbonato sódico permanece inalterado a 700º pero sufre pérdidas considerables a 900º Los fosfatos y carbonatos reaccionan entre sí Si no se recomienda temperatura especial se pone a 525 - 550º hasta cenizas blancas o grisáceas, pasar a desecador y pesar cuando este a temperatura ambiente La incineración se lleva a cabo en mufla provista de un pirómetro y de un dispositivo de termostatación La cápsula mejor para la incineración es la de platino Si la muestra tiene abundante agua se mantiene sobre un baño de vapor hasta sequedad y se incinera luego hasta peso constante a la temperatura recomendada Se debe evitar que la muestra arda con llama porque puede haber pérdidas y una combustión demasiado activa puede formar inclusiones de Carbono que no incineran Si no se logra obtener cenizas exentas de Carbono, se retira la cápsula de la mufla, se enfría y se tratan las cenizas con agua caliente, filtrar y evaporar el filtrado a sequedad y desecar el residuo y el papel a 150 - 200º Luego incinerar a la temperatura adecuada para el producto, hasta formar una ceniza de color blanco o grisáceo. Si todavía persiste el Carbono añadir unas gotas de agua, secar a 150 - 200º y someterse a incineración La incineración de muchos alimentos, especialmente de los que contienen aceite, grasa y compuestos a base de fósforo es difícil de realizar, particularmente en estos últimos porque durante la incineración y aunque la temperatura no sea muy alta, la sustancia se funde y forma una masa vidriosa que ocluye partículas de Carbono, esto se debe la transformación de fosfatos mono y diácidos en metafosfatos En la determinación de cenizas es difícil a veces obtener resultados concordantes, especialmente cuando estos son ricos en bases alcalinas pues se presentan cambios de peso causados por la descomposición de carbonatos o pérdidas de sustancias relativamente volátiles como cloruros, lo mismo que a la hidratación rápida de cenizas de reacción alcalina durante la pesada Cuando se calcinan algunos aceites vegetales, se puede agregar un poco de vaselina que no deja ningún residuo. Los jugos de frutas y jarabes diluidos, se acostumbra dejarlos fermentar antes de calcinarlos Con azúcar o derivados el AOAC recomienda secarlos primero a 100º al BM o en la estufa para eliminar completamente el agua, y luego se agrega unas gotas de aceite de oliva puro, libre de cenizas, se calienta sobre la llama, de esta manera se evita la formación de espuma en la masa y su embombamiento Recipientes: Los más adecuados son los crisoles de platino, los de sílice son atacados por la ceniza que tienen reacciones alcalinas (el NaCl disuelto produce alcalinidad en las cenizas) Los de Ni, no pueden emplearse ya que estos en presencia de carbono producen níquel carbonilo Los crisoles de porcelana pierden peso en las sucesivas calcinaciones. En platino no deben calentarse sustancias ricas en fósforo a menos y los crisoles vycor se pueden calentar a 900º y tienen resistencia a la acción de sustancias químicas excepto bases. Las temperaturas aconsejables son: 525º azúcar, frutas, derivados, 550º vinos, cereales, derivados y 650º para otros. El carbonato de potasio se volatiliza a 700°C y se pierde a 900°C en tanto que el carbonato de sodio permanece inalterado a 700°C y se volatiliza a 900°C. Métodos para obtener cenizas de color claro:

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Si no es importante la destrucción de las cenizas en su forma inicial CO3= HCO3 _, basta agregar unas gotas de HNO3, evaporarlo a la entrada de la mufla y luego calcinar a fondo (el HNO3 oxida el carbono y puede reemplazarse por H2O2 y ambos se evaporan) Dejar enfriar el residuo calcinado, lavar el crisol con agua destilada, disolver las sales solubles, filtrar a través de un filtro sin cenizas, calcinar este aporte, finalmente se agrega el filtrado, se evapora a sequedad se calcina al rojo hasta obtención de cenizas blancas Humedecer las cenizas para acelerar la oxidación del Carbono, calcinar suavemente para evitar la decrepitación, calentar temperatura adecuada con el objeto de activar la obtención de cenizas, se aconseja agregar a las sustancias que se calcinan sustancias que aceleran la producción de cenizas claras, algunas son volátiles a la temperatura de calcinación : NH4NO3, HNO3, H2O2

Sustancias de composición constante e invariable a la temperatura de obtención de cenizas: piedra pómez, arena de cuarzo lavada y calcinada para análisis que se oponen a que las cenizas se fundan y ocluyen partículas de carbono y otras son oxidantes. Si se desea obtener la composición de las cenizas no se deben agregar aceleradores, sino sustancias totalmente volátiles: Ejemplo NH4NO3, HNO3, H2O2. Un método rápido y efectivo, para obtener cenizas libres de carbono es calcinar la sustancia a 450º C en un tubo de combustión y en presencia de O2 Solubilidad de las cenizas En el análisis de las conservas, jalea, mermeladas es interesante determinar el contenido de cenizas solubles en agua que indican aproximadamente la cantidad de fruta que contienen. Las cenizas derivadas de frutas y productos vegetales son alcalinas debido al K2CO3 mientras que las de cereales y alimentos ricos en proteínas son ácidas. En los frutos ricos en ácido orgánico (tartárico y cítrico) se debe a la transformación en carbonatos o alcalinotérreos correspondientes. La alcalinidad se expresa como volumen de ácido N/10 necesario para neutralizar 100 gramos de muestra con fenolftaleína como indicador. En resumen se puede decir que las cenizas: • Son un residuo inorgánico de una muestra incinerada • Sin valor energético • Que Indica adulterantes minerales • Son un Índice de pureza y calidad • Indican la procedencia de alimento • Se forman por cenizas solubles e insolubles. • Permiten la detección de metales nocivos ( pesticidas ) • Vegetales son ricas en Potasio y Sodio • Sometidas a digestión húmeda evita pérdida de compuestos volátiles como Azufre halógenos • Como sales metálicas de ácido orgánico producen óxidos o carbonatos • Durante la incineración producen fosfatos, sulfatos y haluros

y

Tabla 4. Cantidad de muestra a pesar para determinar cenizas Muestra

Cantidad (g)

Temperatura calcinación °C

Leche evaporada o condensada 1,6 y 2.0

550

Granos

2.0

600

3,0 y 5,0

550

2.0 g

Cereales y harinas

Azúcar, productos azucarados, vegetales, 5,0 y 10,0 productos cárnicos Jaleas, conservas, jamón, mermeladas, productos secos, leche. Jugos frescos, frutas enlatadas, Vi vinagre Pescado y productos marinos

de Observaciones

525

10,0

525

25.0

525 en baño de agua.

Equivalente a 20 g de muestra seca 550

Harina de trigo 5.0

600

Adicionar gotas de aceite a los productos con alta concentración de azúcar.

Concentrar primero en baño de agua Incinerar primero a baja temperatura hasta quemar grasa Adicionar 5 ml de acetato de Mg, reposo y evaporar Preparar un blanco

(Tomada de Laboratorio de Análisis de Alimentos. Complemento. 1993)

Principio: calcinación de la muestra, a una temperatura que permita la incineración de la materia orgánica, sin que ocurra pérdida de elementos minerales volátiles, hasta la obtención de cenizas libres de carbón. Materiales y aparatos • Mufla • Desecador • Balanza analítica • Crisol vycor. Reactivos Solo en caso necesario, H202

Procedimiento • Homogeneizar bien la muestra, pesar con exactitud entre 2 y 5 g (de acuerdo con la naturaleza de la muestra según se indica en la tabla 4) en una cápsula apropiada, previamente tarada. • Colocar la muestra en la puerta de la mufla (calentada previamente) hasta que no se desprendan humos. • Introducir la muestra al interior de la mufla e incinerarla entre 500° y 550 °C hasta obtener cenizas libres de carbón. En caso contrario, humedecer con agua o con H2O2 e incinerar nuevamente. • Retirar la cápsula, tapar para evitar hidratación, enfriar en desecador y pesar. Expresar el resultado en porcentaje de cenizas, tanto en base húmeda como seca.

Cálculos % Cenizas BH = (Peso cenizas + crisol) - Peso crisol x 100 Peso de la muestra

% Cenizas BS = % Cenizas BH x 100 (100 - %H) BH: Base húmeda

BS: Base seca

La cantidad de muestra, la temperatura de ignición y el tratamiento previo, dependerán de la naturaleza de la muestra y del grado de refinación tal como se muestra en la Tabla 4. Para determinar la presencia de cenizas insolubles se añade a las cenizas ácido clorhídrico diluido y se hierve por 5 minutos, se filtra a través de un papel filtro sin cenizas y se lava con agua hasta que los lavados dejen de ser ácidos, se transfiere el papel de filtro y su contenido a la cápsula original, se deseca e incinera a 625 - 650º, enfriar, pesar. Métodos especiales: Muchos laboratorios emplean el método de la digestión húmeda de la cual obtienen una alícuota, evitando así pérdidas de constituyentes volátiles. La ceniza de productos ricos en azúcares como la melaza se determina según el AOAC así: Pesar de 5 a 10 gramos de muestra y calentar a 100º hasta evaporación del agua, adicionar unas gotas de aceite de atún y calentar lentamente sobre una llama hasta que la hinchazón desaparezca, colocando en la mufla y llevar a temperatura a 525º hasta cenizas blancas Mojar las cenizas con agua, secar en baño de vapor y luego sobre parrilla y se coloca nuevamente en la mufla a 525º aproximadamente 2 horas Determinación del extracto etéreo o grasa bruta Las grasas y los aceites son muy insolubles en agua pero solubles en alcohol, muy solubles en éter de petróleo, éter etílico, Bisulfuro de Carbono CCl4, hexano, también solubilizan ceras, vitaminas liposolubles, residuos, pigmentos solubles en grasas como clorofila y carotenos, debido a esto, el análisis se denomina “Grasa Bruta” o cruda o extracto etéreo y se refiere al conjunto de ésteres de ácidos grasos como el glicerol, fosfolípidos, lecitinas, esteroles, ceras, ácidos grasos libres, carotenoides

Solventes: La extracción se hace con éter etílico anhidro (Punto de ebullición 34.6º), éter de petróleo (Punto de ebullición 35 - 45º) El éter de petróleo es más selectivo con respecto a verdaderos lípidos, es barato y tiene la ventaja de no ser afectado por trazas de humedad existente en la sustancia analizada y no se hidrata durante la extracción, el único control a verificar es su punto de ebullición y si no deja residuos al evaporarse. El éter etílico es el mejor disolvente de las grasas y disuelve lípidos oxidados pero al estar seco forma peróxidos estables y debe ser usado completamente anhidro y libre de alcohol y permanecer así durante la extracción ya que la humedad y los alcoholes disolverían azúcares, además es muy inflamable. La humedad se comprueba por manchas que deja al evaporarse sobre el papel de filtro. Muestra: El éter penetra rápidamente en los tejidos celulares cuando están secos pero lentamente cuando están húmedos, cuando la muestra contiene mucha H, el éter la absorbe y se acumula en la tapa etérea de la cual no puede eliminarse sino por ∆ alto lo que significa la descomposición del extracto o sino se seca habrá resultados demasiado altos La muestra seca se pasa a un dedal bien dividida, si no es posible se mezcla dos o tres veces con arena. En ciertos alimentos como productos de panadería, huevos y alimentos que contengan levaduras no se logra extraer con éter la grasa que contienen, porque este no penetra o porque la grasa se ha combinado con otros constituyentes como proteínas o Carbohidratos. Para liberar la grasa se somete el alimento al calor con HCl con el fin de hidrolizar las proteínas y los almidones. En las levaduras debe calentarse aproximadamente dos horas con HCl a reflujo, luego se filtra y se lava para eliminar azúcares, se seca a temperatura ambiente y se hace la extracción con éter Principio: extracción de la grasa de la muestra previamente desecada, por medio de hexano o éter de petróleo. Eliminación del disolvente por evaporación, desecación del residuo y posterior pesada, previo enfriamiento. Materiales y Equipo: • Extractor Soxhlet, • Dedales o papel de filtro, • Estufa eléctrica. • Desecador provisto de un desecante eficaz (sílica gel con indicador). • Balanza analítica. • Placa calefactora. • Rotaevaporador. • Balón de 500ml. Reactivos • Éter de petróleo 40-60°C p.a. • Gel de sílice con indicador g.r. (Si es necesario secarla a 105°C) • N - hexano p.a. Procedimiento usando un soxhlet • Pesar exactamente entre 3-5 g de muestra seca previamente homogeneizada. • Introducirla en un cartucho de papel de filtro y tapar el extremo del cartucho con algodón. Colocar el cartucho con su contenido en la cámara central del aparato de soxhlet (Ver figura 4). • Pesar el balón del aparato Soxhlet, después de haberlo lavado y secado en la estufa y enfriado en desecador. • Colocar en el balón 70 ml de éter de petróleo y ensamblar en el aparato Soxhlet. • Extraer a reflujo durante 4-5 horas.

• • • • •

Eliminar el disolvente en el rotaevaporador 0 Colocar el balón con su contenido en una estufa a 100 -105 C, para evaporar los restos de solvente. Enfriar el balón y su contenido en desecador y una vez frío, pesarlo. Repetir el calentamiento y la pesada hasta que la diferencia entre 2 consecutivas sea menor de 5 mg. Nota importante: guardar el residuo obtenido para realizar el análisis de fibra cruda.

Procedimiento usando una unidad extractora con solventes

•

deda l Solven te

• • • •

Colocar la muestra previamente pesada en el dedal de la unidad. • Poner el dedal en el equipo (figura 4) • Adicionar 70 ml de éter de petróleo en el vaso de la unidad extractora. • Colocar el vaso en el plato de calentamiento. • Cierre el sistema de reflujo con la palanca de la izquierda. • Encender la unidad. • Programar la unidad con el botón SET. • Iniciar la extracción con el botón START. • Colocar las llaves en forma vertical los 2 primeros tiempos (no se observan en el diseño adjunto) Figura 4. Unidad extractora con solventes www.buchi.fr

El sistema sonará al cambio de cada tiempo. En el último tiempo la llave debe estar en forma horizontal. Cuando finalice abrir el sistema con la palanca Retirar los vasos de la placa de calentamiento.

Nota: Para cambiar los tiempos presionar el botón SET

Cálculos Expresar el resultado en porcentaje de peso de grasa bruta en base seca y en base húmeda % Grasa Base Seca (% GBS) = P(b+g) – Pb x 100 Pm % Grasa Base Húmeda (%GBH) = %GBS x 100 - % H 100 P (b+g) = Peso en g del balón más grasa Pb = Peso en g del balón.

Pm = Peso en g de la muestra. % H = Porcentaje de humedad Determinación de fibra. 1. Fibra cruda o bruta Constituye un índice de sustancias presentes en los alimentos de origen vegetal y se compone fundamentalmente por celulosa, hemicelulosa, lignina y pentosanas junto con pequeñas cantidades de sustancias nitrogenadas de las estructuras celulares de los vegetales Se considera que la fibra bruta se pierde en la incineración del residuo seco obtenido tras la digestión de las muestras con SO4H2 y NaOH 1.25% bajo condiciones específicas El método no ha tenido variación desde su introducción en 1864 por los químicos agrícolas alemanes Van Soest y Wine del Agricultural Research Service han introducido un nuevo concepto del significado de fibra bruta Van Soest estima que el método Weende pierde: 8 – 90% lignina, 5 – 31% celulosa y 21 – 89% hemicelulosa, sustancias vegetales insolubles no digeridas por las enzimas diastásicas o proteolíticas nutritivamente inútiles excepto por la fermentación microbiana en el tracto digestivo de los animales rumiantes Critican, esos autores, el método del AOAC porque en esa digestión ácido alcalina el residuo contiene cantidades considerables de proteína vegetal perdiéndose en cambio parte de la lignina que se gelatiniza o disuelve y usan detergentes neutros para la extracción de celulosa, lignina y cenizas insolubles (sílice). Este método no se sigue mucho porque generalmente los datos que aparecen en las publicaciones contienen datos de fibra bruta, pero los resultados que da son más precisos en cuanto al valor nutritivo para hombres y animales monogástricos. El detergente se encuentra formado por lauril sulfato sódico, dihidrato de tetraacetato diácido disódico de etilendiamina, decahidrato de borato sódico, fosfato disódico 2 – etoxietanol, decahidronaftaleno, acetona, sulfito sódico. La fibra obtenida por este tratamiento se denomina constituyente de la pared celular y el material que no forma parte de la pared celular se calcula restando este valor de 100. Al incinerar se obtiene el peso de las cenizas de la fibra insoluble en detergente neutro. Cuando los datos se vayan a utilizar en cuestiones relacionadas con los animales monográsticos que tienen escasa capacidad de utilización de fibra, el único valor de interés es el de la fibra insoluble en detergente neutro Los valores de fibra cruda a veces resultan mayores que los del ENN, además esta porción contiene más lignina (una sustancia que se considera indigerible) que la porción de fibra cruda. El procedimiento es empírico con gran número de pasos a seguir: - Se pesa la muestra - Se extrae el agua - Se determina la materia seca - Se extrae con éter para remover los lípidos - El residuo se hierve con ácido diluido, luego con álcali diluido se seca, pesa e incinera La pérdida de peso en la incineración se considera como la fibra cruda de la muestra pesada antes de extraer la humedad “La extracción de la fibra cruda, por digestión con ácido y álcali, es la de más fácil digestión de los nutrimentos contenidos en los alimentos. El residuo insoluble es la fibra cruda” Principio: disolución de sustancias orgánicas, con excepción de celulosa, hemicelulosa y ligninas,

mediante la acción de soluciones ácidas y alcalinas y sometiendo a reflujo y bajo condiciones específicas. Equipo y materiales • Balanza analítica. • Equipo de reflujo y filtración por succión • Plancha con recipiente para el calentamiento de las soluciones. • Estufa • Mufla • Desecador • Filtro de vidrio aglomerado con tamaño de poro apropiado. • Celita, en caso necesario. • Reactivos • Ácido sulfúrico al 1,25% p.a. • Hidróxido de sodio 1,25% p.a. • Alcohol 95% p.a. o acetona p.a. • Agua destilada p.a. Procedimiento • Pesar exactamente 1 g de muestra seca y desengrasada y pasarla al filtro de vidrio aglomerado del equipo, previamente tarado. • Adicionar 100 ml de H2SO4 al 1,25% caliente y agitando • Llevar la muestra al equipo, y digitar las condiciones apropiadas de tiempo y temperatura (p.ej. hervir 30 min). • Si es necesario adicionar un antiespumante como alcohol amílico (unas pocas gotas) y agitar. • Terminada la digestión ácida, activar la bomba de filtración. Lavar con un total de 100 ml. de agua destilada caliente. • Verificar fin de reacción ácida. • Adicionar 100 ml de NaOH caliente al 1,25% • Hervir nuevamente agitando de vez en cuando como en el primer tratamiento. • Filtrar la solución caliente a través del filtro de vidrio, previamente pesado. • Lavar el residuo insoluble con un total de 150 ml de agua destilada caliente hasta que el líquido de los lavados no presente reacción alcalina comprobando con papel indicador. • Lavar con 25 ml de alcohol p.a. o acetona. • Secar en la estufa a 105°C hasta peso constante • Calcinar a 550°C hasta obtener cenizas claras y pesarlas Cálculos % Fibra BS = (Pf+Pc)- Pc x 100 x (100 - % G) Pm 100 % Fibra BH = % Fibra BS x (100 - %H) 100 Pf + Pc = Peso en g de la fibra + cenizas Pc = Peso en g de las cenizas Pm = Peso en g de la muestra. % G = Porcentaje de grasa

Expresar el resultado como porcentaje de fibra bruta en base húmeda.

2. Fibra dietaria total (FDT) por Método Gravimétrico Enzimático Con este método y el gravimétrico no enzimático se valora el total de fibra contenida en los alimentos que incluye tanto la soluble como la insoluble, entendiendo por fibra soluble las pectinas, gomas y mucílagos en tanto que la insoluble comprende la celulosa, hemicelulosa y la lignina. A nivel nutricional el análisis de esta fibra es de gran importancia en la alimentación humana. El método Weende solamente mide fibra insoluble y ya se ha explicado sobre las grandes pérdidas que se sufren durante el tratamiento. Método Oficial AOAC Principio: disolución de sustancias orgánicas, con excepción de celulosa, hemicelulosa, ligninas, pectinas, gomas y mucílagos, mediante la adición de enzimas actuando a pH controlado. Equipos y materiales • Beaker • B.M. • Pipetas • Agitador mecánico Reactivos • Buffer fosfato, a pH 6,00 • Alfa amilasa Sigma • NaOH de 0,275N • Proteasa Sigma • Glucosidasa amilasa Sigma Procedimiento • Pesar por duplicado 1 ± 0,1 g de muestra en un beaker, previamente preparado. • Adicionar 50 ml de buffer fosfato a pH 6.0 y verificarlo. • Adicionar 0,1 ml de la enzima α- amilasa. 0 • Llevar las muestras al B. M., hasta alcanzar la temperatura interna requerida (95 C). • Retirar las muestras del baño y enfriar a temperatura ambiente. Ajustar el pH hasta 7,5 ± 0,2 con una solución de NaOH 0,275 N, y adicionar la proteasa preparada previamente (50 mg en un 1 ml de buffer fosfato) y pipetear 0,1 ml a cada muestra. • Incubar con agitación continua a 600C por 30 minutos. • Retirar de la incubación y enfriar a temperatura ambiente. • Ajustar el pH entre 4,00 - 4,60 con una solución de HCl 0,325 N. Tener en cuenta el pH inicial de las muestras, antes de adicionar el ácido y agregar 0,3 ml de amiloglucosidasa. Siempre revisar el kit porque las concentraciones del reactivo o las instrucciones pueden cambiar. • Incubar con agitación a 600C por 30 min. • Retirar de la estufa y adicionar cuatro volúmenes de alcohol al 95%, previamente calentados a 600C. • Dejar toda una noche en precipitación, cuidando de tapar con papel aluminio los vasos de precipitado.

• • • • •

Filtrar en crisoles previamente preparados con celita y pesados. 0 Dejar el residuo en la estufa a 105 C, toda la noche. Retirar de la estufa y llevar al desecador, pesarlos. Restar el peso de la celita más crisol y obtener el peso del residuo. Los residuos, que están por duplicado se analizan de la siguiente forma: uno de ellos se analiza por el método de Kjeldhal para obtener las proteínas que han permanecido sin digerir. El segundo se incinera a 5250C durante tres horas para obtener las cenizas. Ambos análisis se realizan según la práctica de Métodos Generales de Análisis. Estos dos datos se restan del residuo y se obtiene la FDT en porcentaje.

3. Fibra dietaria total (FDT) por Método gravimético no enzimático Método Oficial AOAC 993.21 Utilizado para analizar fibra dietaria en alimentos y productos alimenticios con 2% de almidón. Este método es aplicable en alimentos y productos alimenticios con 10% de fibra dietaria total y productos que contengan 2% de almidón, en base seca Principio: Una suspensión en agua de, frutas secas, vegetales o aislados de fibra, es incubada a 37°C durante 90 minutos para solubilizar azúcares y sustancias solubles. La fibra soluble en agua es precipitada con alcohol. El residuo es lavado sucesivamente con alcohol al 78%, etanol 95%, acetona y secar a 105°C. Uno de los duplicados se analiza para proteína cruda y el otro para cenizas. La fibra dietaria total (FDT) será el peso del residuo seco restándole la proteína y las cenizas. Se adjunta el método en su versión original para su estudio y realización con productos que cumplan los parámetros descritos. Determinación de nitrógeno Determinación de nitrógeno total por el método microkjeldhal Este método se denominada Macro cuando se utilizan 2.0 gramos de muestra y Micro cuando se utilizan unos 100.0 miligramos de muestra y se utiliza para valorar el Nitrógeno total de la muestra. El principio del método se basa en una digestión de la muestra por medio del ácido sulfúrico que actúa como oxidante más un agente catalítico, convirtiendo el Nitrógeno en sulfato de amonio. Dejar enfriar, adicionar agua produciendo una reacción exotérmica. El amonio se libera al agregar un álcali, y destilar la mezcla en ácido bórico 2 – 4%, clorhídrico 0.10, sulfúrico 0.1 Con la adición del agente catalítico se reduce considerablemente el tiempo de digestión. El Selenio no puede recomendarse como un agente catalítico para uso general en el método de Kjeldahl debido a que una digestión muy prolongada puede resultar en una pérdida de Nitrógeno. Sin embargo es muy conveniente para digestiones que duran menos de una hora. Los tejidos de planta rara vez duran más de 45 minutos y por lo tanto, se puede utilizar. Una mezcla de catalizadores consistente en sales de Cobre, Selenio y mercurio ha probado ser mejor que cuando está cada uno actuando solo. La solución donde se recibe el amoníaco debe tener mezclado el indicador que señala el fin de la reacción.

Proteína verdadera Este concepto incluye solo la proteína o el núcleo proteico. Los componentes nitrogenados de un alimento incluyen proteínas, sales de amonio, y nitritos que se encuentran principalmente en la raíz y algunos cereales verdes. Las proteínas solubles se pueden pp por ciertas sales metabólicas como sales de Cobre en solución alcalina Método Barnstein: Uno o dos gramos de muestra en polvo, hervir en un vaso con 50 ml de agua (si hay almidón se calienta 10 minutos al baño hirviente) y se pp la proteína con Cu (OH)2 resultante de la adición de CuSO4 60% y bajo agitación de 25 ml de NaOH al 12.5% El líquido sobrenadante se filtra, el sedimento se decanta varias veces con agua y se traslada al filtro donde se lavan con agua caliente hasta que el filtrado no acuse la presencia de Cobre con ferrocianuro. Luego se pasa el filtro al Kjeldahl Protidos digestibles ( Sjollema y Wesdeney ): Hacer una digestión artificial tratando 2 gramos de muestra con 500 ml de agua, 1 gramo de pepsina y 10 ml HCl 15% en matraz tapado, se digiere a 37 – 40º por 24 horas agitando con frecuencia Agregar 10 ml de HCl al 25% y se vuelve a digerir 24 horas de 37 - 40º luego se filtra al vacío por Büchner, se lavaron agua caliente hasta desaparecer del ión Cl- y se pasa al Kjeldahl el contenido del filtro. La diferencia entre el Nitrógeno total y el Nitrógeno de este residuo es el Nitrógeno de las proteínas digestibles Prueba de descomposición de proteínas: Análisis rápido Muestra (100g) + 50 ml H2SO4 al 10%. Agitar y tapar con el tapón Colocar un papel de acetato de Pb Observar papel, si este toma color negro hay descomposición de los amino ácidos azufrados que con Pb → PbS (negro). Medir el tiempo Método de Dumas: El Nitrógeno liberado por pirólisis y combustiones subsecuentes, es barrido por una corriente de Nitrógeno en un Nitrómetro. El CO2 es absorbido en KOH y el volumen de nitrógeno residual es medido y convertido a su equivalente en nitrógeno por un factor numérico Método microkjeldhal Principio: ataque del producto por ácido sulfúrico 96%, catalizado con cobre II sulfato y selenio, en el cual se transforma el nitrógeno orgánico en iones amonio, que en medio fuertemente básico, permite la destilación del amoníaco, que es recogido sobre ácido bórico. La posterior valoración con ácido clorhídrico permite el cálculo de la cantidad inicialmente presente de nitrógeno en la muestra. Equipos y materiales • Digestor y destilador Büchi • Bureta con divisiones de 0,1 • Balanza analítica • Manta calefactora • Probetas de 50 ml • Matraces de Kjeldhal • Embudos de tallo largo • Erlemneyer de 200 ml.

Reactivos • Ácido bórico solución al 4% gr • Ácido clorhídrico 0,1 N sv • Ácido sulfúrico 96% p.a. • Agua destilada p.a. • Alcohol etílico 96%v/v p.a • Azul de metileno, solución al 0,1% en agua. • Cobre II sulfato 5-hidrato • Indicador mixto: se puede preparar disolviendo 2 g de rojo de metilo y 0,1g de azul de metileno. Este indicador vira de violeta a verde a pH 5,4. Conservarlo en frasco topacio. • Piedra pómez 4-8 mm • Potasio sulfato • Rojo de metilo • Selenio metal en polvo • Sodio hidróxido 97% lentejas para preparar solución al 40% • Indicador de Tashiro: consta de dos soluciones: Solución A: se disuelve 0,1 gramo de azul de metileno en l00 ml. de alcohol del 96%. Solución B: se disuelve rojo de metilo en alcohol del 96 % hasta saturación. El indicador se obtiene mezclando 2 volúmenes de B con un volumen de A. En medio ácido, presenta coloración violeta; en medio neutro es incoloro y en medio alcalino es verde. Procedimiento 1. Digestión o mineralización: • Pesar con precisión de 0,1 mg entre 100 y 300 mg de la muestra y llevarlos al matraz Kjeldahl e introducir unos granos de piedra pómez. • Agregar 4 g de catalizador el cual consta de sulfato de potasio, sulfato de cobre y óxido de selenio y 10 ml. de ácido sulfúrico concentrado y mezclar con una rotación suave. • Colocar el matraz en el digestor, prenderlo y presionar Start para iniciar el proceso. • Programar las 4 rampas de temperatura y tiempo (los cambios se efectúan automáticamente); con este procedimiento se busca aumentar el calor paulatinamente haciendo el proceso mucho más eficiente. • El aparato consta de una trampa para la evacuación de gases generados durante la digestión, los cuales son neutralizados para facilitar su deshecho. • Agitar de vez en cuando el balón para que haya una mezcla uniforme. Figura 5. Digestor Buchi www.buchi.fr • •

El color de la muestra va aclarando cada vez más, (este proceso es más lento en los aparatos automáticos al parecer por el mejor control que tienen de la temperatura). La digestión se considera concluida cuando la solución tiene un color claro (verde o amarillo claro).

•

Apagar el digestor y la trompa de vacío y dejar enfriar la muestra hasta temperatura ambiente y añadir con precaución 100 ml de agua destilada para análisis, disolviendo por rotación suave el potasio sulfato cristalizado.

En esta etapa la reacción que se sucede es la siguiente: K2SO4, Na2SO4 Muestra orgánica + H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + SOX + H2O Se, Hg, Cu • • • • •

2. Destilación Poner el tubo con la muestra digerida en el soporte del destilador. Adicionar de 30 a 40 ml de NaOH al 40%. Aparte, en un erlenmeyer de 250 ml, tomar 75 ml de ácido bórico al 4% y 3 gotas del indicador mixto. Introducir hasta el fondo del erlenmeyer, la alargadera del aparato de destilación e iniciar la destilación hasta recoger unos 100 ml de destilado. Lavar con agua destilada, la salida del condensador y proceder a bajar el erlenmeyer de la plataforma con la solución a valorar, para que no se vaya a succionar.

Figura 6. Destilador Buchi

www.buchi.fr

En esta etapa la reacción que se sucede es la siguiente: (NH4)2SO4 + [NaOH]

NH3 +H2O

NH4OH

3. Titulación: Valorar el borato de amonio formado, con HCl 0,1 N sv hasta la coloración original violeta. Efectuar una prueba blanco, utilizando 5 ml de agua destilada para análisis en vez de la muestra siguiendo el mismo procedimiento. En esta etapa la reacción que se sucede es la siguiente: Indicador mixto NH4OH + HBO2 NH4BO2 + H2O Verde Indicador mixto NH4BO2 + HCl NH4Cl + HBO2 Violeta Cálculos % N total = 0,014 N (V1 - V2) X 100 Pm %P = %N x F* N = pesa 14g/mol

N = normalidad del titulante V1= Vol muestra V2 = Vol blanco Pm = Peso de la muestra %P = porcentaje de proteína total o cruda F* = factor de conversión de N a proteína (Ver tabla 5)

Tabla 5. Factores para la conversión de N a proteína. Alimento

Factor

Proteína en general Cebada, centeno, avena Leche y productos lácteos Productos de la soya Harina de trigo Arroz Gelatina Trigo candeal Almendras Cacahuete

6.25 5.83 6.38 5,77 5,70 5,95 5,55 5,38 5,18 5,46

Para calcular la cantidad de proteína cruda que contiene la muestra analizada, multiplicar % de proteína por uno de los siguientes factores, según le corresponda. Determinación de nitrógeno total en presencia de nitratos y nitritos •

•

Para determinar el nitrógeno total, se procede exactamente como se indica en la descripción del método micro Kjeldahl, con la diferencia de que en el proceso de digestión, se le agrega, al ácido sulfúrico 1 g de ácido salicílico y se deja en reposo 30 min antes de comenzar la digestión. Se hace además, una determinación de nitrógeno pero sin agregar ácido salicílico. La diferencia entre las dos determinaciones, corresponde al nitrógeno nítrico y nitroso.

Determinación de nitrógeno amoniacal • • •

Pesar una cantidad de muestra adecuada y destilarla con 200 ml de agua, siguiendo el método micro Kjeldahl. Recibir el destilado sobre 20 ml de ácido sulfúrico 0,5 N, en presencia del indicador de Tashiro. Expresar el resultado como % de NH3

Extracto no nitrogenado (ENN ) Es una categoría del sistema Weende y se encuentra por diferencia y da razón del contenido de carbohidratos analizados por éste método. Se calcula de la siguiente manera:

ELN = 100 – (% humedad + %ceniza + %extracto etéreo+ %proteína+%fibra) El ELN no contiene ninguna celulosa pero puede contener hemicelulosa y algo de lignina. Puede además contener todos los productos solubles en agua que son insolubles en éter como por ejemplo las vitaminas hidrosolubles. La mayor parte del ELN se compone de almidón y azúcares quedan el valor energético al alimento. Cuando se habla de carbohidratos totales se incluye además la fibra bruta. Cualquier error cometido en las demás determinaciones queda reflejado en el ENN. Medida de las calorías proporcionadas por un alimento Bomba Calorimétrica Bombona de Oxígeno

Termómetro

Recipiente para el Agua Camisa Adiabática

Bomba de acero inoxidable

Figura 7. Componentes de la Bomba Calorimétrica La bomba calorimétrica se usa para medir la energía de cualquier materia combustible. Se pesa una muestra y se quema en un recipiente a presión lleno de oxígeno o bomba calorimética, sumergido en un volumen conocido de agua. Midiendo exactamente el aumento en la temperatura del agua se pueden calcular las unidades de calor liberadas. El alimento a analizar es puesto en un pequeño disco y colocado en una cámara llena de oxígeno y rodeada de agua. Cuando el alimento es quemado por el paso de una corriente eléctrica a través de un fusible, las moléculas son totalmente oxidadas para dar H20, CO2, NOx y SOx. La energía liberada durante la combustión es convertida en calor lo que causa un aumento de la temperatura en el agua que rodea la cámara central. Principio: Medición del poder calorífico de un alimento cuando se quema a volumen constante en una bomba calorimétrica. Procedimiento: • • •

Pesar entre 1,0 y 1,5 g del alimento y elaborar una pastilla. Llevar la muestra al portamuestras de la bomba de acero inoxidable Tomar 10 cm. de alambre de ignición y sujetarlo firmemente a los extremos de los electrodos de

• • • • • • • • • • • •

la bomba calorimétrica teniendo cuidado en que el alambre toque la muestra pero no las paredes del recipiente. Adicionar 2 ml de agua en la bomba de acero inoxidable Cerrar la bomba herméticamente y cerrar la válvula de alivio. Llenar con 2 L de agua el recipiente del agua. (Hacerlo cada vez que se vaya a realizar un ensayo). Adicionar entre 15 y 20 atm de presión desde el tanque de oxígeno en la bomba de acero inoxidable, teniendo las debidas precauciones e introducirla dentro del recipiente con agua. Instalar los terminales electricos en los contactos de los electrodos. Introducir el recipiente dentro de la camisa adiabática tapar y leer la temperatura inicial. Presionar el botón de ignición yy continuar leyendo, cada minuto, el aumento de temperatura hasta que se estabilice. Apagar el equipo y destapar la camisa adiabática . Sacar la bomba y abrir la válvula de alivio para que se escapen los gases. Destapar la bomba y enjuagar las paredes con agua destilada. Medir el alambre restante y por diferencia hallar la cantidad consumida. Pasar el contenido de la bomba a un erlenmeyer y titularlo con NaOH 0.0725 N en presencia de fenolftaleína hasta color rosado pálido. Anotar el volumen.

Cálculos: •

Hallar el equivalente calórico o W de la bomba en cal/°C, calculándolo de la siguiente manera: W = Hm+e1+e2+e3 Δ T°

Donde : H: Calor de combustión del ácido benzóico (6313 cal/g) e1: Valor de NaOH 0.0725 N utilizados en la valoración (corrección por ácido). Cada ml corresponde a 0.55 cal e2: Corrección en calorías para la formación de H2 SO4 (14x%SxWm) e3: Corrección en calorías para el calor de combustión del alambre. Ver valor en el empaque del alambre. •

Hallar el calor de combustión de la muestra en cal/g, calculándolo de la siguiente manera: Hg = (TW – e1-e2-e3) m

Donde: T= aumento corregido de la temperatura e1= corrección en calorías para la formación de HNO3 y que corresponde al volumen de NaOH 0.0725 N usado en la titulacón de los lavados. e2 = Corrección en calorías para la formación de H2 SO4 e3 = Corrección en calorías para el alambre. Ver valor en el empaque del alambre. Nota: Para obtener datos más exactos se deben producir menos de 7000 cal, lo que limita la cantidad de muestra analizada a 1 o 1,5 gramos en sólidos; en muestras líquidas medir entre 1 y 1,5 ml. Visitar: http://web.mst.edu/~gbert/cal/assy/assy.htm?SP

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