GUIA DE LABORATORIO

BIOTECNOLOGIA ALIMENTARIA 211619 Tres (3) créditos académicos

GLAEHTER YHON FLOREZ GUZMAN Director de curso

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA (ECBTI) 2013

INTRODUCCIÓN La Biotecnología Alimentaria se puede definir como: el desarrollo, producción y utilización racional de recursos biológicos destinados a la creación, modificación e implementación de procesos como alternativa a soluciones que repercutan en la seguridad y calidad de los recursos alimentarios. Estos objetivos se pueden realizar gracias a los avances en las últimas décadas en la manipulación de macromoléculas orgánicas como el ADN, ARN y proteínas; dando origen a campos de conocimiento como: la genética molecular 1 , proteómica 2 , metabolómica3, citómica4 entre otras; los conocimientos obtenidos por técnicas básicas como la cinética de crecimiento celular, determinación de actividad enzimática, aislamiento y cuantificación de ácidos nucleicos (a.n.), son determinantes para la comprensión, desarrollo y control de procesos en Biotecnología Alimentaria. El Ingeniero de Alimentos debe estar capacitado en las técnicas básicas y mas utilizadas en la cuantificación y determinación de estas macromoléculas, toda vez que la mayoría del avance científico en biotecnología alimentaria se basa en el conocimiento y alcance de este tipo de tecnologías. Algunas practicas básicas desarrolladas en esta guía son relacionados con técnicas de cuantificación, identificación y caracterización de proteínas y ácidos nucleicos como la electroforesis en agarosa y SDS PAGE, las cuales son el cimiento para sus variaciones y aplicaciones. La metodología para la cuantificación y comportamiento celular en un medio de cultivo, es la identificación primaria en bioprocesos para la obtención de un metabolito. Este material es destinado al componente practico de la asignatura Biotecnología Alimentaria del programa de Ingeniería de Alimentos y a su vez esta supeditado a la corrección metodológica y académica del mismo.

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Estudia la forma como se transmiten, se generan y se expresan las características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas o conductuales de los organismos vivos, de una generación a otra, bajo diferentes condiciones ambientales. 2 Estudio a gran escala de las estructuras y funciones de proteínas. 3 Conjunto de técnicas dedicadas al estudio de sistemas o intermediarios metabólicos. 4 Estudio de los sistemas celulares a nivel de células individuales.

OBJETIVO GENERAL Se busca como objetivo general al desarrollar este material, que el estudiante adquiera una comprensión más profunda de algunas de las técnicas básicas utilizadas en la extracción, purificación y caracterización de macromoléculas orgánicas empleadas en Biotecnología Alimentaria, y potencializar académicamente el conocimiento de estas.

PRACTICA 1. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO 1.1. Tipo de practica Presencial 1.2. Temáticas de la practica Bioprocesos, crecimiento microbiano. 1.3. Intencionalidades formativas Objetivos: 1.3.1. Identificar y comparar las diversas fases de crecimiento del microorganismo E. coli, en diferentes medio de cultivo. 1.3.2. Determinar las diferencias en el tiempo de duplicación y la velocidad específica de crecimiento del microorganismo en diferentes fuentes de carbono. 1.3.3. Expresar la biomasa en unidades de concentración mediante la elaboración de una curva patrón. 1.4. Metas El estudiante entregará un informe de laboratorio, en el que presente los resultados de la práctica y la fundamentación teórica de crecimiento microbiano que respaldan los resultados 1.5. Competencias A partir de éste trabajo el estudiante mejorará procedimentales, argumentativas y de escritura científica.

sus

competencias

1.6. Seguridad industrial Los estudiantes en el laboratorio, deberán atender las normas de Bioseguridad recomendada para estas prácticas, deberán llevar bata blanca que cubra ¾ de su vestuario, zapatos cerrados, guantes, mascarilla. No deberán manipular ningún reactivo con la boca , no pueden consumir alimentos ni líquidos dentro del laboratorio y deberán estar pendientes de los implementos asignados, deberán seguir atentamente las instrucciones del laboratorista y haber leído la guía de laboratorio antes de ingresar al laboratorio. 1.6.1. Practica 1. Cinética de crecimiento microbiano Para la primera práctica deben lavarse y desinfectarse las manos luego del manejo del microorganismo; especialmente evitar la manipulación del M.O. a mujeres en estado de embarazo. Todo residuo o solución que halla tenido contacto con la bacteria Escherichia coli, obligatoriamente debe eliminarse en una solución de hipoclorito de sodio a 500 partes por millón (p.p.m.). La bacteria Escherichia coli es patógena y se debe considerar de alto peligro.

1.6.2. Practica 2. Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes Para esta práctica se debe tener extremo cuidado en la manipulación de la mayoría de reactivos como: acrilamida, bis- acrilamida, β-mercaptoetanol, metanol entre otros, los cuales son neurotóxicos y altamente peligrosos para la salud humana cuando se tiene contacto dermal o ingieren. En la totalidad de la práctica se debe usar guantes5 de nitrilo o cloruro de polivinilo, los de látex no son recomendables. El reactivo β-mercaptoetanol manipularlo en cabina de extracción, no tanto por su nauseabundo olor si no sus vapores (El 2mercaptoetanol se considera un veneno "severo", causando irritación en las vías nasales y el tracto respiratorio al ser inhalado, vómitos y dolor de estómago al ser ingerido, y absorción potencialmente fatal al entrar en contacto con la piel) 1.6.3. Practica 3. Extracción, purificación y electroforesis de ácidos nucleicos Para esta práctica se debe tener extremo cuidado en la manipulación de la mayoría de reactivos especialmente el bromuro de etidio EtBr ya que es un mutágeno potente. En la totalidad de la práctica se debe usar guantes de nitrilo para la manipulación de los elementos, el EtBr se debe manejar en un lugar destinado para ello; evitar en lo posible la contaminación innecesaria de muebles y equipos por este reactivo, los materiales (como: puntas, papel, soluciones entre otros) que hallan estado en contacto con EtBr deben desecharse en un lugar apto para el vertimiento de líquidos de alto riesgo toxicológico. 1.6.4. Practica 4. Cinética enzimática En esta practica se debe mantener las normas básicas de bioseguridad, los reactivos utilizados no poseen alta peligrosidad, tan solo manipularlos con guantes toda vez que el manejo de proteínas puede ocasionar alergias. 1.6.5. Practica 5. Inmovilización enzimática En esta practica se debe mantener las normas básicas de bioseguridad, los reactivos utilizados no poseen alta peligrosidad, tan solo manipularlos con guantes toda vez que el manejo de proteínas puede ocasionar alergias. 1.7. Fundamentación teórica En un sistema biológico se define al crecimiento microbiano como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo; esto implica que el aumento de la masa celular por acumulación de productos de reserva no constituyen crecimiento; la medida del crecimiento involucra el incremento de células individuales (aumento del tamaño y peso de las células que precede a la división celular) por un lado y el crecimiento de estas por el otro. El crecimiento celular es la sumatoria de los ciclos celulares de todos sus individuos y puede ser de dos tipos: (i) asincrónico: cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular (independiente de todos los

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Guantes de látex (hule natural): se fabrican con látex de caucho natural (Hevea brazilienses) con alto nivel de comodidad y elasticidad, son resistentes a productos químicos acuosos pero se degradan con hidrocarburos, pueden producir alergias. Guantes de nitrilo: fabricados con materiales derivados del petróleo, muy resistentes a aceites, combustibles y sustancias químicas. Guantes de cloruro de polivinilo (PVC): excelente resistencia a productos químicos, ácidos , bases y material biológico.

demás) y (ii) sincrónico, en el cual todas las células en un mismo momento se encuentran en una misma fase del ciclo celular. La velocidad de crecimiento (dx/dt) es el aumento de la cantidad de microorganismos por unidad de tiempo, sus unidades son: (g/l).h-1. Velocidad específica de crecimiento (µ) es la velocidad de aumento de la concentración celular por unidad de tiempo y se expresa en h-1. El tiempo de duplicación (td) es el tiempo en minutos necesario para que las poblaciones de células se dupliquen; este periodo es constante durante la fase logarítmica. Tabla 1. Tiempos de duplicación de algunos microorganismos. Tiempo de Microorganismo duplicación td (h) Escherichia coli 0.33 Saccharomyses cerevisiae 1.5 Candida utilis 1.7 Schizosaccharomyses pombe 4.0 Penicillium chrysogenum 2.5 Geotrichum lactis 2.0 Fusarium graminearum 2.5 Las fases que presenta un cultivo microbiano típico son (i) fase de latencia o adaptación: las bacterias se adaptan a las condiciones de crecimiento y aun no tienen la posibilidad de dividirse. (ii) fase exponencial o fase logarítmica: es el periodo caracterizado por la duplicación celular (iii) fase estacionaria: la tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos y (iv) fase de declive o muerte: las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren. 1.8. Resumen En esta practica se evaluará el crecimiento y comportamiento de una cepa de Escherichia coli en diferentes medios sintéticos de cultivo; para ello se utilizarán dos matrices; la primera: modificando la fuente de carbono, manteniendo constantes los demás compuestos y la segunda: variando la concentración de un sustrato. La medición del crecimiento se realizará por turbidimetría utilizando una curva patrón relacionando absorbancia y concentración de biomasa seca por ml de medio. 1.9. Materiales y equipos Los materiales y equipos utilizados en el desarrollo de esta practica se muestran en la tabla 2.

Tabla 2. Materiales y equipos utilizados en la practica: cinética de crecimiento microbiano. Materiales Cantidad a Reactivos 5g Sacarosa 5g Glucosa 5g Fructosa 5g Lactosa 5g Galactosa 5g Maltosa 5g Extracto de levadura 2g CaCl2. 2H2O 1g MgSO4.7H2O 1g FeSO4 . 7H2O 1g MnSO4 . H2O 1g H3PO4 al 85% 1g NaOH 3M 1g Hipoclorito de sodio NaClO, 500 p.p.m. 400 ml Material microbiológico Cepa de Escherichia coli

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Equipos Incubadora Autoclave Cronómetro Espectrofotómetro (λ : 600 nm) Baño termostatado o Shaker con agitación Balanza analítica Mechero bunsen Vortex

1 1 1 1 1 1 1 1

Material de vidrio Espátula Gradillas para tubos de ensayo Pipetas estériles (5 y 10 ml) Pipeteador Tubos de ensayo ( 10 ml) Elenmeyer (250 ml) Vaso de precipitado (250 ml)

1 1 2 de cada una 1 12 14 2

a: La cantidad de materiales esta destinada para un solo grupo; estableciéndose como grupo un total de cuatro alumnos.

Para esta práctica se prepararán los medios de cultivo mostrados en la tabla 3 y 4.

Tabla 3. Medios de cultivo utilizados para el crecimiento de E-coli. variando la fuente de carbono. Medio (g/l) Compuesto 1 2 3 4 5 6 7 Fuentes de carbón Sacarosa 40 ------Glucosa -40 -----Fructosa --40 ----Lactosa ---40 ---Maltosa ----40 --Galactosa -----40 -Fuente de nitrógeno Extracto de levadura 10 10 10 10 10 10 10 Micronutrientes CaCl2. 2H2O 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 MgSO4.7H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 FeSO4 . 7H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 MnSO4 . H2O 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 H3PO4 al 85%, (ml) 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 NaOH 3M a a a a a a a a: Ajustar el medio con NaOH 3M a pH 7.

Tabla 4. Medios de cultivo utilizados para el crecimiento de E-coli variando la concentración de sustrato. Medio (g/l) Compuesto 8 9 10 11 12 13 14 Fuentes de carbón Sacarosa 60 40 20 10 5 2,5 -Fuente de nitrógeno Extracto de levadura 10 10 10 10 10 10 10 Micronutrientes CaCl2. 2H2O 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 MgSO4.7H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 FeSO4 . 7H2O 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 MnSO4 . H2O 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 H3PO4 al 85%, (ml) 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 1,33 NaOH 3M a a a a a a a a: Ajustar el medio con NaOH 3M a pH 7

1.10. Procedimiento 1.10.1. Preparación de medios de cultivo Preparar 95 ml de cada medio de cultivo, en elenmeyer de 250 ml, según lo referido en las tablas 1 y 2, esterilizar en autoclave a 120 oC por 15 minutos.

1.10.2. Activación del microorganismo El inóculo se realiza en 100 ml de caldo nutritivo, para ello se inocula dos (o mas) colonias directamente de un cultivo en caja (agar nutritivo), luego se incuba a 37 °C por 24 horas. 1.10.3. Inoculación y cinética enzimática 1. Agitar y tomar en un tubo de ensayo, una alícuota de 2 ml en condiciones asépticas (utilizando un mechero) de cada medio de cultivo, el cual se utilizará como blanco, marcar como “B”. 2. Inocular en condiciones asépticas 5 ml del inóculo a cada medio de cultivo (medios del 1 al 14)6, agitar y tomar 2 ml de muestra en un tubo de ensayo marcado como tiempo cero “0”. Agitar el medio e incubar a 37 °C; tanto los tubos marcados como blanco (B), cero (0) y las demás muestras posteriores, deben ser almacenarlos rápidamente a 4 °C para evitar el crecimiento del microorganismo en los mismos. 3. Repetir la toma de muestra en tubos de ensayo (ítem 2) en los tiempos: 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 y 300 min, cada tubo debidamente marcado con su respectivo tiempo, almacenarlos en la gradilla a 4 °C hasta el final del crecimiento (minuto 300). 4. Luego de la última toma (al minuto 300), agitar y leer cada muestra en un espectrofotómetro a una longitud de onda de: 600 nm, utilizando como blanco el tubo marcado como B, para cada medio. Luego de su medición, las muestras deben ser desechadas en una solución de hipoclorito de sodio. Tabla 5. 5. Para visualizar la cinética, realizar una grafica relacionando absorbancia (eje Y) y tiempo (min) (eje X). 6. La relación entre la biomasa y la absorbancia se obtiene realizando una curva patrón. 1.10.4. Curva patrón 1. Marcar y secar a 80 oC por tres horas, doce tubos de ensayo de centrífuga, pesarlos en balanza analítica y anotar estos pesos como: “W1,.. W12 ”. 2. A cada tubo de centrifuga adicionarle 5 ml de solución salina (NaCl al 0.9% p/v) 3. Tomar en cada uno de los tubos de centrífuga marcados como W1 y W7, 15 ml de medio de cultivo procedente del inóculo, centrifugar a 7000 g7 por 5 minutos a 12 oC. desechar el sobrenadante en una solución de hipoclorito de sodio, teniendo cuidado de no eliminar el precipitado.

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Se puede dividir el grupo en dos partes, una de ellas trabajar con los cultivos de la tabla 3. Del 1 al 7 y el otro del 8 al 14 tabla 4. 7 Para convertir fuerza g en r.p.m.(revoluciones por minuto) se debe aplicar la siguiente formula: (r.p.m.)2 = (g/0,0000112xR) donde: r.p.m.: revoluciones por minuto. g: Fuerza expresada en “g”. R: Radio del rotor de la centrífuga expresada en cm.

4. En los mismos tubos de centrífuga, re suspender el precipitado en 10 ml de solución salina ayudándose con una micropipeta o con vortex. 5. Dividir los tubos de centrifuga en dos grupos, el primero los tubos marcados como: W1 al W6 y el segundo grupo (duplicado) del W7 al W12. 6. Con ayuda de una pipeta, pasar 5 ml de la suspensión celular W1 al W2, mezclando con un vortex para homogenizar la dilución. 7. Pasar 5 ml de la suspención celular del tubo W2 al W3 mezclando nuevamente con un vortex; realizar las diluciones sucesivamente hasta terminar en el tubo W6. 8. Realizar el mismo procedimiento (item 6 y 7) con el duplicado (tubos del W7 al W12). 9. A todos los tubos de ensayo exceptuando los tubos marcados como W6 y W12, medir la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm y asignarle el valor de absorbancia a cada tubo. Tabla 6. 10. Todos los tubos de ensayo exceptuando los tubos W6 y W12, centrifugarlos a 7000 g por 5 min, a 12 oC. 11. Desechar el sobrenadante de cada tubo en una solución de hipoclorito de sodio, teniendo cuidado de no eliminar el precipitado. 12. Secar a 80 oC todos los tubos hasta tener peso constante. Referenciar cada peso final con su respectivo tubo. 13. Realizar una gráfica relacionando Absorbancia (eje Y) con concentración de biomasa. Obtener la ecuación lineal correspondiente.

1.11. Toma de datos Los datos obtenidos en el transcurso de la práctica pueden ser relacionados en las tablas 5 y 6.

Tabla 5. Datos de crecimiento microbiano, valores de absorbancia relacionado con tiempo. Absorbancia (600 nm) Tiempo Medio de cultivo (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Tabla 6. Datos de absorbancia y pesos tomados en la practica para realizar la curva patrón de biomasa. Peso tubo Peso de Peso de Concentración Tubo de seco Absorbancia tubo seco biomasa de Biomasa centrífuga a con biomasa a 600 nm (g) (mg) (mg/ml) (g) W1 W2 W3 W4 W5 W7 W8 W9 W10 W11 a: Los tubos de centrífuga W6 y W12 no son tenidos en cuenta debido a que el volumen final en ellos es de 10 ml. Si se desea incluirlos en la tabla, se deben descartar 5 ml de la suspensión celular de cada tubo.

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PRACTICA 2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE) 2.1. Tipo de práctica Presencial 2.2. Temáticas de la práctica Herramientas analíticas para macromoléculas orgánicas, análisis de proteínas. 2.3. Intencionalidades formativas Objetivos: 2.3.1. Conocer el fundamento fisicoquímico de la electroforesis de proteínas y la importancia como herramienta analítica para la caracterización de estas macromoléculas. 2.3.2. Establecer el peso molecular de algunas proteínas y la metodología para lograrlo. 2.3.3. Comprender las diferencias conceptuales de las diversas electroforesis, su variación, utilidad y limitación. 2.4. Metas El estudiante entregará un informe de laboratorio, en el que presente los resultados de la práctica y la fundamentación teórica de la electroforesis de proteínas, su utilidad y limitantes y que a su vez respalden los resultados. 2.5. Competencias A partir de éste trabajo el estudiante fortalecerá sus competencias procedimentales, argumentativas y de escritura científica. 2.6. Fundamentación teórica La electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecilo sulfato (SDSPAGE) es un método económico, reproducible y rápido para cuantificar, comparar y caracterizar proteínas. Este método de separación de proteínas se basa en sus pesos moleculares (Laemmli, 1970). Las proteínas pueden ser desnaturalizadas por detergentes iónicos fuertemente positivos o negativos. El detergente aniónico sodio dodecilo sulfato (SDS). El SDS en la concentración adecuada se une a la mayoría de las proteínas en una relación peso/peso constante (1.4 g de SDS/ g proteína). La carga aportada por el SDS es proporcional al peso molecular de la proteína y todos los complejos SDSproteína tendrán la misma densidad de carga. Además, el SDS al unirse a las proteínas mediante interacciones hidrofóbicas, las desnaturaliza (elimina sus

estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria). Para lograr la completa desnaturalización de la muestra se debe incluir un agente reductor como el 2mercaptoetanol y un tratamiento térmico a ebullición durante unos minutos. Estos agentes reducen los puentes disulfuro de las proteínas. La electroforesis en condiciones no desnaturalizantes (Nativa-PAGE) una proteína en su estructura nativa tendrá una determinada relación carga – radio y migrará en un campo eléctrico a una velocidad proporcional a esa relación. Si el medio en que se realiza la electroforesis es un gel con tamaño de poro adecuado, se debe tener en cuenta la relación carga - radio y el efecto tamiz aportado por el gel. Las proteínas poseen una carga neta a valores de pH diferentes de su punto isoeléctrico (PI) en el cual la carga neta de la molécula es nula. La forma de la proteína dependerá de cómo se pliegue la cadena polipeptídica (estructuras secundaria y terciaria) y su tamaño molecular. Bajo condiciones experimentales (pH, fuerza iónica, características del gel, voltaje, temperatura, tiempo de corrida) se podrán separa moléculas con diferente relación carga - radio. Este tipo de electroforesis al no desnaturalizar la muestra, permite realizar ensayos biológicos posteriores a la separación, como la actividad enzimática sobre el gel (zimograma). La electroforesis Nativa – PAGE, separa proteinas de acuerdo a su tamaño molecular y propiedades de carga, mientras el tamaño de poro de acrilamida sirve como tamiz molecular. La coloración de coomassiee es el método más común de tinción de proteínas. El azul de Coomassiee es un colorante orgánico que en medio ácido se une a las proteínas mediante interacciones electroestáticas con los grupos amino. Luego de teñido y desteñido el gel, las proteínas se visualizan como bandas azules. La tinción es simple pero presenta baja sensibilidad, se puede detectar hasta 0.1-1.0 µg de proteína por banda. 2.7. Resumen En esta práctica se preparará y desarrollará el montaje y la corrida de una electroforesis de proteínas SDS – PAGE. Utilizando poliacrilamida al 7%, y βmercaptoetanol para determinar las subunidades de una proteína (invertasa) y un perfil electroforético del sobrenadante procedente de la fermentación de la cepa Escherichia coli del medio 4 (lactosa) practica 1. Utilizando un marcador de peso molecular se podrán determinar el peso molecular de las bandas problema. Igualmente se realizará un zimograma para la identificación de la enzima βgalactosidasa (EC 3.2.1.23) producida en la fermentación del medio 4 (lactosa) practica 1. 2.8. Materiales y equipos Para la realización de esta practica se requieren los equipos y reactivos mostrados en la tabla 7 y la preparación de las soluciones de trabajo mostradas en el item 2.8.1.

Tabla 7. Equipos y reactivos necesarios en la práctica electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) Equipo Cámara de electroforesis Bio-Rad Mini Preotean III Fuente de poder (capacidad 300 V, 400 mA) Beaker con agua para ebullición (92 ºC) Flotador para microtubos Centrífuga eppendorf Contenedores de plástico o de vidrio (12x16x3 cm) Tubos eppendorf Vortex Reactivos Acrilamida Bis-acrilamida (N.N´-metilenobisacrilamida) Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol) Sódio dodecilo sulfato (SDS) TEMED (N,N,N´,N´-tetrametileno-etilenodiamina) Persulfato de amonio (PSA) 2-mercaptoetanol Glicerol Azul de bromofenol Glicina Ácido Clorhídrico (HCl) Azul de Coomassie R-250 Metanol - CH3OH Ácido acético glacial - CH3COOH

2.8.1. Soluciones de trabajo Solución A. Solución Stock de Acrilamida (100 ml) Acrilamida 29.2 g Bis-acrilamida 0.8 g Adicionar agua destilada a 100 ml y agitar hasta disolver completamente. La solución de acrilamida debe ser cubierta con parafilm hasta que esté completamente disuelta. La solución puede ser almacenada por meses en la nevera. Precaución: La acrilamida es extremadamente tóxica, causa parálisis en el sistema nervioso central. Puede ser absorbida por la piel. Si la piel llega a estar en contacto con polvo de acrilamida o en solución, lavar con jabón y exceso de agua. Solución B. Buffer del gel separador 4X (100 ml) 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 18.2g de Tris en 40 ml de agua, adicionar HCl para ajustar el pH a 8.8 y completar con agua destilada a 100 ml. La solución es estable por varios meses en la nevera.

Solución C. Buffer del gel concentrador 4X (100 ml) 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 6.0 g de Tris en 40 ml de agua, adicionar HCl para ajustar el pH a 6.8 y completar con agua destilada a 100 ml. La solución es estable por varios meses en la nevera. Persulfato de amonio, PSA (10 %) 5 ml 0.5 g PSA, adicionar 5 ml de agua. La solución es estable por varios meses en la nevera. Buffer de electroforesis SDS-PAGE, 1 litro 3.0 g de Tris 25 mM 14.4 g de Glicina 192 mM 1 g de SDS 0.1 % Adicionar agua a 1 litro (el pH final debe ser 8.3) Buffer de electroforesis Nativa-PAGE, 1 litro 3.0 g de Tris 25 mM 14.4 g de Glicina 192 mM Adicionar agua a 1 litro (el pH final debe ser 8.8) Ambos buffer de electroforesis se puede preparar a una solución Stock 10X y son estables indefinidamente a temperatura ambiente. Soluciones Stock de teñido Solución de teñido, 1 litro 1. Azul de Coomassie R-250 2. Metanol 3. Agua 4. Ácido acético glacial

1g 450 ml 450 ml 100 ml

Solución de desteñido, 1litro 1. Metanol 2. Agua 3. Ácido acético glacial

100 ml 800 ml 100 ml

Solución de Conservación del gel, 50 ml 1. Agua 25 ml 2. Metanol 20 ml 3. Glicerol 5 ml

Tabla 8. Buffer de carga 5X de 1 ml, para electroforesis en condiciones reductoras y nativas. SDS-PAGE Nativa-PAGE Compuesto (µl) (µl) Buffer Tris-HCl (pH 6.8), 1M 60 310 Glicerol 50 % 500 500 SDS 10% 200 -----Azul de Bromofenol 1% 100 50 H2O destilada desionizada 90 140 2-mercaptoetanol 50 -----En la tabla 9 se establecen las cantidades necesarias de reactivos para preparar el gel separador y el concentrador de acuerdo al contenido de %T deseado. Tabla 9. Cantidad de reactivos necesarios para preparar geles separador y concentrador de acuerdo al % T deseado. Gel (%T) Compuesto Concentrador Separador H2O (µl) Solución A Poliacrilamida (µl) Solución B (Buffer 8.8) (µl) Solución C (Buffer 6.8) (µl) SDS (10%) (µl) PSA (10%) (µl) TEMED (µl) Vol. Final (ml)

5 875 250 ----375 15 5 3 1.5

7 2583 1167 1250 ----50 25 5 5

8 2400 1350 1250 ----50 60 8 5

9 2250 1500 1250 ----50 25 5 5

El volumen final (5 ml) se calculó para una cámara de electroforesis convencional con una separación entre sus vidrios de 0,7 mm y con dimensiones de 10 x 7 cm para el gel. En la electroforesis nativa-PAGE no se adiciona SDS (10%) al gel separador ni al gel concentrador porque la enzima de interés puede ser desnaturalizada. Las demás cantidades se mantienen igual. 2.9. Procedimiento Se deben usar guantes durante todo el proceso de electroforesis en gel de poliacrilamida. 1. Colocar el set de vidrios en el sistema de fijación para el moldeo, verificando que el fondo de ambos vidrios estén perfectamente asegurados a la espuma. Se debe colocar un nivelador para garantizar uniformidad en la polimerización del gel.

Figura 1. Soporte de vidrios con su separador para electroforesis. 2. Adicionar las soluciones A, B, SDS y agua en un vial de 10 ml para el gel separador. 3. Adicionar el persulfato de amonio y TEMED, mezclar suavemente el vial, ya que una excesiva aireación pude interferir con la polimerización. 4. Introducir la solución en el interior del set de vidrios usando una micropipeta permitiendo que esta descienda a lo largo del espaciador sin formar burbujas. Peine

1.5cm GEL SEPARADOR

5.5 cm GEL CONCENTRADOR

Figura 2. Forma del gel de electroforesis separador y concentrador. 5. Cuando una apropiada cantidad de la solución del gel separador ha sido adicionada (alrededor de 1.5 cm por debajo de la parte superior del vidrio ó 0.5 cm por debajo del nivel del peine) suavemente adicionar 1.5 ml de agua para mantener la superficie del gel plana. 6. Permita que el gel polimerice. Cuando el gel ha polimerizado, aparece una interfase entre el gel separador y el agua. El gel puede ser inclinado para verificar la polimerización. 7. Adicionar las soluciones A, C, SDS y agua en un vial de 5 ml para el gel concentrador.

8. Adicionar el persulfato de amonio y TEMED, mezclar suavemente el vial, ya que una excesiva aireación pude interferir con la polimerización. 9. Introducir la solución sobre el gel separador hasta llenar el espacio libre y colocar el respectivo peine de 10 pozos, asegurando de no atrapar burbujas en los dientes de peine. 10. Permita que el gel polimerice y remueva el peine con cuidado. 11. Retirar el gel del sistema de fijación y colocarlo en el interior de la cámara para ensamblarlo, asegurando las puertas en el compartimiento. 12. Colocar el interior de la cámara en su respectivo tanque. 13. Adicionar 400 ml de buffer de electroforesis en el interior y exterior de la cámara, permitiendo humedecer los pozos, los cuales deben ser purgados con una micropipeta de 1000 ml para evitar excesos o residuos de la polimerización. 14. Preparar las muestras en tubos eppendorf. Mezclar cada muestras de proteínas con el respectivo buffer de carga 5X (i.e 20 ml de muestra + 5 ml de buffer carga) para alcanzar una dilución (1:5) del buffer. El volumen de muestra puede ser de 5 a 20 ml. 15. En la electroforesis SDS-PAGE las muestras deben ser colocadas en baño a ebullición (92 ºC) por 3 min, para lograr una completa desnaturalización de las proteínas por la acción del agente reductor 2-mercaptoetanol. 16. Centrifugar por 30 seg las muestras para homogenizarlas. 17. En la electroforesis nativa-PAGE las muestras no se someten a un calentamiento, ya que las proteínas de interés pueden perder su actividad enzimática. 18. Introducidas cada una de las muestras en los respectivos pozos, teniendo cuidado de no introducir burbujas, ya que pueden contaminar los pozo vecinos. 19. Conectar correctamente los electrodos. La corriente debe fluir hacia el ánodo. 20. Prender la fuente de poder y colocarla a una intensidad constante de 30 mA. Registrar el voltaje inicial y el tiempo final de la electroforesis. Bajo estas condiciones de corrido, el tiempo de operación debe estar entre 45 – 50 min. 21. Verificar que el frente de corrida (azul de Bromofenol) comience a descender hacia el ánodo. 22. Detener la electroforesis cuando el frente de corrido alance la parte inferior del gel separador.

23. Apagar la fuente de poder y desconectar los electrodos para retirar el gel y continuar con el proceso de teñido. Teñido con azul de coomassie R-250 1. Utilizar guantes durante todo el procedimiento para evitar manchar el gel con los dedos. 2. Recoger el gel y colocarlo en un contenedor plástico o de vidrio. 3. Enjuagar el gel con agua destilada, 3 veces. 4. Adicionar una pequeña cantidad de la solución de teñido (20 ml es suficiente). 5. Agitar suavemente el gel por 10–15 min en un shaker. Cubrir el contenedor con vinipel durante el teñido y desteñido. 6. Enjuagar el gel con agua destilada, 3 veces. 7. Adicionar la solución de desteñido (cerca de 50 ml) hasta que las bandas aparezcan. 8. Para desteñir completamente el gel, cambiar la solución de desteñido y agitar toda la noche. 9. Sumergir el gel en la solución de conservación por 30-60 min. 10. Sumergir dos hojas (15x15 cm) de papel celofán en agua para hidratarlo y colocar el gel entre las dos hojas. Se puede utilizar un vidrio (14x12 cm) para fijar el celofán en sus extremos, los cuales deben ser sujetados con dos pinzas. 11. Finalmente se deja secar el gel a temperatura ambiente ó en una incubadora (37ºC) por 2 - 4 horas. Antes de retirar el gel verificar que esté completamente seca la superficie del gel. Luego cortarlo y almacenarlo.

PRACTICA 3. AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE ADN CROMOSOMAL BACTERIANO Y ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS8 2.1. Tipo de práctica Presencial 2.2. Temáticas de la práctica Herramientas analíticas para la extracción, purificación y análisis de macromoléculas orgánicas. 2.3. Intencionalidades formativas Objetivos: 2.3.1. Analizar las diferencias obtenidas por el método analítico entre ADN genómico, plasmídico y RNA. 2.3.2. Comprender y analizar la metodología establecida para la extracción y purificación de ácidos. 2.3.3. Conocer el fundamento fisicoquímico de la extracción de ácidos nucleicos, la electroforesis de estas macromoléculas y su importancia como herramienta analítica. 2.4. Metas El estudiante entregará un informe de laboratorio, en el que presente los resultados de la práctica y la fundamentación teórica, utilidad y limitantes de la extracción, purificación y electroforesis de ácidos nucleicos; todo análisis y resultado debe ser respaldado por bibliografía que sustente la afirmación. 2.5. Competencias A partir de éste trabajo el estudiante fortalecerá sus competencias procedimentales, argumentativas y de escritura científica. 2.6. Fundamentación teórica 2.7. Resumen En esta practica se desarrollará la metodología para la extracción y purificación de ácidos nucleicos del microrganismo Escherichia coli; este procedimiento se basa en el rompimiento químico celular (lisis), utilizando dodecilo sulfato de sodio (SDS) y su purificación parcial con alcohol isoamílico. La purificación se realizará por el método fenol – cloroformo en el cual se retirarán la mayoría de contaminantes (mayoritariamente proteína). La visualización y la determinación del peso molecular se lograrán realizando el montaje y corrida de una electroforesis en agarosa, utilizando un marcador de peso molecular. 8

El procedimiento esta basado en el protocolo universal de extracción de ácidos nucleicos.

Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: Paso uno (1): Lisis de las células: Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS se requiere a menudo para eliminar las membranas. Paso dos (2): Degradación de la fracción proteica asociada al ADN: Se consigue mediante la adición de una proteasa o su precipitación con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. Paso tres (3): Purificación: la cual consta de tres fases: Primera fase: Precipitación del ADN: el ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar en etanol frío o isopropanol y recuperarlo mediante una centrifugación. Segunda fase: Lavado del pellet: Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse. Tercera fase: Recuperación: El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa, posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz Ultravioleta a 480 nm. 2.8. Materiales y equipos Para la realización de esta practica se requieren los equipos y reactivos mostrados en la tabla 10 y la preparación de las soluciones de trabajo mostradas en el item 2.8.1. Tabla 10. Materiales y equipos utilizados en la práctica: Aislamiento y purificación de ADN cromosomal bacteriano y electroforesis de ácidos nucleicos. Materiales Cantidad a Reactivos Sódio dodecilo sulfato (SDS) al 10% 5 ml Solución salina EDTA (SSE) 100 ml Etanol 70% 10 ml Alcohol isoamílico (grado analítico, 99.5%) 5 ml Fenol saturado con Tris/HCl 5 ml Fenol-Cloroformo-Isoamílico (25:24:1) 5 ml Cloroformo – Isoamílico (24:1) 5 ml 9 Medio de cultivo: caldo LB (Luria Bertani) 100 ml Solución de NaCl al 4M 50 ml

9

Material microbiológico Cepa de Escherichia coli cultivo ONb

1

Equipos Incubadora Autoclave Centrifuga y microcentrifuga Espectrofotómetro (λ : 600 nm) Baño termostatado o Shaker con agitación

1 1 1 1 1

Ver anexo A: Preparación de soluciones.

Balanza analítica Mechero bunsen Vortex Baño de agua a 60 oC Micropipetas 200 µl y 1000 µl Puntas para micropipetas Material de vidrio Espátula Gradillas para tubos de ensayo Pipetas estériles (5 y 10 ml) Pipeteador Tubos de ensayo cónicos para centrifuga de 20 ml Tubos de ensayo ( 10 ml) Elenmeyer (250 ml) Capilares de vidrio Vaso de precipitado (250 ml)

1 1 1

1 1 2 de cada una 1 4 12 14 2

a: La cantidad de materiales esta destinada para un solo grupo; estableciéndose como grupo un total de cuatro alumnos. b: Cultivo ON: Se encuentre al final de la fase exponencial.

Procedimiento 1. Propagar un cultivo de E. coli en 50 ml de medio LB en un matraz de 250 ml, durante toda la noche (14 -16 h) a 37°C con agitación orbital constante (>150 rpm aproximadamente). 2.

Transfiera 15 ml de la suspensión de células a un tubo plástico de centrífuga (polipropileno) de 40 a 50 ml de capacidad con tapa rosca.

3. Centrifugar en refrigeración durante 5 min. a 6000 g. 4. Descartar el sobrenadante, resuspenda las células en 5 ml de solución SSE en frio agitando periodicamente. 5. Recolecte las células por centrifugación (refrigeración, 5 min. a 6000 g), descarte el sobrenadante y resuspenda homogeneamente en 1200 µl de solución SSE; subdivida en dos microtubos (polipropileno) de 1,5 ml. 6. Adicione a cada tubo 300 µl de solución SDS al 10%, mezcle suavemente en vortex e incube en un baño en agua a 60 oC durante 10 min. o hasta que se observe un cambio significativo de la viscosidad; deje enfriar a temperatura ambiente. 7. Mientras se enfría la suspensión de células lisadas, prepare un capilar para colectar el ADN. Con ayuda del mechero bunsen y pinzas metálicas, cierre uno de los extremos del capilar y doble la punta tratando de hacer pequeño el triangulo.

8. Adicione 0.54 volúmenes de isopropanol, así: Localice la punta, uno o dos milímetros por encima del nivel lisado y deposite el liquido lentamente para formar una sobrecapa. 9. Localice la punta doblada del capilar en la interfase, gire el capilar en remolinos hacia abajo y recoja el precipitado que se va formando a medida que se mezclan las dos fases. Este paso deberá hacerse rápidamente para evitar que se precipite ARN ( 10 segundos de mezclado es suficiente). 10. Drene el exceso del liquido, presionando la punta del capilar en la pared interna del tubo. Traslade cada capilar a un tubo microcentrífuga de 2 ml que contiene 200 µl de etanol al 70%. Enjuague durante 5 minutos. 11. Traslade el ADN, previamente drenado, a un tubo con 100 µl de etanol absoluto. Después de un minuto de enjuague, retire el capilar, drene el exceso de liquido. Localice el capilar en un tubo desocupado de 2 ml. Deje secar el ADN a temperatura ambiente durante por lo menos 5 minutos. Este ADN es llamado ADN crudo. 12. Disuelva el ADN en 700 µl de buffer TE con muy suave agitación. 13. (Si se desea obtener ADN cromosomal altamente polimerizado es mejor permitir que el ADN se disperse libremente, incubando durante varias horas a 4 °C). 14. Adicione 20 µl de NaCl 4M para ajustar la fuerza iónica, antes de extraer con fenol y solventes orgánicos. Purificación de ADN (Extracción fenólica) 15. A los 700 µl de ADN disuelto en TE, adicione igual volumen de fenol saturado, mezcle invirtiendo el tubo suavemente (evitando el fraccionamiento excesivo del ADN) varias veces durante 5 minutos. 16. Centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g (10000 r.p.m aprox) para separar las fases. 17. Transfiera el mayor volumen posible de la fase superior acuosa a un nuevo tubo, evitando transferir material de la interfase. 18. Adicione a la fase acuosa 500 µl de una mezcla: fenol-cloroformo-isoamílico; mezcle invirtiendo el tubo suavemente varias veces durante 5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g para separar las fases. 19. Transfiera la fase acuosa a un nuevo microtubo de ensayo y adicione 500 µl de una mezcla cloroformo-isoamílico, mezcle invirtiendo el tubo suavemente varias veces durante 5 minutos; centrifugue a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16800 g para separar las fases. 20. Transfiera la fase superior a un nuevo microtubo de ensayo.

Concentración del ADN por precipitación 21. Adicione 600 µl de etanol absoluto frio (utilice etanol almacenado a -10 oC evitando la hidratación de este producto). 22. Mezcle invirtiendo el tubo dos o tres veces e incube en hielo durante 10 minutos. 23. Centrifugue a 23500 g (14000 aprox.) durante 15 minutos en refrigeración. 24. Elimine con cuidado el sobrenadante evitando desprender el pellet de ADN. 25. Invierta el tubo sobre un papel absorbente para retirar el exceso de alcohol, deje invertido para que se evapore los residuos de etanol. 26. Disuelva el ADN en 500 µl de buffer TE y prepare diluciones para evaluación electroforética y espectrofotométrica. Conserve la solución en refrigeración. Recuerde marcar el tubo apropiadamente. Medición de la concentración de DNA por espectrofotómetria 27. Diluir un alícuota 1:20 (15µL en 285µL de agua destilada desionizada), y leer a una longitud de onda de 260 nm. (λ= 260nm.) 28. La absorbancia a 260 nm es igual a la concentración de DNA en gr/L

PRACTICA 4. CINETICA ENZIMÁTICA 2.1. Tipo de práctica Presencial 2.2. Temáticas de la práctica Unidad de actividad enzimática; caracterización de enzimas; inhibición de enzimas; parámetros cinéticos (Vmax, Km entre otros) 2.3. Intencionalidades formativas Objetivos: Influir 2.3.1. Comprender y analizar la metodología establecida para la determinación de la actividad enzimática de la glucosa oxidasa. 2.3.2. Analizar la relación entre la concentración de sustrato y su influencia en la actividad enzimática. 2.3.3. Conocer el procedimiento experimental para la obtención de los parámetros cinéticos de la glucosa oxidasa. 2.3.4. Determinar el tipo de inhibición enzimática presentada y su fundamento bioquímico según los modelos matemáticos establecidos. . 2.4. Metas El estudiante entregará un informe de laboratorio, en el que presente los resultados de la práctica y la fundamentación teórica, utilidad y limitantes de la determinación de los parámetros cinéticos enzimáticos. Todo análisis y resultado debe ser respaldado por bibliografía que sustente la afirmación. 2.5. Competencias A partir de éste trabajo el estudiante fortalecerá sus competencias procedimentales , argumentativas y de escritura científica. 2.6. Fundamentación teórica La enzima glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4) es una enzima oxidoreductasa la cual cataliza la oxidación de la β-D-glucosa (C6H12O6) en ácido Glucónico (C6H12O7) y peróxido de hidrógeno (H2O2) en presencia de agua (H2O) y oxigeno (O2). Entre las aplicaciones específicas en la industria de alimentos, esta enzima se utiliza en la industria vinícola, para prevenir el oscurecimiento de los vinos durante su almacenamiento, para remover glucosa de la clara de huevo (Kamalrookh et al., 1994), para eliminar el oxígeno disuelto de aderezo para ensaladas (Mistry & Min, 1992), estudiar la susceptibilidad oxidativa de la mayonesa (Isaksen & AdlerNissen, 1997), como aditivo para mantener la estabilidad del concentrado del aroma del mango (Ramteke & Eipeson, 1997) y para evitar el oscurecimiento de puré de manzanas entre otros. En cuanto al fundamento del método enzimático de la glucosa oxidasa peroxidasa (GOD-POD) la glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD ) a

ácido glucónico y agua oxigenada (H2O2). El agua oxigenada en presencia de la enzima peroxidasa (POD) produce el acoplamiento oxidativo del fenol con la 4aminofenazona dando lugar a la formación de un cromógeno 4-p-benzoquinonamonoimino fenazona, de color rojo-cereza. 2.7.Resumen El presente reporte está elaborado en miras a focalizar y entender la aplicación del método experimental referente a la verificación de mediciones haciendo uso del modelo de Michaelis-Menten para una reacción química a través del estudio de la catálisis enzimática para la enzima “glucosa oxidasa”. Se realiza la cinética enzimática variando la concentración de sustrato (glucosa), manteniendo la concentración de enzima constante, la variación en la producción de ácido glucónico es medida por el cambio de la coloración directamente en el espectrofotómetro a una longitud de 510 nm. 2.8.Materiales y equipos Para la realización de esta practica se requieren los equipos y reactivos mostrados en la tabla 11. Tabla 11. Materiales y equipos utilizados en la práctica: Cinética Enzimática. Materiales Cantidad a Reactivos Reactivo para la determinación de glucosa (GOD POD) 1 Glucosa 1g Agua destilada 1000 ml Equipos Espectrofotómetro (λ : 510 nm) Balanza analítica Micropipetas 200 µl y 1000 µl Puntas para micropipetas Material de vidrio Espátula Gradillas para tubos de ensayo Pipetas (5 y 10 ml) Pipeteador Balón aforado 25 ml Tubos de ensayo ( 10 ml) Vaso de precipitado (50 ml)

1 1 1 de cada una

1 1 2 de cada una 1 1 12 2

2.9.Procedimiento 2.9.1. Con la ayuda de un balón aforado, preparar 10 ml de una solución de glucosa a una concentración de: 8.8 mg/ml. Pasar a un tubo de ensayo y marcar como: Tubo 1.

2.9.2. En una gradilla ubicar seis (6) tubos de ensayo con cinco (5) ml de agua destilada cada uno; marcarlos como: tubo 2, tubo 3, tubo 4, tubo 5, tubo 6 y tubo 7. 2.9.3. Realizar diluciones sucesivas así: tomar 5 ml de la solución de glucosa del tubo 1 y adicionarlo al tubo 2; agitar y mezclar con la ayuda de un vortex. De los diez mililitros del tubo 2, tomar cinco (5) ml y adicionarlo al tubo tres (3), agitar y mezclar con ayuda de un vortex; esta acción se repite hasta el tubo 7. Este procedimiento es ilustrado en la figura 1. 2.9.4. Las concentraciones esperadas se muestran en la tabla 12. 2.9.5. En la celda de espectrofotómetro adicionar 1 ml de solución del reactivo de GOD POD; Introducir la celda en el equipo, y programar este a una longitud de onda de 510 nm.

Figura 1. Diluciones sucesivas para obtener diferentes concentraciones de sustrato. 2.9.6. En la celda de espectrofotómetro con el reactivo adicionar 0.1 ml del sustrato correspondiente al tubo uno (1), agitar rápidamente con ayuda de la micropipeta e inmediatamente llevar a cero la absorbancia (digitar blanco); e igualmente iniciar conteo del tiempo con ayuda de un cronómetro. Ir tomando datos de la variación de la absorbancia en el tiempo.10 2.9.7. Repetir los numerales 2.9.5 y 2.9.6 con cada uno de los sustratos (Tubos de ensayo del 2 al 7). 2.9.8. Los resultados anotarlos en la tabla 13.

10

Este procedimiento es realizable con tres (3) personas de la siguiente forma: a. Primera persona: encargada de manejar el espectrofotómetro y dictar el valor de la absorbancia. b. Segunda persona: Encargada de cuantificar el tiempo, cuyo valor depende del momento en que la primera persona dicte la absorbancia. c: tercera persona: Es la encargada de anotar los valores de la primera y segunda persona.

Tabla 12. Concentraciones esperadas en la dilución del sustrato para la práctica Cinética enzimática. Concentración Tubo Dilución (mg/ml) 1 (1:0) 8,800 2 (1:1) 4,400 3 (1:3) 2,200 4 (1:7) 1,100 5 (1:15) 0,550 6 (1:31) 0,275 7 (1:63) 0,137

2.10. Toma de datos. 2.10.1. Los datos obtenidos en el transcurso de la práctica pueden ser relacionados en la tabla 13. Tabla 13. Toma de datos practica cinética enzimática Tubo: uno (1) Tubo: dos (2) Tubo: tres (3) Tubo: cuatro (4) Tiempo Absorbancia Tiempo Absorbancia Tiempo Absorbancia Tiempo Absorbancia (Seg) (510 nm) (Seg) (510 nm) (Seg) (510 nm) (Seg) (510 nm)

Tubo: cinco (5) Tubo: seis (6) Tubo: siete (7) Tiempo Absorbancia Tiempo Absorbancia Tiempo Absorbancia (Seg) (510 nm) (Seg) (510 nm) (Seg) (510 nm)

Graficar concentración de glucosa transformada a ácido glucónico con respecto al tiempo. La concentración de glucosa transformada a ácido glucónico se puede determinar mediante la siguiente relación: 0,320 Absorbancia equivale a 0,1 mg/ml de glucosa. Con lo anterior determinar la actividad enzimática de cada concentración (en total son siete 7 actividades) Una unidad de actividad enzimática (U) se puede establecer como: cantidad de enzima necesaria para transformar un (1) mg de glucosa a ácido glucónico por minuto. Realizar una gráfica de actividad enzimática con concentración de sustrato y determinar la Vmax y Km de la enzima Glucosa oxidasa. Productos a entregar Los estudiantes deberán entregar un informe de laboratorio con los siguientes acápites: 1. Información básica de todos los integrantes del grupo, los cuales deben aparecer en la portada con: su nombre completo, código, grupo virtual y cead al cual pertenecen, nombre del tutor virtual con su correo electrónico. 2. Introducción: Breve resumen sobre el tema de la práctica, la importancia en el desarrollo de la misma, una descripción.

3. Justificación: Describa brevemente la importancia de la medición del crecimiento microbiano en los bioprocesos y algunas operaciones productivas en la industria alimentaria. 4. Revisión Bibliográfica: Realice un marco conceptual y teórico sobre el crecimiento microbiano, los modelos matemáticos y los diferentes procedimientos que se utilizan para describir el mismo. 5. Metodología: Realice un diagrama de flujo sobre los procedimientos que utilizó para desarrollar la práctica, puede utilizar esquemas ó fotografías. 6. Resultados y análisis de resultados: Cuantifique los resultados y preséntelos en tablas y gráficas, para ello puede utilizar Exel ó presentarlo en papel milimetrado, argumente y explique con bases científicas las razones de los resultados 7. Conclusiones: Redacte los apartes más importantes del desarrollo del tema, los resultados y el análisis de resultados. 8. Bibliografía. Realice una lista de las fuentes consultadas, teniendo en cuenta las normas APA

1.13. Retroalimentación Los estudiantes tendrán doce (12) días hábiles para entregar el informe de laboratorio al tutor a través de correo electrónico ó impreso, y a partir de esta fecha el tutor tendrá ocho (8) días hábiles para la entrega de la evaluación y calificación la cual será enviada al director de curso por correo electrónico.

Bibliografía Kamalrookh Z & D ́Souza S (1994) Removal of glucose from hen egg using glucose oxidase and catalase co-immobilized in hen egg white foam matrix. J. Food Sci. Technol. 31(2): 153-155. Mistry B & Min DB (1992) Redution of disolved oxygen in model salad dressing by glucose oxidase-catalase dependent on pH and temperature. J. Food Sci. 57(1): 196-199. Isaksen A & Adler-Nissen J (1997) Antioxidative Eeffect of glucose oxidase and catalase in mayonnaises of different oxidative susceptibility. II. mathematical modelling. Lebensm. Wiss. Technol. 30 (8): 847-852 Ramteke R & Eipeson W (1997) Effect of additives on the stability of mango aroma concentrate during storage. J. Food Sci Technol. 34(3): 195-199.

Ítem Evaluado

Estructura del informe

Redacción y ortografía

Rúbrica de evaluación Valoración Valoración Valoración Baja Media Alta Aunque los documentos El estudiante no Los documentos entregados tuvo en cuenta presentan una presentan una las normas excelente estructura base, la básicas para la estructura con los misma carece de construcción requerimientos algunos elementos del trabajo solicitados del cuerpo (Puntos = 0) (Puntos = 6 -10) Solicitado. (Puntos = 1 - 5) Los documentos presentan deficiencias en redacción y errores ortográficos. (Puntos = 0)

Fines del trabajo

No se desarrolla el objetivo de los laboratorios y el informe presentado carece de coherencia científica. (Puntos = 0)

Análisis de resultados

Conclusiones

No existe en el informe análisis con criterio científico basado en la bibliografía, ni hay relación coherente con los resultados. (Puntos = 0) Las

No hay errores de ortografía y Los documentos presentan una mediana articulación de las ideas y la estructura de los párrafos (Puntos = 1 - 5)

La redacción es excelente, las ideas están correlacionadas, y el cuerpo del texto es coherente en su totalidad.

10

10

(Puntos = 6 -10)

El informe de laboratorio desarrolla el objetivo del mismo; se evidencia coherencia científica entre los diferentes acápites del informe. (Puntos =11 - 20) Existe un criterio Los análisis científico en los poseen un criterio análisis, pero estos científico y estos no se relacionan son producto de forma directa directo de los con los resultados resultados de la practica. obtenidos en el laboratorio. (Puntos = 1-15) (Puntos = 16-30) El informe de laboratorio desarrolla el objetivo del mismo; sin embargo en algunos a partes no se evidencia coherencia científica. (Puntos = 1 -10)

Las conclusiones

Máximo Puntaje

Las conclusiones

20

30

20

conclusiones son simplistas y no son producto directo de la realización y resultados de las practicas. (Puntos = 0)

Referencias

son acertadas pero estas no son producto directo de la realización y resultados de las practicas (Puntos = 1-10)

son acertadas y a su vez son el producto de lo realizado directamente en el labor. (Puntos = 11-20)

Presenta Presenta No presenta referencias referencias referencias bibliográficas bibliográficas bibliográficas o además cumplen confiables y estas son muy con la se encuentran escasas, además normatividad APA acorde con la estas no son pero muchas de temática tratada , citadas en el estas no se son citadas dentro cuerpo del encuentran acorde del documento, informe y no se con la temática las referencias encuentran tratada , y no son bibliográficas acorde con las citadas en el cumplen con la temáticas del cuerpo del normatividad informe informe APA (Puntos = 0) (Puntos = 1- 5) (Puntos= 6 –10) Total de puntos posibles

10

100