Herramientas básicas de clonación molecular Estirpes de Escherichia coli para propagar el DNA Plasmidos como vectores de clonación Métodos de transformación de bacteria Bacteriófagos para clonación

Estirpes de Escherichia coli para propagar el DNA

E. coli K12 Bacteria Gram-negativa con flagelos Habitat natural: intestino Membrana interna y externa Cromosoma circular con un unico origen de replicación Se replica cada 20 minutos en condiciones aeróbicas Pueden ser congeladas en glicerol

Crecen bien en condiciones de laboratorio No son patógenas Se conoce bien su genética y su bioquímica No vive fuera de condiciones de laboratorio

El operon lac de E. coli consiste en un promotor, un operador (o), un lugar de unión de la proteína activadora de catabolito CAP (c), 3 genes estructurales en un mRNA policistronico (lacZ, lac Y, lac A) y un gen estructural que produce la proteína represora Lac

Sistema de inducción de la expresión por IPTG usando componentes del operon lac.

Se requiere que la cepa de E. coli contenga la mutación de sobreexpresión en el receptor lacIq

La actividad ß-galactosidasa como indicador de la función génica Los plasmidos que expresan el Nterminal de la enzima pueden ser usados en cepas de E. coli que expresan el Cterminal del enzima en el plasmido F’.

Varios tipos de sistemas de modificación y restricción deben ser eliminados de las cepas de E. coli K12 para que puedan ser usadas en clonación. (a) DNA no metilado se degrada por la nucleasa hsdR y por tanto para clonar DNA no metilado debe emplearse estirpes hsrR–. (b) DNA metilado en posiciones distintas del de E.coli se degrada por las proteínas mdrA/mcrB por tanto para clonar DNA de mamifero y plantas deben emplearse estirpes con mutaciones en mdrA/mcrB.

PLÁSMIDOS: los modelos pBR322 y pUC18

pBluescript SK+

Bacteriofago λ Infección por fagos es muy eficiente en comparación con métodos químicos de transformación

Ciclo del fago λ Lisogenia vs. Lisis

Infección por fago λ

Lisogenia vs. Lisis

El gen cI inhibe la transcripción de los genes tempranos de la ruta lítica: genes estructurales de cabeza, cola y de lisis de pared bacteriana

Genoma del fago λ: 48502 pb (18 kpb necesarios para lisis)

Genoteca en fago λ

Genoteca en fago λ: Sitios cos

Capacidad: empaqueta entre 38 y 52 kb (clona hasta 25 kb de DNA)

Genoteca en fago λ : Ensayo de formación de placas de lisis

Screening de genoteca en fago lambda

Fagemidos y fagos auxiliares para producción de cadenas sencillas de DNA

λ ZAP: clonación de cDNA Contiene elementos reguladores eucarioticos (promotores y poliadenilación) que permiten expresión en células eucarióticas y selección de la integración estable de DNA

Rescate de fagémidos

Infección secuencial con 2 cepas diferentes de E.coli que permite o restringe la producción de fagos y que resulta en el rescate de colonias resistentes a kan (con el fagemido)

Expresión heteróloga en E.coli con el vector pET

Producción de anticuerpos utilizando proteína recombinante

Screening por anticuerpos

Screening por oligonucleótidos degenerados

Hibridación substractiva

Utilización de clones de cDNA como sonda: Para detectar expresión diferencial de genes (“nuclear run-on”): marcaje in vivo e hibridación

Sistema de dos híbridos en levaduras 3 elementos para detectar interacciones entre dos proteínas: - Proteína de fusión GAL4-DBD con proteina “cebo” - Genoteca de cDNA con insertos de fusión en el gen GAL4-AD. - Gen indicador seleccionable activable por el complejo GAL4-DBD-AD

Protocolos de transfección transitoria Optimización de la eficiencia para cada tipo celular y para construcción.

Control de la expresión en lineas celulares de mamíferos El receptor de la tetraciclina puede ser utilizado para dos sistemas: apagado y activado. La presencia o ausencia de doxiciclina inhibe o activa la expresión VP es un dominio de activación de la transcripción Mutaciones en rTetR evitan la unión a DNA en ausencia de Tet.

Expresión de proteínas de fusión en E. coli (e.g. Thiofusión) Expresión es inducida por la derepresión del gen λcI mediada por triptofano. En E.coli las proteínas de fusión con actividad tioredoxina se localizan en las proximidades de la membrana: por shock osmotico pueden liberarse al medio (purificación). Mediante una proteasa (enteroquinasa) puede eliminarse la zona de la tioredoxina dentro de una columna de afinidad.

Expresión de proteínas con modificaciones posttraduccionales (Baculovirus y células eucariotas) Fosforilación, glicosilación y procesamiento proteolítico no sucede en E.coli. Vectores de expresión de baculovirus se producen in vivo seleccionado eventos de recombinación específicos (complementación de lacZ) Ventajas: - Proteinas activas y solubles - Genoma viral acomoda tamaños grandes (hasta 15kb) - Acoplamiento de heterodimeros -Virus de hospedador restringido - Altas producciones de proteína

Genes indicadores permiten mapear in vivo secuencias reguladoras. Fragmentos genomicos amplios pueden delimitarse por su funcíon reguladora de la expresión. Mutagénesis de deleción secuencial permite ir identificando zonas necesarias para la expresión del gen indicador (luciferasa). El análisis de los datos permite la localización de diferentes elementos (potenciadores, promotores, etc…)

Las secuencias reguladores de unión a DNA pueden ser identificadas mediante analisis por protección (footprinting) Proteínas que se unen con alta afinidad a DNA se pueden incubar con fragmentos de DNA reguladores y la secuencia de DNA que une la proteína es identificada. (a) En una primera aproximación se puede observar la presencia de diferentes tamaños en una digestión limitada con Dnase I (b) En una segunda aproximación se puede identificar con precisión la secuencia de unión.

Genes indicadores permiten identificar regiones reguladoras específicas de tipos celulares. CAT: gen de cloranfenicol acetil transferasa. 3 tipos de plasmidos permitiran saber si la zona clonada de un gen codifica un promotor especifico de un tipo celular. La actividad de CAT se mide mediante CCF con cloranfenicol marcado. El fragmento clonado dirige selectivamente la transcripción en el tipo B

MUTACIÓN Cambio en la secuencia de DNA Detección

Efecto fenotípico: disfunción clínica en individuos, familias y/o poblaciones

Disfunción MOLECULAR TERAPIA

Detección de mutaciones en fragmentos de PCR SSCP: “single strand conformation polymorphism” Mutaciones en DNA genomico pueden ser identificadas mediante desnaturalización de fragmentos de PCR y analisis de su movilidad en geles de electroforesis.

Clonación de fragmentos de PCR Los productos de PCR pueden ser clonados de diferentes formas dependiendo de la secuencia terminal del fragmento. El sistema de elección depende del uso posterior del clon.

Mutagenesis por PCR La mutagenesis dirigida es muy frecuentemente necesaria para crear fusion de fragmentos, imitar mutaciones naturales, y elaborar construcciones recombinantes. El solapamiento de segmentos puede servir de puente para una segunda amplificación por PCR. El resultado es un nuevo fragmento con las dianas de restriccion necesarias para la clonación