Seminarios en español 2012   

Implementando el conteo de granulocitos inmaduros (IG) en el analizador XE‐ 5000 de Sysmex   

Diapositiva 1: La siguiente presentación se titula “Implementando el conteo de granulocitos inmaduros  (IG) en el analizador XE‐5000 de Sysmex”.   Es una versión traducida al español de la presentación hecha por Linda M. Sandhaus quien es médico  especialista,  directora  del  laboratorio  de  hematología,  profesora  asociada  de  patología  y  directora  de  análisis en puntos de cuidado del paciente para el University Hospitals Case Clinical Center en el estado  de Ohio, Estados Unidos.     Diapositiva 2: Quiero aclarar que he recibido honorarios de parte de Sysmex para dar esta presentación  el día de hoy. También los recibo por impartir algunos cursos de educación para la Sociedad Americana  de Patología Clínica.     Diapositiva 3: Hoy compartiré con ustedes nuestra experiencia en el University Hospitals de Cleveland  con  la  implementación  del  conteo  de  granulocitos  inmaduros  en  el  XE‐5000  utilizado  en  nuestro  laboratorio.  Los objetivos de aprendizaje son:     - Discutir cuál es el significado clínico del conteo de granulocitos inmaduros y revisar el concepto  de desviación a la izquierda   - Comparar  el  método  manual  con  el  método  automatizado  para  el  conteo  de  granulocitos  inmaduros en sangre periférica   - Hablar sobre las diferentes formas en  que podemos obtener los rangos de referencia  para los  granulocitos inmaduros  - Darles algunas opciones e ideas para la implementación de granulocitos en su propio laboratorio     Diapositiva  4:  Los  granulocitos  inmaduros  son  una  nueva  categoría  de  leucocitos  para  el  conteo  diferencial  automatizado  e  incluyen  los  estadios  de  promielocito,  mielocito  y  metamielocito.    Los  neutrófilos  en  banda  no  están  incluidos  en  el  conteo  de  IG  pero  están  incluidos  en  el  conteo  automatizado  de  neutrófilos.  Cuando  usted  introduzca  el  conteo  de  granulocitos  inmaduros  en  su  laboratorio, será importante recordar a los médicos esta diferencia.     Diapositiva 5: ¿Cuál es la definición de desviación a la izquierda? Esta es una pregunta interesante.  ¿Cómo  define  usted  desviación  a  la  izquierda  en  su  laboratorio?  ¿Está  basado  en  el  porcentaje  de  bandas  en  sangre  periférica?  ¿Está  basado  en  el  conteo  absoluto  de  bandas?  ¿Usa  usted  alguna  definición que incluye la presencia de otros granulocitos inmaduros como metamielocitos, mielocitos o  promielocitos?   Los neonatólogos a menudo usan una proporción entre los granulocitos inmaduros y el conteo total de  granulocitos; es una práctica exclusiva entre ellos.   La verdad es que no existe una definición concreta para desviación a la izquierda.     Diapositiva 6: ¿Cuál es el significado clínico de la desviación a la izquierda? En neonatos puede ser un  hallazgo normal pero en otros pacientes puede ser un signo importante de infección o de otro proceso  inflamatorio;  puede  ser  también  un  signo  de  recuperación  medular,  por  ejemplo,  después  de  1   

 Seminarios en español 2012    quimioterapia  cuando  la  medula  ósea  está  en  recuperación  liberando  células  inmaduras  a  la  sangre  periférica.  De igual manera, puede ser un indicador importante de enfermedad de la médula ósea en  procesos tales como un desorden mieloproliferativo o una leucemia como la mieloide crónica.   Una  desviación  a  la  izquierda  también  puede  indicar  la  presencia  de  un  carcinoma  metastásico  en  la  médula ósea, una situación donde las células inmaduras migran a la sangre periférica.   Una  desviación  a  la  izquierda  también  puede  ser  iatrogénica;  esto  significa  que  es  causada  por  un  tratamiento.  Por  ejemplo,  los  médicos  pueden  tratar  un  paciente  con  factores  de  crecimiento  para  estimular la función de la médula ósea y esto también puede provocar o inducir la presencia de células  inmaduras en sangre periférica. Pueden haber múltiples causas para la desviación a la izquierda.     Diapositiva 7: Quizás algunos de ustedes estén familiarizados con esta tabla que representa el 95% de  intervalo de confianza para el conteo diferencial en frotis de una muestra de sangre.   En la primera columna muestra cuál es el valor verdadero y en las columnas siguientes puede verse el  número de células que son contadas en el diferencial manual.   Entonces, por ejemplo, si el valor verdadero es de un 10% de bandas en sangre periférica y usted cuenta  100  células  en  el  diferencial  manual,  cualquier  valor  entre  5  y  16  %  será  correcto;  esto  significa  que  estará dentro del 95% de intervalo de confianza para un valor verdadero de 10.  Si usted cuenta 200 células reducirá ese intervalo de confianza; en este caso cualquier valor entre 6 y  14.5 será un valor correcto y usted podría llegar a cualquiera de estos números solo por coincidencia.  Una persona puede contar 6 células y otra 14 y ambas estarán correctas.   Como  pueden  ver  hay  más  valores  hacia  la  derecha.  En  la  medida  que  se  cuenten  más  células  el  intervalo de confianza será más estrecho.   Lo que esta tabla nos ilustra es la falta de posición que tenemos cuando hacemos un diferencial manual  contando 100 células, lo que usualmente se hace. El manejo de equipos automatizados permite realizar  el conteo de miles de células por lo que podemos mejorar la precisión.     Diapositiva 8: Esta fotografía nos muestra un ejemplo de un linfocito en el centro de la imagen y dos  granulocitos; podría haber un debate sobre si son bandas o no.  Este es un ejemplo de por qué nosotros  tenemos dificultad en la clasificación de células aún cuando vienen del mismo diferencial de leucocitos  en el diferencial manual.    Diapositiva 9: Este es un caso real de nuestro hospital.  Un niño de 2 años que fue recibido en la sala de  emergencias con fiebre.  Su conteo de leucocitos fue 41 x 109/L y un conteo absoluto de neutrófilos de  casi 35 mil. Este es el resultado del frotis de sangre en el que el conteo de bandas fue cuestionado por el  pediatra.  Pensé  que  era  una  buena  oportunidad  para  ver  cuál  era  la  variación  en  nuestro  laboratorio  para  el  conteo de bandas así que pasé ese frotis a varios tecnólogos sin explicarles nada acerca del caso.   Pueden  ver  en  la  columna  de  la  derecha  la  variabilidad  que  obtuvimos  en  el  conteo  de  bandas  en  un  mismo frotis de sangre. Resalté en color los dos datos aberrantes. El conteo más bajo fue 2% y el más  alto  fue  30%.    Si  elimino  esos  dos,  pueden  ver  que  el  rango  de  bandas  estuvo  entre  9  y  16%;  exactamente lo que se predice con la tabla estadística de Rümke.    Diapositiva  10:  Lo  que  quiero  mostrarles  aquí  es  que  las  limitaciones  del  diferencial  manual  son  causadas  por  falta  de  exactitud  debido  a  que  los  criterios  para  la  identificación  de  células  son  muy  subjetivos  y  porque  tenemos  diferentes  niveles  de  habilidad  entre  tecnólogos.  También  podemos  encontrar inconsistencias en la calidad de la tinción de los frotis que ocasiona errores en la clasificación  2   

 Seminarios en español 2012    de las células. Además, como lo había mencionado, tenemos el problema de la pobre precisión debida al  bajo número de células que se cuentan.     Diapositiva 11: Aunque la detección de la desviación a la izquierda puede ser clínicamente importante,   no  hay  una  definición  aceptada  globalmente  para  desviación  a  la  izquierda  y  el  conteo  diferencial  manual de 100 células no es una medición precisa ni exacta de la misma. Por lo tanto, un indicador más  confiable de una desviación a la izquierda clínicamente significativo sería muy beneficioso.     Diapositiva 12: Esta diapositiva muestra el dispersograma generado por los analizadores de la Serie X.   Los analizadores usan citometría de flujo fluorescente para clasificar leucocitos basados en dispersión de  luz  y  tinción  fluorescente.    Los  grupos  de  colores  que  se  observan  corresponden  a  las  poblaciones  celulares  que  están  presentes.    En  esta  figura  pueden  observar  el  óvalo  marcado  como  IG  donde  aparecerán los granulocitos inmaduros de estar presentes en la muestra.     Diapositiva  13:  Los  granulocitos  inmaduros  también  pueden  identificarse  por  inmunofenotipificación  con  citometría  de  flujo.    La  inmunofenotipificación,  además  de  usar  dispersión  de  luz  y  tinción  fluorescente  del  núcleo  para  identificar  las  células,  utiliza  anticuerpos  que  están  dirigidos  contra  antígenos  de  superficie  para  clasificarlas  basándose  en  estos  marcadores  inmunológicos.    Los  marcadores  que  pueden  emplearse  para  identificar  granulocitos  inmaduros  incluyen:  CD45  (llamado  antígeno leucocitario común), CD11b y CD16.  No es importante saber en realidad qué es lo que este analizador está tiñendo pero sí que tiñe antígenos  presentes en la superficie de los granulocitos en desarrollo.  Ellos muestran incremento de la expresión  a medida que los granulocitos maduran.     Diapositiva 14: Esta serie de gráficos de dispersión muestran cómo podemos utilizar citometría de flujo  para identificar granulocitos inmaduros.  Veamos primero la sección de abajo que muestra sangre normal. En el primer paso los granulocitos se  agrupan  y  quedan  alineados  en  la  parte  superior  derecha  del  primer  gráfico  marcado  como  “Gran”.  Después  se  excluyen  los  eosinófilos  que  tienen  mayor  afinidad  por  el  CD45,  quedando  solamente  los  neutrófilos  agrupados.  En  el  siguiente  paso  observamos  el  cuadrante  de  análisis  que  muestra  la  expresión de CD16 y de CD11b; los neutrófilos se ubican en el cuadrante superior derecho.  Ahora vamos a compararlo con un paciente que tiene granulocitos inmaduros, en la sección de arriba.   El primer paso es agrupar los granulocitos y luego excluir los eosinófilos utilizando la expresión de CD45  y  CD16.  Cuando  hacemos  el  análisis  del  cuadrante,  observamos  que  hay  células  que  aparecen  en  los  sectores  superior  e  inferior  izquierdos  marcados  como  etapa  1  y  2  de  granulocitos  inmaduros  en  el  gráfico indicado como “C”. Ahora queremos saber qué son estas células.     Diapositiva 15: En la siguiente diapositiva verán lo que sucede si  clasificamos estas células y las vemos  bajo  el  microscopio.  Todas  las  células  que  se  encuentran  en  el  cuadrante  superior  derecho  son  neutrófilos  maduros.  En  el  cuadrante  superior  izquierdo  que  está  marcado  como  IG  estado  2  vemos  células  similares  a  metamielocitos  y  en  el  cuadrante  IG  estado  1,  el  inferior  izquierdo,  hay  células  parecidas a promielocitos y mielocitos.  En otras palabras, la citometría de flujo está mostrando una correspondencia directa con los estados de  la maduración de los granulocitos que reconocemos bajo el microscopio.     3   

 Seminarios en español 2012    Diapositiva 16: Esta tabla, tomada de la misma publicación, muestra la precisión de los resultados de la   citometría de flujo comparados con los del conteo del diferencial manual realizado con 100 células en  muestras que tienen conteos bajos de granulocitos inmaduros.  En la segunda columna verán que el coeficiente de variación para todos los granulocitos inmaduros fue  de  cerca  de  6.8  comparado  con  el  coeficiente  de  variación  de  alrededor  de  50%  para  la  microscopía  manual.  Así que como se podría predecir, el método automatizado tiene una mayor precisión debido a que se  cuentan muchas más células de las que somos capaces de contar en el diferencial manual.    Diapositiva  17:  En  esta  diapositiva  tenemos  tres  gráficos.  El  primero,  identificado  con  B  arriba  a  la  izquierda, muestra la correlación entre el conteo de IG del XE de Sysmex con el del diferencial manual.  Pueden ver que hay una buena relación lineal pero hay mucha dispersión.  El  siguiente,  arriba  a  la  derecha  marcado  con  la  letra  F,  muestra  los  granulocitos  inmaduros  por  inmunofenotipificación con citometría de flujo así como el conteo obtenido por ese método comparado  con el método manual. Se observa una distribución de puntos muy similar a la que vimos en el primer  gráfico; de nuevo hay una buena relación lineal pero hay mucha dispersión.  Ahora veamos el tercer gráfico, marcado con la letra D, en la parte de abajo.  Se muestra la correlación  entre  el  conteo  de  granulocitos  inmaduros  por  citometría  de  flujo  y  el  conteo  de  Sysmex.  Aquí  se  observa  una  correlación  más  alta;  la  mayoría  de  los  puntos  están  alineados  muy  cerca  de  la  línea  de  regresión.  ¿Qué  es  lo  que  esto  nos  está  diciendo?  Sabemos,  por  la  diapositiva  anterior,  que  el  método  de  inmunotipificación por citometría de flujo correspondió a los granulocitos inmaduros que identificamos  por morfología. Ahora podemos mostrar que el XE‐2100 y la citometría de flujo correlacionan muy bien  y concluir que los métodos están identificando las mismas células.    Diapositiva  18:  Tenemos  cierta  experiencia  con  el  conteo  de  granulocitos  inmaduros  en  nuestro  laboratorio.  Algunos  años  atrás,  cuando  teníamos  el  analizador  XE‐2100,  hicimos  un  estudio  para  observar el desempeño de dicho conteo como predictor de sepsis neonatal.  No  voy  a  entrar  en  los  detalles  de  ese  estudio  pero  quisiera  compartir  con  ustedes  los  resultados  de  nuestra correlación de los conteos celulares que hicimos aquella vez.     Diapositiva  19:  Esta  diapositiva  muestra  la  frecuencia  de  distribución  del  porcentaje  de  granulocitos  inmaduros por el método manual y el del analizador Sysmex obtenidos de 293 muestras de sangre de  neonatos.  El conteo manual de células está mostrado en color azul claro y el automatizado en color azul  oscuro,  en  la  gráfica  de  barras  a  la  izquierda.    Lo  que  se  muestra  con  estos  resultados  es  bastante  interesante.  No  tenemos  una  distribución  normal  del  conteo  celular;  el  valor  más  frecuente  para  el  porcentaje de IG manual fue cero mientras que en el analizador Sysmex fue de 0.5%.    Diapositiva 20: Nosotros analizamos estos datos un poco más; voy a explicarles esta tabla. Si observan el  lado izquierdo de la tabla hay una columna marcada como conteo manual de granulocitos inmaduros en  porcentaje. El primer número en esa columna es 0 y van incrementando. El siguiente es de 0.5 a 1, luego  entre 1 y 3 y por último mayor a 3. Estas son las categorías para el porcentaje manual de granulocitos  inmaduros que estamos observando.  A  la  derecha  de  la  tabla  verán  los  granulocitos  inmaduros  obtenidos  en  el  analizador  Sysmex.  Si  observan la tercera columna verán el rango de granulocitos inmaduros en porcentaje que fue obtenido  por el analizador Sysmex y que corresponde al conteo manual de granulocitos inmaduros.  Por ejemplo,  4   

 Seminarios en español 2012    si el conteo manual fue 0% el rango obtenido en el conteo automatizado fue de 0 a 0.8% y el valor de la  mediana fue 0.2. Para cada incremento en el conteo manual de IG, se puede ver que hay un incremento  progresivo en el porcentaje de granulocitos inmaduros que fueron detectados por el analizador Sysmex.   Pueden  ver  que  el  valor  de  la  mediana  va  desde  0.2  a  0.4  y  0.6  y  luego  1.2.    Esta  es  una  muy  buena  progresión que era lo que esperábamos encontrar.  También vimos en estos datos que los rangos de percentiles para cada categoría se sobreponían.  Por  ejemplo,  en  el  rango  para  un  conteo  manual  de  IG  igual  a  0  lo  que  obtuvimos  en  el  instrumento  fue  entre 0 a 0.8. Si observan el valor de IG manual mayor a 3% el rango que vimos en el analizador Sysmex  estuvo entre 0.6 a 10%.En otras palabras si obtienen un valor digamos de 7% en el analizador Sysmex lo  que  correspondería  sería  cualquier  valor  entre  0  y  mayor  a  3  en  el  conteo  manual  de  granulocitos  inmaduros. Esto significa que es difícil traducirlo de un método a otro; la correlación no fue sencilla.  En  aquel  momento  no  implementamos  el  conteo  de  IG  en  nuestro  laboratorio,  pero  continuamos  considerándolo.    Diapositiva  21:  El  conteo  automatizado  de  granulocitos  inmaduros  es  un  nuevo  parámetro  hematológico que nosotros vamos a implementar en el laboratorio y es necesario decidir cómo hacerlo.  En los analizadores de la serie XE‐2100 este parámetro es opcional pero en el XE‐5000 el parámetro IG  está  incluido  en  el  conteo  diferencial  de  6  partes.  Si  están  implementando  este  instrumento  en  su  laboratorio  necesitarán:  implementar  el  IG  como  parte  de  su  conteo  diferencial  automatizado,  determinar su rango de referencia para este nuevo parámetro, adicionar el parámetro IG a la batería de  pruebas del diferencial en su sistema de información de laboratorio, informar a los médicos acerca de  este  nuevo  parámetro  y  preparar  al  personal  del  laboratorio  para  responder  preguntas  acerca  del  parámetro IG.    Diapositiva 22: La primera pregunta es: ¿cuál sería el rango de referencia para granulocitos inmaduros?  Esta  es  una  publicación  de  los  Doctores  Fernandes  y  Hamaguchi  en  el  American  Journal  of  Clinical  Pathology. Pueden referirse a este documento para sus rangos de referencia. Este estudio fue hecho en  60  adultos  sanos  obteniéndose  un  valor  medio  para  IG  de  0.22%  y  de  0.30  para  tres  desviaciones  estándar. Al sumar dichos valores se puede obtener un rango de referencia de aproximadamente 0.5%  siendo este el límite superior anormal para dicho rango.  Uno de los métodos aprobados para rangos de  referencia es verificar un rango de referencia publicado con sus propios resultados.    Diapositiva  23:  Hay  algunas  preguntas  prácticas:  si  0.5%  es  punto  de  corte  para  adultos  normales,  entonces  ¿un  IG  de  0.6%  sería  anormal?  ¿El  sistema  de  información  del  laboratorio  va  a  marcar  este  resultado como anormal? ¿Indicará la presencia de desviación a la izquierda? ¿Cómo van a interpretar  este resultado los médicos?  También  me  pregunto  sobre  los  rangos  de  referencia  para  pacientes  pediátricos:  ¿Serán  diferentes?  ¿Deberían determinarse rangos de referencia específicos por edad?  Por  supuesto  que  podrían  tener  bastantes  problemas  haciendo  esto  porque  es  muy  difícil  recolectar  muestras de niños normales. Ustedes preferirán evitar eso.    Diapositiva  24:  Un  enfoque  alternativo  para  determinar  el  rango  de  referencia  podría  ser  usar  los  resultados de pacientes para derivar el rango de referencia para el conteo automatizado de granulocitos  inmaduros.  Esto  es  lo  que  ustedes  deberían  hacer  en  su  laboratorio.  Lo  que  voy  a  hacer  ahora  es  describirles cómo hacerlo.  5   

 Seminarios en español 2012    El  primer  paso  es  definir  la  variable  “IG  manual”  como  la  suma  de  promielocitos,  mielocitos  y  metamielocitos.    Entonces  se  va  a  definir  esta  variable  y  cuáles  células  van  a  ser  reportadas  en  el  diferencial manual para este estudio.  Luego se va a definir nuestro método de referencia para “desviación a la izquierda” como la presencia  de  algún  granulocito  inmaduro  en  el  extendido.  Si  usted  hace  un  diferencial  manual  de  100  células  y  encuentra un 1% de IG, este será un hallazgo positivo para desviación a la izquierda; o si usted hace un  diferencial  manual  de  200  células  y  ve  un  granulocito  inmaduro  lo  que  tendrá  será  0.5%  y  se  llamará   positivo para desviación a la izquierda.  Después  vamos  a  responder  esta  pregunta:  ¿cuál  es  el  valor  o  punto  de  corte  en  porcentaje  para  el  parámetro IG automatizado que mejor predice la presencia de algún granulocito inmaduro en el frotis  manual?  Vamos  a  realizar  los  análisis  de  sensibilidad  y  especificidad  usando  el  conteo  manual  de  granulocitos  inmaduros  como  método  de  referencia  y  luego  aplicaremos  la  curva  ROC  para  determinar  cuál  es  el  mejor valor de corte para el porcentaje de IG automatizado. Ahora voy a describirles este estudio.      Diapositiva 25: Este es el diseño del estudio que muestra que se usaron muestras de pacientes adultos y  pediátricos  aleatoriamente.    El  muestreo  aleatorio  es  conveniente  porque  nosotros  quisimos  incluir  pacientes que representaran el grueso de la población.  Incluimos pacientes adultos y pediátricos, tanto  ambulatorios  como  hospitalizados,  y  también  muestras  de  oncología  debido  a  que  tenemos  aquí  un  servicio de oncología con bastantes pacientes del tipo que incluimos en el estudio.  Se  realizaron  diferenciales  manuales  de  200  células  por  tecnólogos  experimentados  quienes   permanecieron “ciegos” para los resultados automatizados; es decir, que ellos no vieron los resultados  del instrumento y por ende desconocían el conteo de IG en el equipo.  Establecimos  un  criterio  de  “revisión  por  un  patólogo”.  Decidimos  que  seríamos  el  residente  de  hematopatología y yo quienes revisaríamos aquellos resultados de frotis con alguna discrepancia entre  el diferencial manual y el del instrumento. Los criterios para la revisión fueron:  - Cualquier muestra con conteo automatizado de IG mayor a 1%  - Cualquier muestra con presencia de IG en el diferencial manual y con conteo automatizado de  IG menor a 1%   - Bandas presentes en un número mayor a 10%. La razón para incluir bandas en este criterio fue  que si se detectaban bastantes en el frotis habría una alta probabilidad de que los granulocitos  inmaduros también estuvieran presentes  Es importante aclarar que el propósito de esta “revisión por un patólogo” no se hizo para comparar el  desempeño del patólogo con el del tecnólogo. Dicha revisión no fue ciega porque el propósito de esta   fue verificar resultados anormales y discrepancia entre los mismos.  Al conteo revisado por el patólogo  lo llamamos “conteo IG revisado”.     Diapositiva  26:  Esta  diapositiva  explica  el  análisis  estadístico  que  hicimos.    Lo  voy  a  explicar  en  las  siguientes diapositivas. Usamos la correlación de Spearman para los métodos automatizado y manual;  este es un análisis no paramétrico que es el método apropiado porque los resultados no tuvieron una  distribución normal cuando analizamos el conteo celular automatizado frente al manual.  También hicimos los análisis de sensibilidad y especificidad y el análisis ROC que les voy a mostrar.     Diapositiva 27: Se incluyeron 198 muestras en este estudio de las cuales el patólogo revisó 88 frotis, es  decir el 44% y solamente en 25 de esas muestras la revisión hecha por el patólogo afectó el análisis de  6   

 Seminarios en español 2012    sensibilidad o especificidad debido a que en estas la presencia de granulocitos inmaduros se cambió de  0 a 1 o viceversa.    Diapositiva  28:  ¿Cuáles  fueron  las  discrepancias  que  encontramos?  La  mayoría  se  debieron  a  la  presencia de mielocitos y metamielocitos en baja frecuencia que se perdieron del conteo diferencial por  azar.  Otra  de  ellas  fue  que  algunas  veces  los  monocitos  y  los  granulocitos  inmaduros  fueron  mal  clasificados  entre  uno  y  otro.  En  algunos  de  los  casos  la  pobre  calidad  de  la  tinción  contribuyó  a  los  errores de clasificación de las células.     Diapositiva 29: Esta diapositiva muestra la gráfica de la correlación entre el conteo automatizado de IG  con el manual y lo que vemos es que hay una muy buena correlación; el coeficiente de correlación es 0.8  que es altamente significativo.     Diapositiva  30:  Con  el  análisis  de  la  curva  ROC  nos  preguntamos  ¿qué  tan  bueno  es  el  nuevo  análisis  para predecir una desviación a la izquierda? Para propósitos de este estudio el conteo automatizado de  IG% fue el nuevo análisis, es decir, el método que estábamos evaluando y el conteo manual “revisado”  de IG% fue el método de referencia.     Diapositiva 31: Este gráfico muestra la curva ROC que obtuvimos.  La línea azul es la correlación que se  generó cuando usamos el conteo manual de IG inicial; es decir, el que fue obtenido por el tecnólogo. La  línea  roja,  que  aparece  más  arriba  a  la  izquierda,  es  la  que  obtuvimos  usando  el  conteo  manual  “revisado”  para  IG.  Ambas  son  muy  similares  en  el  área  bajo  la  curva,  que  es  el  valor  estadístico  que  nosotros  comparamos  en  el  análisis  de  la  curva  ROC.    La  gráfica  muestra  0.986  para  el  IG  manual  “revisado”  que  es  el  estándar  de  oro  para  este  análisis  y  es  bastante  alto:  muy  cercano  a  uno  lo  que  indica que es un buen análisis.  Hay una forma especial en esa curva. Pueden ver que parece un “codo” allí en donde está señalando la  flecha. Ese es, probablemente, el mejor valor de corte para el conteo automatizado de IG.    Diapositiva  32:  La  siguiente  diapositiva  muestra  el  análisis  de  sensibilidad  y  especificidad  que  corresponden  a  la  curva  ROC.  Pueden  ver  que  el  conteo  automatizado  de  IG  de  1%  obtuvo  una  sensibilidad  de  96.2  y  una  especificidad  de  90.2%  por  lo  que  se determinó  que  era  el  mejor  punto  de  corte.  ¿Por qué elegimos ese resultado como el punto de corte? El punto de corte óptimo va a ser el que mejor  sensibilidad y especificidad tenga. Eso corresponde al “codo” en la curva ROC y al conteo automatizado  de IG que fue 1%. Hicimos el mismo análisis usando el conteo inicial de IG, es decir el que los tecnólogos  habían reportado y obtuvimos exactamente el mismo punto de corte de 1%.     Diapositiva 33: Si usan resultados de pacientes para derivar los rangos de referencia lo que obtienen es  un 1% que corresponde al conteo manual.  ¿Qué  sucede  con  el  estudio  tradicional  para  rangos  de  referencia  en  el  que  se  analizan  muestras  de  pacientes  normales  para  derivar  la  media  y  desviación  estándar?  Lo  que  nosotros  hicimos  para  ese  estudio fue recolectar muestras de 52 adultos normales y obtuvimos una media de 0.3% para IG con una  desviación estándar de 0.17%. Sumamos 3 desviaciones estándar a nuestra media para obtener el límite  superior del rango de referencia que fue alrededor de 0.8%, lo que está muy cercano a 1%.  Observamos una buena concordancia entre los dos métodos para rangos de referencia.    7   

 Seminarios en español 2012    Diapositiva  34:  ¿Cuáles  son  las  conclusiones  que  podemos  mencionar  en  este  punto?  Primero:  que  el  conteo automatizado de IG correlaciona muy bien con el conteo manual. Segundo: que los análisis de  sensibilidad  y  especificidad  confirman  que  un  1%  en  el  conteo  automatizado  de  IG  corresponde  con  nuestra definición de desviación a la izquierda basado en el diferencial manual que fue 1%. Finalmente,  que el punto de corte de 1% para IG corresponde muy de cerca con las determinaciones tradicionales  para rangos de referencia: 0.8% en nuestro estudio y 0.5% en el estudio publicado previamente.    Diapositiva 35: Después de que habíamos determinado un rango de referencia para IG podíamos pensar  en cómo dar a conocer el parámetro IG al personal médico. Nuestros objetivos fueron dos: explicar el  nuevo  parámetro  para  que  ellos  supieran  cómo  interpretar  los  resultados  y  reducir  las  llamadas  telefónicas al laboratorio que podrían hacer los médicos confundidos.    Diapositiva 36: Lo que hicimos en nuestro hospital fue hablar con los clientes difíciles primero y obtener  su apoyo para el lanzamiento de este nuevo parámetro de granulocitos; esto incluyó a los hematólogos,  particularmente los hematólogos pediatras, y a los neonatólogos que hay en nuestra institución.  Lo  que  ustedes  deben  hacer  en  su  hospital  es  identificar  quiénes  son  los  médicos  clave  con  los  que  tienen que hablar; explicarles lo que significa el parámetro IG y solicitar su apoyo de tal forma que ellos  también puedan ayudar a comunicar el cambio a todos los demás.    Diapositiva 37: Lo que hicimos en nuestro hospital fue crear una comunicación electrónica que se envió  a  los  médicos.  Quiero  compartir  con  ustedes  el  texto  de  nuestro  memorándum  e  invitarlos  para  que  piensen sobre su propio texto para su personal médico.  Esto es lo que decía:    A partir de hoy el laboratorio de hematología reportará el conteo de granulocitos inmaduros, IG, como  parte del conteo diferencial automatizado de leucocitos.    Luego nosotros definimos la variable:  Los  granulocitos  inmaduros  son  precursores  de  los  neutrófilos  y  su  presencia  indica  una  desviación  granulocítica a la izquierda en la sangre.    En el tercer punto:  La presencia de granulocitos inmaduros es un criterio más objetivo del significado clínico de desviación a  la izquierda que la reproducibilidad pobre que tiene el conteo de bandas.  Yo quise usar este texto como  una oportunidad para educarlos ya que esto muestra que el conteo de bandas es poco confiable y que  nosotros estamos introduciendo algo que creemos que será de más utilidad para ellos.     Diapositiva  38:  El  parámetro  de  granulocitos  inmaduros  (IG)  corresponde  a  la  suma  de  promielocitos,  mielocitos y metamielocitos.  - El  rango  de  referencia  para  granulocitos  inmaduros  en  el  conteo  diferencial  de  leucocitos  es  menos del 1%  Luego nosotros dijimos:  - El conteo de granulocitos inmaduros solo será reportado si es mayor o igual a 1%.  Esta fue una  decisión  que  yo  tomé  como  directora  médica  de  nuestro  laboratorio  de  que  nosotros  no  reportamos conteos normales para IG    8   

 Seminarios en español 2012    En el siguiente punto:  - Un  porcentaje  de  granulocitos  inmaduros  mayor  o  igual  que  1%  indica  la  presencia  de  desviación a la izquierda  - Las  bandas  no  están  incluidas  en  el  conteo  automatizado  de  IG;  lo  están  en  el  conteo   automatizado  de  neutrófilos.  Los  médicos  no  tienen  experiencia  con  los  analizadores  automatizados  por  lo  que  puede  que  no  entiendan  esto  o  que  no  lo  sepan  así  que  es  una  oportunidad para comunicarlo  - Si  se  realiza  un  diferencial  manual  el  laboratorio  seguirá  reportando  neutrófilos  segmentados,  bandas,  metamielocitos,  mielocitos  y  promielocitos  como  categorías  separadas  si  están  presentes    Diapositiva 39: Algunos de ustedes se estarán preguntando ¿por qué no usamos el estándar de la CLSI  de  diferencial  manual  de  400  células  como  nuestro  estándar  de  oro?  La  razón  es  porque  la  carga  de  trabajo  en  nuestro  laboratorio  es  muy  grande  para  haber  dedicado  personal  para  hacer  los  conteos  diferenciales de 400 células para este estudio de correlación.  A  cambio  de  esto  tuvimos  un  complemento:  conteos  diferenciales  de  200  células  realizados  por  un  tecnólogo  con  la  revisión  de  un  patólogo  para  muestras  seleccionadas  por  criterios  pre  establecidos.  Esto cumplió el mismo propósito que era reducir la probabilidad de perder eventos raros.  Esta es la forma en que nosotros elegimos hacerlo en nuestro hospital pero si usted tiene el personal  suficiente y desea que se hagan conteos diferenciales manuales de 400 células, la CLSI está de acuerdo  con que lo haga.  ¿Por  qué  no  reportamos  conteos  de  IG  menor  a  1%?  La  razón  por  la  que  elegí  no  hacerlo  fue  simplemente para reducir la extensión del reporte del hemograma sin comprometer la utilidad clínica de  la información.    Diapositiva 40: He hablado sobre los rangos de referencia para el conteo de IG en porcentaje pero ¿qué  hay acerca de los rangos de referencia para el conteo de IG en número absoluto?  El  rango  de  referencia  para  el  número  absoluto  de  IG  puede  ser  calculado  a  partir  de  los  rangos  de  referencia para leucocitos y del porcentaje de IG. Estos deberían reportarse juntos.   Un rango de referencia para IG en número absoluto puede ser como el que se muestra aquí. Se puede  reportar  un  rango  de  referencia  de  IG  de  esta  forma  si  así  se  elije.  Nosotros  no  lo  hacemos  en  el  laboratorio. Si deciden hacer esto deben tener en cuenta que pacientes con neutropenia severa pueden  tener un porcentaje muy alto de IG. Vemos esto todo el tiempo en nuestros pacientes oncológicos que  tienen  un  conteo  muy  bajo  de  leucocitos  y  están  recibiendo  factores  de  crecimiento  y  tienen  una  marcada desviación a la izquierda. Hay circunstancias en las que puede haber un porcentaje alto de IG  pero el número absoluto de los mismos puede ser muy bajo.    Diapositiva  41:  ¿El  conteo  automatizado  de  IG  reducirá  el  número  de  diferenciales  manuales  en  su  laboratorio?...eso depende de varios puntos:  - ¿Cómo escriben sus reglas para la revisión manual de los frotis? Cuando comenzamos con este  parámetro utilizábamos un valor de IG de 1% como punto de corte en la revisión manual; si un  resultado tenía más del 1% en el conteo automatizado revisábamos el frotis  -  ¿Cuántos  anormales  revisa?  Depende  de  la  población  de  pacientes  de  su  laboratorio  y  de   cuánto personal tenga en el mismo  - También depende de su nivel de tranquilidad si ocasionalmente se pierde un conteo de IG    9   

 Seminarios en español 2012    Diapositiva  42:  Esta  diapositiva  muestra  un  algoritmo  de  cómo  nosotros  revaluamos  el  conteo  de  granulocitos  inmaduros  aproximadamente  seis  meses  después  de  haberlo  implementado.  Una  tecnóloga  del  laboratorio  me  dijo  que  ella  pensaba  que  estábamos  revisando  muchos  frotis  donde  la  única  alarma  que  se  disparaba  era  la  de  conteo  de  granulocitos  inmaduros.  El  aviso  para  IG  estaba  configurado para que se disparara cuando el conteo de dichas células fuera mayor a 1%. Ella pensaba  que  había  muchos  frotis  que  estábamos  revisando  únicamente  por  ese  criterio.  Hicimos  un  pequeño  estudio  por  un  periodo  de  4  semanas  y  ella  identificó  142  muestras  que  habían  sido  revisadas  únicamente por esa alarma. Revisamos cuantas de esas tenían un resultado mayor a 1% pero menor o  igual  a  2%  y  encontramos  que  fueron  112,  como  se  puede  ver  en  el  cuadro  de  la  izquierda.  De  esas  muestras  todas  tuvieron  una  revisión  del  diferencial  manual  y  en  102  de  ellas  no  se  observaron  granulocitos inmaduros. Esas revisiones de frotis se podrían eliminar si se reajustara el punto de corte a  2% y eso fue lo que decidimos hacer.     Diapositiva  43:  El  uso  del  conteo  de  IG  en  la  práctica  actual  puede  diferir  algo  de  cuando  hicimos  el  estudio. Encontramos en nuestro estudio que en el conteo automatizado para IG de 1% era altamente  predictivo de la presencia de granulocitos inmaduros en los diferenciales manuales. Pero al ponerlo en  práctica parece que 2% es un mejor predictor de la presencia de IG en el conteo manual.  ¿Por qué es diferente?  Lo que creo que lo hace diferente es la forma como hicimos el estudio y cómo lo  usamos actualmente.  En  el  estudio  realizamos  diferenciales  manuales  de  200  células  y  la  revisión  de  un  patólogo;  fuimos  2  patólogos los que revisamos los frotis para aclarar las discrepancias con el diferencial manual pero en la  práctica solo hacemos el diferencial en 100 células y no hay revisión por un patólogo.  Además  el  estudio  se  limitó  a  pocos  tecnólogos  experimentados  pero  en  la  práctica  tenemos  muchos  más tecnólogos con diferentes niveles de experiencia que hacen los diferenciales. Por lo tanto, lo que  hacemos actualmente es ligeramente diferente de lo que se hizo en el estudio.    Diapositiva  44:  Espero  haberles  proporcionado  información  útil  y  algunas  ideas  sobre  cómo  implementar el conteo de IG en su propio laboratorio.  El primer paso es establecer un rango de referencia para lo que pueden usar un rango de referencia que  se haya publicado; pueden referirse a nuestro estudio o verificar sus propios rangos. Necesitan definir  sus reglas para la revisión del diferencial manual en el frotis.  Se debe discutir este nuevo parámetro con los médicos clave en el hospital y ganar su apoyo; también  solicitarles  algunas  ideas  sobre  cómo  ellos  esperan  que  se  les  reporte  el  parámetro  IG  dentro  del  hemograma.  Puede  que  sea  necesario  volver  a  diseñar  el  reporte  para  incluir  el  parámetro  IG  dependiendo de cómo desee presentarse: si es en porcentaje de IG, en número absoluto de IG, uno solo  o ambos.  Es  necesario  encontrar  las  vías  para  comunicar  el  cambio  al  personal  médico.  Finalmente  sugerimos  algunos puntos que pueden llevar a cabo una vez hayan ganado alguna experiencia con el parámetro y  puedan revaluar las reglas para la revisión de los frotis después de varios meses de trabajo basándose  en su propia experiencia.    Diapositiva 45: Muchas gracias por su atención.  

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