Monroy Cárdenas C, González Andrade M, Guevara Flores A, Lara Lemus R, Matuz Mares D, Molina Jijón E, Torres Durán PV. Mensaje Bioquímico, Vol. XL, 39-50, Depto de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd. Universitaria, CDMX.,MÉXICO.,(2016). (http://bioq9c1.fmedic.unam.mx/TAB) (ISSN-0188-137X)

INACTIVACIÓN DE INSULINA POR EL ESTRÉS OXIDANTE EN PACIENTES DIABÉTICOS Y OBESOS INSULIN INACTIVATION BY OXIDATIVE STRESS IN DIABETIC AND OBESE PATIENTS Ivonne María Olivares Corichi y José Rubén García Sánchez Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional. [email protected] Tel. 5729-6000 ext. 62820 Resumen La literatura científica describe que la hiperglucemia que caracteriza a la diabetes mellitus tipo 2 es debida a la baja o nula producción de la insulina por parte de las células β pancreáticas y/o por que los tejidos dependientes de ella no responden; sin embargo, actualmente hay evidencias de la participación de un tercer factor, el cual es la existencia de polímeros de insulina, formados por cambios químicos y estructurales de la hormona cuando es expuesta a un ambiente de estrés oxidante, como el que está presente en pacientes diabéticos y obesos. La hormona en forma de polímero, pierde su función biológica como hipoglucemiante. Interesantemente estudios recientes demuestran que los polímeros de insulina se detectan en el plasma de pacientes obesos y se asocian con la resistencia a la insulina y con el grado de estrés oxidante a nivel plasmático. Estos datos sugieren que los polímeros de insulina podrían estar participando en el mecanismo generador de resistencia a la insulina, el cual es un proceso relacionado con la obesidad y con la diabetes mellitus tipo 2.

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Palabras clave: insulina, estrés oxidante, diabetes, obesidad. Abstract The scientific literature describes that hyperglycemia that characterizes Type 2 diabetes mellitus is due to low or no insulin production by pancreatic beta cells and / or that dependent tissues of her not respond; however, currently there are evidence of a third factor, it is the existence of insulin polymers formed by chemical and structural changes of the hormone when it is exposed to an environment of oxidative stress, such as is present in diabetic and obese patients. The hormone in polymer form, it loses its biological function as hypoglycemic. Interestingly, recent studies show that the polymers of insulin were detected in the plasma of obese patients and were associated with the presence of insulin resistance and the degree of oxidative stress in plasma. These data suggest that polymers of insulin could be involved in the generating mechanism of insulin resistance, which is a process related to obesity and type 2 diabetes mellitus. Keywords: insulin, oxidative stress, diabetes, obesity.

Insulina La hormona peptídica insulina es sintetizada en las células β de los islotes de Langerhans del páncreas; está constituida por una cadena α de 21 aminoácidos y una β con 30, unidas por dos puentes disulfuro intercatenarios (A7:B7 y A20:B19) y uno intracatenario (A6:A11); donde A es la cadena α, B es la cadena β y los números indican el residuo del aminoácido correspondiente (Figura 1). Posee un peso molecular aproximado de 6,000 daltones, con un punto isoeléctrico de 5.4, su vida media plasmática es de ~ 6 minutos y desaparece de la circulación sanguínea entre los 10 y 15 minutos. La insulina se degrada por la enzima insulinasa, la cual se encuentra en mayor concentración en el hígado, los riñones, el músculo y de forma muy discreta en el resto de los tejidos [1].

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Figura 1. Estructura terciaria de la hormona peptídica insulina. Cadena A = cadena α. Cadena B = cadena β.

Los principales órganos y tejidos donde tiene acción la insulina son el hígado, el músculo y el tejido adiposo donde participa en el metabolismo de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. En particular, los efectos de la insulina sobre el metabolismo de los carbohidratos incluyen: estimulación del transporte de glucosa hacia el interior de los adipocitos y de las células musculares a través de sus membranas plasmáticas; regulación de la síntesis del glucógeno hepático, e inhibición de la formación de glucosa a partir del glucógeno (glucogenólisis) y de los aminoácidos precursores (gluconeogénesis). El resultado final de todas estas acciones es una reducción de la glucemia. Sin embargo, cuando hay una deficiente síntesis y secreción de la insulina y/o la disminución en la respuesta biológica de los tejidos a la hormona insulina (Definido como Resistencia a la Insulina), da lugar a la hiperglucemia, la cual es la evidencia más conocida que permite diagnosticar a la enfermedad llamada Diabetes [2]. Diabetes Particularmente, la Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) es una enfermedad caracterizada por alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos (hiperglucemia), lípidos y proteínas causado por la disminución en la acción de la insulina;, secundaria a la disminución de la secreción de insulina dada por las

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células β pancreáticas (la insulina puede producirse poco, nada o estar defectuosa) o a la insensibilidad de los tejidos a la hormona. Cualquiera que sea el mecanismo, las consecuencias son las mismas [3] Entre los factores de riesgo para DM2 se encuentran el sedentarismo, antecedentes familiares diabéticos, hipertensión arterial, hipertrigliceridemia, intolerancia a la glucosa y obesidad entre otras. Obesidad La obesidad es un desorden resultante de un desequilibrio entre el aporte y gasto de energía. Se acompaña de alteraciones metabólicas que incrementan el riesgo a desarrollar comorbilidades tales como: diabetes mellitus tipo 2 (DM2), hipertensión arterial, enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares, así como algunas neoplasias a nivel de endometrio, colon, mama y próstata, entre otras [4]. La obesidad se caracteriza por acumulo excesivo de tejido adiposo y la presencia de un estado inflamatorio crónico de bajo grado, que favorece el desarrollo de un estado de estrés oxidante, así como alteraciones metabólicas como son resistencia a la insulina e hiperinsulinemia; pasos previos a la aparición de Diabetes Mellitus tipo 2. Estrés oxidante. El estrés oxidante es un estado metabólico que se caracteriza por una diminución de la capacidad antioxidante, el incremento de daño a biomoléculas por especies reactivas de oxígeno (ERO) entre otras, y que se ha detectado en pacientes con diabetes [5] y obesidad [6] entre otras enfermedades. Las ERO son moléculas que se forman por la reducción parcial del oxígeno molecular (O2) y algunas de éstas se encuentran en forma de radicales libres debido a que contienen un electrón desapareado en su último orbital. Ejemplos de radicales libres de oxígeno son el anión superóxido (O2•-), radical hidroxilo (•OH), radical peroxilo (ROO•), el radical alcoxilo (RO•) y el radical hidroperoxilo (HOO•). El óxido nítrico (NO•) y el dióxido de nitrógeno (NO2•) son considerados radicales libres de nitrógeno [7]. Estrés oxidante, diabetes y obesidad. En la Diabetes mellitus la hiperglucemia induce la sobreproducción del anión superóxido (O2•-) en la cadena de transporte de electrones de las mitocondrias, lo cual parece ser el primer evento para la activación de otras vías de producción de las ERO; como la de los polioles, la de la hexosamina, el incremento de la formación de productos terminales de glicación avanzada y la

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activación de la proteína cinasa C [8]. Además, esta producción incrementada de las ERO paralelamente va acompañada de un decremento de la actividad antioxidante tanto enzimática como no enzimática [5, 9, 10]. En el caso de la obesidad, las fuentes productoras de las ERO son: la disfunción mitocondrial, el daño endotelial y la inflamación [11]. Como consecuencia de la glucotoxicidad en el paciente diabético y la lipotoxicidad en el paciente obeso, se da el aumento en la producción de las ERO y a la disminución de las defensas antioxidantes, lo cual promueve el daño a las biomoléculas (lípidos, proteínas y ácidos nucleicos). Se ha detectado en el plasma tanto de pacientes obesos como de diabéticos un aumento de la concentración de malondialdehido [5, 6] y de dienos conjugados [12], los cuales son productos de la lipoperoxidación. También se han encontrado un incremento en la concentración de ditirosinas [5], así como un incremento en la formación de quinonas y grupos carbonilos [5, 6, 13], moléculas que son indicadoras de daño a proteínas por las ERO. Oxidación de proteínas La oxidación de proteínas es definida como la modificación covalente de las proteínas inducida directamente por las ERO o indirectamente por la reacción con los bioproductos del estrés oxidante. Prácticamente todos los residuos de aminoácidos pueden ser blanco del ataque oxidante de las ERO, aunque algunos residuos como la metionina [14], el triptófano, la fenilalanina, la tirosina, la cisteína [15], la leucina, la valina, la lisina, la arginina, la prolina y la histidina [16, 17, 18, 19] son más susceptibles. La modificación de las cadenas laterales de éstos, puede conducir a la alteración directa de la estructura y la función de las proteínas [20, 21], a la fragmentación química o al incremento en la susceptibilidad a proteólisis [16, 22, 23]. La albúmina es una proteína que se ha descrito como susceptible al daño por las ERO. Se tienen evidencias de que los principales residuos de aminoácidos oxidados son el Trp-134, Trp-214 (formando radicales derivados del triptófano) y Cis-34 (dando lugar a un radical tiílo (RS•)) en la albúmina bovina sérica [20]. La alteración conformacional de la proteína da lugar a la formación de radicales en sitios adicionales. La formación de los radicales derivados del triptófano [24] y los de tiílo permiten la desnaturalización, la fragmentación y la polimerización de la proteína, incrementando la susceptibilidad de la proteína oxidada a la proteólisis [20, 25].

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La gonadotropina equina es un ejemplo más de una proteína que puede ser alterada por las ERO (HO•) in vitro, tanto en su estructura como en su función; conllevando a una pérdida de la ovulación y una disminución en el peso de los ovarios y el útero en la rata [21]. Las proteínas dañadas por las ERO no deben ser considerados como productos finales, ya que estás son capaces de dañar otras biomoléculas, como fue demostrado al exponer al ácido linoleico y un polipéptido (Glu-Ala-Tir) a radical-albumina-sérica bovina, dando como resultado la formación de dienos conjugados y ditirosinas respectivamente [26]. Las proteínas también son sensibles al ataque por parte de los intermediarios o productos finales generados por el daño de los lípidos mediante los radicales libres, como es el caso del 4 hidroxinonenal [27, 28]. Los residuos de la histidina, la lisina y la cisteína son particularmente sensibles a este tipo de ataque [27]. De igual manera, otras proteínas pueden ser dañadas por las ERO y sus productos de oxidación, tanto en su función como en su estructura, como es el caso de la hormona insulina. Insulina oxidada Teniendo como base que la estructura primaria de la insulina contiene 28 residuos de aminoácidos (de 51 que la componen) susceptibles al daño por estrés oxidante (en la cadena α los residuos susceptibles son: una valina, 4 cisteínas, 2 leucinas y 2 tirosinas, y en la cadena β son 3 valinas, 4 leucinas, 1 prolina, 1 arginina, 1 lisina, 2 histidinas, 2 cisteínas, 3 fenilalaninas y 2 tirosinas), como está descrito en la literatura; Olivares-Corichi y colaboradores plantearon la posibilidad de que la hormona peptídica insulina fuera susceptible a oxidación [29]. En este contexto, demostraron en un sistema in vitro, que la exposición de la Insulina Recombinante Humana (IRH) a las ERO (formadas por la reacción de Fenton) generan cambios químicos y estructurales en la hormona. Esto fue evidenciado por la formación de ditirosinas, de quinonas y la exposición de grupos carbonilo [29]. Posteriormente, estos mismos autores, considerando que los pacientes diabéticos se encuentran en un estado metabólico de estrés oxidante; expusieron a la IRH a sangre de pacientes diabéticos como fuente de ERO. Esto con base a que la sangre de estos pacientes es un medio completo de estrés oxidante sistémico que involucra sistemas celulares como neutrófilos, plaquetas y macrófagos generadores de las ERO, productos de daño oxidante y proteínas

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modificadas; asociado a un sistema antioxidante compuesto de eritrocitos, enzimas y agentes antioxidantes que están disminuidos. Con esto demostraron que la hormona nuevamente presenta cambios químicos y estructurales. Además, demostraron que la insulina oxidada pierde su función como hipoglucemiante probado en un modelo murino [5]. Tomando en cuenta que la obesidad es un factor de riesgo para el desarrollo de Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y que los pacientes obesos también se encuentran en estrés oxidante, Olivares-Corichi y colaboradores en el 2011 [6] expusieron nuevamente a la IRH a las ERO pero ahora utilizaron como fuente la sangre de un paciente obeso. Demostrando que la sangre de este tipo de paciente también tiene la capacidad de modificar a la hormona tanto en su estructura como en su función, pero interesantemente se pudo determinar que la causa de la pérdida de su función, se debe a que la insulina al oxidarse forma polímeros de aproximadamente 18 kDa los cuales fueron detectados en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes (el peso molecular de la insulina funcional es de ~6 kDa). Además se pudo observar que el grado de polimerización de la insulina era dependiente del grado de estrés oxidante el cual se encontraba el paciente [6, 30]. Estos resultados in vitro sugerían la participación de una insulina modificada en el mecanismo de resistencia a la insulina. Es en el 2014 que Rincón- Víquez y Colaboradores [30] demuestran por primera vez la presencia de polímeros de insulina en el plasma de pacientes obesas y establecen una correlación con biomarcadores de estrés oxidante y la resistencia a la insulina presente en estas pacientes. En el estudio participaron mujeres de 20 a 40 años de edad. Un grupo con Índice de Masa Corporal (IMC) de 30 a 34.9 u obesidad grado 1 (O1) y otro con IMC> 40 u obesidad grado 3 (O3). El grupo control se integró con mujeres sanas con IMC de 20 a 24.9 o normo peso (NP). Empleando la técnica de inmunización con antígeno aislado por electroforesis se generó un anticuerpo policlonal murino contra polímeros de insulina que posteriormente fue acoplado a perlas magnéticas. Las perlas magnéticas fueron incubadas en plasma de NP, O1 y O3. Terminado el tiempo de incubación las perlas magnéticas fueron recuperadas con un magneto para posteriormente correr geles de poliacrilamida; y mediante la técnica de Western blot empleando anticuerpos contra insulina, se evidenció la presencia de polímeros de insulina. Finalmente se realizó un análisis densitométrico de los polímeros de insulina y los valores obtenidos fueron asociados con parámetros clínicos de resistencia a la insulina. Interesantemente, se observó una asociación entre los niveles de polímero de insulina, los valores de

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insulina y el índice HOMA (Homeostasis model assessment); este último es una forma de evaluar la resistencia a la insulina, utilizando concentraciones de glucosa en ayunas y de insulina. Los resultados demuestran por primera vez que en el paciente obeso, el daño molecular inducido por las ERO promueve la formación de polímeros de insulina, y que estos polímeros de insulina se asocian con la presencia de resistencia a la insulina. Con base en los resultados obtenidos; a nivel clínico, Gutiérrez y colaboradores [13] propusieron una estrategia que disminuyó el estrés oxidante del paciente obeso grado 1, lo que permitió una disminución de la formación de polímeros. Dicha estrategia consistió en dar dieta y ejercicio diseñado específicamente para este tipo de obesidad. Aunque los resultados fueron alentadores, existen otros tipos de obesidad como la mórbida, donde el paciente difícilmente puede hacer ejercicio por las condiciones físicas y clínicas en las que se encuentra. Para este tipo de paciente, Rincón-Víquez y colaboradores en el 2014 [30] demuestran que in vitro, el flavonoide (-)- epicatequina - un potente antioxidante- evita la formación del polímero de insulina. La ventaja de este compuesto es que se encuentra en productos naturales como la cocoa y el té verde, lo cual facilita la administración de este flavonoide como coadyuvante de sus tratamientos. Además no se han descrito efectos tóxicos en comparación con otros antioxidantes. Finalmente, si se toma en cuenta que se ha reportado que la insulina glicada en sólo 3 aminoácidos (ε amino de la lisina y los dos aminos terminales de la glicina y de la fenilalanina) disminuye su función en un 40%; la suma de estos dos efectos de oxidación y glicación de la insulina, más la posibilidad de que la insulina forme aductos con productos de oxidación [31], aunado a la baja capacidad antioxidante del paciente diabético y el estrés oxidante agudo en el que permanece, debido en parte a que las proteínas glicadas forman radicales libres por autooxidación de la glucosa [23]; es probable que estas características de daño molecular pueden contribuir a las complicaciones del diabético incluyendo a la aterosclerosis asociada, y a la disfunción endotelial, vascular y neurovascular. Se ha reportado que las complicaciones de la diabetes como la neuropatía y la retinopatía, están relacionadas con el estrés oxidante, lo que nos hace pensar que una mejor capacidad antioxidante del paciente diabético no solo disminuiría las complicaciones, sino que la insulina no sería dañada y su función biológica sería eficiente.

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Semblanza de la Dra. Ivonne María Olivares Corichi

LICENCIATURA: Carrera: Biología UNAM. ENEP-Iztacala. MAESTRÍA: Maestría en Ciencias Biológicas (Biología Experimental). UNAM Facultad De Ciencias DOCTORADO: Doctorado: Investigación en Medicina. IPN. Escuela Superior De Medicina. -Miembro del Sistema Nacional de Investigadores nivel I. -Miembro de la Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología. -Miembro de la Red en Salud del Instituto Politécnico Nacional. -Docente desde el 2006 en la Escuela Superior de Medicina IPN -29 Artículos en revistas indexadas Internacionales, -9 Publicaciones nacionales, -16 alumnos graduados de posgrado y 5 de Especialidad. -5 capítulos de libros.

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