Instituto Politécnico Nacional Secretaria de Investigación y Posgrado Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Sección de Estudios de Posgrado e Investigación

Participación del estrés oxidativo y de las alteraciones del ambiente óxido-reducción en la generación de daño celular inducido por la deficiencia de hormonas tiroideas

T

e

s

i

s

Que para obtener el grado de Doctorado en Ciencias Q u i m i c o b iólogicas PRESENTA

Edgar Cano Europa

México, D. F. 2009

EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZÓ EN EL DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA “MAURICIO RUSSEK BERMAN” DE LA ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL BAJO LA DIRECCIÓN DE LA DRA. MARÍA DEL ROCIO ELIZABETH ORTIZ BUTRÓN. EL DESARROLLO DEL PRESENTE TRABAJO FUE APOYADO POR EL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT) (BECA 202194) Y LOS PROYECTOS SIP 20070119 Y 20080318, ASÍ COMO EL PROYECTO CONACyT 53227.

AGRADEZCO A:

DRA. MARÍA ELENA CAMPOS ALDRETE DRA. MARÍA LILIA DOMINGUEZ LÓPEZ DRA. ETHEL AWILDA GARCÍA LATORRE DRA. MARÍA EVA GONZÁLEZ TRUJANO DRA. MARÍA ESTELA MELÉNDEZ CAMARGO DRA. MARIA DEL ROCIO E. ORTIZ BUTRÓN

POR SUS PERTINENTES COMENTARIOS Y OBSERVACIONES DURANTE EL DESARROLLO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN QUE SUSTENTA ESTA TESIS.

LOS RESULTADOS GENERADOS DE ESTA TESIS FUERON PRESENTADOS PARCIALMENTE EN:

1.- LI CONGRESO NACIONAL DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS. 7-11 DE SEPTIEMBRE 2008. MÉRIDA, YUCATÁN CON EL TITULO DE: “PARTICIPACIÓN

DE

LAS

PEROXIDASAS

EN

EL

DAÑO

CELULAR

PROVOCADO POR EL HIPOTIROIDISMO INDUCIDO CON METIMAZOL”. GALLARDO-CASAS, C. A., CANO-EUROPA, E., PINEDA-REYNOSO M., ORTIZBUTRON, R.

2.- COLOQUIO INTERNACIONAL: RETOS E INNOVACIONES EN LA INVESTIGACIÓN

FARMACÉUTICA.

5-7

DE

MARZO

DE

2008.

CUERNAVACA, MORELOS. CON LOS TÍTULOS DE A) “PARTICIPACIÓN DE LAS PEROXIDASAS EN EL DAÑO HEPÁTICO INDUCIDO POR METIMAZOL” GALLARDO-CASAS, C. A., ORTIZ-BUTRÓN, R., HERNÁNDEZ-GARCÍA, A., CANO-EUROPA, E. B) “LA ADMINISTRACIÓN DE T NO PREVIENE EL DAÑO CELULAR 4

PROVOCADO POR EL HIPOTIROIDISMO INDUCIDO CON METIMAZOL”. PINEDA-REYNOSO, M., ORTIZ-BUTRÓN, R., GALLARDO-CASAS, C. A., HERNÁNDEZ-GARCÍA, A., CANO-EUROPA, E.

3.- REUNIÓN NACIONAL DE MORFOLOGÍA. 25 DE OCTUBRE 2007. TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS CON EL TITULO DE: “ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES HISTOLÓGICAS PROVOCADAS POR EL HIPOTIROIDISMO INDUCIDO CON METIMAZOL”. GALLARDO-CASAS, C.A., CANO-EUROPA, E. HERNÁNDEZ-GARCÍA, A. Y ORTIZ-BUTRÓN, R. XVII

LOS RESULTADOS GENERADOS DE ESTA TESIS FUERON PUBLICADOS COMO: METHIMAZOLE-INDUCED HYPOTHYROIDISM CAUSED CELLULAR DAMAGE IN THE SPLEEN, HEART, LIVER, LUNG, AND KIDNEY. CANO-EUROPA, E, BLASVALDIVIA, V, FRANCO-COLIN, M, GALLARDO-CASAS, C A, ORTIZ-BUTRÓN, R. ACTA HISTOCHEMICA, 2009 IN PRESS.

NEONATAL BILATERAL LIDOCAINE ADMINISTRATION INTO THE VENTRAL HIPPOCAMPUS CAUSED POSTPUBERTAL BEHAVIORAL CHANGES: AN ANIMAL MODEL OF NEURODEVELOPMENTAL PSYCHOPATHOLOGICAL DISORDERS. BLASVALDIVIA

V,

CANO-EUROPA

E,

HERNÁNDEZ-GARCÍA

A,

ORTIZ-BUTRÓN

R.

NEUROPSYCHIATR. DIS. TREAT.. 2009;5:15-22.

KETAMINE PREVENTS LIDOCAINE-CAUSED NEUROTOXICITY IN THE CA3 HIPPOCAMPAL AND BASOLATERAL AMYGDALA REGIONS OF THE BRAIN IN ADULT RATS. LOPEZ-GALINDO GE, CANO-EUROPA E, ORTIZ-BUTRON R. J ANESTH. 2008;22 (4):471-4.

LIDOCAINE AFFECTS THE REDOX ENVIRONMENT AND THE ANTIOXIDANT ENZYMATIC SYSTEM CAUSING OXIDATIVE STRESS IN THE HIPPOCAMPUS AND AMYGDALA OF ADULT RATS. CANO-EUROPA E, LÓPEZ-GALINDO GE, HERNÁNDEZGARCÍA A, BLAS-VALDIVIA V, GALLARDO-CASAS CA, VARGAS-LASCARI M, ORTIZBUTRÓN R. LIFE SCI. 2008;83(19-20):681-5.

HYPOTHYROIDISM INDUCES SELECTIVE OXIDATIVE STRESS IN AMYGDALA AND HIPPOCAMPUS OF RAT. CANO-EUROPA E, PÉREZ-SEVERIANO F, VERGARA P, ORTIZBUTRÓN R, RÍOS C, SEGOVIA J, PACHECO-ROSADO J. METAB. BRAIN DIS. 2008;23(3):275-87.

HIPPOCAMPUS AND AMYGDALA NEUROTOXICITY PRODUCED BY SYSTEMIC LIDOCAINE IN ADULT RATS. BLAS-VALDIVIA V, CANO-EUROPA E, HERNÁNDEZGARCÍA A, ORTIZ-BUTRÓN R. LIFE SCI. 2007;81(8):691-4.

Índice Lista de abreviaturas ……………………………………..……………………..i Relación de figures ...…….………………………………………………………iii Relación de tablas…. …….………………………………………………………iv Resumen………………………………………….………………………………..v Abstract …………………………………………………………………………..vi

Introducción …..……………………………………………………….. 1 Regulación del ambiente óxido-reducción…………………………………………………..1 Sistema oxidante……..………………………..……………………………… .………...1 Sistema antioxidante….….………………….……………………………………...........4 Sistema antioxidante no enzimático………..…………………………………………….6 Sistema glutatión reducido-glutatión oxidado (GSH2/GSSG) y ambiente óxido reducción (REDOX)……………..…………………………………...............7 Bases fisicoquímicas del ambiente REDOX……………………………………...7 Ciclo del GSH y sus funciones biológicas …………………………….……….…10 Modelo de regulación del ambiente REDOX ……………………......................12 Sistema antioxidante enzimático…………………………………………………..15 Estrés oxidativo…..……………………………………………………………………….17

Hormonas tiroideas…………………………………………………………………………..18 Glándula tiroidea…………………………………………………………………..…18 Estructura y características fisicoquímicas de las hormonas tiroideas…..….........19 Sistema transportador de hormonas tiroideas……………………………………...20 Regulación de la concentración sérica de las hormonas tiroideas. Eje hipotálamo-hipófisis-glándula tiroides………………………………………………21 Síntesis y metabolismo de hormonas tiroideas…..…………………………….........23 Mecanismo de acción genómico de las hormonas tiroideas…………………..........24 Mecanismo de acción extragenómico de las hormonas tiroideas………..…………26 Efectos de las hormonas tiroideas……………………………..………......................27 Modelos experimentales para el estudio del hipotiroidismo…………………..........29 Metabolismo del metimazol ……………………………………………………..…30

Antecedentes………………………………………………….…………………….……..32 Justificación………………………………………………….…………………….……...36 Hipótesis………………………………………………….…………………….……………36 Objetivo general................................................................................................................37 Objetivos particulares ……..........................................................................................37 II.- Métodos…………………………………………………………..…………………....38 Diseño experimental ……………………………..………………..……………………38 Evaluación de marcadores de estrés oxidativo………………………………..………39 Determinación de la peroxidación de lípidos ………………………………………39 Cuantificación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ……………………….40

Evaluación del sistema antioxidante….…………………………………………………40 Determinación del glutatión reducido (GSH), glutatión oxidado (GSSG) e índice GSH2/GSSG…………………………………………………………………......40 Determinación de la actividad de la GPX……………………………………...............41 Determinación de la actividad de la catalasa ……………………………….................41 Determinación de la actividad de la Cu/Zn-superóxido dimutasa (SOD), Mn-SOD y SOD total………………………..…………………………………...............42 Evaluación del ciclo del glutatión………………………………………………………….42 Determinación de la actividad de la γ-glutamilcisteina sintetasa (γ-GCS)………….…...42 Determinación de la glutatión reductasa (GR) ………………..……………………..…………42 Determinación de la glutatión-S-tranferasa …………………..………………………..43 Determinación de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GT)……..………………………….43 Determinación de proteínas………………….………………..………………………….43 Análisis estadístico………………………….…………………………………………….44

III.- Resultados……………………………………………………………………………..45 Evaluación de las variable físicas y determinación de la concentración sérica de hormonas tiroideas; calcio y fósforo sérico en ratas tratadas farmacologicamente con metimazol o tiroidectomía………………………..……………………………..45 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre el daño celular en hígado, riñón, corazón y bazo…………...………………………..48 Determinación de marcadores bioquímicos ……………………………..……..………51 Efecto del hipotiroidismo inducdio con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en hígado de ratas…………………………….………….51

Efecto del hipotiroidismo inducdio con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en riñón de ratas…………………….……….………….56 Efecto del hipotiroidismo inducdio con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en corazón de ratas…………………….……….……….63 Efecto del hipotiroidismo inducdio con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en bazo de ratas….…………………….……….…….….68

IV.- Discusión……………………………………………………………………………..74 Valoración del estado tiroideo de ratas tratadas farmacológicamente con metimazol o tiroidectomía………….……………………………………………....74 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomia sobre el daño celular en hígado, riñón, corazón y bazo…………………………………75 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomís sobre marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el hígado..………………………………...77 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomís sobre marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el riñón....………………………………...79 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomís sobre marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el corazón………………………………...80 Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomís sobre marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el bazo…..………………………………...82

V.- Conclusión…………………………………..…………………………………..………...85 VI.- Perspectivas…………………………………………………………………………..…86 VII.- Referencias ……………………….…………………………………………………...87

Lista de abreviaturas •CO2

Radical carbónico

Gs

Proteina G estimuladora

•NO2

Radical nitrito

GSH

Glutatión reducido

•OH

Radical hidroxilo

GSSG

Glutatión oxidado

A/B

Dominio amino terminal

GST

Glutatión S-transferasa

ALB

Albúmina

HR

Región visagra

ANDEVA Análisis de variancia

HT

Hormonas tiroideas

ANT

IL-

Interleucina

IP3

1,4,5-trifosfato de inositol Ácido lipoico

Adenina nucleotido translocasa

Asc-

Radical ascorbilo

LA

AscH-

Ascorbato

LAT

Transportador L-aminoácidos

CYP

Citocromos P450

LBD

Dominio de unión a ligando

DAG

Diacilglicerol

LO•

Radical alcohoxilo

DBD

Dominio de unión a DNA

LOO•

Radical hidroperóxido

DHLA

Ácido dihidrolipoico

LOOH

Hidroperóxido de

DI, DII, DIII

fosfolípido

Desyodasa I, II y III

EC

Clasificación enzimática

LP

Peroxidación de lípidos

EDTA

Ácido etilendiamino

MAO

Monoamina oxidasa

tetracético

NO

Óxido nítrico

Regulador de fosfatos con

NOS

Sintasa del óxido nítrico

EDTA

O2•-

Radical anión superóxido

FMO

Flavin mono oxigenasa

ONOO-

Peroxinitrito

GABA

Ácido γ-aminobutírico

OPT

o-ftaldialdehido

γ-GCS

γ-glutamilcisteina sintetasa

PBS

Solución reguladora de

Gq

Proteina Gq

GPX

Glutatión peroxidasa

GR

Glutatión reductasa

PLC

Fosfolipasa C

GRX

Glutarredoxina

PTU

6-propiltiouracilo

GST

Glutatión-S-tranferasa

REDOX

GT

Glutatión transpeptidasa

PUFA

Ácidos grasos

PKA

Proteín cinasa A

PUFA

Ácidos grasos

PKC

Proteín cinasa C

FEDTA

fosfatos

Óxido-reducción

poliinsaturados i

RM

Medidas repetidas

RNS

Especies reactivas de nitrógeno

ROS

Especies reactivas de oxígeno

RT

Receptores nucleares a HT

SERCA

Ca2+-ATPasa del retículo sarcoplásmico

SOD

Superóxido dismutasa

T2

3, 5-diyodotironina

T3

3, 5, 3´-triyodotironina

rT3

3, 3´,5´,-triyoditironina

T4

3, 5, 3´, 5´-tetrayodotironina

TBG

Globulina de unión a tiroxina

T-O•

Radical tocoferilo

T-OH

Vitamina E

TREs

Elemento de respuesta a HT

TRH

Hormona liberadora de tirotrofina

TSH

Tirotrofina

TTR

Transtirretina

TyrO•

Radical tirosilo

TyrOH

Grupo hidroxilo de la tirosina

UCP

Proteina desacoplante

ii

Relación de figuras Figura 1 Formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a partir del radical anión superóxido …………………………………………..…………………………………2 Figura 2 Vías de formación de ROS y peroxidación lipídica así como el papel del glutatión reducido y otros antioxidantes ………………………………………………………...5 Figura 3 Estructura del α-tocoferol……………………………………………………………...6 Figura 4 Potenciales de reducción teóricos de parejas REDOX………………………………...8 Figura 5 Relación de los procesos celulares con el cambio del potencial reductor del GSH2/GSSG………………………………………………………………………......9 Figura 6 Ciclo del glutatión (GSH) …………………………………………………………….10 Figura 7 Modelo general de los sistemas de regulación ……………………………………..13 Figura 8 Propuesta del modelo de regulación del ambiente REDOX..………………………...14 Figura 9 Esquema histológico de la tiroides …………………………………………………...18 Figura 10 Estructura química de las hormonas tiroideas…...…..………………………………19 Figura 11 Regulación de la síntesis y secreción de las HT ejercida por el eje hipotálamohipófisis-glándula tiroides ……………………………………………………………22 Figura 12

Desyodación de la T4 para convertirse en la hormona activa T3 ………………..….23

Figura 13

Metabolismo de las hormonas tiroideas ………..………………………………….24

Figura 14 Activación de receptores membranales para hormonas tiroideos …………………..27 Figura 15 Posible mecanismo de inactivación de la TPO por el metimazol…………………....29 Figura 16 Metabolismo del metimazol ………...……………………………………………....31 Figura 17

Efecto del hipotiroidismo sobre la temperatura rectal y el peso corporal en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía.…46

Figura 18 Cuantificación de hormonas tiroideas en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía……………………………47 Figura 19 Cuantificación de la concentración sérica de calcio y fósforo en ratas hipotiroideas inducidas por tiroidectomía…………………………………………………………48 Figura 20 Fotomicrografías características del bazo, higado riñón y corazón de animales hipotiroideos…………………………………………………………………………49 Figura 21 Cuantificación de la peroxidación de lípidos y ROS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en hígado…...……………51 iii

Figura 22 Cuantificación de GSH, GSSG y su índice en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en hígado…………………52 Figura 23 Determinación de la actividad de peroxidasas en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía……………………………53 Figura 24 Determinación de la actividad de GST y γ-GCS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en hígado…………………55 Figura 25 Cuantificación de la peroxidación de lípidos y ROS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en riñón…………………...57 Figura 26 Cuantificación de GSH, GSSG y su índice en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en riñón…………………..58 Figura 27 Determinación de la actividad de GR y GST en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en riñón……………….….62 Figura 28 Cuantificación de la peroxidación de lípidos y ROS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en corazón…..…………...63 Figura 29 Determinación de la actividad de GST, GR y γ-GCS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en corazón….……………65 Figura 30 Determinación de la actividad de las isoformas de la SOD en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en corazón…….66 Figura 31 Determinación de la actividad de las peroxidasa en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en corazón…….67 Figura 32 Cuantificación de la peroxidación de lípidos y ROS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en bazo….…..…………...68 Figura 33 Cuantificación de GSH, GSSG y su índice en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en bazo…………………..69 Figura 34 Determinación de la actividad de las isoformas de la SOD en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en bazo……….70 Figura 35 Determinación de la actividad de las peroxidasa en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en bazo………..71 Figura 36 Determinación de la actividad de GST y γ-GCS en ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol o por tiroidectomía en bazo….….……………72

iv

Relación de tablas Tabla 1

Características de las isoformas de la superóxido dismutasa…………………………16

Tabla 2

Variables físicas evaluadas ………………………………………………………... 45

Tabla 3

Actividad de las isoformas de la SOD en hígado de ratas tratadas con metimazol.....54

Tabla 4

Actividad de las isoformas de la SOD en hígado de ratas tiroidectomizadas…….....54

Tabla 5

Actividad de la γ-GT en hígado de ratas tratadas con metimazol...............................56

Tabla 6

Actividad de la γ-GT en hígado de ratas tiroidectomizadas………………………....56

Tabla 7

Actividad de las peroxidasas en riñón de ratas tratadas con metimazol......................59

Tabla 8

Actividad de las peroxidasas en riñón de ratas tiroidectomizadas…………..……....59

Tabla 9

Actividad de las isoformas de la SOD en riñón de ratas tratadas con metimazol.......60

Tabla 10

Actividad de las isoformas de la SOD en riñón de ratas tiroidectomizadas…..…......60

Tabla 11

Actividad de γ-GT y γ-GCS en riñón de ratas tratadas con metimazol......................61

Tabla 12

Actividad de γ-GT y γ-GCS en riñón de ratas tiroidectomizadas…………....….......61

Tabla 13

Cuantificación de GSH, GSSG y su índice en corazón de ratas tratadas con metimazol....................................................................................................................64

Tabla 14

Cuantificación de GSH, GSSG y su índice en corazón de ratas tiroidectomizadas…………………………………………………….……..……....64

Tabla 15

Cuantificación de la GR en bazo de ratas tratadas con metimazol……………….....73

Tabla 16

Cuantificación de de la GR en bazo de ratas tiroidectomizadas………….………....73

v

Resumen En su mayoría, los estudios que relacionan el hipotiroidismo con alteraciones del ambiente REDOX y daño celular están descritos en modelos farmacológicos, sin embargo, se ha observado que los anti-tiroideos presentan efectos extra-tiroideos y pueden contribuir al daño celular. Por lo que el objetivo de este trabajo fue comparar en un curso temporal, los marcadores de estrés oxidativo del ambiente REDOX y del ciclo del glutatión en hígado, corazón, riñón y bazo de ratas con hipotiroidismo inducido por metimazol o por tiroidectomía. Para ellos, se emplearon 104 ratas macho Wistar (240-260 g). Se realizaron dos estudios: el histológico y el bioquímico. Para el estudio histológico, se emplearon 20 ratas divididas en cinco grupos (n=4 c/u): control, falsa tiroidectomía, metimazol (60 mg/kg/d), metimazol (60 mg/kg/d) + reemplazo de T4 (20 μg/kg/d) y tiroidectomía. Los animales tratados farmacológicamente se sacrificaron a la 4ª semana de tratamiento, mientras que los animales sometidos a cirugía se sacrificaron hasta la 8a. Se disecó el hígado, bazo, corazón y riñón, para procesarlos por la técnica de inclusión en parafina y teñirlos con hematoxilina-eoxina. Para el estudio bioquímico, se emplearon 84 ratas divididas en dos grupos: 1) farmacológico y 2) sometido a cirugía. El grupo farmacológico fue dividido en dos subgrupos: control (n=24) y tratado con metimazol (n=24). A los animales del segundo subgrupo se les administró dicho fármaco por 4 semanas. Mientras que, el grupo sometido a cirugía se dividió en dos subgrupos: tiroidectomía (n=18) y falsa tiroidectomía (n=18). 12 animales del grupo farmacológico (6 ratas de cada subgrupo) fueron sacrificados por decapitación cada semana, hasta la cuarta. Mientras que, 12 animales del grupo de la cirugía (6 ratas de cada subgrupo) fueron sacrificados por el mismo método al término de la 2a, 4a y 8a semana. Se disecó el hígado, corazón, bazo y riñón. Se determinaron los marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión. El peso corporal, la temperatura rectal y la concentración plasmática de T3 y T4 disminuyeron en los grupos hipotiroideos. Con base en el estudio histológico, se demostró que el hipotiroidismo con metimazol induce daño celular en todos los órganos evaluados y que puede prevernirse parcialmente por el suplemento de T4. Dicho daño esta relacionado con un aumento de los marcadores de estrés oxidativo que no pueden ser compensados por los incrementos del sistema antioxidante. Incluso, en órganos como el bazo e hígado, la disminución de la actividad de la catalasa favorece el daño. En cuanto al hipotiroidismo inducido por tiroidectomía, no se observa daño celular y en algunos órganos se incrementa el sistema antioxidante. En conclusión, el metimazol aunado a las alteraciones provocadas por el hipotiroidismo provoca daño celular en el corazón, bazo, riñón e hígado. Mientras que el hipotiroidismo per se no ocasiona daño celular.

v

Abstract In most studies which link hypothyroidism with REDOX environment alterations and cell damage are described in pharmacological models, however, it has been observed extra-thyroid action of anti-thyroid drugs which can contribute to cell damage. The aim of this study was to compare in a temporal course, markers of oxidative stress, REDOX environment and glutathione cycle in liver, heart, kidney and spleen of rats with methimazole- or thyroidectomy-induced hypothyroidism. We used 104 male Wistar rats (240-260 g). Two studies were made: the histological and biochemical. For histological study, 20 rats were divided into five groups (n = 4 each one): control, false thyroidectomy, methimazole (60 mg/kg/d), methimazole + T4 replacement (20 μg/kg/d) and thyroidectomy. Pharmacologically treated animals were sacrificed at the 4th week, whereas animals undergoing surgery were sacrificed until the 8th week. It was dissected the liver, spleen, heart and kidney to be processed by paraffin inclusion. Cuts were stain with hematoxylineosin. For the biochemical study, 84 rats were divided into two groups: 1) pharmacological and 2) underwent surgery. The pharmacological group was divided into two groups: control (n = 24) and methimazole (n = 24). The second subgroup received the drug for 4 weeks. While, the surgery group was divided into two subgroups: thyroidectomy (n = 18) and false thyroidectomy (n = 18). 12 animals in the pharmacological group (6 rats of each group) were sacrificed by decapitation every week until the fourth. Whereas, 12 animals of the surgery group (6 rats of each subgroup) were killed by the same method at the end of the 2nd, 4th and 8th week. It was dissected the liver, heart, spleen and kidney. It was determined the markers of oxidative stress, REDOX environment, antioxidant enzymatic system and glutathione cycle. The body weight, rectal temperature and plasma concentration of T3 and T4 were decreased in hypothyroid groups. The histological study reveals that methimazole-induced hypothyroidism causes cell damage in all organs tested and it can prevent partially by T4 supplement. This damage is associated with an increased of oxidative stress markers which they were compensated by antioxidant system. In spleen and liver, the catalase activity is reduced and it promotes damage. The thyroidectomy-induced hypothyroidism did not cause cell damage and in some organs it increased the antioxidant system. In conclusion, both methimazole and hypothyroidism cause cell damage in the heart, spleen, kidney and liver. While hypothyroidism per se does not cause cell damage. vi 

I.- Introducción Regulación del ambiente óxido-reducción Todos los organismos mantienen un estricto ambiente óxido-reducción, el cual es de vital importancia para la fisiología celular. Dicha variable se mantiene regulada preservando la producción de compuestos pro-oxidantes, que se generan del metabolismo celular, y los elementos del sistema antioxidante. En condiciones fisiopatológicas, el ambiente REDOX puede modificarse provocando un estado de estrés oxidativo el cual provoca diversas cascadas de señalización que inducen daño celular, y que eventualmente podrían desencadenar la muerte.

Sistema oxidante Los elementos del sistema oxidante son radicales libres y las especies reactivas de diversos átomos o compuestos, tales como el oxígeno, nitrógeno, fierro, cobre, glutatión (GSH), por mencionar algunos. Los radicales libres son moléculas o fragmentos moleculares que contienen uno o más electrones desapareados en sus orbitales atómicos o moleculares. El que una molécula posea electrones desapareados le confiere la característica de ser muy reactiva con los centros nucleofílicos de varios compuestos (Halliwell & Gutteridge, 1999). En cuanto a las especies reactivas, éstas no necesariamente son radicales libres, pues por su naturaleza química al pH de 7.4 ± 0.1 pueden ser moléculas electroneutras con la capacidad de donar electrones a radicales libres, así como la oxidación de los metales de transición presentes en las células, sin embargo, independiente de los compuestos con los que interactúe termodinámicamente, se generarán cantidades mayores de oxidantes. Existen diversos grupos de compuestos que se consideran oxidantes, sin embargo los más importantes desde el punto de vista fisiológico son los compuestos derivados del oxígeno y del nitrógeno. De tal forma que los primeros son comúnmente llamadas especies reactivas de oxígeno (ROS) y los segundos se conocen como especies reactivas del nitrógeno (RNS). En condiciones fisiológicas, la presencia de ROS y RNS es necesaria para diversas vías de señalización (Valko et al., 2007).

1

Entre los elementos más importantes del sistema oxidante en los seres vivos se •-

encuentran: los radicales anión superóxido (O2 ) e hidroxilo (•OH), así como, el peróxido de hidrógeno (H2O2), el óxido nítrico (NO) y el peroxinitrito (ONOO-). La presencia de un electrón en el oxígeno molecular (O2) forma el radical libre •-

•-

anión superóxido (O2 ). El O2 puede generarse a partir de varias rutas metabólicas dentro de la célula. Una de las principales surge en la cadena respiratoria mitocondrial. Se sabe que en los complejos I (NADH:ubiquinina óxido-reductasa) y III (citocromo C •-

óxido-reductasa) se forma entre el 1 y el 4 % de O2 por una reducción incompleta del O2 total consumido. Por otro lado, complejos enzimáticos como el de la xantina oxidasa (EC 1.1.3.22) y los citocromos P450, así como la sintasa del óxido nítrico (NOS) o la •-

monoamina oxidasa (EC 1.4.3.10), entre otras, promueven la producción de O2 , al que se le considera como especie reactiva de oxígeno primaria, la cual puede interactuar con otras moléculas para generar especies ROS secundarias o especies RNS (Valko et al., 2007). •-

Como se observa en la figura 1, el O2 promueve la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (•OH) por diversas rutas químicas. Igualmente, el radical anión superóxido favorece la formación del peroxinitrito (ONOO-). .

Figura 1. Formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a partir del radical anión superóxido. (A) representa la dismutación del O2•- la cual puede ser espontánea o catalizada por la SOD. (B) muestra la reacción de Haber-Weiss. (C) simboliza la reducción del Fe+3 a Fe+2. (D) representa la reacción de Fenton. (E) muestra la formación de peroxinitrito (ONOO-).

2

•-

El O2 además de inducir la formación de ROS y RNS, puede inactivar a enzimas que participan en el sistema antioxidante, rutas metabólicas y de señalización, tales como: la catalasa (EC 1.11.1.6), la

glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.19), la

gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.2.1.12), la ornitina descarboxilasa (EC 2.1.3.3.) y la adenilil ciclasa (EC 4.6.1.1), por mencionar algunas (Halliwell & Gutteridge, 1999;Gutteridge & Halliwell, 2000). Con respecto al H2O2, éste se forma por acción de la dismutación espontánea o catalizada por la superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1). Dicho compuesto casi no presenta acciones oxidativas sobre las biomoléculas, sin embargo, el principal papel que desempeña dentro del proceso de estrés oxidativo es la generación del •OH, pues el H2O2 atraviesa las membranas celulares y llega a compartimentos que contienen metales de transición como Fe+2 o Cu+, de tal forma que los puede oxidar e inducir la formación del radical hidroxilo. En ese sentido, el •OH puede ser formado por vías dependientes •-

de O2 o H2O2 (Wlodek, 2002;Valko et al., 2007;Halliwell & Gutteridge, 1999). La forma neutra del ión hidróxido (OH-) es el •OH quien posee una alta reactividad (107-1010 M-1 s-1) con una vida media muy corta (10-9 s) (Pastor et al., 2000). De esta forma, cuando se produce in vivo el •OH reacciona cerca del sitio donde se formó y resulta muy tóxico cuando un metal catalizador se encuentra localizado sobre biomoléculas como DNA, fosfolípidos membranales o proteínas. El óxido nítrico (NO) es una molécula que contiene un electrón desapareado en el orbital 2πy*, por lo que muchos químicos le consideran un radical. El NO es un gas generado por la sintasa del óxido nítrico (NOS; EC 1.14.13.39), la cual metaboliza la conversión de la L-arginina a la L-citrulina con la formación de dicho radical (Bredt & Snyder, 1990). En condiciones fisiológicas, el óxido nítrico participa en procesos como: neurotransmisión, regulación de la presión arterial, mecanismos de defensa en contra de patógenos y regulación de la respuesta inmune, entre otras (Valko et al., 2007). El NO tiene una vida media corta en medio acuoso, sin embargo, en un medio hipóxico presenta mayor estabilidad y su vida media puede ser mayor de los 15 s (Chiueh, 1999). La producción excesiva del NO provoca la formación de especies reactivas del nitrógeno secundarias como el peroxinitrito (ONOO-) el cual tiene una constante de reacción muy alta (7x109 M-1s-1). De tal forma que el efecto tóxico del NO se encuentra estrechamente relacionado con la formación del ONOO-, ya que éste último es un 3

potente agente oxidante de membranas, lo que genera peroxidación lipídica (Valko et al., 2007). Además, la interacción del NO con otros compuestos provoca la generación de especies reactivas de nitrógeno secundarias, como el radical nitrito (•NO2). El •NO2 y el radical carbónico (•CO2) surgen de la reacción entre el ONOO- y el CO2. Dichos radicales median la nitrotirosilación de proteínas, debido a que al reaccionar con el grupo hidroxilo del aminoácido tirosina (TyrOH) de las proteínas se forma un radical libre tirosilo (TyrO•) el cual puede ser neutralizado por otro •NO2 (Winterbourn & Kettle, 2003).

Sistema antioxidante En organismos aerobios, son necesarias e indispensables concentraciones bajas de oxidantes en diversos procesos como crecimiento, diferenciación celular, apoptosis y respuesta inmune. Cuando existe un aumento del sistema oxidante se genera un estado de estrés oxidativo que puede provocar el mal funcionamiento de la célula e inclusive la puede llevar a la muerte. En ese sentido, existe un sistema antioxidante que puede neutralizar a ROS y RNS, para que el sistema funcione óptimamente. El sistema antioxidante se encuentra dividido en dos subsistemas, el enzimático y el no enzimático. Dentro del sistema antioxidante no enzimático se encuentran compuestos orgánicos como el ácido ascórbico, el α-tocoferol, los carotenoides, los flavonoides y el glutatión reducido (GSH), por mencionar algunos. Mientras que enzimas como la catalasa (EC 1.11.1.6), la glutatión peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.19) y la superóxido dismutasa, son consideradas la primera línea de defensa antioxidante enzimática. Sin embargo, existen otras enzimas que participan en el sistema antioxidante como la glutatión reductasa (GR; EC 1.6.4.2), la glutatión S-transferasa (GST; EC 2.5.1.18) y la tioredoxina reductasa (EC 1.6.4.5) (Wlodek, 2002;Valko et al., 2007;Halliwell & Gutteridge, 1999;Dorado-Martínez et al., 2003). Así, todos los componentes del sistema antioxidante mantienen en límites estrechos la concentración de oxidantes, para mantener la homeostasis de los organismos. En la figura 2, se presenta un esquema general del cómo interactúan algunos de los elementos más importantes tanto del sistema oxidante como del antioxidante.

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Figura 2. Vías de formación de ROS y peroxidación lipídica así como el papel del glutatión reducido (GSH) y otros antioxidantes (ácido lipoico, vitamina C y E). Reacción 1: el O2•se forma por el proceso de reducción del O2 mediado por la NAD(P)H oxidasa y el complejo xantina oxidasa o por vías no enzimáticas como las que involucra a la semiubiquinona en la cadena respiratoria mitocondrial. Reacción 2: el O2•- se dismuta por la superóxido dismutasa (SOD) a H2O2. Reacción 3: el H2O2 es neutralizado por la glutatión peroxidasa (GPX) empleando GSH como cofactor. Reacción 4: el glutatión oxidado (GSSG) es reducido a GSH por la glutatión reductasa (GR) empleando NADPH. Reacción 5: metales como el Fe+2 y Cu+ rompen al H2O2 en •OH. Reacción 6: el •OH toma un

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electrón de los lípidos poli-insaturados (LH) formando radicales lipídicos (L•). Reacción 7: el L• reacciona con el O2 formando radical peroxilo o hidroperóxido (LOO•). Si el LOO• no es neutralizado por el sistema antioxidante se provoca el proceso de peroxidación de lípidos (reacciones 15-23). Reacción 8: el LOO• se puede reducir por la vitamina E (T-OH) formando un hidroperóxido de fosfolípido (LOOH) y el radical de la vitamina E (T-O•). Reacción 9: el T-O• se regenera a T-OH por el sistema ascorbato (AscH-) radical ascorbilo (Asc-). Reacción 10: La regeneración del Asc- a AscH- e incluso la del T-O• a T-OH se encuentra mediada por la oxidación de GSH a GSSG. Reacción 11: el Asc- y el GSSG se reducen a AscH- y GSH por la conversión del ácido dihidrolipoico (DHLA) a ácido α−lipoico (ALA). Reacción 12: Se reduce de DHLA a ALA empleando NADPH. Reacción 13: Los LOOH se reducen a alcohol enzimaticamente por la GPX. Reacción 14: Los LOOH reacciona rápidamente Fe+2 para formar radical alcohoxilo (LO•), en menor grado el LOOH reacciona con el Fe+3 para formar radicales peroxilo (LOO•). Modificado de Valko y colaboradores (Valko et al., 2007).

Sistema antioxidante no enzimático Dentro de la célula existen diversos compuestos orgánicos nucleofílicos que cumplen la función de neutralizar a las especies reactivas. Entre los compuestos más importantes se tiene a la vitamina A, vitamina E, ácido ascórbico y ácido dihidrolipoico. El α-tocoferol es la forma más activa dentro del grupo de los tocoferoles o comúnmente llamada vitamina E. En la figura 3 se observa la estructura de la vitamina E, la cual tiene un anillo de cromano que es responsable de la actividad antioxidante, mientras que la cadena carbonada de fitilo mantiene a la molécula anclada a las membranas celulares. Se considera que el α-tocoferol es el antioxidante lipídico más potentes in vitro que inhibe la propagación de la peroxidación lipídica y el más importante de los que se encuentran en la circulación sanguínea.

Figura 3. Estructura del α-tocoferol (2R,4’R,8’R-tocoferol) tomada de Van Acker y colaboradores (Van Acker et al., 1993).

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La vitamina C o ácido ascórbico es imprescindible para la síntesis de diversas proteínas como colágeno, oxitocina y vasopresina. Su capacidad antioxidante radica en la reducción del radical tocoferilo anclado a las membranas celulares debido a su carácter hidrosoluble (ver reacciones 8-12 de la figura 2). Aunado a lo anterior, el ácido ascórbico puede reducir los nitritos e inhibir la formación de nitrosaminas (Fang et al., 2002). El ácido dihidrolipoico (DHLA) o ácido 6-8 dimercapto-octanoico es un compuesto orgánico que funge como cofactor de varias enzimas. La alta densidad electrónica en los dos grupos –SH le confiere la característica de ser un nucleófilo, lo que favorece la formación del anillo 1-2-diotiolano del ácido α-lipoico (LA) al interaccionar con especies reactivas. Inclusive, por sus grupos -SH es mucho más fácil oxidar al DHLA que a otros monotioles ya que el sistema LA/DHLA tiene un potencial REDOX de -32 mV. El DHLA a una concentración de 0.05-1 nM neutraliza las especies •OH, LOO•, ONOO- y ácido hipocloroso, incluso se ha observado que dicho antioxidante puede formar complejos estables con el Mn+2, Cu+2, Zn+2 y Fe+2 evitando la interacción oxidativa entre dichos metales de transición y biomoléculas. Finalmente, otras de las funciones antioxidantes del sistema LA/DHLA es la regeneración de antioxidantes como el ácido ascórbico, ya que reduce el radical dihidroascorbato y semidihidroascorbilo (Moini et al., 2002). Sin embargo, uno de los compuestos orgánicos antioxidantes más importantes es el GSH ya que de él depende en su mayoría el ambiente REDOX de la célula.

Sistema

glutatión

reducido-glutatión

oxidado

(GSH2/GSSG)

y

ambiente óxido-reducción (REDOX) Bases fisicoquímicas del ambiente REDOX En organismos aerobios, la vida depende de los procesos de oxidación que favorecen la movilización de electrones de moléculas orgánicas al oxígeno, ya que de ellos depende la producción de energía que es necesaria para el mantenimiento de los procesos celulares. En general, el flujo electrónico depende de los pares REDOX, sin embargo, el movimiento de electrones para proveer a la célula de energía sería imposible si no existiera un ambiente reductor. En ese sentido, se define al ambiente 7

REDOX como la suma de todos los estados REDOX de los pares óxido-reducción que se encuentran dentro de la célula (ambiente REDOX intracelular) o en el líquido extracelular (ambiente REDOX extracelular). Históricamente, se ha usado el término estado REDOX para definir al ambiente REDOX, no obstante, según Schafer y Buettner (Schafer & Buettner, 2001), con base en estudios fisicoquímicos definen el estado REDOX como el potencial de reducción de una pareja REDOX. Debido a que el ambiente REDOX involucra la transferencia de electrones, el modelo teórico de Schafer y Buettner (Schafer & Buettner, 2001) emplea la ecuación de Nernst, pues debido a que existe transferencia de electrones se muestra la participación de diversas parejas REDOX en el ambiente óxido-reducción. En la figura 4 se muestra el cambio de potencial de reducción medio (Epc1/2) de los pares REDOX involucrados en el mantenimiento del ambiente REDOX, los cuales implican la transferencia de dos electrones: 1) el sistema NADPH/NADP+ considerando una concentración 0.1 mM. 2) el sistema de la tiorredoxina reducida/tiorredoxina oxidada (TrxSH2/TrxSS) considerando una concentración de 15 μM.

% de oxidación del par reducido

3) el sistema GSH2/GSSG considerando una concentración de 3 mM

100

50

0 -400

-350

-300

-250

-200

-150 -150

E pc1/2 Potencial de reducción del par REDOX E (mV) (mV) pc1/2 (mV) Figura 4. Potenciales de reducción teóricos de las parejas REDOX involucradas en el mantenimiento del ambiente REDOX al incrementar la proporción del par oxidado. El • representa al par NADPH/NADP+, el ▲ representa al par TrxSH2/TrxSS, y el □ representa al par GSH2/GSSG. Modificado a partir de (Schafer & Buettner, 2001)

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Los tres pares REDOX antes mencionados participan en el mantenimiento del ambiente REDOX, debido a que las curvas que se generan presentan un modelo de tercer orden, el pKa de sus grupos se encuentra por arriba del pH fisiológico y la relación del par reducido respecto al oxidado es 1:100, 1:1000 o mayor. Por otro lado, aunque los tres sistemas amortiguadores intracelulares participan en el mantenimiento del ambiente REDOX, el par GSH2/GSSG es de quien depende fundamentalmente dicha variable. Esto se debe a que presenta la mayor concentración de los tres, es quien mejor amortigua los cambios de potencial entre -300 y -100 mV a pesar de variar la concentración del par reducido, además los cambios de su Epc1/2 se relacionan perfectamente con los procesos de proliferación celular, diferenciación, apoptosis y necrosis, como se observa en la figura 5 (Cai et al., 2000;Hwang et al., 1992;Jones et al., 1995;Cai & Jones, 1998;Kirlin et al., 1999).

Figura 5. Relación de los procesos de proliferación (I), diferenciación (II), apoptosis (III) y necrosis (IV) con los cambios del potencial de reducción medio del par GSH2/GSSG. El representa una concentración de 10 mM de GSH, el ■ representa una concentración de 3 mM de GSH y el▲ representa una concentración de 1 mM de GSH. Tomado de Schaffer y Buetchner (Schafer & Buettner, 2001).

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Ciclo del GSH y funciones biológicas La síntesis del glutatión reducido (GSH) o γ-L-glutamil-cisteinil-glicina involucra dos pasos enzimáticos dependientes de ATP que se llevan a cabo en el citoplasma celular. En la figura 6 se observa el ciclo del GSH.

Figura 6. Ciclo del glutatión (GSH). Donde GR es glutatión reductasa; GST, glutatión Stransferasa y GSSG, glutatión oxidado.

La síntesis del GSH inicia con el ingreso de sus precursores los aminoácidos glutamato, cisteina y glicina a la célula. El glutamato y la glicina pueden ingresar a la célula mediante transporte activo secundario. Algunos de los transportadores del glutamato cotransportan a la cisteina. Respecto a la cisteina, el ingreso a la célula también puede deberse al sistema de transporte de aminoácidos neutros. De hecho, se considera que la cisteina es el aminoácido limitante de la síntesis de GSH debido a que se presenta en menor concentración en plasma y tiene una menor Km (Aoyama et al., 2008). Una vez que los aminoácidos han ingresado a la célula, la γ-glutamilcisteina sintetasa (γ-GCS, EC 6.3.2.2) forma la γ-glutamilcisteina. El proceso de formación del producto involucra dos pasos, el primero es la interacción entre el glutamato y el ATP 10

en presencia de Mg+2 para formar γ-glutamilfosfato (intermediario), mientras que el segundo involucra la interacción del intermediario con la cisteina y la liberación de ADP (Griffith & Mulcahy, 1999). Este primer paso es el más importante en la formación de GSH ya que la γ-GCS es la enzima limitante de la síntesis del GSH. La γGCS es una enzima heterodimérica compuesto por una subunidad catalítica conocida como subunidad pesada (γ-GCSH Mr ≈ 73 KDa) y una subunidad reguladora o ligera (γGCSL Mr ≈ 31 KDa). La actividad de la γ-GCS depende fundamentalmente de los sustratos y es inhibida por el GSH. Incluso, la actividad de la γ-GCSL se encuentra bajo el control de cinasas como la protein-cinasa A (PKA) y PKC (Griffith, 1999). Termodinámicamente pueden ocurrir dos procesos una vez que se forma la γglutamilcisteina. Por un lado el compuesto puede ser empleado por la GSH sintetasa (GS, EC 6.3.2.3) para formar GSH al conjugarse con la glicina o puede interactuar con la γ-glutamilciclotransferasa para formar 5-oxo-L-prolina y L-cisteina. El camino que prevalece depende de la Km de cada enzima, en condiciones fisiológicas la Km de la GS es 12 veces mayor que la γ-glutamilciclotransferasa por lo que se favorece la formación de GSH en más del 95 % (Weber, 1999). Una vez que se ha sintetizado el GSH existen diversos procesos en los cuales participa: 1) En la hidrólisis del GSH del plasma para sintetizar de novo GSH por una célula, por ejemplo al secretar el hepatocito GSH otra célula puede hidrolizar el dicho compuesto en sus precursores (cisteinilglicina y glutamato) por la

γ-

glutamiltranspeptidasa (γ-GT, EC 2.3.2.2) que se expresa en la parte externa de la membrana plasmática. Los compuestos de cisteinilglicina o sus conjugados-S pueden ser sujetos a dipeptidasas para tener aminoácidos libres, capaces de ser introducidos a la célula e iniciar la formación de GSH (Konigsberg-Fainstein, 2008;Weber, 1999). 2) En la destoxificación de electrófilos al conjugar los electrofilos con carbonilos α y β insaturados mediante la glutatión-S.transferasa (GST, EC. 2.5.1.18). Esta reacción da como resultado la eliminación del electrófilo por el consecuente metabolismo de los gluatión-S-conjugados mediante las enzimas γ-GT y la cisteinilglicina dipeptidasa (Konigsberg-Fainstein, 2008). Aunque no siempre este proceso se presenta a favor de la célula, pues en ocasiones puede originar especies más tóxicas, como se abordará más adelante. 11

3) En la destoxificación del peróxido de hidrógeno por acción de las enzimas glutatión peroxidasa (GPX, EC 1.11.1.19) (Beckett & Arthur, 2005). 4) En el mantenimiento del ácido ascórbico y de la vitamina E (Van Acker et al., 1993). 5) En procesos de comunicación intracelular como modulador interno de diversas vías de señalización (Cruz et al., 2003). 6) En la modulación de receptores membranales como en el caso del receptor NMDA a nivel del sistema nervioso central (Oja et al., 2000) 7) En el transporte de metales como Cu+2, Hg+2, Pb+2 y Zn+2, entre otros (Filomeni et al., 2002). La concentración mitocondrial de GSH es aproximadamente de 11-15 mM. El ingreso de GSH a la mitocondría depende de los transportadores electroneutrales como el de los ácidos tricarboxílicos o el de los dicarboxílicos (Lash, 2006). En general, el índice GSH/GSSG es mayor de 10 para las células y organelos como mitocondria y núcleo, mientras que, el retículo endoplásmico posee el índice GSH/GSSG más bajo de (1-3) (Schafer & Buettner, 2001).

Modelo de regulación del ambiente REDOX Desde hace varios años los modelos de Russek en el campo de la regulación y control en Fisiología, presentan una forma sencilla de abordar a las variables fisiológicas comparadas con los modelos cibernéticos (Russek & Cabanat, 1983). Las generalidades de su modelo se presentan en la figura 7. Toda variable fisiológica para ser considera regulada necesita que: 1) sus valores oscilen en valores estrechos, 2) un receptor cense sus valores 3) el receptor informe a un comparador, el cual coteja el valor de la variable con un punto de regulación, 4) el centro integrador mande asas de información a los elementos de la entrada (retroalimentación) o a la salida (anteroalimentación) que generalmente son las variables controladas para mantener a la variable regulada dentro de sus límites

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Figura 7. Modelo general de los sistemas de regulación propuesto por Russek (Russek & Cabanat, 1983).

En general el modelo esta descrito para todas las variables fisiológicas, sin embargo es posible traslapar este modelo a las variables intracelulares, sólo que se presentaran ciertas diferencias. Particularmente, nuestro grupo de investigación considera al ambiente REDOX como una variable intracelular regulada dado que posee los elementos antes descritos. En la figura 8, se presenta el modelo propuesto por nuestro grupo de trabajo. En nuestro modelo se consideran dos variables reguladas que participan activamente en el mantenimiento de ambiente REDOX: la concentración de ROS y RNS, así como el Ehc del par REDOX GSH2/GSSG. Las ROS y RNS son censadas en los microorganismos por proteínas como la oxyR, sosRS, Hsp33, el complejo Yap1-GPX3, PrXI y PrXII, por mencionar las más importantes. Dichas proteínas que fungen como receptoras también actúan como moduladores para activar vías de señalización intracelular. La función final de la comunicación intracelular es disminuir la generación de especies reactivas y/o su neutralización al estimular la expresión de enzimas antioxidantes. Además, se ha propuesto que activan vías de supervivencia celular para evitar la muerte, aunque en condiciones extremas de estrés oxidante se favorece la apoptosis e incluso la necrosis.

13

Figura 8. Propuesta del modelo de regulación del ambiente REDOX

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En los mamíferos se tiene un esquema parecido, sin embargo las primeras proteínas que censan las especies reactivas a menores concentraciones son la PKC, el citocromo c reducido y las PTKs. Estas últimas juegan el papel más importante dado que favorecen la fosforilación de factores transcripcionales que fungen como señalizadores. Entre los factores que se activan se encuentran la p38, ERK, JNK, akt, PKC, C-Ab1 y NFkB, por mencionar algunos. A su vez, éstos estimulan a otras proteínas o favorecen la transcripción de genes. En general lo que se promueve es un aumento de la expresión y actividad de enzimas antioxidantes; reducción en la producción de especies reactivas y/o su neutralización; además se favorece la expresión de factores de supervivencia y se inhiben las señales de muerte. Por otro lado, las RNS y ROS pueden favorecer nitrosilación, formación de conjugados del ácido sulfénico, sulfínico, suldenilamidas o tiosulfinatos con residuos de cisteína, tirosina y/o metionina de las proteínas, modulando así su actividad (Filomeni et al., 2002;Halliwell & Gutteridge, 2007;Valko et al., 2007;Barford, 2004;Haddad, 2004;Haddad, 2002;Adler et al., 1999) La otra variable que se considera regulada es el potencial del par REDOX GSH2/GSSG. En primer lugar, la γ-GCS censa la concentración de GSH, al disminuir ésta, se estimula la síntesis de GSH para enfrentar los procesos oxidantes. Si hay más disponibilidad de GSH se favorece la neutralización de peróxido de hidrógeno y la transferencia de electrófilos al GSH por la GST. Además, la glutarredoxina (GRX) una enzima tiol-disulfuro óxido-reductasa, se estimula al incrementar las proteínas glutationiladas por el incremento de las especies reactivas. La desglutationilación de una proteína puede hacer que recupere su función. Incluso, el GSH y el proceso de glutationilación pueden modular factores transcripcionales que incrementen la expresión de enzimas antioxidantes, sobre todo si actúan en el elemento de respuesta a antioxidantes (le-Donne et al., 2007;Rebrin & Sohal, 2008;Gallogly & Mieyal, 2007).

Sistema antioxidante enzimático La superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1) es una de las enzimas de la primera línea de defensa antioxidante ya que cataliza la dismutación del O2•- para formar peróxido de hidrógeno (figura 2-A). En mamíferos se ha demostrado la

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existencia de tres isoformas, las características de dichas enzimas se presentan en la tabla 1. Tabla 1. Características de las isoformas de la superóxido dismutasa Nombre

Peso molecular

Metal

Localización

SOD citoplásmica o SOD-1

Homodímero de 64 KDa

Cu/Zn

Citoplasma

SOD mitocondrial o SOD-2

Homotetrámero de 96 KDa

Mn

Mitocondria

SOD extracelular o SOD-3

Homotetrámero de 135 KDa

Cu/Zn

Extracelular

Referencia (Chang et al., 1988;Crapo et al., 1992) (MillanCrow et al., 1998) (Marklund et al., 1982)

El gene de la Cu/Zn-SOD se localiza en el cromosoma 21 (región 21q22), presenta cinco exones y cuatro intrones. Los estímulos que incrementan la expresión del mRNA de la Cu/Zn-SOD son: la presencia de metales pesados, H2O2 y óxido nítrico. De hecho, se ha observado que el NFκB es uno de los factores transcripcionales que controla la producción del mRNA de dicha isoenzima. En el caso de la Mn-SOD, se ha demostrado que las ratas presentan dos genes que expresan el mismo mRNA y que los estímulos que aumentan la trascripción de los genes de la Mn-SOD son la presencia de interleucinas (IL-1, IL-4, IL-6 e interferón γ). Finalmente, el gene de la SOD-3 se ha encontrado en el cromosoma 6 y aunque diversas citocinas inducen el aumento del mRNA, no se ha observado que incremente su expresión (Zelko et al., 2002). Sin embargo, el NO provoca la sobre-expresión de la SOD-3 en células del músculo liso. La actividad destoxificadora de la SOD se ha relacionado con procesos como la muerte celular, ya que existen reportes que indican que aumentos en la actividad y expresión de la Mn-SOD inhiben el proceso apoptósico (Kahl et al., 2004). Por otro lado, las enzimas encargadas de neutralizar el peróxido de hidrógeno son llamadas peroxidasas. Existen dos grupos de peroxidasas muy importantes en la célula, la catalasa (EC 1.11.1.16) y la glutatión peroxidasa (GPX, EC 1.11.1.19). La catalasa es una enzima homotetramérica de 240 KDa que contiene un solo grupo de ferriprotoporfirina por subunidad (Matés et al., 1999). Dicha enzima presenta una constante de reacción aproximada de 1x107 M-1s-1 con una baja energía de activación (2500-7100 kJ/mol), lo que favorece una rápida hidrólisis del H2O2. En condiciones 16

experimentales se ha demostrado que la catalasa sufre una rápida inactivación por el sustrato a una concentración de 0.1 M (Aebi, 1984). Además, el incremento de la expresión y el aumento de actividad de la catalasa se relacionan con proliferación celular en cáncer, debido a que inhibe el proceso apoptósico por disminuir la concentración intracelular de H2O2 (Kahl et al., 2004). Por otro lado, la GPX es una selenoenzima capaz de neutralizar al peróxido de hidrógeno empleando dos moléculas de GSH que eventualmente se oxidan a GSSG. La GPX contiene una sóla selenocisteina en cada una de las cuatro subunidades idénticas de 21 KDa. Hasta el 2005, se han descrito 6 isoformas de la GPX. Todas las isoformas neutralizan al peróxido de hidrógeno, sin embargo la GPX-4 es la única capaz de neutralizar los hidroperóxidos de fosfolípidos productos de la peroxidación lipídica (Beckett & Arthur, 2005).

Estrés oxidativo En condiciones fisiológicas, los organismos aerobios presentan un estricto balance en su ambiente REDOX celular, lo que implica que siempre existe la producción de pro-oxidantes que son contrarrestados por el sistema antioxidante hasta un estado estable, sin llegar nunca a un equilibrio estático. Sin embargo, existen circunstancias que provocan un desbalance en el ambiente REDOX que se caracterizan por aumentos de los elementos del sistema oxidante o disminución del sistema antioxidante, lo que ocasiona un estado de estrés oxidativo. El estrés oxidativo entonces debe ser clasificado como temporal, adaptativo o irreversible (necesario para varios procesos celulares) y en estrés oxidativo irreversible que conlleva a daño celular. El estrés oxidativo puede alterar la estructura de las biomoléculas lo que se traduce en pérdida de la función. Así, eventos de estrés oxidativo pueden terminar en muerte celular (Dorado-Martínez et al., 2003;Halliwell & Gutteridge, 1999). Entre los marcadores que se han empleado para evaluar los efectos del estrés oxidativo, se encuentran los productos terminales de peroxidación lipídica (malondialdehido, bases de Schiff y 4-hidroxinonenal), productos del daño al DNA (8hidroxi-20-desoxiguanosina), productos de carbonilación (2-pirrolidona, semialdehido glutámico,

ácido

2-amino-3-cetobutírico)

o

nitración

proteica

(nitrotirosina),

cuantificación del ambiente REDOX (GSH, GSSG y el radio GSH2/GSSG), por mencionar algunos (Dalle-Donne et al., 2006).

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Hormonas tiroideas Glándula tiroides La glándula tiroides se deriva del endodermo, tiene forma de mariposa y se localiza en la parte anterior del cuello, abrazando a la tráquea e inmediatamente por debajo del cartílago cricoides. En los mamíferos, la glándula tiroides consiste de dos lóbulos mantenidos en su posición por la cápsula tiroidea, que es una extensión de la aponeurosis cervical. Dicha glándula posee tres ligamentos; uno medio, que se extiende de la laringe a la parte media de la tiroides, y otros laterales, que van de los lóbulos laterales de la tráquea al cartílago cricoides. También es sostenida por los vasos tiroideos, conjuntamente con sus vainas conjuntivas. La estructura funcional de la glándula tiroides es el folículo tiroideo formado por células epiteliales cúbicas. La morfología de las células foliculares puede variar de planas hasta cilíndricas dependiendo de la actividad que presenten, la que a su vez se encuentra en función de la hormona tirotrofina (TSH) (figura 9) (Hadley, 2000).

Célula parafolicular

Membrana basal

B Célula epitelial folicular

Coloide

A Lagunas de reabsorción Microvellosidad

C

Figura 9. Esquema histológico de la tiroides, el cual muestra los folículos tiroideos. A: estado en reposos. B: estructura normal. C: en condiciones de una gran actividad. Tomada de Cuellar-García (Cuellar-García, 2002).

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Estructura y características fisicoquímicas de las hormonas tiroideas La estructura química y el modelo molecular correspondiente de las hormonas tiroideas se presentan en la figura 10. Las principales hormonas secretadas por la glándula tiroides son la 3, 5, 3´, 5´-tetrayodotironina (T4) y la 3, 5, 3´-triyodotironina (T3) con un peso molecular de 777 Da y 651 Da, respectivamente. Sin embargo, se ha mencionado que los subproductos de la degradación metabólica de la T3, como son la 3, 3´,5´,-triyoditironina o triyodotironina reversa (rT3) y la 3, 5-diyodotironina (T2) pueden tener cierto grado de actividad biológica, como se abordará después (Hulbert AJ, 2000). Los grupos amino, carboxilo y fenólico de las hormonas tiroideas pueden ionizarse dadas sus características químicas. En el caso de los grupos fenólicos, se encuentran disociados en un 50% a un pH de 10, además conforme aumentan los átomos de yodo en la tironinas el pK del grupo fenólico disminuye, por ejemplo para el caso de T3 el pK es de 8.45, mientras que para T4 es de 6.73 (Gemill, 1955).

Figura 10. Estructura química de las cuatro hormonas tiroideas biológicamente activas. Tiroxina

(T4),

3´,3,5-triyodotironina

(T3),

3´,5´,5-triyodotironina

(rT3)

y

3,

5-

diyodotironina (T2) . Tomada de Hulbert (Hulbert AJ, 2000).

A pH fisiológico, aproximadamente el 80% de T4 y el 10% de T3 tienen su grupo enólico ionizable, esta gran diferencia promueve los diferentes grados de hidrofobicidad de cada hormona (Korcek & Tabachnick, 1976). El límite de solubilidad de T4 en solución acuosa depende del pH, por ejemplo, se puede solubilizar 2.3 μM de la hormona a un pH de 7.0; 4.5 μM a un pH de 9.0 y 260 μM a un pH de 11.0 (Schreiber & Richardson, 1997). Por otro lado, el coeficiente de partición entre 19

fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina, y un ambiente acuoso es de 12000 para T4 y de 22000 para la T3 a un pH fisiológico (Hillier, 1970).

Sistema transportador de hormonas tiroideas Para que las hormonas tiroideas (HT) sean tranportadas desde el lugar de síntesis hasta el sitio de acción, es necesario un sistema que se encuentra compuesto por tres proteínas plasmáticas, globulina de unión a tiroxina (TBG), transtirretina (TTR) y albúmina (ALB). De las tres proteínas, la TBG es quien presenta la mayor afinidad por la T4, ya que tiene una constante de afinidad de 1x10-10 M, mientras que la TTR presenta una constante de afinidad de 7x10-7 M. Por otro lado, la albúmina es quien posee la menor afinidad para la T4, pues tiene una constante de afinidad de 7x10-5 M. Las proteínas transportadoras tienen menor afinidad para T3 (Hulbert AJ, 2000). En la revisión elaborada por Schreiber y Richardson (Schreiber & Richardson, 1997) se menciona que la ALB es la primera proteína que aparece en la escala evolutiva. Mientras que la TTR (proteína secretada por el plexo coroideo) es la encargada de transportar las HT a las células del sistema nervioso central (SNC). En el caso de la TBG, se ha demostrado que es la principal responsable de la concentración sérica total de T4 en el humano. Finalmente, para que las HT induzcan sus efectos en sus células blanco, las hormonas que llegan hasta la periferia de la célula deben de ser ingresadas al citoplasma; para ello existen dos mecanismos, el pasivo y el activo. En el caso del mecanismo pasivo, simplemente existe una difusión siguiendo un gradiente de concentración debido a que las HT son lipofílicas (Lai et al., 1985). En cuanto al mecanismo activo, las HT pueden ser introducidas por endocitosis de las proteínas transportadoras o por activación de acarreadores específicos, dependientes de ATP o por transporte activo secundario, el cual emplea el gradiente de sodio para introducir a la hormona. Entre los transportadores de HT localizados en membrana celular externa se encuentran

el

co-transportador

de

taurocolato/Na+

(SLC10A1),

polipéptidos

transportadores de aniones orgánicos independiente de sodio P1 y P2 (SLC21P1 y SLC21P2), y el acarreador de soluto de familia 7 independiente de Na+ perteneciente al sistema de transporte de L-aminoácidos LAT1 y LAT2. Así mismo, se cree que la disulfuro isomerasa (PDI) y dos proteínas membranales, aún desconocidas, de pesos

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moleculares de 52 KDa y 27 KDa, podrían participar en el transporte activo de las HT (Hennemann et al., 2001).

Regulación de la concentración sérica de las hormonas tiroideas. Eje hipotálamo-hipófisis-glándula tiroides La concentración sérica de HT se regula, por las hormonas provenientes del eje hipotálamo-hipófisis (figura 11). El modulador más importante de las HT es la TSH o tirotrofina. La síntesis y secreción de la TSH en la adenohipófisis, se estimula por la hormona liberadora de tirotrofina (TRH) que es secretada por el hipotálamo y es transportada hasta la adenohipófisis a través del sistema porta hipofisiario. La secreción de TRH y TSH se controla por las HT mediante un mecanismo de retroalimentación negativa (Nussey & Whitehead, 2001). La TSH es una glicoproteina de 211 aminoácidos y un peso molecular de 28 KDa, además presenta una vida media de una hora en circulación. La TSH está formada de dos subunidades, α y β, esta última es quien confiere la especificidad biológica a la TSH. El receptor de membrana a TSH se encuentra acoplado a proteína Gs y Gq que estimula la actividad de la adenilato ciclasa y la fosfolipasa C, respectivamente. La primera activa a la vía de la PKA, mientras que la fosfolipasa C estimula la hidrólisis de fosfatidilinositoles a IP3 (trifosfato de inositol) y diacilgilcerol (DAG), a su vez el IP3 aumenta la concentración de Ca2+ mientras que el DAG activa a la proteín-cinasa C. Los mecanismos

antes descritos inducen la

transcripción y traducción de proteínas como la tiroglobulina y peroxidasa tiroidea. Por otro lado, la activación de los receptores a TSH induce la captura de yodo. Con respecto a la TRH, se sabe que es un tripéptido secretado por las células del núcleo paraventricular del hipotálamo, el cual estimula la liberación de TSH a nivel de la adenohipófisis mediante la activación DAG e IP3 a partir del acople TRH- Gq (Hulbert, 2000b;Nussey & Whitehead, 2001;Hadley, 2000;Hulbert AJ, 2000).

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Figura 11. Regulación de la síntesis y secreción de las HT ejercida por el eje hipotálamohipófisis-glándula tiroides. Modificado de Nussey y Whitehead (Nussey & Whitehead, 2001).

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Síntesis y metabolismo de hormonas tiroideas El principal producto de la glándula tiroides es la T4 y presenta baja afinidad por receptores nucleares a HT. A nivel sistémico una proporción de T4 es convertida en T3 por desyodación, esta última es considerada la hormona biológicamente activa por tener la mayor afinidad por sus receptores nucleares, mientras que la T4 se considera una prohormona. La vía principal del metabolismo de dicha hormona se muestra en la figura 12, y como se puede observar se realiza por desyodación progresiva de la molécula de T4. La desyodación se logra gracias a las desyodasas (EC 1.97.1.11) las cuales son selenoproteínas que presentan en su centro activo una selenocisteína, la que por su capacidad nucleofílica, favorece la eliminación del yoduro del grupo tirosilo de las hormonas tiroideas. La activación de las hormonas tiroideas inicia con la desyodación de la T4 por dos isoenzimas, la 5'-desyodasa tipo I y II (DI y DII), para formar T3 o rT3, según se pierda el átomo de yodo de la posición 5' del anillo externo (5'-desyodación) o del anillo interno (5-desyodación) respectivamente. Además, la DII puede desyodar a la rT3 para formar T2. Por otro lado, la DIII favorece la inactivación de T3 y T4 por formar T2 y rT3 (Köhrle, 1999).

Figura 12. Desyodación de la T4 para convertirse en la hormona activa T3. Tomado de Bianco y Kim (Bianco & Kim, 2006).

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Varios tejidos pueden metabolizar las yodotironinas por diferentes vías. En la figura 13 se muestran las diferentes reacciones que se pueden llevar a cabo para eliminar a las hormonas tiroideas. En el hígado y riñón, la T3 puede ser conjugada con donadores de grupo sulfato como el 3´-fosfatoadenosina o el 5´-fosfosulfato. Mientras que la T4 es glucuronidasa sólo en el riñón. La glucuronidación es un proceso enzimático que se cataliza por la uridina difosfato-glucuronosiltransferasa. En general, los sulfato-conjugados son excretados por la bilis, mientras que los glucurónconjugados son eliminados por la orina. Además, existen vías alternas para degradar a las tironinas como: desaminación, descarboxilación y ruptura del enlace éter. Aproximadamente el 80% de la T4 se metaboliza a través de la desyodación (40% hacia T3 y el otro 40% hacia rT3); el 20% restante se metaboliza por las otras vías produciendo metabolitos con poca o nula actividad biológica (Wu et al., 2005;Bianco & Kim, 2006).

Figura 13. Metabolismo de las hormonas tiroideas. DIT: diyodotironina; tetrac: ácido tetrayodotiroacético; tetram: tetrayodotironamina. Modificado de Wu y cols. (Wu et al., 2005).

Mecanismo de acción genómico de las hormonas tiroideas Debido a la existencia de receptores nucleares para hormonas tiroideas, durante mucho tiempo se creyó que las HT sólo inducían sus efectos por vía genómica, sin embargo, desde finales de la década de los ochentas se ha propuesto que las HT pueden

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inducir efectos independiente a la maquinaria genética, ya que afectan la composición de lípidos membranales o la activación de enzimas (Lazar, 1993). Los receptores para hormonas tiroideas (RT) son proteínas que fungen como factores transcripcionales que pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares donde están incluidos los esteroides, vitamina D, ácido retinoico, ácidos grasos, prostaglandinas y receptores huérfanos (Zhang & Lazar, 2000). Los RT tienen regiones como el dominio de unión a DNA (DBD), dominio de unión a ligando (LBD), región bisagra (HR) y dominio amino terminal (A/B) (Sap et al., 1986). Las HT atraviesan la membrana lipídica debido a su naturaleza hidrofóbica, en el citoplasma pueden unirse a los RT recién sintetizados, sin embargo, la mayoría de las HT se unen a receptores nucleares. Los RT unidos a las HT pueden regular el proceso de transcripción modificando la estructura de la cromatina, permitiendo que otros factores ejerzan su acción sobre elementos respuesta de las HT (TREs). Además, los RT interactúan, directamente o indirectamente a través de moléculas puente o coactivadoras, con la maquinaria del proceso transcripcional. Un aspecto crítico en la regulación del proceso de transcripción por los RT, es el cambio conformacional que la T3 ejerce sobre el propio receptor. La T3 disminuye la capacidad hidrofóbica de los RT y puede modificar el modo por el cual los RT, ya sea en forma de dímero o heterodímero, se unen al DNA. El modelo actual del mecanismo de acción de las hormonas tiroideas establece que los RT se unen al TREs para regular la transcripción, en forma de monómero, homodímero, heterodímero o heteromultímero. La unión de la hormona tiroidea al RT provoca cambios en la estructura de estos complejos modulando así la interacción con otros elementos del aparato transcripcional que determinará el tipo de respuesta: estimuladora o inhibidora (Hulbert AJ, 2000). Existen dos isoformas que inducen la transactivación de los RT, los cuales están codificados por los genes α y β. La traducción del mRNA del gen TRα genera tres proteínas TRα-1, TRα-2 y TRα-3 (c-erbAα-2 ó TRv1), de las cuales la segunda es incapaz de unirse a la T3 debido a que contiene un aminoácido carboxi-terminal en la posición 122, el cual reemplaza la región de unión a T3 crítica para unir HT, sin embargo, puede unirse débilmente a los TREs, pero sin transactivar genes respuesta a HT, por ello se cree que es un controlador negativo de la acción de las HT (Hulbert AJ, 2000).

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Mecanismo de acción extragenómico de las hormonas tiroideas Existen diversas rutas por las cuales las HT pueden inducir sus efectos sobre los sistemas biológicos, independiente de la vía de los receptores nucleares y afectan principalmente a las membranas lipídicas y la actividad de diversas enzimas. Desde hace tiempo, se ha evaluado la influencia de las HT sobre la composición de las membranas lipídicas. Se ha observado que las membranas de los glóbulos rojos de ratas hipotiroideas presentan mayor concentración de fosfolípidos y colesterol respecto de sus controles (Digiorgio et al., 1988). La disminución de HT induce el incremento de

fosfolípidos 18:2 y una

disminución de los 20:4, posiblemente por una reducción de la actividad de la desaturasa Δ6 y la Δ5, que provoca el acúmulo de lípidos 18:2 como precursores de síntesis de cadenas largas, debido al bloqueo en las vías de formación de especies n-6 (Hoch, 1988;Hulbert, 2000a;Hulbert AJ, 2000) . Incluso, se ha observado que la acilcomposición de las membranas se modifica porque las HT afectan el ciclo de acilación/reacilación,

específicamente,

la

T4

modifica

la

acilación

de

la

lisofosfatidiletanolamina en corazón de rata (Hulbert AJ, 2000). Por otro lado, la hipótesis acerca del control de la actividad enzimática por HT se comprobó con el experimento de Davis y colaboradores (Davis et al., 1983) al evaluar la actividad de la Ca2+-ATPasa de eritrocitos maduros de humanos con alteraciones tiroideas. Se demostró que la concentración de hormonas tiroideas correlacionaba con la actividad enzimática independientemente de los mecanismos genéticos. Aunado a la evidencia anterior, Lawrence y su grupo de trabajo (Lawrence et al., 1989) encontraron un aumento de la actividad de la PKC al adicionar T3 o T4 a glóbulos rojos. Respecto al aumento de actividades enzimáticas por efecto de las HT, se observa en la figura 14 que, principalmente la T4, interactúan con receptores membranales del tipo integrina. La integrina es un heterodímero que al ser activado favorece la estimulación de la vía de las MAPK por activación de PLC y PKC. En ese sentido, es posible la activación de enzimas como proteínas transportadoras. Incluso, se cree que la fosforilación de receptores membranales por la vía de las MAPK es necesaria para su traslocación al núcleo (Davis et al., 2005).

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Figura 14. Activación de receptores membranales para hormonas tiroideos. Modificada de Davis y colaboradores (Davis et al., 2005).

Efectos de las hormonas tiroideas Durante mucho tiempo se ha establecido que T3 es la única hormona activa, mientras que T4 es sólo una pro-hormona y que las otras tironinas son sólo subproductos del metabolismo de T4 y T3, por lo que se dice que presentan muy baja o nula actividad biológica. Sin embargo, existen evidencias de que cada una de la tironinas juegan un papel importante en diversas funciones celulares, por ejemplo existen genes específicos como los que codifican para la enzima málica y la cadena β de la TSH, los cuales sólo se activan cuando T4 se encuentra unida a los receptores nucleares (Bogazzi et al., 1997). Con respecto a los efectos no genómicos de T4, se ha observado que dicha tironina es necesaria para la correcta polimerización de la actina F durante el desarrollo 27

neuronal (Farwell et al., 1995). Con respecto a la T2 existen evidencias que la relacionan con el proceso calorigénico (Leary et al., 1996;Lanni et al., 1994;Horst et al., 1995). El metabolismo basal, así como la termogénesis, son dos procesos que involucran a la mitocondria, los cuales son estrictamente controlados por las hormonas tiroideas. Inicialmente se propuso a T3 como la única tironina controladora de los procesos antes mencionados, sugiriendo que la acción se debía a la activación de genes nucleares y a la expresión del genoma mitocondrial, sin embargo, hay estudios que muestran que T2 también participa en el metabolismo basal y la termogénesis (Leary et al., 1996;Lanni et al., 1994;Goglia et al., 1994). En relación con los efectos a corto plazo de las HT sobre la mitocondria, se ha encontrado que T2 afecta a la citocromo c oxidasa y de esta manera activa la cadena respiratoria. Así mismo, T3 induce la estimulación del acarreador de la adenina nucleótido translocasa (ANT) (Sterling & Brenner, 1995) y la activación de la sintasa de la cardiolipina, la cual afecta a diversos sistemas de acarreadores y enzimas (Paradies & Ruggiero, 1989). Se ha propuesto que las HT también ejercen sus efectos a nivel del genoma mitocondrial, debido a que se han encontrado proteínas en la membrana interna, las cuales tienen mucha similitud con los TR nucleares, una de ellas es la proteína de 28 KDa, la cual sirve de unión a T3, a dicha biomolécula también se le ha denominado proteína de Stearling o p28. La p28 (no encontrada en núcleo) parece ser un receptor c-erbAα−1 truncado, que aparentemente puede afectar la síntesis de los componentes de la cadena respiratoria, como las proteínas desacoplantes (UCPs) y la ANT. Además, se ha encontrado otro c-erbAα−1 truncado en mitocondria, al cual se le denominó p43. Dicha proteína sirve de anclaje para el DBD e incrementa la transcripción y síntesis de proteínas a nivel mitocondrial (Wrutniak-Cabello et al., 2001). Las HT también afectan la fisiología de tejidos excitables como el muscular y el nervioso. A nivel de músculo liso se ha observado que las HT participan en la regulación y síntesis de la isoforma G4 de la acetilcolinesterasa. Además, las HT afectan el flujo de iones Na+ y Ca2+ debido a que se induce sobre-expresión de canales de Na+ y Ca2+. Incluso, las HT provocan un aumento en la expresión de la Ca2+-ATPasa localizada en el retículo sarcoplásmico (SERCA), ya que existen los TREs en los genes que codifican para la isoforma SERCA1 (Hulbert AJ, 2000). A nivel del músculo cardíaco, se ha observado que las HT inducen cambios en la actividad eléctrica, lo cual

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se encuentra asociado con los cambios de los fosfolípidos membranales, antioxidantes membranales y vitamina E (Venditti et al., 1997).

Modelos experimentales para el estudio del hipotiroidismo En la actualidad existen dos grandes grupos de modelos para el estudio del hipotiroidismo: el grupo de los modelos farmacológicos y el de los no farmacológicos. En el grupo de los modelos farmacológicos se encuentran los que emplean tionamidas

como

la

tiourea,

propiltiouracilo

(PTU)

y

metimazol

(2-

mercaptometilimidazol) los cuales intervienen en la organificación de la tiroglobulina o la desyodación periférica, principalmente la hepática. El inconveniente de este tipo de modelos es que la interacción del fármaco no es exclusiva del sistema de las hormonas tiroideas y puede interactuar con otros sistemas presentándose efectos adversos. Incluso, en ocasiones es difícil interpretar si los efectos estudiados se deben al hipotiroidismo, al fármaco o al efecto sumado de ambos (Cooper, 2005;Bandyopadhyay et al., 2002) Particularmente, el metimazol evita la organificación de la tiroglobulina debido a que inhibe irreversiblemente a la peroxidasa tiroidea (TPO, EC 1.11.1.7). Por modelos teóricos, se cree que el metimazol al interactuar con el centro catalítico de la enzima forma sulfenilyodometimazol (intermediario) el cual formará un compuesto disulfuro con otra molécula de metimazol. Posteriormente, el compuesto disulfuro formará metilimidazol el cual puede estar ligado al centro catalítico (ver figura 15) (Cooper, 2005).

Figura 15. Posible mecanismo de inactivación de la peroxidasa tiroideo por el metimazol.

Tomado de Cooper (Cooper, 2005).

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En el grupo de los modelos no farmacológicos se encuentran aquellos que al no emplear fármacos sólo afectan el sistema de la glándula tiroides, como la tiroidectomía y la tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides. Incluso, se ha considerado la aplicación de I131 como un modelo quirúrgico pues la glándula tiroides es quién lo incorpora provocando una tiroidectomía (Tenorio-Velásquez et al., 2005) En realidad el mejor modelo para el estudio del hipotiroidismo es la tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides porque sólo se afecta al sistema en estudio sin alterar otro sistema.

Metabolismo del metimazol En la figura 16 se muestra un esquema del metabolismo del metimazol. El metimazol (1a) es biotransformado por los citocromos P450 (CPY) al 4-5 epóxido (6) el cual forma un intermediario tipo hemicetal (7) el cual se rompe en dos productos el glioxal (8) y la N-metilurea (5b). A nivel hepático, por acción de la enzima microsomal flavinmonoxigenasa (FMO, EC 1.14.13.8), la N-metilurea forma conjugados 5-oxidados con el ácido sulfínico y sulfénico (9 y 10). Existen estudios que demuestran que ésos últimos pueden provocar citotoxicidad hepática al disminuir la concentración intracelular de GSH (Mizutani et al., 1994). Por otro lado, el metimazol por acción de la FMO puede ser conjugado con ácido sulfínico y sulfénico (13 y 14) los cuales tambien guardan cierto grado de toxicidad. Además, existen reportes que demuestran que la tioureas oxidadas pueden conjugarse con el GSH, ya sea en forma espontanea o mediados por la GST (Krieter et al., 1984). En la orina de pacientes o animales tratados con metimazol se encuentran productos como el glioxal y N-metilurea

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Figura 16. Metabolismo del metimazol. Tomado de Mitzuni y colaboradores (Mizutani et al., 1994).

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Antecedentes Las hormonas tiroideas juegan un papel muy importante en el mantenimiento de los procesos bioquímicos y fisiológicos como el desarrollo, la diferenciación y el mantenimiento de la homeostasis del metabolismo de todas las células; esto de debe a sus efectos genómicos o extra-genómicos sobre las células, lo que afecta a moléculas de importancia biológica como DNA, proteínas o lípidos (Sarkar, 2002). Uno de los efectos más estudiados de las hormonas tiroideas es la aceleración de la tasa metabólica basal (Freake & Oppenheimer, 1995). Respecto a este punto, se ha sugerido que el hipertiroidismo induce desacople electrónico a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial (Venditti & Di Meo, 2006). Las alteraciones mitocondriales asociadas al hipertiroidismo favorecen la generación de ROS, lo que induce eventos de estrés oxidativo que pueden llevar a la muerte celular (Venditti et al., 1997;Venditti & Di Meo, 2006). Por el contrario, el hipotirodismo se ha relacionado con protección ante estímulos dañinos que generan estrés oxidativo como la hipoxia (Rastogi et al., 2006). Sin embargo, este punto es controversial ya que el hipotiroidismo ocasiona alteraciones en el ambiente óxido-reducción (REDOX) que podrían estar relacionadas con la modificación de la acil-composición de las membranas (Hoch, 1988) desbalance del sistema antioxidante (Das & Chainy, 2001;Das & Chainy, 2004;Hulbert AJ, 2000;Mano et al., 1995;Sarandöl et al., 2005) y del ciclo del glutatión (Dasgupta et al., 2005;Dasgupta et al., 2007). Incluso, el modelo empleado para inducir hipotiroidismo podría participar en los eventos de estrés oxidativo y daño celular. Es posible que alteraciones en el sistema antioxidante participen en los eventos de estrés oxidativo, ya que se ha demostrado que la disminución de HT modifica variables del sistema antioxidante, aunque depende del modelo anti-tiroideo empleado, órgano evaluado, duración y dosis del tratamiento. En ese sentido, se ha observado que la administración de 6-propiltiouracilo (PTU) al 0.05 % durante 30 días provoca una reducción del índice GSH/GSSG en testículos de rata, debido a la disminución del GSH y al aumento del GSSG (Choudhury et al., 2003). Usando el mismo fármaco antitiroideo, pero a una dosis de 10 mg/kg durante 14 días, Mogulkoc y cols. (Mogulkoc et al., 2005) han demostrado que los niveles de GSH se reducen tanto en testículo como en riñón. Además, Das y Chainy (Das & Chainy, 2001) empleando PTU 0.05% durante 32

tres semanas, encontraron una reducción del índice de GSH/GSSG en hepatocitos de ratas hipotiroideas, incluso, el mismo grupo observó que la corteza cerebral de ratas hipotiroideas presentó un aumento en la concentración de GSSG (Das & Chainy, 2004). En el caso de SOD, se ha demostrado que en homogeneizados de hígado de ratas con deficiencia tiroidea, se aumenta la actividad de las isoformas Cu/Zn- y Mn-SOD (Das & Chainy, 2001), mientras que en el testículo se presenta una disminución de SOD total (Choudhury et al., 2003). El efecto del hipotiroidismo en corazón es controversial, ya que Chattopadhyay y Zaidi (Chattopadhyay et al., 2003) encontraron aumento de la actividad de la SOD en la fracción mitocondrial, mientras que Shinohara y cols. (Shinohara et al., 2000) no encontraron diferencias. Además, en homogeneizados de cerebro completo de ratas tratadas con metimazol, no se modifica la actividad de las isoformas de SOD (Rastogi et al., 2006), mientras que, en la corteza cerebral el tratamiento anti-tiroideo con PTU provocó una disminución de Cu/Zn-SOD y un aumento de Mn-SOD (Das & Chainy, 2004). El sistema de las peroxidasas tampoco presenta un patrón común de actividad debido al estado hipotiroideo. Hay reportes que indican que el empleo de metimazol, como anti-tiroideo, favorece el aumento de las enzimas antioxidantes catalasa y las isoformas de la SOD en el tejido adiposo café de ratas (Petrovic et al., 2005). Sin embargo, en el mismo modelo de hipotiroidismo, Mano y colaboradores (Mano et al., 1995) observaron que en el cerebro de ratas hipotiroideas, los niveles de catalasa no se modifican, mientras que se presenta un aumento de la actividad de GPX y las isoformas de la SOD. Rastogi y colaboradores (Rastogi et al., 2006) corroboraron que el metimazol no induce cambios en la actividad de la catalasa en el cerebro de ratas. No obstante, en el corazón de ratas tratadas con metimazol se presenta un aumento en la actividad destoxificadora de la GPX sin cambios en la actividad de la catalasa (Mano et al., 1995), mientras que en el mismo órgano, la generación de hipotiroidismo con PTU no modifica la actividad de la catalasa (Chattopadhyay et al., 2003), lo que fue reproducido por Venditti y colaboradores (Di Meo et al., 1995;Venditti et al., 1995) que, además, encontraron incrementos de GPX en músculo esquelético, pero no en homogeneizados de hígado. Sin embargo, el empleo de PTU como anti-tiroideo indujo una disminución de la actividad de catalasa en el hígado (Das & Chainy, 2001), sin alteraciones en el corazón (Chattopadhyay et al., 2003), mientras que en el cerebro de ratas aumentó la actividad de las dos peroxidasas (Das & Chainy, 2004). Finalmente,

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con el empleo de modelos no farmacológicos como el del I131, se ha demostrado que en homogeneizados de riñón, la actividad de la catalasa no se modifica, mientras que la GPX se incrementa (Sawant et al., 2003). lo que se relaciona parcialmente con el modelo de hipotiroidismo promovido por tiroidectomía total con reimplante de glándula paratiroides, ya que se encontró que el hipotiroidismo no modifica la actividad de enzimas antioxidante (Tenorio-Velásquez et al., 2005). Por otro lado, el hipotiroidismo clásico inducido por fármacos de tipo tioamida como el metimazol y el PTU presentan efectos secundarios. Se ha reportado, que estos compuestos pueden provocar anemia, agranulocitosis e inmunosupresión, (Gessl & Waldhausl, 1998;Rojano et al., 1998); también, se conoce que el metimazol estimula la secreción del ácido gástrico y el pepsinógeno (Bhattacharjee et al., 1998) además puede inducir daño a la mucosa olfatoria (Bergman & Brittebo, 1999b) y auditiva (Genter, 1998). Por otra parte, se ha reportado que las tioamidas pueden inducir artritis (Bajaj et al., 1998;Tosun et al., 1995), erupciones papulares, parestesias, dolor de cabeza, náuseas y despigmentación del cabello (Bartalena et al., 1996). En el caso del hipotiroidismo experimental en ratas inducido con metimazol, los individuos de experimentación presentan una marcada alteración de la homeostasis del zinc, magnesio y calcio (Simsek et al., 1997). Incluso hay reportes de que en humanos ha ocasionado síndromes como lupus eritematoso (Wang et al., 2003), pancreatitis y parotiditis (Taguchi et al., 1999), y la exposición a drogas antitiroideas durante los tres primeros meses de embarazo puede ocasionar teratogénesis en el producto (Wilson et al., 1998). Se ha encontrado que el metimazol daña a las células del hígado (Arab et al., 1995) y ocasiona aplasia congénita del cutis (Vogt et al., 1995). También se sabe que, el PTU y el metimazol aumentan los niveles séricos de creatina cinasa (Suzuki et al., 1997) y también ocasionan pancitopenia (Macia et al., 1997) cuando se administran en pacientes con enfermedad de Graves. En gatos hipertiroideos después del tratamiento con metimazol, se ha encontrado una disminución de la tasa de filtración glomerular (Becker et al., 2000). Por otra parte, tanto el PTU como el metimazol ocasionan una inhibición irreversible de las peroxidasas con grupo hemo, en el caso de la eosinofilperoxidasa, peroxidasa intestinal, peroxidasa de la médula ósea, peroxidasa uterina inducida por estrógenos (Lee et al., 1988), lactoperoxidasa y peroxidasa gástrica (Chattopadhyay et al., 2003).

34

En general, existen diversos factores que se deben considerar en los modelos de hipotiroidismo cuando tratan de relacionar eventos de estrés oxidativo y daño celular. Así, los reportes de los modelos farmacológicos son inconsistentes y podrían dar información errónea en el campo del estrés oxidante, dado los efectos secundarios de los antitiroideos. De tal forma, nuestro interés fue determinar en un curso temporal marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX y del ciclo del glutatión en homogeneizados de hígado, corazón, riñón y bazo de ratas con hipotiroidismo inducido por metimazol o tiroidectomía para esclarecer la incógnita del hipotiroidismo y el daño celular.

35

Justificación El hipotiroidismo se ha relacionado paradójicamente con eventos de daño celular y con protección celular. Sin embargo, en la mayoría de los estudios se han empleando modelos farmacológicos. En los últimos años se ha demostrado que los anti-tiroideos presentan efectos adversos extra-tiroideos que pudieran estar involucrados con procesos de estrés oxidativo y daño tisular, dependiendo del tiempo, órgano evaluado y duración del tratamiento. Por lo que es más conveniente desarrollar modelos que reduzcan la concentración de hormonas tiroideas sin afectar otro sistema, como es la tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides.

Hipótesis

Si el metimazol que provoca hipotiroidismo induce estrés oxidativo y dainhibición de las peroxidasas con grupo hemo, entonces es posible que dicho fármaco y no la disminución en la concentración sérica de hormonas tiroideas sea quien cause las alteraciones en el ambiente REDOX

36

Objetivo general Comparar en un curso temporal marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX y del ciclo del glutatión en homogeneizados de hígado, corazón, riñón y bazo de ratas con hipotiroidismo inducido por metimazol o por tiroidectomía.

Objetivos particulares 1. Evaluar el daño celular presente en hígado, corazón, riñón y bazo de ratas con hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía. 2. Evaluar en un curso temporal en hígado, riñón, corazón y bazo: •

Marcadores de estrés oxidativo (peroxidación de lípidos y especies reactivas de oxígeno).

•

Marcadores del ambiente óxido-reducción (concentración del glutatión reducido (GSH y oxidado (GSSG), así como el radio GSH2/GSSG).

•

Marcadores del sistema antioxidante enzimático (actividad de las isoformas de la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutatión peroxidasa).

•

Marcadores del ciclo del glutatión (actividad de la γ-glutamilcisteina sintetasa,

glutatión

reductasa,

transpeptidasa).

37

gutatión-S-tranferasa

y

γ-glutamil

II.- Métodos Diseño experimental Se emplearon 104 ratas macho de la cepa Wistar, con un peso de 240 a 260 g, las cuales se mantuvieron en jaulas individuales con alimento y agua ad libitum, en cámaras con temperatura regulada y ciclos de luz-oscuridad 12:12 h (las luces encienden a las 8:00 a. m.). Los procedimientos realizados en este trabajo se apegaron a la norma NOM-082-ZOO-1999 para el manejo de animales de laboratorio. Se realizaron dos estudios: el histológico y el bioquímico. Para el estudio histológico, se emplearon 20 ratas las cuales se dividieron en cinco grupos experimentales, de cuatro animales cada uno. Los grupos empleados fueron el eutiroideo, falsa tiroidectomía, hipotiroidismo inducido con metimazol (60 mg/kg/d), metimazol (60 mg/kg/d) + reemplazo de T4 (20 μg/kg/d) y tiroidectomía. Los animales de los grupos eutiroideo y tratados con metimazol fueron sacrificados por decapitación a la cuarta semana, mientras que los sometidos a cirugía fueron sacrificados a la octava por el mismo procedimiento. Se disecó el hígado, corazón, bazo e hígado y se fijaron en Buoin para ser procesados por la técnica convencional de inclusión en parafina. Se obtuvieron cortes de 7 μm y se tiñeron por la técnica de hematoxilina-eosina. La descripción histológica se realizó a doble ciego. Para el estudio bioquímico los animales fueron divididos en dos grupos experimentales: 1) grupo farmacológico y 2) grupo sometido a cirugía. El grupo farmacológico se dividió en dos subgrupos: eutiroideo (n=24) e hipotiroidismo inducido con metimazol (n=24). A los animales pertenecientes al segundo subgrupo se les administró dicho fármaco a una dosis de 60 mg/kg/d, solubilizado en el agua de beber, durante cuatro semanas. La dosis del fármaco se ajustó cada tercer día. El segundo grupo se dividió en dos subgrupos: falsa tiroidectomía (n=18) y tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides (n=18). Para realizar la tiroidectomía los animales se anestesiaron con ketamina-xilazina. En condiciones asépticas, se realizó una incisión a nivel del músculo estenotiroideo y se descubrió la tráquea. Se localizaron las glándulas paratiroides y se disecaron, para reimplantarlas en

38

el músculo pectoral. La glándula tiroides fue removida completamente. A los animales sometidos a cirugía se les administró gentamicina (50 mg/kg) y ketorolaco (10 mg/kg) durante cinco días. Durante todo el tratamiento, se evaluó indirectamente el estado tiroideo de los animales midiendo la temperatura rectal y el peso corporal. En el estudio bioquímico, seis animales de cada subgrupo, del grupo farmacológico, fueron sacrificados por decapitación desde la primera semana y hasta la cuarta. Mientras que, seis animales de cada subgrupo, del grupo sometido a cirugía fueron sacrificados por el mismo método al término de la segunda, cuarta y octava semana. El día del sacrificio se disecó el hígado, riñón, corazón y bazo, los cuales fueron mantenidos a -70 ºC hasta la determinación de los marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, la actividad de enzimas antioxidantes y del ciclo del glutatión. Además, se obtuvieron muestras de suero en las que se determinó la concentración de hormonas

tiroideas

por

el

método

de

ELISA

inmunocompetitivo

(ICN

Pharmaceuticals). Además, sólo en el grupo sometido a cirugía se determinó la concentración sérica de calcio y fósforo mediante el empleo del kit de RANDOX. La evaluación de los marcadores de estrés oxidativo, ambiente REDOX, sistema antioxidante enzimático y ciclo del glutatión fueron validadas con muestras obtenidas y procesadas al momento.

Evaluación de marcadores de estrés oxidativo Determinación de la peroxidación de lípidos Para evaluar la peroxidación de lípidos (Cano-Europa et al., 2008b;Cano-Europa et al., 2008a), cada muestra fue homogeneizada en 5 ml de regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4. Se tomaron alícuotas de 1 ml del homogenizado y se adicionaron 4 ml de una mezcla de cloroformo-metanol (2:1 v/v), posteriormente se agitaron durante 10 s. Para permitir la separación de las fases acuosa y clorofórmica, las muestras se mantuvieron a 4 °C durante 30 min protegidas de la luz. Pasado ese tiempo, la fase acuosa se aspiró y se desechó con ayuda de una bomba de vacío. Finalmente, se tomaron 2 ml de la fase orgánica

(clorofórmica)

y

se

determinó

la

fluorescencia

empleando

un

espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS5, a longitudes de onda de 370 nm 39

de excitación y 430 nm de emisión. La sensibilidad del espectrofotómetro se ajustó a 140 unidades de fluorescencia con una solución de quinina a una concentración de 0.001 mg/ml. Los resultados se expresaron como unidades relativas de fluorescencia (URF)/mg de proteínas.

Cuantificación de las especies reactivas del oxígeno (ROS) Las ROS se cuantificaron empleando el método del diacetato de 2’,7’diclorofluorescina (DCFH-DA), el cual es desesterificado por la presencia de peróxido de hidrógeno produciendo una molécula más oxidada (2’,7’-diclorofluoresceina o DCF), la cual es capaz de fluorescer (Ali et al., 1992;Cano-Europa et al., 2008a). El DCF tiene una longitud de excitación a 488 nm y una longitud de emisión de fluorescencia máxima a los 525 nm. Para ello, se tomaron 10 μl del homogeneizado y se colocaron en 1950 μl de regulador TRIS: HEPES (18:1). La fracción diluida se incubó con 50 μl de DCFH-DA por 1 h a 37 °C en agitación constante. La reacción se detuvo colocando las muestras en hielo, inmediatamente se tomó la lectura de la fluorescencia en un espectrofotómetro Perkin-Elmer LS5, a longitudes de onda de 488 nm de excitación y 525 nm de emisión. Los resultados se expresaron como DCF formado/h/mg proteínas.

Evaluación del sistema antioxidante Determinación del glutatión reducido (GSH), glutatión oxidado (GSSG) e índice GSH2/GSSG A 100 μl del homogeneizado empleado para peroxidación de lípidos se les adicionó 15 μl de H3PO4 al 30 %. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 12, 000 g por 30 min a 4 ºC. Para la cuantificación de GSH, se tomaron 30 μl de una dilución 1:10 del sobrenadante en un volumen final de 1.9 ml de regulador de fosfatos 100 mM con EDTA 5 mM (FEDTA) y se agregaron 100 μl de o-ftaldialdehído (OPT). Se determinó la fluorescencia de la muestra empleando un espectrofotómetro PerkinElmer LS5 con longitud de emisión de 420 nm y 350 nm de excitación. Para determinar la concentración de GSSG se tomaron 75 μl del sobrenadante y se mezclaron con 35 μl de N-etilmaleimida. 60 μl de la mezcla se colocó en un volumen final de 1.9 ml de 40

FEDTA. Finalmente, se agregó 100 μl de OPT y se determinó la fluorescencia bajo las mismas condiciones de la cuantificación de GSH. Los resultados se expresaron como ng de GSH o GSSG/mg de proteínas (Cano-Europa et al., 2008a). El radio se obtuvo haciendo la relación GSH2/GSSG como se ha propuesto previamente (Cano-Europa et al., 2008a;Schafer & Buettner, 2001)

Determinación de la actividad de la GPX Se empleó la técnica de Hafeman y colaboradores (Hafeman et al., 1974), modificada (Cano-Europa et al., 2008a) la cual consiste en evaluar la actividad destoxificadora de la GPX reduciendo el H2O2 por la oxidación del GSH. Se colocaron 60 μl del homogeneizado en 3 ml de regulador de fosfatos 100 mM pH 7.0, el cual contenía EDTA 0.4 mM, NaN3 10 mM y GSH 2 mM. La mezcla de reacción se incubó por 5 min a 37 ºC. Posteriormente se adicionó 1 ml de H2O2 1.25 mM para iniciar la reacción. Se tomaron dos muestras a los 5 y 10 min de iniciada la reacción y se colocaron en 1.2 ml de solución precipitante (NaCl 30 g y ácido metafosfórico 1.6 g en 100 ml). Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm y se realizó una dilución 1:2 con regulador de fosfatos 400 mM. Finalmente, se agregaron 250 μl de ácido 5,5-ditio-bis2-nitrobenzoico y se obtuvo la absorbancia a 412 nm. Los resultados se expresan como μg de GSH oxidado/min/mg de proteínas.

Determinación de la actividad de la catalasa Para la evaluación de la actividad de la catalasa, se utilizó la técnica de Aebi (Aebi, 1984), la cual evalúa la degradación de H2O2 a 240 nm. Se colocaron 10 μl del homogeneizado en 3 ml de regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4 que contenía H2O2 30 mM. Se determinó la absorbancia cada 15 s durante 30 s. Los resultados se expresaron como velocidad de reacción de una cinética de primer orden (k) por mg de proteína.

41

Determinación de la actividad de la Cu/Zn-superóxido dismutasa (SOD), Mn-SOD y SOD total Para la evaluación de la actividad de la SOD, se empleó la técnica de Crapo y colaboradores (Crapo et al., 1978), la cual evalúa el cambio de absorbancia por minuto del citocromo C a 550 nm. Se colocaron 20 μl del homogeneizado en 2.85 ml de sustrato (EDTA 1 mM, citocromo c reducido 10 μM, azida de sodio 10 μM y xantina 100 μM solubilizados en regulador de carbonatos 10 mM con tritón X-100 al 0.02%). La reacción inició al adicionar 50 μl de xantina oxidasa a la muestra. Para discriminar la actividad de la Cu/Zn-SOD de la Mn-SOD, se realizó una incubación con KCN 1 mM. Se considera una unidad de actividad de SOD como la cantidad de enzima que disminuye la proporción de reducción del citocromo c en un 50 %. Así, los resultados se expresaron como U de SOD/mg de proteína.

Evaluación del ciclo del glutatión Determinación de la actividad de la γ-glutamilcisteina sintetasa (γGCS) Se colocaron 100 mg de proteínas en regulador tris-HCl 0.01 M pH 7.5 el cual contenía 250 mM de sacarosa. Cada muestra se centrifugó a 1000 g por 20 min a 4 °C. Se colocaron 100 μl del sobrenadante en 1 ml de mezcla de reacción (ATP 5 mM, MgCl2 20 mM, L-glutamato 10 mM, L-α-aminobutirato 10 mM, EDTA 2 mM, albúmina bovina 0.005 % en regulador tris-HCl 0.01 M pH 7.5) y se incubó a 37 °C por 1 h. La reacción fue detenida con 1 ml de ácido tricloroacético al 10%. Las muestras se centrifugaron a 5, 000 g por 1 min. Del sobrenadante se determinó la cantidad de fósforo liberado (Pi) de la hidrólisis del ATP empleando la técnica de Taussky y Shorr (Taussky & Shorr, 1953). Los resultados se expresan como μg de P5+ liberado/mg proteínas/h

Determinación de la glutatión reductasa (GR) Para determinar la actividad de la glutatión reductasa se empleó la técnica de (Carlberg & Mannervik, 1975), la cual se basa en la reducción del GSSG mediante la 42

oxidación del NADPH. Para ello, se emplearon 50 mg de proteínas en regulador de fosfatos 100 mM pH 7.0 el cual contenía GSSG 1 mM, NADPH 0.1 mM a una temperatura de 37 °C. Se determinó la absorbancia a 340 nm al inicio y después de 10 minutos. Se realizó una curva tipo de NADPH y los resultados se expresaron como μmoles NADPH usado/mg proteínas/min.

Determinación de la glutatión S-transferasa (GST) Se colocaron 100 mg de proteínas del homogeneizado usado para peroxidación de lípidos en regulador tris-HCl 0.1 M pH 8.2 el cual contenía GSH 10 mM. La reacción inició al colocar 1-cloro-2,4-dinitrobenceno 50 mM a 37 ºC. Se monitoreo el incremento de absorbancia a 340 nm por minuto. Se consideró 1 U de GST a la formación de 1 μmol de S-2,4-dinitrofenilglutatión considerando ε340= 10 mM-1 cm-1. Así, los resultados se expresaron como U/mg proteínas/min (Sulakhe et al., 1990).

Determinación de la actividad de la γ-glutamil transpeptidasa (γ-GT) Se emplearon 100 mg de proteínas las cuales se colocaron en 1 mL de sustrato que contenía γ-glutamil p-nitroanilina 1 mM y glicilglicina 20 mM en regulador de triHCl 100 mM pH 8.0. Se preincubó durante 1 min a 37 ºC y se monitoreó la absorbancia a 410 nm por minuto durante 4 minutos. Se consideró el ε340= 8800 M-1 cm-1 de la pnitroanilina para expresar los resultados como μmoles de p-nitroanilina forma/mg proteínas/min (Dasgupta et al., 2005)

Determinación de proteínas La cuantificación de proteínas se realizó por la técnica de Bradford, la cual se basa en la reacción de los aminoácidos aromáticos de las proteínas con el azul brillante de Coomasie G-250 (Bradford, 1976).

43

Análisis estadístico Todos los resultados se presentan como la media ± el error estándar de la media. Para la parte histológica, las variables de peso corporal, temperatura rectal y concentración sérica de hormonas tiroideas, se analizaron con una prueba de análisis de variancia (ANDEVA) unifactorial y Student-Newmann-Keuls post hoc. Para los experimentos temporales, las variables físicas (peso corporal y temperatura rectal) se analizaron empleando la prueba de ANDEVA bifactorial de medidas repetidas. Para la cuantificación de hormonas tiroideas, determinación de peroxidación de lípidos, ROS, GSH, GSSG, GSH2/GSSG, actividad de las isoformas de la SOD, catalasa, GPX, γ-GCS, GR y GST y γ-GT se aplicó la prueba de ANDEVA bifactorial. Los análisis de variancia bifactoriales serán seguidos de la prueba de Student-Newmann-Keuls. En los análisis bifactoriales se consideró el tiempo y el tratamiento como factores. En todos los análisis los valores que presentaron una P < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

44

III.- Resultados Evaluación de las variables físicas y determinación de la concentración sérica de hormonas tiroideas; calcio y fósforo sérico en ratas tratadas farmacológicamente con metimazol o tiroidectomía En la tabla 2 se presentan los resultados de las variables físicas evaluadas para determinar el estado tiroideo de los animales empleados en el estudio histológico. Se observa que el hipotiroidismo inducido por la administración de metimazol (60 mg/kg) o por la extirpación de la glándula tiroides, favorece una disminución del peso corporal, la temperatura rectal y la concentración sérica de T4. La concentración sérica de T3 no es afectada por ningún tratamiento. Además, se observa que el grupo con reemplazo de T4 se comporta igual que el grupo control. Tabla 2. Variables físicas evaluadas en los grupos analizados Control

Falsa tiroidectomía

Metimazol

Metimazol + T4

Tiroidectomía

Peso corporal (g)

334 ± 6

352 ± 10

305 ± 8 *

341 ± 7

277 ± 5 *

Temperatura rectal (°C)

37.7 ± 0.02

37.8 ± 0.03

37.1 ± 0.02 *

37.8 ± 0.04

36.5 ± 0.4 *

T3 (nmol/l)

2.00 ± 0.01

2.03 ± 0.02

2.03 ± 0.01

2.02 ± 0.03

2.07± 0.06

T4 (nmol/l)

138.19 ± 10.94

111.60 ± 21.04

57.40 ± 12.40 *

152.19 ± 23.64

93.00 ± 9.40 *

Los valores mostrados representan el promedio de 5 experimentos independientes ± error estándar. * P < 0.01 comparado contra el control.

En la figura 17 se muestran los resultados de las variables físicas determinadas para seguir el estado hipotiroideo del estudio bioquímico. Se puede observar que ambos modelos inducen la disminución de la temperatura rectal (paneles A y C), con el antitiroideo a partir de la segunda semana y por cirugía a partir de la cuarta semana Respecto al peso corporal (paneles B y D), los animales hipotiroideos inducidos con metimazol presentan un menor peso respecto a los controles a la cuarta semana de tratamiento. En el caso de la cirugía, desde la segunda semana, los animales tiroidectomizados presentan menor peso corporal respecto a sus controles. 45

C

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

38

* * *

37

36

Temperatura rectal (ºC)

Temperatura rectal (ºC)

A 39

39

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

38

37

* ****

36

D 525

375 350 325 300

*

275 250 225

Peso corporal (g)

Peso corporal (g)

B 525 500 475

475 425 375

* * * * **

325 275 225

0

1

2

3

4

0

Semanas de tratamiento

1

2

3

4

5

6

7

* 8

Semanas de tratamiento

Figura 17. Efecto del hipotiroidismo inducido por metimazol o por tiroidectomía sobre la temperatura rectal (A y C) y el peso corporal (B y D). En el panel A y B se presentan los resultados de las ratas hipotiroideas inducidas con metimazol (A y B) mientras que el panel C y D representa los resultados de las ratas hipotiroideas por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 6-24 evaluaciones repetidas ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

El estado tiroideo fue corroborado por la determinación de la concentración de hormonas tiroideas (ver figura 18). En el caso de la tiroxina (paneles A y C) se observa que tanto el metimazol como la cirugía ocasionan que disminuya la concentración de dicha hormona a partir de la segunda semana de tratamiento. En el caso de la triyodotironina (paneles B y D), el hipotiroidismo inducido con metimazol ocasiona una disminución de su concentración durante la segunda y cuarta semana, mientras que la cirugía ocasiona una disminución en la octava semana.

46

Euitorideas Hipotiroidismo inducido con metimazol

125 100 75

*

50

*

25 0

*

150 125 100 75 50 25

Concentración sérica de T 3 (nmoles/L)

B 8 6 4 2

*

0 1

*

2

3

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

C Concentración sérica de T 4 (nmoles/L)

150

Concentración sérica de T 3 (nmoles/L)

Concentración sérica de T 4 (nmoles/L)

A

4

0

*

D 8 6 4

*

2 0 2

Semanas

*

*

3

4

5

6

7

8

Semanas

Figura 18. Cuantificación de las hormonas tiroideas T4 (A y C) y T3 (B y D) de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 6 evaluaciones ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

En los grupos sometidos a cirugía, la concentración sérica de calcio y fosforo no presentan diferencias (figura 19)

47

B

Falsa tiroidectomía Tiroidectomia

4.5

Concentración sérica de Ca 2+ (m g/dL)

Concentración sérica de P 5+(mg/dL)

A 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 2

3

4

5

6

7

8

10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 2

Semanas de tratamiento

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Figura 19. Cuantificación de la concentración sérica de P+5 (A) y Ca+2 (B) en ratas hipotiroideas inducidas por tiroidectomía. Los valores representan la media de 6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 falsa tiroidectomía.

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre el daño celular en hígado, riñón, corazón y bazo La figura 20 muestra las fotomicrografías características de los diferentes órganos evaluados bajos los tratamientos de hipotiroidismo. El bazo de los animales control presenta trabéculas seccionadas transversalmente. Además, se presenta la organización normal de la pulpa blanca, la cual está constituida por corpúsculos esplénicos o centros germinativos. Los centros germinativos son verdaderos nódulos linfoides, ligeramente ovalados que presentan una zona densa la cual contiene linfocitos pequeños densamente empaquetados. También se puede observar la pulpa roja, la cual está compuesta por los cordones esplénicos o de Billroth, los cuales se encuentran dentro del tejido linfático y en los que se presentan linfocitos asociados a otras células como los glóbulos rojos.

Los animales sometidos a

tiroidectomía presentan las mismas características que el grupo eutiroideo, mientras que, el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca, una reducción del tamaño de los nódulos linfoides. Incluso, su estructura se modifica de tal forma que pierden su forma ovoide y puede observarse la presencia de macrófagos con pigmentos fucsínicos. 48

8

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Tiroidectomia

Reemplazo de T4

Bazo 50 μm 50 μm

50 μm

50 μm

Corazón 50 μm

50 μm

50 μm

50 μm

Hígado 50 μm

50 μm

50 μm

50 μm

Corteza renal 50 μm

50 μm

50 μm

50 μm

Médula renal 50 μm 50 μm

50 μm

50 μm

Figura 201. Fotomicrografías características del bazo, corazón, hígado y riñón de animales control, sometidos a tiroidectomía, hipotiroideos inducidos con metimazol y los que recibieron metimazol más reemplazo de T4.. Sólo en los animales que recibieron metimazol se demuestran alteraciones histológicas, Además, el reemplazo de hormonas tiroideas previene parte del daño tisular.

49

Finalmente, el grupo de animales tratados con metimazol a los cuales se les administró un reemplazo de T4 muestra que sus centros germinativos se observan difusos con un incremento del número de macrófagos con pigmentos fuccínicos. En el caso del corazón el grupo eutiroideo presenta la morfología normal del miocardio, el cual está formado por fibras musculares en forma de pantalón y cuyas células muestran un núcleo central que al teñirse con hematoxilina-eosina pueden observarse de color azul con un citoplasma rosa y estriación discreta. Esta morfología se conserva en los animales tiroidectomizados y en aquellos que recibieron metimazol más reemplazo de T4 mientras que en el caso de los animales hipotiroideos inducidos con metimazol puede observarse la pérdida de los núcleos así como de la estriación de los cardiomiocitos. En el hígado, se observó que los animales eutiroideos y sometidos a tiroidectomía presentan una histología normal. En ambos casos su análisis muestra lobulillos hepáticos formados por cordones de hepatocitos, los cuales pueden contener uno o dos núcleos esféricos centro-mediales, y que se disponen en forma radiada en torno a una vena central o vena centro-lobulillar. Mientras que, en el caso de los animales hipotiroideos por administración de metimazol (C), así como en los que recibieron metimazol más reemplazo de T4 (D), presentaron discontinuidad celular, pérdida de los cordones de hepatocitos. Además, se observa la pérdida de la relación núcleo citoplasma, incluso algunas células son hipercromáticas y picnóticas. A nivel de la corteza renal, los grupos, eutiroideo y tiroidectomizado, presentan glomérulos en buenas condiciones. Entre los distintos glomérulos pueden observarse las secciones longitudinales y transversales de los túbulos contorneados proximales y distales. En los animales hipotiroideos con metimazol se presenta glomeruloesclerosis y atrofia de los túbulos contorneados, con distorsión de la continuidad celular y ausencia de núcleos. Estas alteraciones se presentan de manera menos severa en el grupo que recibió reemplazo de T4. Finalmente, a nivel de la médula renal se observan grandes túbulos colectores acompañados de otras estructuras ductales, más pequeñas, correspondientes a las asas de Henle, tanto en animales controles como en los sometidos a tiroidectomía. En los animales con hipotiroidismo farmacológico se presentó atrofia de las células de las asas de Henle y de los túbulos colectores, con pérdida de núcleos y de la continuidad celular. Dichas alteraciones se observaron también en el grupo que recibió reemplazo de T4.

50

Determinación de marcadores bioquímicos Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en el hígado de ratas. El panel A de la figura 21 se muestra que el grupo hipotiroideo inducido con metimazol presenta un incremento de la peroxidación lipídica (LP) a la cuarta semana de tratamiento debido a un incremento de la concentración de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la tercera semana de tratamiento (figura 21, panel B). Así mismo, en el panel C de la figura 21 se demuestra que el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía no modifica la concentración de LP, aunque se induce un aumento de las ROS durante la segunda semana de tratamiento.

*

Eutiroideo

1.85

Hipotiroideo inducido con metimazol

1.50

1.15

0.80

C Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

A

1.85

1.50

1.15

0.80

B

D

24

Cuantificiación de ROS (pmoles of DCF forma/mg proteínas/h)

Cuantificiación de ROS (pmoles of DCF forma/mg proteínas/h)

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

*

20

16

12 1

2

3

4

Semanas de tratamiento

24

20

16

*

12 2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Figura 21. Cuantificación de la peroxidación de lípidos (A y C) y de las especies reactivas de oxígeno (B y D) como marcadores de estrés oxidante en hígado de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

51

8

En el panel A de la figura 22, se observa que los animales tratados con metimazol presentan un aumento de la concentración de GSH durante la primera semana de tratamiento. Además, dicho tratamiento provoca un aumento de la concentración de GSSG durante la segunda semana (figura 22, panel B). Sin embargo, en el panel C de la misma figura se muestra que el radio GSH2/GSSG no presenta cambios. Concentración de GSH (pmoles GSH/mg proteínas)

350

*

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

300 250 200 150

B

Concentración GSSG (pmoles GSSG/mg proteínas)

Concentración GSSG (pmoles GSSG/mg proteínas)

Concentración de GSH (pmoles GSH/mg proteínas)

A 400

160 140 120

*

100 80 60 40 20

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

350

*

300 250 200 150

E 160 140 120 100 80 60 40 20

F

C

4500

Radio GSH 2/GSSG

4500

Radio GSH 2/GSSG

D 400

3500 2500 1500

3500 2500 1500 500

500 1

2

3

4

2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Semanas de tratamiento

Figura 22. Determinación de la concentración de glutatión reducido (GSH; panel A y D), glutatión oxidado (GSSG; panel B y E) y del radio GSH2/GSSG (panel C y F) como marcadores del ambiente REDOX en hígado de ratas hipotiroideas inducidas con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

52

8

Por otro lado, el grupo hipotiroideo inducido por tiroidectomía presenta un incremento de la concentración de GSH durante la segunda semana post-cirugía (fig. 22, panel D), sin afectar la concentración de GSSG (fig. 22, panel E) ni el radio GSH2/GSSG no presenta cambios (fig. 22, panel F). Respecto a las peroxidasas, en el panel A de la figura 23 se observa que sólo el tratamiento con metimazol provoca la disminución de la actividad de la catalasa durante todo el tratamiento

C

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.06

Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

A 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01

*

* *

*

0.05 0.04 0.03 0.02 0.01

D Actividad de GPX ( μ g de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

B Actividad de GPX ( μ g de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

0.06

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1

2

3

4

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 2

Semanas de tratamiento

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Figura 23. Determinación de la actividad de la catalasa (panel A y C) y de la glutatión peroxidasa (GPX, panel B y D) en hígado de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

53

En la tabla 3 y 4 se muestran los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD en los dos modelos de hipotirodismo empleados. Sin embargo no se observan alteraciones de la actividad de dichas enzimas por los tratamientos Tabla 3. Actividad de las isoformas de la SOD en el hígado de ratas Mn-SOD

Cu/Zn-SOD

SOD total

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

0.286 ± 0.041

2

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.212 ± 0.070 0.025 ± 0.065 0.158 ± 0.074

0.491 ± 0.090

0.370 ± 0.035

0.092 ± 0.026

0.178 ± 0.075 0.300 ± 0.054 0.260 ± 0.028

0.392 ± 0.030

0.437 ± 0.036

3

0.181 ± 0.059

0.216 ± 0.037 0.243 ± 0.097 0.215 ± 0.119

0.424 ± 0.075

0.426 ± 0.102

4

0.176 ± 0.036

0.262 ± 0.054 0.177 ± 0.036 0.188 ± 0.040

0.353 ± 0.026

0.450 ± 0.058

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

Tabla 4. Actividad de las isoformas de la SOD en el hígado de ratas Mn-SOD

Cu/Zn-SOD

SOD total

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

Semanas de tratamiento

Falsa tiroidectomía

2

0.092 ± 0.026

8

0.207 ± 0.074

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

0.206 ± 0.060 0.300 ± 0.054 0.284 ± 0.077

0.392 ± 0.031

0.491 ± 0.053

0.228 ± 0.047 0.224 ± 0.044 0.095 ± 0.019

0.432 ± 0.038

0.323 ± 0.053

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

En el panel A de la figura 24, se observa que los animales tratados con metimazol presentan una disminución de la actividad de la glutatión S-transferasa (GST) durante las dos primeras semanas de tratamiento. Además, la actividad de la γglutamilcisteina sintetasa (γ-GCS) disminuye su actividad durante la primera semana e incrementa su actividad durante cuarta semana de tratamiento anti-tiroideo con metimazol (fig. 24, panel B).

54

0.35 0.30

*

0.25

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

C Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

Actividad de la glutatión S-transefer asa (U/mg proteínas/min)

A

*

0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

B

D

*

6 5

*

3

7

Actividad de γ -glutamilcisteina sintetasa ( μg de P5+ liberado/mg proteínas/h)

Actividad de γ-glutamilcisteina sintetasa (μ g de P5+ liberado/mg proteínas/h)

7

4

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

0.35

6 5 4 3

1

2

3

4

Semanas de tratamiento

2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Figura 24. Determinación de la actividad de la glutatión-S.transferasa (GST; panel A y C) y de la γ-glutamilcisteina sintetasa (γ-GCS; panel B y D) en hígado de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

Respecto a la γ-glutamil transpeptidasa y la glutatión reductasa, en la tabla 5 y 6 se puede observar que ninguno de los tratamientos evaluados modifica la actividad de dichas enzimas.

55

8

Tabla 5. Actividad de la γ-glutamil transpeptidasa y de la glutatión reductasa en el hígado de ratas con hipotiroidismo inducido con metimazol Actividad de γ-glutamil transpeptidasa

Actividad de la glutatión reductasa

(μmoles de p-nitroanilina forma/mg proteínas/min)

(μmoles NADPH usado/mg proteínas/min)

Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

0.536 ± 0.101

0.414 ± 0.212

219.31 ± 80.59

131.41 ± 53.58

2

0.387 ± 0.143

0.369 ± 0.162

196.81 ± 61.28

186.03 ± 87.06

3

0.510 ± 0.153

0.404 ± 0.139

206.84 ± 82.08

190.98 ± 70.85

4

0.415 ± 0.056

0.290 ± 0.090

243.21 ± 64.75

134.52 ± 34.47

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

Tabla 6. Actividad de la γ-glutamil transpeptidasa y de la glutatión reductasa en el hígado de ratas con hipotiroidismo inducido por tiroidectomía.

Semanas de tratamiento

Actividad de γ-glutamil transpeptidasa

Actividad de la glutatión reductasa

(μmoles de p-nitroanilina forma/mg proteínas/min)

(μmoles NADPH usado/mg proteínas/min)

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

2

0.443 ± 0.140

0.284 ± 0.061

196.81 ± 61.28

142.90 ± 86.99

8

0.318 ± 0.091

0.236 ± 0.065

105.57 ± 34.47

134.15 ± 48.00

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

56

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en el riñón de ratas. El panel A de la figura 25 muestra que hipotiroidismo inducido con metimazol provoca un incremento de la LP durante la primera semana de tratamiento debido a un aumento de las ROS. Además, en el panel C y D de la figura 25, se observa que el hipotiroidismo inducido por cirugía no provoca cambios en la LP ni ROS.

35 30

C

*

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

25 20 15 10 5 0

Peroxidación de lípidos (URF/mg de pr oteínas)

Peroxidación de lípidos (URF/mg de proteínas)

A

Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

25

Falsa tiroidectomía

30

Tiroidectomía

25 20 15 10 5 0

D

B 30

35

*

20 15 10 1

2

3

4

30 25 20 15 10 2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Semanas de tratamiento

Figura 25. Cuantificación de la peroxidación de lípidos (A y C) y de las especies reactivas de oxígeno (B y D) como marcadores de estrés oxidante en riñón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

57

8

En la figura 26 se puede observar que el grupo hipotiroideo inducido con metimazol presenta un aumento de la concentración de GSH (panel A), GSSG (panel B) y del radio GSH2/GSSG (panel C) D

8

*

Concentración de GSH (nmoles GSH/mg proteínas)

10

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

6 4 2 0

B 0.6 0.5

Concentración de GSSG (nmoles GSSG/mg proteins)

Concentración de GSSG (nmoles GSSG/mg proteins)

Concentración de GSH (nmoles GSH/mg proteínas)

A

*

0.4 0.3 0.2 0.1

*

6 4 2 0

E 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

175

*

Radio GSH 2/GSSG

Radio GSH 2/GSSG

125

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

8

F

C 175 150

10

100 75 50

150

*

125 100 75 50 25 0

25 1

2

3

2

4

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Semanas de tratamiento

Figura 26. Determinación de la concentración de glutatión reducido (GSH; panel A y D), glutatión oxidado (GSSG; panel B y E) y del radio GSH2/GSSG (panel C y F) como marcadores del ambiente REDOX en riñón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

58

Mientras que el grupo hipotiroideo inducido por tiroidectomía sólo presenta un incremento de la concentración de GSH (fig. 26, panel D) y del radio GSH2/GSSG (fig. 26, panel F) cuatro semanas posteriores a la cirugía. Respecto a las peroxidasas del riñón, en la tabla 7 y 8 se muestra que ningún tratamiento anti-tiroideo provoca cambios de la actividad de catalasa y GPX. Tabla 7. Actividad de la catalasa y GPX en el riñón de ratas con hipotiroidismo inducido con metimazol Actividad de catalasa

Actividad de la GPX

(k/mg de proteínas)

(μg de GSH oxidados/mg proteínas/min)

Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

0.335 ± 0.077

0.389 ± 0.024

4.48 ± 2.31

2.88 ± 0.74

2

0.459 ± 0.050

0.419 ± 0.038

4.74 ± 1.58

2.95 ± 0.46

3

0.328 ± 0.044

0.370 ± 0.042

5.56 ± 2.18

1.85 ± 1.23

4

0.325 ± 0.053

0.371 ± 0.034

5.14 ± 1.64

4.12 ± 1.64

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± estándar. Tabla 8. Actividad de la catalasa y GPX en el riñón de ratas con hipotiroidismo inducido por tiroidectomía

Semanas de tratamiento

Actividad de catalasa

Actividad de la GPX

(k/mg de proteínas)

(μg de GSH oxidados/mg proteínas/min)

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

2

0.026 ± 0.003

0.058 ± 0.029

3.81 ± 1.21

3.90 ± 0.23

4

0.033 ± 0.003

0.063 ± 0.032

2.50 ± 0.27

2.53 ± 0.28

8

0.024 ± 0.005

0.046 ± 0.019

4.52 ± 0.62

3.07 ± 0.42

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

En la tabla 9 y 10 se muestran los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD en los dos modelos de hipotiroidismo empleados. Sin embargo no se observan alteraciones de la actividad de dichas enzimas por los tratamientos

59

Tabla 9. Actividad de las isoformas de la SOD en el riñón de ratas Mn-SOD

Cu/Zn-SOD

SOD total

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

0.468 ± 0.135

2

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.446 ± 0.134 0.215 ± 0.067 0.326 ± 0.096

0.625 ± 0.182

0.772 ± 0.178

0.280 ± 0.078

0.297 ± 0.062 0.142 ± 0.016 0.221 ± 0.078

0.426 ± 0.087

0.518 ± 0.030

3

0.271 ± 0.075

0.449 ± 0.183 0.137 ± 0.032 0.138 ± 0.036

0.408 ± 0.94

0.585 ± 0.209

4

0.324 ± 0.073

0.344 ± 0.044 0.165 ± 0.048 0.097 ± 0.025

0.489 ± 0.108

0.441 ± 0.143

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

Tabla 10. Actividad de las isoformas de la SOD en el riñón de ratas Mn-SOD

Cu/Zn-SOD

SOD total

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

(U/mg proteínas)

Semanas de tratamiento

Falsa tiroidectomía

2

0.337 ± 0.075

4 8

Falsa tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

0.244 ± 0.048 0.398 ± 0.075 0.424 ± 0.201

0.523 ± 0.100

0.718 ± 0.140

0.409 ± 0.102

0.384 ± 0.090 0.104 ± 0.015 0.174 ± 0.088

0.496 ± 0.105

0.554 ±0.058

0.249 ± 0.051

0.289 ± 0.092 0.122 ± 0.034 0.164 ± 0.057

0.370 ± 0.071

0.454 ± 0.062

Tiroidectomía

Tiroidectomía

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

60

En la tabla 11 y 12 se presentan los resultados de la actividad de la γ-GT y la γGCS. Se puede observar que ninguno de los tratamientos modifica las actividades de dichas enzimas. Tabla 11. Actividad de la γ-glutamil transpeptidasa y la γ-glutamilcisteina sintetasa en el riñón de ratas hipotiroideas con metimazol Actividad de γ-glutamil transpeptidasa (μmoles de p-nitroanilina forma/mg proteínas/min)

Actividad de γ-glutamilcisteinil sintetasa (μg de P5+ liberado/mg proteínas/h)

Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

226.41 ± 58.73

238.57 ± 53.18

24.71 ± 0.64

24.65 ± 0.51

2

166.07 ± 24.12

175.46 ± 39.46

25.65 ± 0.37

25.33 ± 0.15

3

160.75 ± 24.12

110.40 ± 24.50

25.68 ± 0.73

24.87 ± 0.95

4

183.94 ± 29.33

174.95 ± 28.93

25.34 ± 0.55

25.73 ± 0.95

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

Tabla 12. Actividad de la γ-glutamil transpeptidasa y la γ-glutamilcisteina sintetasa en el riñón de ratas con hipotiroidismo inducido por tiroidectomía Actividad de γ-glutamil transpeptidasa (μmoles de p-nitroanilina forma/mg proteínas/min) Semanas de tratamiento

Actividad de γ-glutamilcisteinil sintetasa (μg de P5+ liberado/mg proteínas/h)

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

2

274.23 ± 45.03

265.90 ± 43.78

25.24 ± 0.40

24.32 ± 0.42

4

170.46 ± 38.26

170.21 ± 42.98

24.85 ± 1.71

24.44 ± 0.33

8

149.53 ± 28.71

212.08 ± 54.97

25.86 ± 0.50

25.52 ± 0.31

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

61

En la figura 27 se presentan los resultados de la actividad de la GR y de la GST en el riñón de ratas hipotiroideas. Se puede observar que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca sólo un aumento de la actividad de GR durante la tercera semana de tratamiento (panel A). Mientras que el grupo hipotiroideo inducido por tiroidectomía sólo presenta un incremento de la actividad de la GST dos semanas post-cirugía (panel D).

C Eutiroideo Hipotiroidismo induc ido c on metimazol

2

Actividad de glutatión reducatsa (μmoles NADPH usado/mg proteínas/min)

Actividad de glutatión reducatsa (μmoles NADPH usado/mg proteínas/min)

A

*

1

0

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

1

0

D

1.25

Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

B

2

1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 1

2

3

4

1.25 1.00

*

0.75 0.50 0.25 0.00 2

Semanas de tratamiento

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Figura 27. Determinación de la actividad de la glutatión reductasa (GR; panel A y C) y de la glutatión-S-transferasa (GST; panel B y D) en riñón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

62

8

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en el corazón de ratas. En la figura 28 se presentan los resultados de los marcadores de estrés oxidativo en el corazón de ratas hipotiroideas. Se puede observar que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca incrementos de la LP durante la segunda y tercera semana (panel A). Además, dicho tratamiento provoca que las ROS aumenten en la primera y cuarta semana de tratamiento (panel C). También se puede observar que las ratas tiroidectomizadas presentan un incremento de las ROS a la octava semana posttratamiento (panel D). Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

12

*

9

*

6 3 0

Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

15

C 15

Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

A

65

Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

52

Tiroidectomía

12 9 6 3 0

D

C 65

Falsa tiroidectomía

*

39

Eutiroideo Hipotiroideo inducido con metimazol

*

26 13 0 1

2

3

4

52 39 26

*

13 0 2

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Semana de tratamiento

Figura 28. Cuantificación de la peroxidación de lípidos (A y C) y de las especies reactivas de oxígeno (B y D) como marcadores de estrés oxidante en corazón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

63

En las tablas 13 y 14 se presentan los resultados de los marcadores del ambiente REDOX. Sin embargo, ninguno de los marcadores es afectado por el hipotiroidismo. Tabla 13. Cuantificación del GSH, GSSG y del radio GSH2/GSSG en el corazón de ratas hipotiroideas farmacológicamente GSH (nmoles/mg de proteínas) Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

5.58 ± 1.37

3.74 ± 1.19

2

3.52 ± 1.36

3 4

GSSG (nmoles/mg de proteínas)

Radio GSH2/GSSG

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.60 ± 0.18

0.41 ± 0.14

54.36 ± 13.86

35.93 ± 10.49

4.00 ± 1.62

0.30 ± 0.13

0.48 ± 0.18

50.12 ± 29.09

35.47 ± 14.70

5.37 ± 2.04

3.72 ± 0.72

0.46 ± 0.14

0.48 ± 0.19

64.66 ± 30.76

29.23 ± 14.69

4.14 ± 0.24

5.98 ± 3.70

0.43 ± 0.03

0.62 ± 0.14

40.85 ± 10.06

59.99 ± 29.90

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Eutiroideo

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. Tabla 14. Cuantificación del GSH, GSSG y del índice GSH2/GSSG en el corazón de ratas tiroidectomía GSH (nmoles/mg de proteínas)

GSSG (nmoles/mg de proteínas)

Radio GSH2/GSSG

Semanas de tratamiento

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomía

2

2.62 ± 1.48

2.79 ± 0.47

0.38 ± 0.20

0.26 ± 0.05

19.69 ± 10.98

30.93 ± 7.35

4

2.45 ± 0.04

2.29 ± 0.50

0.36 ± 0.07

0.26 ± 0.04

16.87 ± 1.75

22.17 ± 9.87

8

3.00 ± 1.30

3.39 ± 1.12

0.22 ± 0.08

0.34 ± 0.07

39.16 ± 19.89

37.48 ± 18.63

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

En la figura 29 se presentan los resultados de las enzimas del ciclo del glutatión en el corazón de ratas hipotiroideas. En el panel A y C, se observa que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca un aumento de las actividades de la GST (panel A) y de la γ-GCS (panel C) durante la tercera y cuarta semana de tratamiento.

64

Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

*

250

Actividad de glutatión reductasa (μ moles NADPH usado/mg de proteínas/min)

B

*

200 150 100 50 0

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

80 70 60 50 40 30 20 10 0

E 250 200 150 100 50 0

F

C

*

750

Actividad de γ-glutamilcisteina sintetasa (μg de P5+ liberado/mg proteínas/h)

*

*

500

250

750

Actividad de γ-glutamilcisteina sintetasa ( μ g de P5+ liberado/mg proteínas/h)

Actividad de glutatión reductasa (μmoles NADPH usado/mg de proteínas/min)

80 70 60 50 40 30 20 10 0

D Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

A

0

500

250

*

0 1

2

3

4

2

Semanas de tr atamiento

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Figura 29. Determinación de la actividad de la glutatión-S-transferasa (GST; panel A y D), de la glutatión reductasa (GR; panel B y E) y de la γ-GCS en corazón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (DF). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

Además, el hipotiroidismo farmacológico provocó un aumento de la GR (panel B) durante la segunda semana de tratamiento. Finalmente, el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía presenta un incremento de la actividad de la γ-GCS (panel F) durante la segunda semana post-cirugía. Por otro lado, en la figura 30 se muestran los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD. En el panel A se observa que la actividad de SOD total se

65

encuentra incrementada durante todo el tratamiento anti-tiroideo con metimazol. El aumento de la actividad de SOD total se debe al aumento de la actividades ambas isoformas, participando la Mn-SOD (panel B) durante las dos últimas semanas y la CuZn-SOD (panel C) durante todo el tratamiento.

302 . Det er

Actividad de SOD total (U/mg de proteínas)

ura

Eutiroideo Hipotiroideo inducido con metimazol

A 60 50 40 30

*

*

D

*

*

20 10 0

Actividad de SOD total (U/mg de proteínas)

Fig

60

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

50 40 30 20 10

*

0

mi nac

acti vid ad de sup eró xid o dis mu

50 40 30

*

20 10

*

0

60 50 40 30 20

50 40 30 20 10

*

0

F

C Actividad de Cu-Zn-SOD (U/mg de proteínas)

la

60

Actividad de Mn-SOD (U/mg de proteínas)

la

E

60

*

*

*

*

10 0 1

2

3

4

Actividad de Cu-Zn-SOD (U/mg de proteínas)

de

Actividad de Mn-SOD (U/mg de proteínas)

ión

B

60 50 40 30 20 10 0 2

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Semanas de tratamiento

tas a (SOD) total (panel Ay D), Mn-SOD (panel B y E) y Cu-Zn-SOD (panel C y F) en corazón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

66

En el caso del grupo hipotiroideo inducido por cirugía, en el panel D de la figura 30 se puede ver que dicho grupo presenta un aumento de la actividad de la SOD total debido a un aumento de la Mn-SOD (panel E) dos semanas posteriores a la cirugía. En la figura 31 se muestran los resultados de la actividad de las peroxidasas en ambos modelos de hipotiroidismo. En el panel A se observa que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca el aumento de la actividad de la catalasa durante las dos últimas semanas de tratamiento. Además, en dicho modelo se presenta una disminución de la actividad de la GPX en la tercera semana de tratamiento. Por otro lado, el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía provoca una aumento de la actividad de ambas enzimas a la cuarta semana post-cirugía y sólo de la catalasa a la octava semana post-tratamiento. Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.03

C

*

*

0.02

0.01

0.00

Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

A

*

0.020

*

0.015 0.010 0.005 0.000

D Actividad de GPX (μg de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

B Actividad de GPX (μ g de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

0.025

30 20 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1

2

* 3

4

30

*

20

10

0 2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamient o

Semanas de tratamiento

Figura 31. Determinación de la actividad de la catalasa (panel A y C) y de la glutatión peroxidasa (panel B y D) en corazón de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 46 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

67

8

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o tiroidectomía sobre marcadores de estrés oxidante, ambiente REDOX, enzimas antioxidantes y ciclo del glutatión en el bazo de ratas El panel A de la figura 32 se muestra que el grupo hipotiroideo inducido con metimazol presenta un incremento de la peroxidación lipídica (LP) a la cuarta semana de tratamiento. Además, se presenta aumentos de las ROS a partir de la segunda semana de tratamiento (fig. 32, panel B). Así mismo, en el panel D de la figura 32 se demuestra que el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía promueve un aumento de las ROS cuatro semanas posteriores a la cirugía. C Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

4.50 3.75

*

3.00 2.25 1.50 0.75 0.00

Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

Peroxidación de lípidos (URF/mg proteínas)

A

4.50

Tiroidectomía

3.00 2.25 1.50 0.75 0.00

D

50 40

*

30 20

*

*

10 0 1

2

3

4

Semana de tratamiento

Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

B Cuantificación de ROS (pmoles of DCF formada/mg proteínas/h)

Falsa tiroidectomía

3.75

*

50 40 30 20 10 0 2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Figura 32. Cuantificación de la peroxidación de lípidos (A y C) y de las especies reactivas de oxígeno (B y D) como marcadores de estrés oxidante en bazo de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

68

8

Respecto a los marcadores del ambiente REDOX, la figura 33 muestra que sólo el hipotirodismo inducido con metimazol causa un aumento de la concentración del

Det er mi nac ión de la con cen tra ció n

Concentración de GSH (nmoles GSH/mg de proteínas)

33.

A Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

7 6 5 4 3 2 1 0

B

Concentración de GSSG (nmoles GSSG/mg de proteínas)

ura

Concentración de GSSG (nmoles GSSG/mg de proteínas)

Fig

Concentración de GSH (nmoles GSH/mg de proteínas)

GSSG durante la segunda semana de tratamiento (panel B).

1.5

*

1.0

0.5

0.0

de C

glu

red uci do (G SH

Falsa tiroidectomía

6

Tiroidectomía

5 4 3 2 1 0

E 1.5

1.0

0.5

0.0

120

Radio GSH 2/GSSG

ón

7

F

120

Radio GSH 2/GSSG

tati

D

80

40

0

80

40

0 1

2

3

4

Semanas de tratamiento

2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

; panel A y D), glutatión oxidado (GSSG; panel B y E) y del radio GSH2/GSSG (panel C y F) como marcadores del ambiente REDOX en el bazo de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

En la figura 34 se muestran los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD. En el panel A se observa que el hipotiroidismo inducido con metimazol causa un 69

8

aumento de la actividad de SOD total a la cuarta semana de tratamiento, debido a un aumento de la Mn-SOD y de la Cu-Zn-SOD.

34. Det er mi

Actividad de SOD total (U/mg de proteínas)

ura

Eutiroideo Hipotiroideo inducido con metimazol

A 30

D

*

Actividad de SOD total (U/mg de proteínas)

Fig

20

10

0

30

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

20

10

0

nac ión

vid ad de la eró xid o dis mu tas

10

0

30

20

10

0

F

C Actividad de Cu-Zn-SOD (U/mg de proteínas)

sup

*

20

Actividad de Mn-SOD (U/mg de proteínas)

acti

E

30 20

*

4.5 3.0 1.5 0.0 1

2

3

4

Actividad de Cu-Zn-SOD (U/mg de proteínas)

la

Actividad de Mn-SOD (U/mg de proteínas)

de

B 30

30

20

10

0 2

Semanas de tratamiento

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

a (SOD) total (panel A y D), Mn-SOD (panel B y E) y Cu-Zn-SOD (panel C y F) en bazo de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A-C) o por tiroidectomía (D-F). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

En la figura 35 se muestran los resultados de las actividades de peroxidasas en el bazo. En el panel A se muestra que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca una disminución de la catalasa a la cuarta semana de tratamiento. Además, en el panel B se observa que dicho tratamiento provoca un aumento de la actividad de GPX durante la segunda semana de tratamiento.

70

8

En el panel D de la figura 35 se observa que el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía causa incrementos de la actividad de GPX desde la cuarta semana posterior a la cirugía. Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

0.015

C Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

Actividad de catalasa (k/mg de proteínas)

A

0.010

0.005

0.015

0.010

0.005

*

B

D

150

Actividad de GPX (μg de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

Actividad de GPX (μg de GSH oxidados/mg de proteínas/min)

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

*

100

50

0 1

2

3

4

150

100

50

0 2

Semanas de tratamiento

*

*

3

4

5

6

7

8

Semanas de tratamiento

Figura 35. Determinación de la actividad de la catalasa (panel A y C) y de la glutatión peroxidasa (GPX, panel B y D) en bazo de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (D y E). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

En la figura 36 se muestran los resultados de la actividad de la GST y de la γGCS en el bazo de ratas hipotiroideas. En el panel A se observa que el hipotiroidismo inducido con metimazol ocasiona un aumento de la actividad de la GST durante la segunda y cuarta semana. Además, en el panel B se observa que dicho tratamiento provoca una aumento de la actividad de γ-GCS durante la cuarta semana de tratamiento.

71

Eutiroideo Hipotiroidismo inducido con metimazol

30

*

*

20

D

10

0

Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

Actividad de la glutatión S-transeferasa (U/mg proteínas/min)

A

20

10

0

D

B 1000 800 600 400 200

1200

Actividad de γ-glutamilcistein a sintetasa (μ g de P 5+ liberado/mg proteínas/h)

*

1200

Actividad de γ-glutamilcistein a sintetasa ( μg de P 5+ liberado/mg proteínas/h)

Falsa tiroidectomía Tiroidectomía

30

0

1000 800 600 400 200 0

1

2

3

4

2

3

4

5

6

7

Semanas de tratamiento

Semanas de tratamiento

Figura 36. Determinación de la actividad de la glutatión-S.transferasa (GST; panel A y C) y de la γ-glutamilcisteina sintetasa (γ-GCS; panel B y D) en el bazo de ratas hipotiroideas inducidas farmacológicamente con metimazol (A y B) o por tiroidectomía (C y D). Los valores representan la media de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P < 0.05 vs. Eutiroideo o falsa tiroidectomía.

Respecto a la actividad de la glutatión reductasa, ninguno de los tratamientos modifica su actividad en el bazo de ratas (tabla 15 y 16).

72

8

Tabla 15. Actividad de la glutatión reductasa en el bazo de ratas hipotiroideas con metimazol

Actividad de la glutatión reductasa (μmoles NADPH usado/mg proteínas/min) Semanas de tratamiento

Eutiroideo

1

47.46 ± 20.60

69.34 ± 38.09

2

68.50 ± 26.10

73.86 ± 12.79

3

44.258 ± 8.56

80.84 ± 10.04

4

52.69 ± 13.66

91.89 ± 46.05

Hipotiroidismo inducido con metimazol

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

Tabla 16. Actividad de la glutatión reductasa en el bazo de ratas con hipotiroidismo inducido por tiroidectomía. Actividad de la glutatión reductasa (μmoles NADPH usado/mg proteínas/min) Semanas de tratamiento

Falsa tiroidectomía

Tiroidectomia

2

34.29 ± 12.39

31.34 ± 12.86

4

41.33 ± 8.80

37.06 ± 15.71

8

42.01 ± 8.32

41.24 ± 15.82

Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.

IV.- Discusión

73

Valoración del estado tiroideo de ratas farmacológicamente con metimazol o tiroidectomía

tratadas

En este trabajo se emplearon dos modelos para el estudio del hipotiroidismo, uno farmacológico y el otro quirúrgico. El modelo farmacológico fue inducido por la administración de metimazol. Este fármaco provoca hipotiroidismo debido a que evita la organificación del yodo en los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Mientras que, la tiroidectomía provoca hipotiroidismo por la remoción completa de la glándula tiroides. En este estudio se evaluó el estado tiroideo mediante la evaluación del peso corporal, temperatura rectal y determinación sérica de las hormonas tiroideas. Tanto en el modelo farmacológico inducido con metimazol, como el modelo quirúrgico se encontró una disminución del peso corporal, temperatura rectal y disminución de la concentración sérica de hormonas tiroideas libres. La reducción de la concentración sérica de HT provoca una menor generación de calor (Hulbert AJ, 2000) debido a la reducción del metabolismo basal (Oppenheimer et al., 1994). Sin embargo, Gordon en 1997, propuso que el hipotiroidismo altera los sistema de neurotransmisión a nivel del sistema nervioso central, modificando el punto de regulación de la temperatura central a uno más bajo (Gordon, 1997). Por otro lado, los animales hipotiroideos presentan una menor ganancia de peso corporal, lo que se correlaciona con la disminución en el metabolismo basal. Además, el hipotiroidismo provoca alteraciones de los elementos que regulan el peso corporal, como el tejido adiposo. El hipotiroidismo provoca un aumento de la síntesis de mRNA para leptina en el tejido adiposo (Karakoc et al., 2004), favoreciendo una mayor concentración de dicha hormona en plasma (Escobar-Morreale et al., 1997). Se sabe que la leptina tiene un efecto anorexigénico al interactuar con sus receptores hipotalámicos, lo que provoca una menor ingesta de alimentos. Por otro lado, el hipotiroidismo en los roedores disminuye el crecimiento de los hueso lo que promueve menor ganancia de peso (Nikoletseas, 1981). Respecto a las hormonas tiroideas, se observa que ambos modelos de hipotiroidismo provocan una mayor reducción de la hormona T4 (> 40%) que de la T3 (alrededor del 5%). Esto se debe a que la variable regulada es la concentración sérica de

74

la T3, y el sistema trata de compensar su disminución provocada por el hipotiroidismo. Entre los mecanismos compensatorios que se impulsan son: el aumento de la actividad de la desyodasa II (DII) y la disminución de la actividad de DI y DIII a nivel hepático. El aumento de la DII provoca una disminución de la T4 debido a la transformación de T4 a T3, mientras que si se disminuye la actividad de DI y DIII se mantienen la concentración de T3 debido a que se evita el proceso de inactivación de la T3 a la rT3 y/o T2 (Köhrle, 1999). Finalmente, sólo en los grupos sometidos a cirugía se les determinó la concentración sérica de calcio y fósforo, para evidenciar el correcto reimplante de la glándula paratiroides. Con base en los datos obtenidos de las variables físicas aunadas a la disminución de las hormonas tiroideas, se confirma el estado hipotiroideo de los animales empleados en este estudio.

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre el daño celular en hígado, riñón, corazón y bazo. El hipotiroidismo que disminuye el metabolismo basal previene a las células de la producción de ROS. En la actualidad, se cree que el hipotiroidismo provoca dos efectos contrarios sobre el ambiente REDOX y el daño celular. Uno de los efectos es el mecanismo de citoprotección en contra de sustancias que provocan estrés oxidativo y daño celular (Elfarra et al., 1994;Oren et al., 1996). Mientras que, el otro efecto radica en el hecho de que el hipotiroidismo causa estrés oxidativo y daño celular per se (Bergman & Brittebo, 1999a;Liu & Ng, 1991). Sin embargo, la mayoría de los estudios se han hecho empleado modelos farmacológicos, y se ha descrito que existen diversos efectos extra-tiroideos de los anti-tiroideos (Bandyopadhyay et al., 2002). Por lo que, el objetivos fue establecer si el hipotiroidismo, el fármaco o ambos son responsables del daño. En este trabajo demostramos mediante el empleo de técnicas histológicas que el hipotiroidismo inducido con metimazol provoca daño celular en diversos órganos, el cual puede ser revertido parcialmente por el suplemento de hormonas tiroideas. Alrededor del 5 % de los pacientes con algún tipo de hipertiroidismo tratado con anti-tiroideos, presentan daño a nivel hepático (Casallo Blanco et al., 2007;Woeber, 75

2002), pulmonar (Tsai et al., 2001) o renal (Calañas-Continente et al., 2005). Mientras que, el tratamiento crónico con metimazol en ratas, provoca la formación de tumores (Jemec, 1977). Así mismo, dicho tratamiento modifica la función pulmonar (Liu & Ng, 1991). Sin embargo, modelos no farmacológicos para el estudio del hipotiroidismo, como la tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides, presenta al hipotiroidismo como un estado protector que evita el daño celular provocado por procesos isquémicos en riñón (Tenorio-Velásquez et al., 2005), hígado (Chávez et al., 1998) y corazón (Bobadilla et al., 2002). El metimazol puede participar en el daño celular por diferentes mecanismos que involucra a su estructura química y la interacción de ésta con las alteraciones que provoca el hipotiroidismo que genera el fármaco. Se ha reportado que el metimazol inactiva irreversiblemente a peroxidasas con grupo hemo en su centro activo (Bandyopadhyay et al., 1995;Bandyopadhyay et al., 2002). Así, es posible que el fármaco cause inactivación de otras peroxidasa, como la catalasa, la cual participa en la destoxificación del H2O2. Dicha reducción del sistema antioxidante enzimático, provocaría el acúmulo del H2O2 en la célula, lo que favorecería reacciones oxidantes como las de Haber-Weiss y Fenton. Así mismo, la generación del H2O2 por una célula dañaría a las vecinas incrementando el daño celular, ya que el peróxido de hidrógeno difunde a través de las membranas plasmáticas (Valko et al., 2007;Halliwell & Gutteridge, 2007). Por otro lado, el hipotiroidismo per se modifica la acil-composición de las membranas plasmáticas incrementando la síntesis de ácidos grasos poli-insaturados (PUFA) como el 18:2, 18:3 y 20:3 (Hoch, 1988). El cambio en los lípidos membranales aumenta la susceptibilidad de las membranas a sufrir peroxidación lipídica. Incluso, las reducciones del sistema antioxidante enzimático provocadas por el hipotiroidismo favorecerían el estrés oxidativo generado por el anti-tiroideo (Das & Chainy, 2001;Das & Chainy, 2004;Hultberg et al., 1998;Sarandöl et al., 2005). En esta parte del estudio, también observamos que el suplemento con T4 a ratas tratadas con metimazol reduce el daño celular en órganos como el hígado, riñón y corazón. Es posible que el efecto de prevención del daño se deba a que las hormonas tiroideas favorecen la proliferación celular (Puzianowska et al., 2006).

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre los marcadores de estrés oxidativo, del 76

ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el hígado Para determinar el mecanismo de daño celular provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol fueron evaluados, marcadores del ambiente REDOX, de estrés oxidativo y del sistema antioxidante enzimático. Así mismo, se determinó la actividad de las enzimas más importantes del ciclo del glutatión. En este estudio demostramos que el daño hepático provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol se debe al fármaco y no al estado tiroideo. La mayoría de los estudios que relacionan al hipotiroidismo con daño hepático emplean modelos farmacológicos de hipotirodismo (Das & Chainy, 2001;Yilmaz et al., 2003). Así, las conclusiones a las que llegan carecen de validez, debido a que el fármaco está involucrado en el proceso de daño celular. El hígado es el órgano con una gran actividad metabólica lo que genera ROS, sin embargo, en condiciones fisiológicas la presencia de enzimas antioxidantes en especial de las peroxidasas y dismutasas previene eventos de estrés oxidante y daño tisular (Konigsberg-Fainstein, 2008). Así, el mecanismo general del daño hepático ocasionado por el metimazol se basa en la reducción de la actividad de la catalasa debido a la inactivación

del

centro

catalítico

por

el

fármaco

(Bandyopadhyay

et

al.,

1995;Bandyopadhyay et al., 2002). Esto haría susceptible a la célula de oxidaciones dependientes de H2O2, lo que promueve el aumento de las ROS y por lo tanto de la peroxidación lipídica (LP). El incremento del H2O2 no puede ser compensado por la GPX debido a que no modifica su actividad. Es posible que el incremento de oxidantes reduzca la capacidad antioxidante de la GPX (Beckett & Arthur, 2005;Halliwell & Gutteridge, 2007). Por otro lado, en las primeras semanas de tratamiento, la reducción de la actividad de la GST podría mediar parte de la toxicidad, ya que la falta de conjugación de las bases de Schiff (productos terminales de la LP) con el glutatión promovería reacciones oxidante con DNA o proteínas (Valko et al., 2007;Halliwell & Gutteridge, 2007). Respecto al incremento de la actividad de la γ-GCS, podemos decir que este evento puede ser un mecanismo compensatorio que trata de evitar el daño tisular, lo cual no se logra, pues al término del tratamiento con metimazol se observa

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hepatotoxicidad. El incremento de la γ-GCS se presentaría por activación de alguna proteína señalizadoras independiente de hormonas tiroideas (Griffith, 1999), pues se ha observado que dichas hormonas regulan la síntesis de GSH por activación de cinasas que fosforilan la subunidad reguladora de la γ-GCS (Lu et al., 1991). Considerando, algunos estudios de hepatotoxicidad provocada por el metimazol en donde se demuestra que dicho fármaco se une covalentemente en los hepatocitos centrolobulillares (Lee & Neal, 1978;Decker & Doerge, 1992), algunos grupos de investigación han propuesto que la biotransformación del fármaco juega un papel importante en la toxicidad. Por ejemplo se ha observado que la formación de N-metil urea a partir del metimazol por la FMO ocasiona que sus derivados 5-oxidados conjugados con los ácidos sulfénico y sulfínico oxiden en forma no enzimática al GSH a GSSG (Mizutani et al., 1994). Además, si otros CYP450 forman el N-metilimidazol (compuestos S-oxidados a partir del metimazol) éste puede inducir toxicidad (Genter et al., 1995;Kedderis & Rickert, 1985). Aunado al fármaco, el estado de hipotiroidismo predispone a los hepatocitos al daño debido al aumento de la síntesis de PUFA susceptibles a la peroxidación (Hoch, 1988) y la reducción de la proliferación hepática (Cervinkova & Simek, 1992;Beyer, 1992). El daño hepático se presenta por el hipotiroidismo inducido con metimazol a pesar de que existen mecanismos moleculares por los cuales el hipotiroidismo puede ser un estado protector a nivel hepático, como: la reducción de la actividad de las enzimas asociadas a la cadena respiratoria mitocondrial (Paradies et al., 1994), la disminución de la translocasa del nucleótido de adenina (Schonfeld et al., 1997), la reducción de la actividad de la citocromo c oxidasa (Paradies et al., 1997) y la resistencia a la formación del poro de la transición de la permeabilidad membranal a nivel miotocondrial (Chávez et al., 1998). Respecto al hipotiroidismo inducido por tiroidectomía, en donde sólo se afecta al sistema de las hormonas tiroideas, no se observa alteraciones del ambiente REDOX ni daño celular. Concordamos con varios grupos acerca de que el hipotiroidismo no causa daño hepático per se y que es un estado protector en contra de agentes tóxicos.

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Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre los marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el riñón. Al igual que el hígado, para determinar el mecanismo de daño celular provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol fueron evaluados, marcadores del ambiente REDOX, de estrés oxidativo, del sistema antioxidante y del ciclo del glutatión. En este trabajo demostramos que el hipotiroidismo inducido con metimazol aumenta la concentración de ROS y LP en la primera semana. Y que a pesar de que el ambiente REDOX y la GR se encuentran incrementados, se presenta el daño celular. El mecanismo por el cual el metimazol causa nefrotoxicidad podría deberse a los efectos que ejerce el fármaco en dicho órgano, aunado a los cambios que produce el hipotiroidismo. El principal mecanismo de nefrotoxicidad por el metimazol es la biotransformación, debido a que el riñón expresa enzimas de los CYP450 que participan en procesos de destoxificación (Lee & Neal, 1978;Decker & Doerge, 1992). Aunado a la capacidad tóxica del fármaco, la deficiencia de hormonas tiroideas en el riñón de organismos adultos provoca una reducción del flujo renal de sangre lo que promueve una menor tasa de filtración glomerular que afecta la absorción y secreción tubular (van Hoek & Daminet, 2009). Aunque el alto flujo de sangre a través del órgano se reduce por el hipotiroidismo, el flujo sigue siendo de los más elevados en el organismo y el riñón capta una buena cantidad de metimazol. Éste se filtra más lentamente debido a la reducción de la tasa de filtración glomerular (TFG) (Suher et al., 2005), lo que favorece que el metimazol interactué por más tiempo con las células renales ocasionándoles daño. Respecto a la TFG, el hipotiroidismo también la reduce debido a que las hormonas tiroideas son esenciales para el remodelamiento del área de la superficie glomerular (Bradley et al., 1982). Otro de los efectos del hipotiroidismo aunados al fármaco que contribuyen al daño renal, es la reducción de la actividad de la Na+-K+-ATPasa, lo que afecta el gradiente de Na+ y diversos movimientos iónicos transmembrana lo que puede favorecer que subproductos del metabolismo del metimazol interactúen con las células 79

tubulares y ocasionen daño. En este sentido no descartamos la posibilidad de la interacción covalente de los subproductos del metimazol con elementos celulares, como ocurre en el hígado. Sin embargo, a pesar que el hipotiroidismo ocasiona cambios de la función renal como: resistencia vascular (por un aumento de la contractilidad vascular), menor flujo renal con incremento de la creatinina sanguínea y ligera proteinuria. El hipotiroidismo per se no ocasiona daño, de hecho nosotros demostramos que se presenta un incremento de la síntesis de GSH lo que incrementa el poder reductor del ambiente REDOX. Además, se presenta un incremento de la actividad de la enzima GST lo que reflejaría protección contra la LP. Reportes previos con el empleo del mismo modelo quirúrgico han demostrado que el hipotiroidismo es un estado protector contra enfermedades crónicas del riñón. Esto es debido a que el hipotiroidismo provee un estado de resistencia en contra del estrés nitrérgico y oxidativo, el cual no está mediado por las enzimas antioxidantes (Tenorio-Velásquez et al., 2005).

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre los marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el corazón. Para determinar el mecanismo de daño a células cardiacas provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol se evaluaron, marcadores del ambiente REDOX, de estrés oxidativo, del sistema antioxidante enzimático.y del ciclo del glutatión. En este estudio demostramos que el daño hepático provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol se debe al fármaco y no al estado tiroideo. Encontramos que el fármaco incrementa los marcadores de estrés oxidativo (LP y ROS). El efecto final fue el daño celular a nivel del corazón, a pesar de los mecanismos compensatorios que se activan, como: el incremento de la actividad de las enzimas del sistema antioxidante (Mn-SOD, Cu/Zn-SOD y catalasa) y de las enzimas del ciclo del glutatión (GST, GR y γ-GCS). De nuevo, creemos que el fármaco aunado a los cambios que provoca el hipotiroidismo predispone a las células del corazón al daño tisular. La asociación entre las hormonas tirodeas y la función cardiaca es una de las más estudiadas, e involucra los efectos directos que ejercen dichas hormonas sobre el 80

corazón y los efectos indirectos a consecuencia de los cambios hemodinámicos periféricos (Klein, 1990). Entre los efectos del hipotiroidismo sobre el corazón se han descrito: el efecto cronotrópico e inotrópico negativo, la disminución del gasto cardiaco y la reducción del sistema renina-angiotensina-aldosterona (van Hoek & Daminet, 2009). Aunado a lo anterior, se ha demostrado que el hipotiroidismo induce cambios en la acil-composición de la membrana plasmática (Hoch, 1988) y del sarcolema (Szymanska et al., 1991) que predisponen al daño tisular y a cambios en la actividad eléctrica del corazón. Así mismo, la reducción de la homocisteina durante el hipotirodismo

prevendría

al

organismo

del

desarrollo

de

enfermedades

cardiovasculares, pero favorecería menores agentes REDOX para compensar el efecto de los oxidante en este órgano (Colleran et al., 2005). A pesar de haber encontrado daño a nivel cardiaco por efecto del metimazol, se deben de realizar más estudios para determinar el mecanismo de daño. Respecto al modelo de tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides, demostramos que en el corazón se induce un aumento de la γ-GCS, de las peroxidasas y de la Mn-SOD. Estos eventos podrían ser parte del mecanismo por el cual el hipotiroidismo es un estado protector en contra de perturbaciones que causan daño celular como la isquemia-reperfusión (Bobadilla et al., 2002;Mourouzis et al., 2009). En el caso de las peroxidas y de la Mn-SOD, existen reportes que demuestran que el incremento de actividad y expresión facultan a la célula para que no se induzca apoptosis, lo que se refleja en protección celular (Kahl et al., 2004). El incremento de la catalasa podría estar relacionado con el incremento del ciclo de las pentosas por el hipotiroidismo, esto favorece un aumento del NADPH (Yilmaz et al., 2003). La unión del NADPH con cada homotetrámero de la catalasa es muy estable (Kirkman & Gaetani, 2007) y promueve que el compuesto I (compuesto oxo-ferril) hidrolice el peróxido de hidrógeno a una mayor velocidad (Zamocky & Koller, 1999).

Efecto del hipotiroidismo inducido con metimazol o por tiroidectomía sobre los marcadores de estrés oxidativo, del ambiente REDOX, del sistema antioxidante enzimático y del ciclo del glutatión en el bazo. Al igual que en los otros órganos, se evaluaron marcadores del ambiente REDOX, de estrés oxidativo, del sistema antioxidante enzimático.y del ciclo del 81

glutatión, para determinar el mecanismo de daño celular en el bazo provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol. En este estudio demostramos que el daño hepático provocado por el hipotiroidismo inducido con metimazol se debe al fármaco y no al estado tiroideo. Además, parte de la toxicidad del metimazol en el bazo puede deberse al sinergismo entre el fármaco y las alteraciones que ocasiona el hipotiroidismo. Se demostró que el hipotiroidismo inducido con metimazol favorece un incremento de la peroxidación de lípidos, debido al aumento de ROS. El daño oxidativo no pudo ser compensado por la activación de mecanismos de protección como el aumento de actividad de las isoformas de la SOD, la GPX, la GST y la γ-GCS. Incluso, se observó que la concentración de GSSG se incrementa, sin afectar el índice GSH2/GSSG. Lo anterior podría favorecer la formación de especies reactivas dependientes de GSSG (Wlodek, 2002) y/o la glutationilación proteica que modula la actividad de diversas moléculas señalizadoras (le-Donne et al., 2009). Incluso, la reducción de la catalasa favorecería la permanencia de mayor tiempo del peróxido de hidrógeno. Esta ROS interaccionaría con subproductos de la hemoglobina que contienen fierro, debido a que el bazo es el órgano que destruye a los glóbulos rojos y recicla el fierro de los grupos hemo. Así, las reacciones que se favorecen termodinámicamente son la de Fenton y la Haber-Weiss (Halliwell & Gutteridge, 2007;Valko et al., 2007). Esta situación incrementaría las ROS y RNS que mediarían el daño celular del bazo. Recordemos que, el análisis histológico reveló grandes cantidades de macrófagos con pigmentos fucsínicos, los cuales son productos terminales de la peroxidación lipídica. Así, la activación de dichas células del sistema inmune sería un mecanismo compensatorio para permitir la supervivencia del órgano. Es importante mencionar que éste es el único estudio que existe acerca de la relación entre el daño celular del bazo y las alteraciones del estado tiroideo, por lo que falta mucho por estudiar respecto a este punto. En general, las hormonas tiroideas juegan un papel muy importante en procesos diveros procesos fisiológicos como diferenciación, crecimiento, mantenimiento y proceso de muerte de todas las células del organismo. Así, un desajuste en su sistema de regulación ocasionarían diversos efectos en los organismos ocasionando síndromes clínicos como el hipertiroidismo o el hipotiroidismo (Hulbert AJ, 2000). En este estudio

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se abordó el efecto del hipotiroidismo sobre el ambiente REDOX. Respecto a ese tema, desde hace varios años se han descrito dos efectos opuestos del hipotiroidismo sobre marcadores de estrés oxidativo y daño celular. El primero es de protección ante estímulos nocivos y el segundo es la inducción de daño. La capacidad protectora del estado hipotiroideo se ha demostrado en un estudio en donde se evalúan agentes que ocasionan daño célular por procesos de isquemiareperfusión del corazón (Bobadilla et al., 2002) y cerebro (Rastogi et al., 2006), así como en modelos de falla hepática aguda como el de la tioacetamida (Bruck et al., 2007) y cirrosis experimental (Oren et al., 1996). En general, se considera que el hipotiroidismo reduce el metabolismo basal y por lo tanto la producción de ROS (Hulbert AJ, 2000). Incluso, se promueven cambios a nivel mitocondrial como la resistencia a la formación del poro de la transición de la permeabilidad membranal (Chávez et al., 1998). Mientras que otros reportes, demuestran que existe una resistencia a la oxidación de biomoléculas independientes de la activación del sistema antioxidante (Tenorio-Velásquez et al., 2005). Respecto al daño celular provocado por el hipotiroidismo, existen varios reportes en modelos farmacológicos que demuestran el incremento de la producción de ROS o RNS y disminución del sistema antioxidante en diversos órganos como el cerebro (Cano-Europa et al., 2008b;Chehade et al., 1999;Das & Chainy, 2004), corazón (Mano et al., 1995), hígado (Das & Chainy, 2001) y testículo (Choudhury et al., 2003), entre otros. Sin embargo, los resultados obtenidos acerca del daño celular y el hipotiroidismo son inconsistentes debido a que depende del fármaco empleado, dosis, tiempo de tratamiento y órgano evaluado. Además, no se puede descartar el efecto del fármaco, a pesar de que muchos investigadores emplean un grupo de reemplazo de hormonas tiroideas. Así, el objetivo de este trabajo fue determinar si el fármaco, el hipotiroidismo o ambas eran causantes de daño celular en órganos como el hígado, corazón, riñón y bazo. Demostramos, que el metimazol aunado a los cambios que provoca el hipotiroidismo en cada órgano, son los responsables del daño observado en el modelo. El daño está mediado por el incremento de marcadores de estrés oxidativo que no pueden ser compensados por el incremento del sistema antioxidante. En algunos casos como en el hígado, la reducción del sistema antioxidante favorecería el daño tisular.

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Entre los mecanismo de daño del metimazol se encuentra la biotransformación, la inactivación de las peroxidasas y la unión covalente con elementos celulares. Respecto a la biotransformación, el hígado y el riñón son los órganos más susceptibles dado que presentan CYP450, ya que se pueden producir compuesto más tóxicos que el mismo metimazol lo que se refleja en daño tisular (Lee & Neal, 1978;Decker & Doerge, 1992). Las peroxidasas con grupo hemo son susceptibles a la inactivación, en su mayoría

de

forma

irreversible,

del

metimazol

(Bandyopadhyay

et

al.,

1995;Bandyopadhyay et al., 2002). En órganos como el hígado y el bazo es una situación perjudicial, ya que se favorece la permanencia de más tiempo del peróxido de hidrógeno. El H2O2 favorece la formación de ROS más tóxicas mediante las reacciones de Fenton y Haber-Weiss (Halliwell & Gutteridge, 2007). Se ha observado que el metimazol se une covalentemente con elementos celulares que conlleva a la muerte celular debido a la pérdida de la función (Genter et al., 1995;Lee & Neal, 1978;Decker & Doerge, 1992) El metimazol causaría mayor daño debido a las alteraciones de la célula ocasionadas por el hipotiroidismo. Sobre todo, los cambios en elementos que predisponen al daño como la modificación de la acil-composición membranal favoreciendo la producción de PUFA y aumentando la susceptibilidad a lipoperoxidación (Hoch, 1988). Es importante mencionar, que el hipotiroidismo inducido por tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides, no provocó daño celular en los órganos evaluados. Sin embargo, la evaluación de los diferentes marcadores bioquímicos mostró que existe un incremento de las actividades de enzimas antioxidantes o del sistema de GSH. Estos hallazgos aunados a los encontrados por otros grupos que emplean este modelo, podrían sugerir que el hipotiroidismo es un estado protector, no sólo por la reducción del metabolismo basal, sino por el incremento del subsistema reductor (Bobadilla et al., 2002;Chávez et al., 1998;Tenorio-Velásquez et al., 2005) Finalmente, para estudiar los efectos del hipotiroidismo sobre el ambiente REDOX y el daño celular, es imprescindible emplear modelos no farmacológicos de hipotiroidismo para asegurar la validez de los resultados, Así mismo, el efecto del hipotiroidismo sobre el ambiente REDOX dependerá del órgano evaluado y del tiempo del tratamiento.

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V.- Conclusión El metimazol aunado al las alteraciones provocadas por el hipotiroidismo provoca daño celular en el corazón, bazo, riñón e hígado. Además, las estrategias que desencadene cada órgano para evitar el daño celular provocado por el anti-tiroideo serán las responsables de la supervivencia celular de dicho tejido.

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VI.- Perspectivas Este es el primer trabajo que demuestra que el metimazol y no el hipotirodismo es el responsable del daño. Respecto al metimazol, existen varías líneas de investigación que se pueden abordar a futuro como: 1. Incrementar el sistema antioxidante no enzimático con un suplemento de antioxidantes, debido a que en la actualidad el metimazol es el fármaco de elección para el tratamiento de síndromes de hipertiroidismo. 2. Evaluar el tipo de muerte celular que se activa y los mecanismos intracelulares involucrados. 3. Determinar si en otros órganos a parte de los estudiados en este trabajo presentan daño celular por el fármaco. Respecto al hipotiroidismo inducido por tiroidectomía con reimplante de la glándula paratiroides: 1. Evaluar si el hipotiroidismo ofrece protección en contra de agentes nocivos como fármaco, toxinas o agentes infecciosos. 2. Determinar los mecanismos moleculares por los cuales el hipotiroidismo es un estado protector en diversos órganos 3. Replantear algunas de las controversias encontradas en los modelos de hipotiroidismo farmacológico, como la parte conductual y del desarrollo de órganos

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