UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLOGICASY DE LA SALUD LICENCIATURA EN BIOLOGíA

PROYECTO FINAL

''

INTERPRETACION DE DATOS ELISA Y ESTABLECIMIENTO DEL RANGO POSITIVO NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS CITRICOS (VTC),MUESTRAS SIMPLES

DR. DANIEL TELIZ ORTIZ ASESOR EXTERNO M.en.C MARTIN VALENCIA ACEVES

MATRICULA :

85239323

INTERPRETACION DE DATOS ELISA Y ESTABLECIMIENTO DEL RANGO POSITIVO NEGATIVO EN EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS TRISTEZA DE LOS CITRICOS (VTC), MUESTRAS SIMPLES

CONTENIDO:

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES: o 0 0 0 0

0 0

0

Importancia económica el Virus Tristeza de los Cítricos (VTC) Distribución de la enfermedad Descripción del Virus tristeza de los Cítricos Transmisión Síntomas Metodología de detección Principio de ELISA Antecedentes del VTC

OBJETIVOS: MATERIAL Y METODO: 0 Trabajo de campo 0 Trabajo de laboratorio: RESULTADOS: DISCUSION: VENTAJAS: DESVENTAJAS: CONCLUSION: RECOMENDACIONES: APENDICES: BIBLIOGRAFIA

INTRODUCCION Y ANTECEDENTES:

I

Con base a las estadísticas elaboradas por FA0 (1991), la producción mundial de los cítricos se considera que es de 60 millones de toneladas anuales; de esta cifra los países Sudamericanos 11% aportan el 29.1%; el 23.3% es aportado por Asia; un 23% por Norte y Centro América; unpor Europa; un 8% por Africa y el restante 5.6% por Oceania y por la ex-Unión Soviética (Fig 1). Del totaldelaproducción, el porcentajequecorrespondeporproductocítricoesde66.2%para naranja,l5.6% mandarinas,8.8% toronjas, 8.5% limones y el restante 0.9% con otras especies (Fig 2). (FAO, 1991). Porotraparte,enordendeimportanciacomopaísproductor,seencuentran:Brasil(23.7%), Estados Unidos (15.2%), España (.5%), China (6.45%), Italia (.3%) y México, que ocupa el sexto lugar (4.9%). En total estos países aportan más del 60% de la producción mundial (Fig 3 ) (FAO, 1991). México cuenta en la actualidad, con una superficie total de más de 313O00 mil ha. dedicadas al cultivo de los cítricos, los cuales proporcionan una producción anual promedio estimada en 3.5 millones de toneladas; siendo el principal productor de limón mexicano a nivel mundial y sexto en producción de naranjo. Con lo anterior, se benefician 38 500 productores mexicanos. Anivelnacional,lasuperficiedestinadaacítricosocupa el 23%deltotalquesedestinaa frutales, dicha superficie se distribuye en los siguientes Estados de la República Mexicana, de acuerdo al tipo de cítrico: 1. Naranja,mandarinaytoronja.Veracruz,NuevoLeón,SanLuisPotosíyTamaulipasque aportan el 75 % de la producción nacional.

2.Limón.Colima,Michoacán,GuerreroyOaxaca,queaportan Sinaloa y Tabasco que aportan el 9.5%.(INEGI. 1993).

el 14.9%;Yucatán,Sonora,

La industriacitricoladeMéxico,ademásdeproporcionarfrutaparaconsumolocalypara exportación, representa un importante apoyo para la economía del país proporcionando fuente de divisas y de empleo para una gran parte de la población. Prácticamente, todas las plantaciones comerciales de cítricos en México están injertados sobre patróndenaranjoagrio (Citrusaurantium L.).Noobstante lasventajasagronómicasque representa el empleo de este portainjerto, es extremadamente susceptibleal virus tristeza de los cítricos (VTC), el cual ha eliminado millones de árboles crecidos sobre este patrón de naranjo, ocasionandocambiosradicalesenmuchasáreascitrícolasdelmundocomoBrasil,Uruguay, Argentina, California y Florida, E.U.A, España e Israel. Estaenfermedadde"tristeza",ocasionadaporunviruseslamasdestructivaqueseconoce (Roistacher, C.N. 1976), ya que puede disminuir gradualmente la calidad y rendimiento de los frutoscítricos o matarlosárbolesen un cortoperíodo.Originalmente,eraconsideradauna enfermedadquesepresentabasolamenteenciertascombinacionessusceptiblesdepatróninjerto, como naranjo agrio con naranja, toronja o mandarina y, especies muy susceptibles como limónmexicanoy Citrus macrophilla Wester;sinembargo, el virusestancambianteque continuamente forma nuevas líneas o variantes que se transmiten más rápidamente, o son más virulentos y que atacan a las combinaciones de patrón-injerto antes considerados resistentes.

Produccón anual estimadaen 60 millones de tonelada

Fig. l. Producción mundial de citricos por región.

Limones

T oronja 9%

Otras spp. 1%

1

‘I /’

fig 2. Porciento de producción por producto cítrico a nivel mundial

’i

En total aportan el 60% de la producción mundial E s paiia 12%

México 8%

fig.3 Principales países productores de cítricos

E S tados U nidos 24%

Brail 38%

Transmisión

El virus tristeza de los cítricos es transmitido, además de por injertos naturales y artificiales, por una serie de organismos vectores. Tales agentes diseminadores incluyen principalmente al grupo de los áfidos o pulgones que hospedan los cítricos, entre los que se pueden citar como vectores potenciales Toxoptera citvicidus kirk, T. auruntii Boyer De Fonscolombe, Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch, A. cruccivora kochy Dactynotus jacae L.(klotz,L.J.,E.C.Calavan,andL.G. Weathers. 1972.) El más importante y eficiente de elloselesáfido caféToxoptera citricidus; probablemente es nativo de China y actualmente se encuentra distribuido en una gran cantidad de regiones citricolas del mundo. Aunque es considerado como una especie tropical,el áfido existe en los lugares fríos del Japón, en el sur del desierto del Sahara, en la India, Ceylan, en las regiones áridas de Africa del Sur, Australia, y Nueva Zelanda; así como, en todos los países del Oriente, es en si una plaga de consideración del cultivo de cítricos. No se transmite por semilla (McClean, 1957). La transmisión de planta a planta por equipo de campo es aparentemente rara, aunque experimentalmente el viruspuedetransmitirsemecánicamente al causarheridaseneltallo.(Becerra,Leor.Enrique Noe. 1996). Síntomas:

Los síntomas de los árboles con tristeza son similares a los de un árbol cuyo sistema radical ha sido dañado por hongos del suelo, empantanamiento, exceso de fertilizante u otro daño similar. El primer síntoma apreciable es una coloración ceniza de las hojas las cuales se tuercen hacia arriba como denotando falta de agua. En los primeros estadios los árboles cargan más que los sanos y entran en cosecha 1 o 2 años antes. En esta fase, las raicillas de la periferia mueren y demuestran un abatimiento del contenido de almidón diagnosticable con la prueba del yodo. Conforme avanzala muerte de raíces la copa del árbol se deteriora, las hojas se marchitan y caen. Esto ocurre más frecuentemente en los períodos de sequía. Los síntomas descritos corresponden o mandarina alacombinaciónsusceptibledepatrónagrioinjertadoconnaranja,toronja infectadoscon el virusdelatristeza;sinembargo,estospuedencambiarcondiferente combinaciónpatrón-injerto o especiesdecítricosyconotralíneadeviruspertenecientesal mismo complejo de la tristeza. El mejor indicador para diagnosticar la enfermedad es el limón mexicano (Citrus uurantifolia Christm.)(Swing).Lasplántulasy los árboles dedistintas variedadespuedenmostrartambiénpicaduradetalloylasplántulasdeárbolesdedistintas variedades pueden mostrar los síntomas de amarillamiento (Agrios, 1991) . Métodos de detección:

Laspruebas serolópcas sebasanenlapropiedadquetienenlosvirusdeseraltamente antigénicosdebidoasunaturalezaquímica,yaque al serintroducidosaunorganismoson consideradoscomocuerposextraños(antigenos) y soncapacesdeinducirlainformación de anticuerpos contra ellos( Hernández, M .1993). Además, del empleo de plantas indicadoras para la detección del virus existen varios métodos porloscualeselvirustristezadeloscítricospuedeserdetectadoentejidoinfectado.Tales métodos incluyen:

0

-

0

0

Inmunodifusión con dodecil sulfato de sodio (Bar-Joseph, M., Garnsey, S.M., Gonsalves, D., and Purcifull, D.E. 1980), lnmunoadsorción ligada a enzima (ELISA) (Bar-Joseph, M., Garnsey,S.M Gonsalves, D., and Purcifull, D.e. 1980). Inmunoadherenciaamembranasdenitrocelulosa(Rocha-Peña,M.A.,Lee,R.F.andNiblett, C.L. 1991.), Microscopía de luz y electrónica (Garnsey, S.M., Christie, R.G., Derrick, K.S., and Bar-Joseph, M.1980), Inmunoflurescencia insuti (Brlansky, R.H., Garsey, S.M., Lee, R.F., and Pursifull,D.E. 1984)..

Cada uno de estos métodos tienen diferentes ventajas, desventajas y niveles de sensibilidad en la detecciónporloquetienendiferentesusosyaplicaciones;sinembargo,debidoasugran versatilidadyaltasensibilidad, el métodoELISAhallegadoaserdeusoimprescindibleen el virustristezadeloscítricos cualquierlaboratorio o institucióndondesetrabajecon VTC.(Rocha-Peña, M.A and Lee, R.F. 1991). LapruebaELISA(Inmunoadsorciónconenzimasconjugadas) , sebasaenlauniónquese establece entre antigen0 y anticuerpos solubles que son adsorbidos a una fase sólida insoluble. Principios de la Técnica (ELISA):

a) La adsorción de un antisuero especifico a la pared de un pozo de plástico. b) Agregar un extracto de planta infectada de virus; las particulas vírales se adherirán a las del antisuero. c) Agregar otra vez el antisuero usado inicialmente, pero ahora conjugado con una enzima. El conjugado se adheriráal virus. d) Agregar un sustrato sobre el que la enzima actúe y produzca una coloración, cuya intensidad será proporcional a la concentración del virus. En cada paso se lavael pozo, por lo que si el virus no está relacionado con el antisuero no habrá adherencia ni coloral final .(Téliz, Ortiz, D.et al. 1986) . LatécnicaELISAdescritaporprimeravezenlaliteraturamédicaen1971(Engualland Perlaminn, 1971), se caracteriza por ser: 1. Altamente sensible 2. Rápida 3. Requiere pequeñas cantidades de antisuero(Ghabrie1 y Shepherd, 1980) .

Años más tarde fue introducida a la virología vegetal (Voller y colaboradores 1976) y adaptada en 1977por Clark y Adams para la detección de virus en plantas. Actualmente la técnica ELISA es de gran utilidadelen diagnóstico de enfermedades vírales. Antecedentes del VTC en México:

A nivel nacional, se utiliza casi en un 100% el patrón naranjo agrio, con una gran cantidad de variedades injertadas sobre el. La combinación de naranjo agrio o "cucho" con naranjo Valencia es considerado como la combinación más susceptibleal VTC. En tal situación, se corre el riesgo

de que desaparezcan160 202 has plantadas con cítricos en Veracruz y en los estados productores de limón mexicano del Pacífico, donde el 70% de los árboles están establecidos a pie franco. ElprimerinformedeladeteccióndelVTCenMéxicosereportóen1983enelestadode Tamaulipassobretresvariedadesenunvivero; el segundose da en1986-87enunCampo Agrícola Experimental y en un lote demostrativoelenestado de Veracruz sobre 21 variedades; el tercer reporte se presenta en 1992 nuevamente en Veracruz en los mismos sitios sobre 26 plantas y dos viveros; el cuarto se da en 1993 en los Distritos de Desarrollo Rural de Martinez de la Torre, 14 viveros . Tlapacoyan, Alamo y Tuxpan, Ver. en En cada uno de estos casos, las plantas enfermas se eliminaron completamente. Con respecto, a la ultima detección se erradicaron todos los sitios positivos 1994 en (Rocha P. M.A. et al, 1992; Jasso y Rocha, 1993; Becerra, 1995; Colli y Cardenas, 1995).. Las especies de áfidos reportados en plantaciones comerciales de Nuevo León, Tamaulipas, San Luis Potosíy Veracruz son:Toxoptera auranfii, Aphis gosypii, A.citricola y Myzus persicae.

OBJETIVOS:

Estandarizar un método estadístico para determinar el rango "positivo-negativo" (plantas sanaslos cítricos (VTC), en muestras simples. enfermas), en virus tristeza de

Estandarizarcriteriosenladeterminacióndelrangopositivo-negativoválidos encualquier laboratorio en donde se realiceel diagnóstico del virus tristeza de los cítricos(VTC), mediante la técnica ELISA en muestras simples.

c MATERIAL Y METODOS:

ElCentroNacionaldeReferenciadeDiagnósticoFitosanitario,realizó un proyectopara determinar la ausencia o presencia del virus tristeza de los cítricos; así como, el rango positivonegativo (plantas sanas-enfermas), a la presencia del virus tristeza de los cítricos, en los estados deCampeche,Tabasco,Yucatan y QuintanaRoo.Suestudioestantoencampocomoen laboratorio. Campo:

a)Muestreo.Paradeterminar el númerodemuestraselCentroNacionaldeReferencia Fitosanitaria, se basó en el modelo “W ”, que consistía en dividir el área (una hectárea) de estudio en forma de” W , de está forma se tomaron las muestras de cítricos (naranja, limón) al azar. Cada submuestra consistia de3 brotes tiernos tomadas en diferentes partes de la planta en una hectárea, obteniendo así una submuestra ”simple”. b) Colecta de muestras. Los brotes tiernos se cortaron del árbol, con tijkras de podar, mismas que eran esterilizadas con hipoclorito de sodio al 1 %, cada que se hacía un corte, para minimizar la posibilidaddeladispersióndelaenfermedad. Los 3 brotestiernossecolocaronenpapel secante ó de estrasa, que se humedecia ligeramente. c) Etiquetado: Después de la colecta de las muestras, se llevó a cabo el llenado de las etiquetas parasuidentificación,unapormuestra,conteniendoinformacióndeestado,propietario, vivero o plantaciones comerciales,árbol. d)Envíodemuestrasallaboratorio:Lasmuestrassecolocaronenunabolsadeplástico, anexando la dormación codificada en las etiquetas y el nombre del área o lugar al que se remitenlasmuestrasparasuanálisis.Setransportaronenhieleras al laboratorioporlos medios más rápidos disponibles. Laboratorio.

El procesamiento de las muestras se realizó enel Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario, área de virologia enel laboratorio de serología de la Dirección General de Sanidad Vegetal. Registro de muestras: Al llegar las muestras se reptraban anotando los datos correspondientes: Lugar de procedencia, propietario, vivero ó plantación comercial, número de muestra, etc. Procesamiento. Considerando que las técnicas comunes de diagnostico de virus requiere de entre

30 y 60 díasparaobtener un resultadoparcial,sedecidiótrabajarconlaTécnicaSerologica ELISA, quesecaracterizaporseraltamentesensible,rápida y sobretodoporrequerirsólo

pequeñas cantidades de antisuero.

Método serologico ELISA :

En el procesamiento de las muestras se retiraba la corteza de los tres brotes tiernosy se cortaban en pedazos de aproximadamente 1-2 mm. Posteriormente, se sometian a la técnica ELISA como se indica a continuación: 1.- Agregar 200 u1 deantisueroatrapador(cabraanti VTC) relación (1:lOOO) ensolución amortiguadora (SOLAM) de cobertura a cada pozo de la placa de microtitulación de polietileno. Incubar a 37 "C por 4 a 6 horas o toda la noche (por lo menos16 horas ) a 6 "C. (Los anticuerpos se adherirán a las paredes del pozo).

Si se mantiene a6°C ,una vez cubiertay sellada la placa con polietileno adherible, se puede usar 8 días. en un intervalo de 2.- Lavado de placa:

Después de cada incubación las celdas de las placas se deben lavar con PBST usando una pizeta. Esperar 3 minutos , vaciar y sacudir fuertemente en una toalla de papel sobre una superficie plana. Repetirel lavado tres veces. Vaciary sacudir. (Se eliminaráel exceso,pero los anticuerpos quedarán adheridos a las paredes del pozo) . 3.- Preparación y adición de la muestra.

Macerar la planta por probar en una dilución de 1 : l O o 1:20 (peso/vol) ,en solam de extracción. Durante el procedimiento, el Solamy las muestras vegetales deben mantenerse frías. Agregar 200 u1 de savia de cada planta prueba a pozos duplicados. Incubar la placa durante toda la noche (por lo menos 16 horas) a 6 "C o 37 "C por 4- 6 horas.( Las particulas vírales se adherirán a los anticuerpos, si es que son afines). 4.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos.

5.- Adición de anticuerpos secundarios monoclonal (detector) ratón antiVTC en solam reactivo A en una relación (1:lOOO) . Agregar 200 u1 de esta solución en cada pozo. Incubar por2 horas a temperatura de 37"C ,de preferenciaen cámara húmeda. 6.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos. 7.- Adición del conjugado (Antisuero-enzima).

Prepararlasolucióndelconjugado(antiratónIgG+fosfatasaalcalina)diluyendoensolam reactivo A en una relación (1:lOOO). Colocar 200 u1 por pozo. Incubar una hora a temperatura de 37 "C. (El conjugado se adherirá al compuesto virus-anticuerpo pegado a las paredes del pozo formará un sandwich anticuerpo-virus-conjugado anticuerpo enzima ).

y se

8.- Lavar la placa tres veces como en el paso dos. 9.- Adición del sustrato.

o tableta en La solución del sustrato se prepara disolviendo el p-nitrofenil fosfato (PNP) en polvo solución dietanolamina(DTA), para una concentración final de1 mg/ml.. En todos los casos los sustratos deben ,ser utilizados inmediatamente después de su preparación. Incubar por 30 a60 minutos a temperatura de 37°C en un medio obscuro. 10.- Parar la reacción agregando50 u1 de NaOH 3 M en cada pozo. 11.- Evaluar resultados.

La evaluación de las muestras colectadas para el diagnósticovirus, del se realizo de acuerdo a: Observación visual (coloración) . Medición de absorbancia 405 a nm (lectura fotométrica).

Diagrama del Método ELISA

Agregar 200 u1 en cadapozo (cabra anti-VTC) relación cubrimiento As policlonal.

de antisuero atrapador ( 1:lOOO ) en Solam de

la noche (por lo menos 16 Incubar :Toda temperatura de 6°C ó 4-6 horas a 37°C

hrs)

Lavar Extraer la savia de lasmuestras y diluirenSolamde extracción relación (1:20) peso/vol., a pH= 7.4 . Agregar 200 u1 del extracto vegetal a cada pozo.

a

1

Incubar: Toda la noche (por lo menos 16 hrs) a temperatura de6°C. ó 4-6 horas a 37°C. Lavar

anticuerpo secundario de Adición (monoclonal), detector ratón anti-VTC en Solam reactivo A (1:lOOO). Agregar 200 u1 a cada pozo. Incubar: 2 hrs a temperatura de37°C. Lavar.

Adicióndeenzimaconjugada IgG. Diluir el conjugado del antisuero y la fosfatasa alcalina en Solam reactivo A. Agregar 200 u1 en cada pozo.

I

v

Incubar: lhora a temperatura de37°C Lavar. Enzima sustrato añadido. Agregar sustrato p-nitrofenilfosfatoensoluciondietanolamina, para una concentracion final de 1 mg /d.

1

30-60 minutos a temperatura de 37°C medioobscuro.

50 u1 de NaOH 3.0M. Parar la reaccion con

1

1

LecturavisualLecturaenespectrofotometro a 405 m.

RESULTADOSDELOSDIAGNOSTICOSDELVIRUSDELATRISTEZADELOSCITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA DE ELISA EN MUESTRAS (SIMPLES) CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE CAMPECHE.

b 2a b 3a

b

~~

~~~

2 4

5 6

I

0.0237 0.0212 0.0255 0.0212 0.0231

0.022

0.0024

3 0.0030

I 0.0221

0.0013

0.0233

"

0.0203 b l a 0.0288 0.0279b

PIXTUM

-

48 49 50

b

I

I

0.0006

I

52 53 54 55

I

b 5a 58

b

I

6a b 7a

..

I

3a

I

b 4a

b

I

I

b

71 72 73 74 75

I

78 79 . . 80

7a

b 8a

b 9a

b

~

I

0.001 3

0.0272

1

56 57

I 0.0019

0.0266

0.0014

0.0309 59 60

0.0014 0.0281

0.0007

0.0240 0.001 0.0272 I 0.0268 0.0271 0.0286 76 0.0252 77

0.0248

1

0.0278

0.0010

1

0.0344

0.0298

0.0065

I

0.0291-

I

b

6- a ..

~~~

0.00007

0.0272

0.0276 62

5a

1

0.0283

0.0268

61 0.0286

0.0256 2 a

I

0.0273 0.0263 0.0282 0.0288 0.0252 0.0320 0.0299 0.0279 0.0258 ~

b

b

0.0194

"

"

3a b 4a

0.0012

82 83 84 85

0.0238 0.0246 81 0.0242 0.0253 0.0235 0.0260 0.0273 86

1

I 0.0002

I

0.027

1

0.0037 0.0244

0.0002

0.0244

0.0012

0.0266

0.0009

0.0264

2a b 3a b 4a b 5a h 6a b 7a b l a

RANCHO STA CRUZ. PINO SUAREZ

I

1

89 90 91 92

I

0.0242 0.0314 0.0259 O.0248 0.0253 0.0236 0.0259 0.0248 0.0269 0.0265 0.0245 0.0276 0.0202

94 95 96

97 98 99 100 101

1

1

0.0278

0.0050

0.0253

O. 0007

0.0244

0.0012

0.0253

0.0007

0.0267

0.0002

0.0260

o. 0021 0.0009

93

1

b 2a b 3a b 4a

102 103 104 105 106 107

0.0216 0.0216 0.0248 . 0.0232 0.0207 0.0215

0.0209

0.0219

0.0017

b 2a

122 123 124 125 126 127

0.0100 0.0120 0.0093 0.0392 0.0093 0.0180 0.0086 128 0.0135 0.0084 130 0.0116 0.0206

0.0108

0.0011

0.0106

0.0019

O.0242

0.0211

~~

b 3a b 4a b 5a b 6a

b

~

~

129 131 132

~

~~

~

I

0.0232

0.0066

0.0133 ~

0.0022

~

0.0109

0.0036

0.0161

0.0063

8a 135 b 9a 137 b 138 10 a 0.0350 139 b l a b

CAYAL POZO 2

tI

I

I

EL CORTIJO

I

t

I

2a b 3a b 4a b 5a b 6a b 7a b 8a b 9a b 10 a b l a b b 3a b 4a b 5a b 6a ~~

I I

143 144 145

0.0143 0.0140 136 0.0129 0.0112

I

148 ~~

~

0.0100 O. 0241 0.0265 0.0252 0.0232 O. 0248 0.0230 0.0245 0.0228 0.0242 0.0241

140 141 142

0.0255 0.0237 0.0241 0.0250 0.0232 0.0248 0.0222 0.0241 0.0235 0.0438 0.0423

152

~~

I 146 147 149 150

0.0141

0.0002

0.0120

0.0012

0.0225

0.01 76

0.0253

0.0016

O.0242

0.0014

1 0.0012

0.0237

0.0010

0.0214

153

157 158

162 164 I

165

~"

I

166 167 168 169

b

172

7a b 8a b

174 175

b

I

0.00007

151 0.0242

154 155 156

I

178

0.0016

0.0248

0.0002

0.0239

159 160 161

O.0434 0.0295 - .". -

0.377 0.0459 0.0485 O. 0428 0.0454 O. 0432 0.0443 O. 0428 0.0451 0.0435 0.0422

0.0009

0.0012

0.0241

0.0018

0.0235

0.0004

0.0238

0.0010

0.0430

0.0002

0.0435

0.0057

0.0336

1

0.0472 170 171

0.0018 0.0018

0.0441

0.0007

0.0437

0.0016

0.0439

0.0009

0.0428

173

176

I

0.0459

I

0.0239

0.0447

I

I

I

b

I

200

0.0420

I

0.0425

0.0007

RESULTADOSDELOSDIAGNOSTICOSDELVIRUSDELATRISTEZADELOSCITRICOS PORMEDIODELATECNICADEELISAENMUESTRAS(S1MPLES)CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE TABASCO.

I

I

I

b

I

3a b 4a b 5a b 6a b 7a b 8a

I

144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155

I

0.0269 0.0231 0.0234 0.0237 0.0220 0.0223 0.0225 0.0187 0.0225 0.0198 0.0218

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MIGUEL MERCEDES

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0.0233 0.0235

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298

0.0248 299 0.0228 0.0209 0.0027 300 0.0223 O. 0240 0.0232 0.0222

301 302 303 304

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0.0215 0.0229 0.0219 0.0235 0.0222

0.0009 0.0222

308 309 310 311

0.0011 0.0227 0.0221 0.0221 0.00007 312

313

315 317 318

I

0.0214 0.0213 314 0.0217 0.0220 316 0.0225

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I

0.00007

1 0.0002 0.0218 0.0015 0.0214

RESULTADOS DE LOS DIAGNOSTICOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CITRICOS POR MEDIO DE LA TECNICA ELISADEMUESTRAS(SIMPLES), PROVENIENTES DEL ESTADO DE YUCATAN.

5a 0.0236 165 b 166 6a 0.0239 167 b

0.0234 0.0233 0.0002 0.0246 0.0254 0.0010 168

RESULTADOSDELOSDIAGNOSTICOSDELVIRUSDELATRISTEZADELOSCITRICOS PORMEDIODELATECNICADEELISAENMUESTRAS(S1MPLES)CORRESPONDIENTES AL ESTADO DE QUINTANA ROO.

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CORREDOR FRUTICOLA TIHOSUCO

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CUADRO No. 1. RESULTADO DE MUESTREOS EN HUERTAS, VIVEROS, PLANTAS COMERCIALESDECITRICOSDECUATROESTADOSDE LA REPUBLICA MEXICANA.1993

MUESTRAS PROCESADAS

RESULTADO VTC.

Yucatan

88

Negativo

Quintana Roo

99

Negativo

Tabasco

59

Negativo

Campeche

100

Negativo

Total

446

ESTADO MUESTREADO

CUADRO

No.

ESTADO

2. RESULTADOS DE ANALISIS ESTADISTICO PARA DETERMINACION DEL VIRUSTRISTEZADELOSCITRICOS (VTC)ENPLANTASDECITRICOS,MEDIANTELATECNICA SEROLOGICA ELISA.

NUMERO DE MUESTRAS

Yucatan

88

ANALISIS ESTADISTICO POR ESTADO DESVIACION DE LA ESTANDAR(S). VALOR DE LA MEDIA ABSORBANCIA A 405 NM (X)

99

0.0196

0.0485 I

1

0.002959

I

Tabasco Campeche

Total

1

159

O. 0225

100

0.0277

446

0.0224

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0.0193

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1

0.009739

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0.0330

0.003515

0.0556 0.009307

I

0.007371

I

0.0445

CUADRO NO. 3. ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOSNEGATIVOS EN VTC, CON LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

TESTIGOS NEGATIVOS

VALORES.ABSORBANCIA A 405 nrn DE LOS: ESTADOS Yucatán : 0.0300 Tabasco: 0.0225 Quintana Roo: 0.0218 Campeche: 0.0483 Yucatán : 0.0328 Tabasco : 0.0251 Quintana Roo : 0.0242 CamDeche: 0.0438

I

ANALISIS ESTADISTICO

I x+35

X=MEDIA

0.0306

I

S=DESV. ESTANDAR 0.0123

O.0676

0.0587 0.0090 0.0314

CUADRO No. 4 . ANALISIS ESTADISTICO DE TESTIGOS POSITIVOS EN VTC, CON LA TECNICA SEROLOGIA ELISA

TESTIGOS POSITIVOS PLANTA VTC

CON

VALORES. ABSORBANCIA A 405nm DE LOS: ESTADOS Yucatán:

ANALISIS ESTADISTICO x+35 X=MEDIA

S=DESV. ESTANDAR

0.1045

Tabasco: 0.1015 Quintana Roo: 0.0731 Campeche: 0.1027

0.1403 0.01495 0.09

1

Al analizarlosresultadosobtenidosdemuestrassimplesdecítricosprocesados por medio de la técnica ELISA, para determinar la presencia o ausencia del virus tristeza de los cítricos (VTC), podemos decir que la mayoría de las muestras procesadas presentan una frecuencia de absorbancia que oscila en un rango de 0.0180-0.0270, dichos datos se pueden observar en las gráficas de resultados. Paraqueseestablezcaunaestandarizacióndelrangopositivo-negativo plantean varios razonamientos:

en cítricos se

1. Las lecturas del espectofotometro que automáticamente da

el resultado, asumiendo que los valores de absorbancia están directamente relacionados a la concentración.

2. Análisiscuantitativodondesedeterminalacurvadedosificación o atravésdel empleo de controles positivos de referencia, cuya concentración este bien establecida. Y deestaformalosvaloresobtenidospuedensercomparados,hallándoselas concentraciones relativas de las muestras problema. 3. La densidad ópticano rebase a 0.05 nanómetros

4. Seplanteandiferentesmétodosestadísticosparadeterminarelrangopositivonegativo como son: 2x de los testigos negativos x + 2s de los testigos negativos 3x de los testigos negativos x+3s de los testigos negativos Para el objetivo de este trabajo, se determinó el rango positivo-negativo utilizando el método estadístico de Chebychevs, que considera la media más tres veces la desviación estándar (X+3S); es decir, se toma como límite negativo superior la media de los valores negativos más tres veces la desviación estándar. Se estableció la significación estadística entre las lecturas de las muestras y de los controles positivos y negativos. ElCentroNacionaldeReferenciaFitosanitaria,delaDirecciónGeneraldeSanidad Vegetal, realizó el muestro para determinar la presencia o ausencia del virus tristeza de los cítricos mediante la técnica ELISA en los estados de Tabasco, Campeche, Yucatán y Quintana Roo. Se procesaron muestras simples formadas de tres brotes tiernos por árbol, obteniendo una mayor precisión en el diagnóstico. En el estado de Tabasco se procesaronun total de 159 muestras simples, QuintanaRoo 99 muestras simples, Campeche 100 muestras simples y Yucatán 88 muestras simples, con sus respectivas repeticiones.

Al aplicar la fórmula estadística x+3s en las lecturas reportadas por los cuatro estados,se obtuvo el valorestándartotalqueesde 0.0445. Losvaloresdeabsorbanciaque excedieron el valor estándar total se consideraron positivos, y valores de absorbancia que estuvieron por debajo del valor estándar total se considerarán negativos. Con basea lo anterior se determinó que las lecturas de absorbancia de las muestras simplesevaluadas,dieronvalorespordebajodelvalorestándartotal,por lo que el diagnósticodelasmuestrassimplesprocesadas por mediode latécnica ELISA son negativas. Determinando lano presencia del virus tristeza de los cítricos (VTC). Porotraparte,alconfrontarlosvaloresdeabsorbanciaobtenidos,conlasmuestras control positivos, ninguna excedió al control positivo de referencia. El diagnóstico rápido y preciso de una enfermedad es una condición necesaria para los programasdeerradicaciónycontrol,sobretodocuandoseimpone el aumentodela productividad en la esfera agropecuaria. La serologíatienegranaplicaciónen el estudiodelosvirusdevegetales,sirve para identificarlos, detectarlos en el estado latente, medirlos cuantitativamente, determinar la relación entre distintos virus, etc. Por lo que la técnica ELISA como un método serológico utilizado en diversos campos, particularmente en virología, tanto animal como vegetal, ha tenido una amplia aceptación, habiéndose utilizado para la detección de diferentes antigenos vírales. En fitopatología, esta ha sido la aplicación más generalizada, utilizándoseno sólo para el diagnóstico de infecciones naturales en diversos cultivos fundamentalmente perennes y de propagación vegetativa, sino también para la detección de virus en semillas, áfidos y vectores virulíferos en general.Su mayor utilidad ha sido en la detección de anticuerpos inducidos por antigenos vírales. ELISA ha idoremplazandotécnicasmenossensibles o de difícil ejecución como la inmunodifusión, inmunofluorescencia, inhibición hemaglutinación lade o hamagluitinación pasiva seroneutralización y (Piroird Lombard, y 1980; Sánchez Vizcaíno et al., 1982), demostrándose que en algunos casos de virus vegetales ha llegado a ser más sensible que los ensayos de infectividad en plantas indicadoras (Clark et al; 1976; Bossenec y Maury,1978; Gugerli, 1978). México se considera como una de las pocas áreas del mundo donde aparentemente aún no existen problemas con tristeza. Sin embargo, la predominancia de naranjo agrio como Único portainjertoencasi el 100%delasplantaciones,juntoconlasáreasextensas plantadas con limón Mexicano en la costa del pacífico, lo hacen totalmente vulnerable al VTC. La citricultura Mexicana se encuentra seriamente amenazada por el virus tristeza de los cítricos (VTC); ya que varios reportes indican que tarde o temprano tristeza inevitablemente va a llegar a ser un problema en México;yaquesehanencontrado muestras positivas del VTC dentro del territorio nacional en 1983 y 1986-87, indicando

que puedan existir focos adicionales de infección, principalmente en huertas que hayan sido propagadas con material traído del extranjero

VENTAJAS: Entre las principales ventajas de la técnica ELISA pueden citarse:

1. Alta sensibilidad que permite la detección de concentraciones muy bajas de antigen0 o anticuerpos. 2. Rapidez y precisión en la ejecución del método 3. Posibilidad de utilización de extractos crudos de ydetección de antigenos fragmentados y de diferentes tamaños. 4. Especificidad en la detección que permite la diferenciación y estudio de serotipos y relaciones antigénicos. 5. Factibilidad de automatización, estandarización y empleo para pruebas de diagnóstico masivo. 6. Fácil conservación de los reactivos por períodos largos 7. Bajo costo por determinación y requerimiento de equipamiento simple.

DESVENTAJAS: LadesventajadeutilizarlatécnicaELISA,esque si no serealizacorrectamente procedimiento; podríamos no tener resultados favorables como serían:

el

1. Placasconcolorindiscriminado:Debidoa un recubrimiento defectuoso; conjugado muyconcentrado;lavadoinsuficienteluegodeaplicar el conjugado;controles negativos erróneos. 2. Obtener poca diferencia entre positivos y negativos: A causa de reacciones cruzadas por falta de especificidad de los antisueros utilizados; conjugado muy concentrado o muy diluido; sustrato mal preparadoo poco tiempo de incubación; lavado defectuoso; reactivos envejecidos.

3. Placa sin coloración : Conjugados muy diluidos; sustrato poco concentrado; lavados excesivos; incubación insuficiente; ausencia de controles positivos reales.

n CONCLUSIONES:

Paradeterminarelrangopositivo-negativodelosdatosobtenidosalprocesarlas muestras de cítricos mediante la técnica ELISA utilizamos la fórmula estadística de Chebychevs; la media más tres veces la desviación estándar (x+3s). Un rangodebeseradaptadoenbasea resultados más correctos

una referenciaaceptable,deacuerdoa

los

Las muestras se analizaron serológicamente utilizando la técnica inmunoenzimática ELISA, que utiliza anticuerpos mono y policlonales, se requiere la purificación del virusylapreparacióndeanticuerposespecíficos,y su conjugaciónconenzimas, aunque requiere algo de equipono es tan costoso como otros métodos.La evaluación de las muestras colectadas para el diagnóstico del virus, se efectuó en un espectofotómetro a 405 nm, y sus lecturas se analizaron estádisticamente utilizando x+3s obteniendo así el valor estándar total de 0.0445. Las muestras de los cítricos fueron tomadas de varios viveros, plantaciones comerciales, huertas, definidos en nuestro trabajo como localidades; registrándose un total de 46 localidades por los cuatro estados muestreados que son: Yucatán, Quintana Roo, TabascoyCampeche.Cadalocalidadtiene un nombreespecífico para poder facilitar su : ubicación geográfica, procedencia(huerta, vivero, plantación comercial), propietario. Se procesaron un total de 446 muestras simples y sus repeticiones. Obteniéndose un diagnóstico negativo, es decir que el virus tristeza de los cítricos no estuvo presente en las muestras delos cítricos. El análisis de muestras simples en cítricos(tres brotes tiernos por árbol), nos permitió obtener una confiabilidad del 100% en el diagnóstico de los resultados.

LaestandarizacióndelmétodoELISAtienengranimportancia ya quepermiten garantizar la repetibilidad de las experiencias y la confiabilidad de los resultados, así como su sensibilidad. El establecimiento de estos parámetros resulta de interés para la y lainterpretacióncorrectadelos valoracióndelautilidaddelmétodoELISA resultados que se obtengan.

RECOMENDACIONES:

Para reportar adecuadamente los datos de la técnica ELISA se recomienda:

1. Para el TestigoPositivo(T+)

desviación estandar (X+3S).

seestablezcalamedia

más tresvecesla

2. Establecer claramenteel rango de positivoy negativo 3. Probar suficientes plantas para familiarizarse conel rango de valores negativos (sano) involucradas.

4. Incluirsuficientescontrolesconocidosnegativosencadaensayoderutina para asegurar la representación del rango plenamente establecido de valores negativos. 5. La inclusión de un control o blanco PBS facilitará conocer los errores de manipulación que se hayan cometido al realizar la prueba. 6. Incluir simplementeun control positivo(p1anta con VTC)

7. Considerar un mínimo de dos repeticiones.

O BIBLIOGRAFIA

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No. 5.

3. Cartas China, Juan. 1987: Estadística Medica. Limusa. México.377 pags. 4. Clark, M. F. and A. N. Adams. 1977: Characteristics of microplate mehod of enzymelinked inmunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 : 475483. 5. Ghabriel, S. A. And R. J. 1980: Asensitive radioinmunosorbent assay for detection plant viruses. J. Gen. Virol. 38: 311-317.

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Soluciones amortiguadoras (SOLAM) utilizadas en la técnica ELISA. 1.- Solam de Lavado (PBST) En 1000 ml de agua destilada disolver:

Formula Química NaC 1 Cloruro de sodio Fosfato dibásico de sodio hidratado(disminuir aNa2HP04.12H20 1.15 g si es anhidro) KH2P04 Fosfato monobásico de potasio KC1 Cloruro de potasio Tween-20 Ajustar el PH a 7.4

Cantidad 8.0 g 2.9 g 0.2 g

o .2g

0.5 ml

2.- Solam de Cubrimiento: En 1000 ml de agua destilada disolver

Carbonato de sodio Bicarbonato de sodio Azida de sodio Ajustar el PH a 9.6

Formula Química Na2C03 NaHC03 NaN3

Cantidad 1.59 g 2.93 g 0.2 g

Formula Química

Cantidad 1.3 R 20.0 g 0.2 e

3.- Solam de Extracción de Muestra: Disolver en 1000 ml de PBS-T 1X

Sulfito de sodio Polyvinylpyrrolidone (PVP) Azida de sodio Albumina de Huevo Tween-20 Ajustar el PH a 7.4. Almacenar a 4 oC.

PM= 24-40,000 NaN3

2.0 g 20.0 g

4.- Solam Reactivo A: En 1000 ml de PBS-T 1X agregar:

Albumina de suero Bovino (BSA) Polyvinylpirrolidone (PVP) PM= 24-40,000 Azida de sodio Almacenar a 4 OC

Formula Química NaN3

Cantidad 2.0 g 20.0 g 0.2 g

5.- Solam sustrato; p-nitrofenil fosfato (PNP)

Formula Química Diethanolamina (DTA Agua destilada Azida de sodio NaN3 Ajustar el PH a 9.8 empleando ácido hidroclorhídrico concentrado. Ajustar el volumen final a1000 ml con agua destilada.

Cantidad 97.0 g 800.0 ml 0.2 g

PARAMETROS Y ESTADISTICOS. llama parámetro, que son fijos y por lo regular se

A las características de una población se les desconocem. Los parametros pueden ser: a)

Media

b) Varianza c) Desviación estándar

Estadísticos: A las características de una muestra de población se les llama estadístico. Sonyfijos siempre se conocen. Notación letras latinas y son: a) Media aritmética(x): Esel promedio de los datos y se calcula sumándolos y dividiendo entre el

tamañodelamuestra.Siserequiereunaexpresiónmásformaldelaestimaciónysu variación,podemosobtenerunaestimaciónporintervalo al azarllamadointervalode confianza para mayor claridad;el parámetro a estimar por intervalo de confianza es la media muestral. Sabemos que la distribución muestral de la media es apróximadamente normal por el Teorema de límite central que dice: 0

0 0

El 68% de los casosestáncomprendidosentre X-S y X + S (esdecir,elvalordela desviación estándar a ambos lados de la media. El 95.45% de los casos están comprendidos entre X -2s y X +2S(es decir, el doble del valor de la desviación estándar a ambos lados de la media) El 99.73% de los casos están comprendidos entre X-3s y X+3S( es decir el tripledel valor de la desviación estándar a ambos lados de la media).

b) Varianza: La varianza de desviación estándar.

un conjunto de datos se define como

el cuadrado positivo de la

c) Desviación estándar: Se define como la raíz cuadrada positiva de la varianza. Una población estará caracterizada por la información de la muestra extraída de ella misma. Por lo cual nos permitirá : 1. Estimar valores de los parámetros de las poblaciones con los datos de las muestras que de ellas hemos extraído. 2. Probar hipótesis sobre los valores de los parámetros de las poblaciones usando en las pruebas los datos de muestras sacadas de ellas. Una vez obtenidos los datos de la muestra, se construyen las tablas, gráficas(también llamadas histogramas).Unavezteniendotablasehistogramas,seestáenposicióndetomaralguna decisión. Histograma: Se usa únicamente para representar información que consiste de números sobre una escalacontinua;asípues,en el histogramaserepresentalafrecuenciamedianteáreas proporcionales y en el gráfico de barras es la altura de las barras la que es proporcional a la frecuencia.

Aspectosyconsideracionesprácticasqueinfluyendeformadeterminanteenla aplicación yel éxito de la técnica inmunoenzimática ELISA. a) INMUNOADSORBENTES.

o Los inmunoadsorbentes son sustancias empleadas para insolubilizar antígenos anticuerpos bajo determinadas condiciones, siendo un requerimiento indispensable que pueda adsorberse a ella una cantidad adecuada del reactante de forma reproducible. Entrelosinmunoadsorbentesutilizadosseencuentranlacelulosa,agarosa,sefarosa, poliacrilamida y dextrán, que resultan útiles, pero requieren de centrifugaciones fase de lavado.

en la

b) FASE SOLIDA. El empleodetubos , microplacasdepoliestireno,polipropileno,poliviniloyotros plásticos, denominados fase sólida, proporcionan una adecuada adsorción pasiva anticuerpo en presencia de una solución alcalina.

o el

El empleo de papel activado (Brighton et al., 1974), membranas de nitrocelulosa (Bode et al. , 1984) como inmunoadsorbentes de fase sólida, presentan ventajasen relación con la fase de lavado y la capacidad y selectividad de adsorciónno que deben ser despreciadas. Las placas de microtitulación de poliestireno han sido la fase sólida más utilizada para la realización de ELISA. Las placas pueden ser recuperadas, lavados sucesivos con soluciones de ácido clorhídrico, hidróxido de sodio y etanol han permitido la reutilización de las placas. Las . placas así tratados pueden reutilizarse durante cuatro ocasiones c) ANTISUEROS. La calidad del antisuero es la variable de mayor importancia. Los antisueros empleados sonproducidosgeneralmenteenconejosjóvenes,aunqueotrosanimalespuedenser empleados con estos fines. El método de purificación de los antigenos y el esquema de inmunización a utilizar, dependen de las características del antigen0 en cuestión y de la utilización que se le dará a los antisueros,loquedeterminará su espectro de especificidad. d) ANTIGENOS. Al ser introducidos a un organismo son considerados como cuerpos extraños; entre ellos encontramos a los virus; bacterias; hongos; micoplasmas; ácidos nucleicos y pequeñas proteínas o los anticuerpos inducidos por estos.

En los métodos de doble anticuerpo, las suspensiones antigénicas, sean extractos crudos o purificados, constituyen la muestra problema. En el caso de los vegetales, la parte foliar eslamásempleadaparaestetipodeprueba,peropuedenutilizarsetambién tallos, tubérculos, frutos, etcétera. (Clarke et al, 1980, De Bokx y Maat, 1979). Las muestras conteniendo antigen0 pueden ser evaluadas individualmente o formando grupos, previo análisis de la capacidad del método para detectar una muestra enferma en el grupo. e) CONJUGADOS. La calidad del conjugado es uno de los factores más importantes para la ejecución del métodoELISA.Paraelloesindispensablegarantizarqueseretengan en é1 las propiedades inmunológicas y enzimaticas desus componentes. Laenzimaautilizarparaestosfinesdebecumplirunaseriederequerimientostales y establetantoenalmacenamiento como como:seraltamentereactiva,económica formandopartedelconjugado;poseerunaelevadaactividadespecíficaypoder ser obtenidaenaltogradodepureza.Lasenzimas más comúnmenteusadashasta el presente han sido la fosfatasa alcalinay la peroxidasa.

f ) SUSTRATOS. Para seleccionar el sustrato es necesario tener en cuenta que este permita la detección de la enzima presenteen el conjugado de forma sensible, específica y reproducible, como así quelosproductosdelahidrolisisseansolublescon un altocoeficientedeextinción. Finalmente debe atendersesu fácil preparación y baja nocividad. Paralafosfatasaalcalinaseutilizacomúnmente el p-nitrofenilfosfatocon el que se obtiene un producto coloreado amarillo, fácilmente identificable y legible a 405 nm con poca coloración de fondo. El tiempo de reacción una vez adicionadoel sustrato debe ser determinado experimentalmente. g) LAVADOS. Los lavados se realizan al finalizar cada período de incubación y tienen como objeto eliminarlosreactantesfijadosdeficientemente o no fijados,pudiendo en ocasiones provocar la pérdidao desprendimiento de antigenos (Lehtonen y Viljanen 1980). Generalmente se realizan tres lavados breves con solución PBS o simplementesalina fisiológica, conteniendo tween20 como agente tensoavtivo.

APENDICE No. 4: REPRESENTACION FOTOGRAFICA DEL EQUIPO PARA LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

ALMACENAMIENTO DE MATERIALES VEGETALES. MATERIAL VEGETAL SUJETO A ANALISIS FITOPATOLOGICO.

I

HOMOGENIZADOR PARA LA MACERACION DE MATERIAL VEGETAL QUE SE EVALUARA POR LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

/

LECTOR DE ELISA.,PARA DETERMINAR EL GRADO DE INCIDENCIA DE UN POSIBLE VIRUSEN EL MATERIAL VEGETAL EVALUADO.

Y MATERIAL COMPLEMENTARIO PARA LA PREPARACION DE REACTIVOS SUSTANCIAS REQUERIDAS PARA LAELABORACION DE LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

MATERIALES (BUFFER, REACTIVOS) SEROLOGICOS PARA LLEVAR A CABO LA TECNICA SEROLOGICA ELISA.

DE REACTIVOS EN LA MATERIALES REQUERIDOS PARA LA APLICACION TECNICA SEROLOGICA ELISA (PIPETAS,PIPETA MULTICANAL, PLACA ELISA, CRISTALERIAY SUSTANCIAS)