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Replicación del DNA e introducción a la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Curso de Biología Molecular y Genómica, Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM), Fac. de Medicina Universidad de Chile Dr. Juan Venegas Hermosilla Enero, 2014

Introducción: componentes del ADN, los desoxirribonucleótidos (dNMPs).

Fig.1. Se distinguen dos tipos: a) de un anillo = pirimídicas (C y T), b) de dos anillos = púricas (A y G).

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Estructura de la doble hélice La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) es el modelo genético de cada célula y, en última instancia, lo que determina todos los aspectos de un ser vivo. La molécula de ADN fue descubierta en 1951 por James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins empleando la técnica de difracción de los rayos X. En 1953, Watson (izquierda) y Francis Crick (derecha) describieron la estructura en doble hélice de la molécula de ADN como una especie de escalera de caracol con muchos escalones. En 1962 ambos recibieron el Premio Nobel de Medicina por su trabajo.

Fig. 2.

La estructura de la doble hélice descrita por Watson y Crick en 1953, tiene las siguientes características: •

La unión de dos desoxirribonucleótidos se realiza vía un ENLACE FOSFODIESTER en el cual esta involucrado el oxígeno del carbono 3´ de la desoxirribosa de un dNMP, con el oxígeno del carbono 5´ del siguiente dNMP, unidos vía un grupo fosfato. Tal como se ve en la fig. 3.

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Este hecho da origen a una molécula POLAR. Es decir, que tiene un determinado SENTIDO, caracterizado por un extremo 5´ y un extremo 3´.

Fig. 3.

Hebra de DNA 5´-ATG-3´ o simplemente ATG

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La molécula de ADN estaba formada por dos hebras ANTIPARALELAS.

F1

Fig. 4

Eso quiere decir que una de las hebras estaba en el sentido 5´- 3´ y la otra en el sentido inverso, tal como se muestra en la Figura.

Entre las hebras antiparalelas del ADN doble hebra, hay COMPLEMENTARIDAD DE BASES NITROGENADAS, (Fig.5).

Eso implica que: siempre cuando en una hebra había una timina (T) en la otra hebra había una adenina (A), y vise-versa. En cambio, cuando en una hebra había una citosina (C), en la otra había una guanina (G). -Además, la unión de una T con un A era a través de DOS puentes hidrógenos, en cambio, la unión de una C con una A, era a través de TRES puente hidrógenos. ¿en que afecta esto la estabilidad de la doble hélice?.

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Diapositiva 5 F1

Fcoinhell, 04-11-2012

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En la doble hélice los enlaces fosfodiester forman un esqueleto de azúcar-fosfato helicoidal, que queda hacia el exterior de la molécula.

En cambio, las bases nitrogenadas quedan hacia adentro formando especie de escalones

Fig. 6

De la información anterior:¿Qué se podría inferir con respecto a como podría ser la duplicación o replicación de esta molécula?

-La COMPLEMENTARIDAD de bases nitrogenadas sugería que una hebra podía ser el MOLDE O MATRIZ de la otra (Fig. 6).

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Hebra molde (matriz o parental) y hebra hija

Fig. 7. La doble hélice de Watson y Crick, sugería que la molécula de DNA que surgía de la duplicación (la nueva doble hélice) estaba constituida por una hebra parental (antigua) y una hebra hija complementaria (nueva) Esto sugería que la duplicación del DNA era SEMICONSERVATIVA. Los científicos que demostraron que efectivamente era así, fueron Meselson y Stahl.

Experimento de Meselson y Stahl (1957). a) Cultivó bacterias por varias generaciones en presencia del isótopo pesado 15N. Aisló el DNA y lo centrifugo. Todo el DNA aparece cerca del fondo del tubo. b) Posteriormente, trasladó las bacterias a un medio de cultivo con 14N, dejó que se originara una primera generación de ellas. Aisló y centrifugó el DNA, encontró que el DNA se encontraba en una zona intermedia del tubo. c) En una segunda generación de estas bacterias, al aislar y centrifugar el DNA, encontró dos zonas donde sedimento el DNA.

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Con el experimento de Meselson y Stahl, se demostró que la replicación era semiconservativa, pero surgía una nueva pregunta:

• ¿En que dirección o sentido se realizaba la síntesis de las hebras hijas?.

¿Cuál seria entonces el sentido (dirección) de la síntesis de la hebra hija?. •

La respuesta a esta pregunta vino de los estudios de Reiji Okazaki (1960), analizando la incorporación de timidina tritiada (timidina marcada con el isótopo tritium, 13H) en la replicación del DNA cromosomal de la bacteria Escherichia coli .

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Con estos estudios él demostró que la síntesis de las hebras hijas era en el sentido 5´- 3´, que además, una de las hebras se sintetizaba en forma discontinua (a los que posteriormente se le llamaron “Fragmentos de Okazaki) y la otra en forma continua.

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Es decir, que la replicación del DNA es también SEMIDISCONTINUA.

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Resultados de los estudios de Okazaki: replicación SEMIDISCONTINUA

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Esto implica que hay una hebra “líder” (continua) y una hebra retrazada (discontinua). De este modelo surge el concepto de “horquilla de replicación” = vértice donde se va abriendo la doble hélice. Nótese que la dirección del avance de la horquilla no es igual a la dirección de la síntesis de la hebra retrazada.

Sin embargo, todavía quedaban mas preguntas por contestar, entre ellas: • ¿Dónde se iniciaba la replicación del DNA, en sitios al azar o en algún sitio especifico? • Si se iniciaba en un sitio especifico u ORIGEN DE REPLICACION: ¿ esta seria en una sola dirección (unidireccional) o ambas direcciones (direccional) ?.

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Comienza en un origen y es usualmente bidireccional: Experimentos de John Cairns

Lehninger, pag. 951, IV Ed. 2005 Este experimento confirmó además que la síntesis de ambas hebras era simultánea y que se generaba una estructura que sería llamada “burbuja de replicación”.

La burbuja de replicación • Los resultados de los experimentos anteriores indican que en la replicación del DNA se produce una estructura que se llama “burbuja de replicación” (ver fig.anexa). • En esta estructura hay dos horquillas de replicación, que avanzan en sentidos opuestos.

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La burbuja de replicación: avance bidireccional de las orquillas.

Resumiendo hasta aquí: las características generales de la replicación del DNA (doble hélice) son: - Semiconservativa - Semidiscontinua - Comienza en un origen y es usualmente bidireccional - La síntesis de las hebras hijas es en la dirección (sentido) 5´-3´.

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Bases moleculares de la replicación del DNA

Estudios realizados en la bacteria Escherichia coli (Arthur Kornberg).

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DNA cromosomal de la E.coli: doble hebra circular cerrado. Secuenciado completamente en 1997 (Science 277 (5331) :1453-1462), cepa K-12, tiene una longitud de 4.639.221 pares de bases (pb) y codificaría para 4288 proteínas.

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Características del origen de replicación u oriC.

Formación de complejo preelongación.

- HU y IHF = proteínas tipo histona que ayudan a la unión de la proteína DnaA a la doble hebra en el oriC.

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Necesidad de unión de una TOPOISOMERASA para relajar la tensión producida por la abertura de la doble hélice.

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Síntesis de los RNA partidores (“primers” o cebadores) por la Primasa.

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Elongación de los partidores por la DNA polimerasa III de E. coli, tanto en la hebra líder como en la hebra retrazada.

Características generales de las DNA polimerasas: 1. Requieren una hebra de DNA molde (templado o matriz). 2. Necesitan un partidor (primer). 3. Utilizan un desoxirribonucleótido trifosfato (dATP, d-GTP, d-CTP y d-TTP 4. Polimerizan en sentido 5’ a 3’, adicionando nucleótidos al extremo 3’ libre.

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Reacción catalizada por todas las DNA polimerasa

Además, en E. coli todas las DNA polimerasas poseen una actividad correctora llamada exo 3´-5´.

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Las tres DNA pol. de E. coli

Estructura general de las DNA polimerasas: forma de una mano derecha (modelo de la pol I de E. coli)

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Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli (la pol replicadora)

Estructura de un dímero de la DNA polimerasa III de E. coli

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Volviendo a la horquilla de replicación:

Dímero de la pol III cuando esta sintetizando simultáneamente la hebra líder y la hebra retrazada.

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Remoción de los partidores y ligamiento de los fragmentos de Okazaki.

Función de la topoisomerasa IV para separar los dos DNA duplex replicados

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Fin de esta primera parte.

Suplemento:

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Deoxyribonucleotides and ribonucleotides of nucleic acids

Watson-Crick model for the structure of DNA.

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Comparison of A, B and Z forms of DNA

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