UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO EX VIVO PARA EL ESTUDIO DE LA TUMORIGÉNESIS Y REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VEGF

TESIS DOCTORAL

ISABEL MIRONES AGUILAR MADRID, 2007

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE BIOLOGÍA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

DESARROLLO Y CARACTERIZACIÓN DE UN MODELO EX VIVO PARA EL ESTUDIO DE LA TUMORIGÉNESIS Y REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VEGF

Memoria presentada por ISABEL MIRONES AGUILAR para optar al grado de doctor por la Universidad Complutense de Madrid.

Director de tesis: Dr. Fernando Larcher Laguzzi

El trabajo de investigación presentado en esta memoria se ha realizado en el Departamento de Biomedicina Epitelial del Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT) gracias a la concesión de una beca del Programa de Formación de Personal Investigador de la Comunidad de Madrid.

MADRID, 2007

A Daniel

…y no hay distancia apenas entre un ángel y un niño. Ni entre las ignorancias de uno y otro, pues cuanto desconocen lo embellecen. ANTONIO GALA Mar de Mármara (El poema de Tobías desangelado)

…la vida no se cansa de reflotarnos, viene otra ola y nos levanta,…las penas dan realce a las delicias, éstas no lo serían sin aquéllas…

Glauka, La vieja sirena (JOSÉ LUIS SAMPEDRO)

AGRADECIMIENTOS De todo lo que he escrito para la realización de esta tesis, esta parte, sin duda, es la que más me ilusiona, el poder dedicar unas palabras a las personas que me han ayudado durante tantos años, no sólo laboralmente, sino a convertirse en parte de mi vida de una manera muy entrañable, en hacerme sonreir, y sobretodo, reir en el día día. Es una tarde soleada, apta para el sueño…y el ensueño, así que, ahí voy: En primer lugar quiero agradecerle a José Luis Jorcano la oportunidad que me ofreció para trabajar en su laboratorio,pero sobretodo por confiar en mí. Quiero agradecer especialmente a Fernando Larcher, mi director de tesis, y a Marcela, su acogida, conscientes de mi interés por trabajar en su grupo, sacando de “donde no había”…A Fernando sobretodo quiero agradecerle no sólo la dirección de esta tesis y sus enseñanzas, sino su paciencia y comprensión en determinados momentos que, a lo largo de estos años, he necesitado, y que para mí han significado mucho. Marce, no olvido mis primeras charlas contigo en el que es ahora “el despachito”, ni aquellas margaritas en Filadelfia, pero te estaré siempre agradecida por…colorear mis ojos! A mis compañeras del despachito, “hermanas” de una Congregación caracterizada por su discreción, gracias por vuestra compañía diaria, vuestro apoyo, por las risas , el cachondeo, va a parecer que no trabajamos…: Lucía, Blanca (qué pelo!) y Almudena, a las dos, por tantos trasplantes y más, Sole (qué deleite de textos…), Luisa y David. A Marta G, Mariajo y Marta C, con ellas he estado desde el principio de los tiempos, hemos vivido juntas toda clase de acontecimientos personales: cambios en el color del pelo, bodas, nacimientos…os quiero mucho, gracias por vuestra amistad en el laboratorio y fuera de él. A Marta C y Mariajo las considero mis hermanas mayores y siempre he contado con sus sabios consejos sobre todo lo que he necesitado. A Marta C quiero agradecerle especialmente su manera de enseñar y su buena disposición siempre ante cualquier duda, además de su cariño y apoyo para que la espera y el nacimiento de Dani fuese tan especial. Al dúo Jesús-Edilia y a todas las compañeras del animalario que cuidan de nuestros animales. A Jesús por ayudarme siempre con los ratones, por tratar de quitarme el “reparo” que les tenía, sometiéndome a alguna que otra maldad con jaulas superpobladas, obviamente no conseguiste nada. A Edilia, gracias por tu ayuda y tu amistad, tu serenidad, eres un bálsamo siempre. A todos mis compañeros del laboratorio: Mª Fer y Anita (olé), Marta M, Rodolfito (que te lo digo con cariño, es que eres tan joven…), Carmen (mi compañera de cursos de doctorado, gracias por apartarme a tiempo de aquellos ratoncillos…), Mirentxu, Ramón, Ángel, Angus, Llanos, Rodolfo y Marta Inés. Quiero agradecer especiamente a Jesús Paramio y a Manuel Navarro la oportunidad que me ofrecieron de trabajar con ellos, y el tiempo que dedicaron para explicarme su trabajo. Manuel, sé que algún día me comprarás algo. A Teresiña, Angelines y Nelsy, más majas… A Isabel y Pilar por su ayuda en histología…y por supuesto, a Kiko, a pesar de todo, todo sonrisas. A Elena y Aurora la organización más compleja y blindada, para que no falte de nada, ni siquiera el acceso a la “reserva espiritual”. Gracias sobretodo por vuestro cariño en tiempos de desaliento. A Sergio, a Ludi, desesperada con mis papeleos en mis tiempos de “polizón” en el Ciemat. Y por supuesto a Rubén “saluditos”, por ser tan cariñoso y solícito. También quiero dar las gracias a la gente de Hematopoyesis, cada vez sois más!, yo ya me pierdo: Mª Luz, Guille, Paula, África, Elena, Mª Eugenia, Ariadna, Susana N, Óscar (cualquier día

fluoresces), Miguel (nunca dejaremos de sorprendernos…), Laura, Néstor, Rosa, Juan, José Carlos, Isra (guapetón!, tenía que decirlo), Jaco, Beatriz y Maruja (la mirada con más chispa, gracias por repartir jazmines y por toda la ayuda que me has prestado siempre). A los compañeros del laboratorio que ya no están, pero con los que pasé muy buenos momentos, Eva, Sergito, Martita, Ángela, Javi y Manuel Ramírez, Hugo (doctorleis). A Laura y Alejo, Toñi y Vane, con las que coincidí poco tiempo, pero fueron muy especiales para mí. A Mª Lo, Mandy y Diana. A mis amigos de Inmuno, el primer laboratorio, por aquellos tiempos en los que nos divertimos tanto y tanto: Marta, Juanillo, Fer, Ruth, Pilarín, Juan y Soni, Anita, Alberto, David, Elena, Juan Carlos, Javi, Juani, Marisa, Carlitos…qué partidos de fútbol, qué chuletadas…y el Magic Disco karaoke, por supuesto. A mi amigo Pedro, gracias por animarme, y confiar en mí, cuando llegó un momento en el que ni yo misma confiaba, ni quería continuar con ésto. Mi familia. A mi abuelo Eloy, donde quiera que esté, sé lo importante que era para tí, y sé que estás conmigo. A mi abuela Milagros, la gaditana, lo que me hacías reir mientras estudiaba…A mi abuela Isabel, preocupada siempre por si recibo “pagas de Navidad” en el trabajo y tratando de entender el concepto de beca y su interpretación en términos laborales y económicos. A mi abuelo Rogelio, que durante mucho tiempo abrigó la esperanza de que este título, al menos por similitud semántica, me convirtiera en un médico de familia al que poderle consultar todas las dudas sobre la salud, ya me habría gustado…. A mi tío Cecilio, afanado estudioso, eterno estudiante, gracias porque ni una sola vez has dejado de preguntarme por lo que hago. A mi hermano, patrón de embarcaciones imaginarias, es el mar, la arena, las estrellas y un cabezón. Dani, mi niño, la luz, los colores, la risa…gracias por hacerme mamá, por recordarme que nos hacemos mayores sólo si dejamos de jugar, tan chiquitín y distingues dermis de epidermis… Juanma, fuiste mi cómplice, mi mitad, desde que éramos chicos, gracias por haber estado a mi lado, gracias por toda tu ayuda, tus ánimos, por tu paciencia y sobretodo por Dani. A mis padres, a los que admiro tanto, aún mejor de abuelos, la seguridad, la certeza, el amor infinito y desinteresado. Gracias por haberme dado todo, todo lo que habéis podido y podéis…y mucho más.

ABREVIATURAS

Abreviaturas

___________________________________________________________________________ %

porcentaje

ºC

grados Celsius

µg, µm, mm

microgramo, micrometro, milímetro

µl, ml, µM

microlitro, mililitro, micromolar

A

Absorbancia

aa

aminoácido

Ad

Adenovirus

ADN

Ácido DesoxirriboNucleico

ADNc

Ácido DesoxirriboNucleico complementario

Ang

Angiopoietina

ARN

Ácido RiboNucleico

ARNm

Ácido RiboNucleico mensajero

ATCC

del inglés, American Type Culture Collection, catálogo de líneas celulares e hibridomas

BrdU

BromodeoxiUridina

BSA

del inglés, Bovine Serum Albumine. Albúmina de suero bovino

Ca

2+

iones de calcio

DAB

DiAminoBencidina

DAPI

del inglés, 4, 6 DiAmidin-2-Phenyl-Indole, 4, 6, diamidino-2-fenil-indol

DMBA

7, 12-DiMetilBenz(a)Antraceno

DMEM

del inglés, Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco

DMSO

del inglés, Dimethyl Sulfoxide, dimetil sulfóxido

dNTP

del inglés, deoxi Nucleotidil TriPhosphate, deoxinucleotidil trifosfato

EC

del inglés, Endothelial Cell, célula endotelial

EDTA

del inglés, Ethylen-Diamin-Tetra-Acetate, etilén-diamino-tetra-acetato

EGF

del inglés, Epidermal Growth Factor, factor de crecimiento epidérmico

EGFR

del inglés, Epidermal Growth Factor Receptor, receptor del factor de crecimiento epidérmico

ELISA

del

inglés,

Enzyme

Linked

Immunosorbent

Assay,

ensayo

inmunoabsorbente ligado a enzima EMEM

del inglés, Essential Minimum Eagle Medium, medio mínimo esencial de Eagle

Eph

del inglés, Ephrine, efrina

FACS

del inglés, Fluorescent Activated Cell Sorting, separación celular dependiente de fluorescencia

FBS

del inglés, Fetal Bovine Serum, suero fetal bovino

FITC

del inglés, Fluorescein IsoThiCyanate, Isotiocianato de fluoresceína

Fig

figura

Abreviaturas

___________________________________________________________________________ FGF

del inglés, Fibroblast Growth Factor, factor de crecimiento de fibroblastos

GF

del inglés, Growth Factor, factor de crecimiento

GFP

del inglés, Green Fluorescent Protein, proteína verde fluorescente

Gy

del inglés, Gray, Grey

h

horas

HIF

del inglés, Hypoxia Inducible Factor, factor inducible por hipoxia

HS

del inglés, Horse Serum, suero de caballo

H&E

Hematoxilina/ Eosina

IL

interleuquina

INF

interferón

IRES

del inglés, Internal Ribosome Entry Site, sitio interno de unión al ribosoma

IU

del inglés, Internacional Units, unidades internacionales

K

del inglés, Keratin, queratina

Kb

kilobases

KDa

KiloDalton

LTRs

del inglés, Long Terminal Repeats, repeticiones terminales largas

min

minutos

MMPs

del inglés, Matriz MetalloProteinases, metaloproteinasas de la matriz

MOI

del inglés, Multiplicities Of Infection, multiplicidad de infección

nu/nu

del inglés, nude/nude, animales inmunodeficientes, portadores de una mutación que les confiere el aspecto de animales desnudos, sin pelo

nm

nanometro

OCT

del inglés, Optimal Cutting Temperature, temperatura óptima de corte

pb

pares de bases

PBS

del inglés, Phosphate Buffered Saline, tampón fosfato salino

PCR

del inglés, Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa

PDGF

del inglés, Platelet Derived Growth Factor, factor de crecimiento derivado de plaquetas

pLZR

plásmido Lazarus

rpm

revoluciones por minuto

RT

del inglés, Room Temperature, temperatura ambiente

SCC

del inglés, Squamous Cell Carcinoma, carcinoma escamoso

SMA

del inglés, Smooth Muscle Actin, actina del músculo liso

SDS

del inglés, Sodium Dodecyl Sulphate, dodecil sulfato sódico

TBE

del inglés, Tris-Borate-EDTA, Tris-borato-EDTA

TE

Tris-EDTA

TF

del inglés, Transcriptional Factor, factor de transcripción

Abreviaturas

___________________________________________________________________________ TGF

del inglés, Tumor Growth Factor, factor de crecimiento transformante

TNF-α

del inglés, Tumoral Necrosis Factor, factor de necrosis tumoral

TPA

del inglés, 12-O-Tetradecanoyl-Phorbol-13-Acetate, 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato

Tris

tris-(hidroximetil)-aminometano

TSP-1

del inglés, Thrombospondine-1, tromboespondina-1

V

voltios

VEGF

del inglés, Vascular Endothelial Growth Factor, factor de crecimiento del endotelio vascular

VEGFR

del inglés, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular

VHL

Von Hipper-Lindau

VPF

del inglés, Vascular Permeability Factor, factor de permeabilidad vascular

WT

del inglés, Wild Type, forma nativa

2n

diploide, dotación cromosómica normal de una especie

ÍNDICE

Índice

___________________________________________________________________________ 1. INTRODUCCIÓN··················································································································································

1

1.1 FORMACIÓN DE VASOS SANGUÍNEOS______________________________________________

3

1.2 VASCULOGÉNESIS ________________________________________________________________

3

1.3 ANGIOGÉNESIS ___________________________________________________________________

4

1.3.1 Factores reguladores de la angiogénesis ____________________________________________

5

1.3.2 Receptores para factores angiogénicos _____________________________________________

7

1.4 FAMILIA DEL VEGF _______________________________________________________________

7

1.4.1 Miembros de la familia del VEGF ________________________________________________

7

1.4.2 Actividad biológica del VEGF ____________________________________________________ 10 1.5 ANGIOGÉNESIS TUMORAL ________________________________________________________ 13 1.5.1 El VEGF y la angiogénesis tumoral _______________________________________________ 19 1.5.2 ¿Qué estimula la expresión del VEGF en el tumor? __________________________________ 20 1.6 ANGIOGÉNESIS CUTÁNEA_________________________________________________________ 22 1.6.1 La piel _______________________________________________________________________ 22 1.6.2 Organogénesis de la piel_________________________________________________________ 27 1.6.3 La epidermis de ratón __________________________________________________________ 28 1.6.4 Diferenciación epidérmica in vitro ________________________________________________ 29 1.6.5 Vascularización cutánea_________________________________________________________ 29 1.6.6 Angiogénesis cutánea fisiológica __________________________________________________ 30 1.6.7Angiogénesis cutánea tumoral ____________________________________________________ 33

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ······················································································································ 37

3. MATERIALES Y MÉTODOS ····························································································································· 41 3.1 ANIMALES VEGF-LoxP Y GENOTIPADO ____________________________________________ 43 3.2 OBTENCIÓN DE QUERATINOCITOS Y FIBROBLASTOS PRIMARIOS DE RATÓN _______ 44 3.2.1 Subcultivo de queratinocitos de ratón _____________________________________________ 46 3.2.2 Infección adenoviral de queratinocitos y fibroblastos de ratón _________________________ 47 3.2.3 Clonaje celular por dilución límite ________________________________________________ 48 3.2.4 Curvas de crecimiento de queratinocitos de ratón ___________________________________ 48 3.2.5 Diferenciación de queratinocitos de ratón in vitro ____________________________________ 48 3.2.6. Inmunofluorescencia en queratinocitos de ratón ____________________________________ 49 3.2.7. Infección retroviral de queratinocitos de ratón _____________________________________ 49 3.3 PRODUCCIÓN DEL VECTOR ADENOVIRAL PORTADOR DE LA RECOMBINASA CRE _______________________________________________________________________________ 50 3.4 DISEÑO Y PRODUCCIÓN DE VECTORES RETROVIRALES____________________________ 51 3.5 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO_________________________________________________ 51 3.6 DISEÑO Y PRODUCCIÓN DE UNA SONDA PARA LA DETECCIÓN DEL EXÓN 3 DEL VEGF MEDIANTE EL ANÁLISIS POR SOUTHERN BLOT ___________________________ 52 3.7 SOUTHERN BLOT __________________________________________________________________ 53

Índice

___________________________________________________________________________ 3.8 DETECCIÓN DE PROTEÍNA EN LOS MEDIOS CONDICIONADOS ______________________ 54 3.9 CARIOTIPO ESPECTRAL MULTICOLOR ____________________________________________ 54 3.10 ENSAYOS TUMORAL Y METASTÁSICO ____________________________________________ 55 3.10.1 Ensayo de permeabilidad vascular _______________________________________________ 55 3.11 INCORPORACIÓN DE BrdU IN VIVO _______________________________________________ 56 3.12 TRASPLANTES DE EQUIVALENTES CUTÁNEOS ____________________________________ 56 3.12.1 Trasplante en cámaras de silicona _______________________________________________ 57 3.12.2 Trasplante de cultivos organotípicos de queratinocitos de ratón _______________________ 59 3.13 PROCEDIMIENTOS HISTOLÓGICOS_______________________________________________ 60 3.13.1 Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia _______________________________________ 60 3.14 ANÁLISIS ESTADÍSTICO __________________________________________________________ 62

4. RESULTADOS······················································································································································· 63 4.1 OBTENCIÓN DE LÍNEAS CELULARES DE QUERATINOCITOS DE RATÓN VEGFLoxP Y VEGF -/- _____________________________________________________________________ 65 4.1.1 Modelo de inmortalización del cultivo de queratinocitos de ratón_______________________ 65 4.1.2 Aislamiento de las líneas celulares de queratinocitos de ratón VEGF-LoxP y VEGF -/- _____ 67 4.1.3 Clonaje de los queratinocitos deficientes en VEGF y WT______________________________ 70 4.1.4 Recombinación homóloga del exón 3 del VEGF en los clones de queratinocitos VEGFLoxP in vitro _____________________________________________________________________ 70 4.1.5 Pérdida de la expresión del VEGF164 por clones de queratinocitos modificados genéticamente ____________________________________________________________________ 71 4.2

CARACTERIZACIÓN

FENOTÍPICA

DE

LAS

LÍNEAS

CELULARES

DE

QUERATINOCITOS DE RATÓN VEGF-LoxP Y VEGF -/- _________________________________ 73 4.2.1 Análisis de la capacidad proliferativa ______________________________________________ 73 4.2.2 Análisis de la capacidad de diferenciación __________________________________________ 74 4.2.3 Análisis citogenético ____________________________________________________________ 75 4.2.4 Propiedades tumorigénicas de las líneas celulares____________________________________ 76 4.3 PAPEL FUNCIONAL DEL VEGF EN EL DESARROLLO TUMORAL _____________________ 78 4.3.1 Papel funcional del VEGF en el desarrollo tumoral __________________________________ 78 4.3.2 Análisis de la vasculatura tumoral ________________________________________________ 82 4.3.3 Análisis de la proliferación tumoral _______________________________________________ 84 4.3.4 Potencial metastásico ___________________________________________________________ 84 4.4 CARACTERIZACIÓN DEL PROCESO DE REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL VEGF ______________________________________________________________ 87 4.4.1 Caracterización fenotípica de la piel de ratón trasplantada en cámaras de silicona ________ 88 4.4.1.1 Arquitectura epidérmica ___________________________________________________ 88 4.4.1.2 Proliferación epidérmica ___________________________________________________ 89 4.4.1.3 Diferenciación epidérmica __________________________________________________ 91 4.4.1.4 Maduración dérmica ______________________________________________________ 92

Índice

___________________________________________________________________________ 4.4.1.5 Análisis de la vasculatura __________________________________________________ 93 4.4.2 Caracterización fenotípica de los trasplantes de cultivos organotípicos de ratón___________ 95 4.4.2.1 Calidad histológica de la piel regenerada. Arquitectura epidérmica________________ 95 4.4.2.2 Los trasplantes deficientes en VEGF tienen alteraciones en la proliferación epidérmica_____________________________________________________________________ 96 4.4.2.3 Los trasplantes deficientes en VEGF no presentan alteraciones en el programa de diferenciación epidérmica ____________________________________________________ 97 4.4.2.4 Los trasplantes deficientes en VEGF presentan alteraciones en la organización y maduración dérmica _________________________________________________________ 98 4.4.2.5 Los trasplantes deficientes en VEGF muestran una disminución de la neovasculatura _______________________________________________________________ 99

5. DISCUSIÓN···························································································································································· 103 5.1 EL VEGF EN LA ANGIOGÉNESIS CUTÁNEA FISIOLÓGICA Y TUMORAL ______________ 105 5.2 DESARROLLO DE UNA LÍNEA CELULAR DE QUERATINOCITOS DE RATÓN DEFICIENTE EN VEGF COMO HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO DE LOS PROCESOS DE TUMORIGÉNESIS Y REGENERACIÓN TISULAR ________________________ 106 5.3 PAPEL FUNCIONAL DEL VEGF EN LA TUMORIGÉNESIS CUTÁNEA __________________ 111 5.4 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DEL PROCESO DE REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL VEGF ___________________________________________________________ 118

6. CONCLUSIONES·················································································································································· 125

7. BIBLIOGRAFÍA···················································································································································· 129

1. INTRODUCCIÓN

A d o nde me e sp e ra ba q uie n yo b ie n me s a b ía e n p a r te d o nd e na d ie pa r ec ía S AN J UAN DE LA C RUZ

Introducción

3

___________________________________________________________________________ 1.1 FORMACIÓN DE VASOS SANGUÍNEOS El correcto funcionamiento de los tejidos del organismo requiere un suministro sanguíneo adecuado y ordenado a través de un sistema de arterias, venas y capilares que garantice el aporte de nutrientes esenciales. La formación de vasos sanguíneos comprende dos procesos: la vasculogénesis y la angiogénesis (Carmeliet P, 2000a; Nguyen LL y D’Amore PA, 2001). La vasculogénesis consiste en la formación de vasos sanguíneos en un tejido previamente no vascularizado, es decir, a partir de células progenitoras. Por el contrario, la angiogénesis consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes (Carmeliet, 2000). La formación de vasos sanguíneos es un proceso muy complejo y requiere la interacción coordinada de múltiples tipos celulares. Ocurre en primer lugar durante el desarrollo embrionario y en el período postnatal temprano. En adultos, lo normal es que esta formación de vasos sólo se desencadene de forma local y transitoria en procesos de cicatrización de heridas, crecimiento del pelo y ciclo reproductor femenino (Hobson B y Denekamp J, 1984). Numerosos factores están involucrados en la regulación de este proceso y deben actuar de manera coordinada para que se formen vasos funcionales (Sledge GW y Miller KD, 2002). Además este proceso es particularmente sensible a cualquier cambio, de forma que alteraciones durante la embriogénesis conducen a malformaciones vasculares congénitas (Hanahan D, 1997). En adultos, bajo circunstancias patológicas, puede romperse el equilibrio que existe entre factores pro y antiangiogénicos en el entorno celular, lo que lleva a la formación de nuevos vasos. Este tipo de angiogénesis (patológica) es responsable o se asocia a una gran variedad de trastornos como la retinopatía diabética, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedades cardiovasculares, endometriosis y síndrome de ovario poliquístico (Carmeliet P, 2003). Ante una lesión en los vasos sanguíneos o disminución en la tensión de oxígeno, numerosos factores de crecimiento acuden al lugar dañado para promover el desarrollo de nuevos vasos. La angiogénesis es pues, esencial para la vida, y desde hace algunos años se ha convertido en una diana fundamental en la lucha contra el cáncer: los tumores necesitan también suministro de sangre para su desarrollo y mantenimiento, y los mismos factores angiogénicos que ayudan a mantener a los tejidos vitales también sostienen a los tejidos cancerosos. El cáncer es el trastorno más estudiado y comprendido en el cual la angiogénesis resulta esencial (Folkman J, 1990; Detmar M, 2000; Sledge GW y Millar KD, 2002).

Introducción

4

___________________________________________________________________________ 1.2 VASCULOGÉNESIS La vasculogénesis ocurre en primer lugar en el embrión, pero también participa en la vascularización de algunos tumores sólidos (Jain RK, 2003). Es iniciada por células progenitoras, denominadas hemangioblastos, que se diferencian para formar células hematopoyéticas (precursoras de las células sanguíneas) y angioblastos (Risau W, 1997; Gerwins P y cols., 2000; Yancopoulos GD y cols., 2000) (Fig.1). Los angioblastos son células endoteliales (ECs) primitivas que mediante procesos de proliferación y diferenciación forman una red primitiva de vasos sanguíneos, el plexo vascular primitivo. Posteriormente, esta red sufre modificaciones mediante recortes y prolongaciones de los vasos para formar la vasculatura madura con su patrón característico de vasos ramificados e interconectados. Este proceso se denomina remodelado angiogénico y esencialmente es similar a la angiogénesis (Risau W, 1995; 1997). 1.3 ANGIOGÉNESIS La angiogénesis, como hemos descrito anteriormente, es un proceso que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. La estructura básica de los vasos sanguíneos comprende un lumen central, delimitado por ECs que a su vez están rodeadas por una membrana basal. Esta estructura básica varía en función del tipo de vaso, puede estar rodeada por una o más células de sostén denominadas pericitos o células de Rouget, células de músculo liso y una matriz extracelular en la que se encuentran los fibroblastos. En el sistema circulatorio de los mamíferos los vasos se organizan en sanguíneos y linfáticos, los vasos sanguíneos se clasifican en base a su función y complejidad en arterias, venas y capilares. Este complejo proceso de formación de vasos comprende, básicamente, cuatro etapas: 1. Digestión de la membrana basal que rodea al vaso preexistente, por proteasas secretadas por las ECs. 2. Migración de ECs circulantes al sitio de formación vascular, donde proliferan para formar un nuevo brote vascular. 3. Proliferación y posterior diferenciación de las ECs para la elongación del brote y la formación del lumen del nuevo vaso.

Introducción

5

___________________________________________________________________________ 4. Estabilización de la estructura formada, mediante la secreción de factores de crecimiento por las ECs, que atraen a las células de sostén, como pericitos y células del músculo liso, y formación de la membrana basal. Tanto las células de sostén, como la membrana basal, son indispensables para la estabilidad y funcionalidad del vaso. Es en esta última etapa cuando los vasos desarrollan sus características de especialización para el tejido u órgano al que irrigan (Gerwins P y cols., 2000; Jain RK, 2003) (Fig.1).

hemangioblasto progenitores de células de músculo liso progenitores endoteliales

VEGF

células de músculo liso

arteria

VEGF

vena vasculogénesis

angiogénesis

vasos maduros

SMC: célula culo liso

Figura 1. Descripción esquemática de la vasculogénesis y la angiogénesis. Modificado de Carmeliet P, 2003 y monografía “Entendiendo el VEGF y la angiogénesis”, Roche. .

1.3.1 Factores reguladores de la angiogénesis La formación controlada de la red vascular asegura que la distancia entre una célula y el vaso más cercano no sea mayor que la distancia de la que disponen los nutrientes para difundir, antes de ser completamente consumidos. El principal factor que controla la formación de vasos sanguíneos es la hipoxia o falta de oxígeno. Esto dispara la secreción de factores proangiogénicos, principalmente el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y estimula la formación de nuevos vasos para cubrir la necesidad. Una vez se restablece la presión de oxígeno, se inhibe la producción de factores proangiogénicos, los vasos maduros (preformados) sobreviven y cualquier vaso inmaduro remanente (de nueva síntesis) involuciona. Como se mencionó anteriormente, la angiogénesis en adultos se limita a un papel fisiológico. Se han identificado numerosos factores que promueven o inhiben la angiogénesis (Sledge GW y Millar KD, 2002; Jain RK, 2003). Muchos de ellos son factores de crecimiento como el VEGF, el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de

Introducción

6

___________________________________________________________________________ crecimiento transformante (TGF -α y -β). Otros factores proangiogénicos son la interleuquina-8 (IL-8), la leptina y la angiogenina. Entre los factores inhibidores de la angiogénesis se encuentran la angiostatina, endostatina, trombospondina-1 (TSP-1), interferón -α (INF- α) y la IL-12. La angiogénesis es un campo objeto de estudio exhaustivo. Cada año los trabajos publicados crecen de forma exponencial y, si bien se ha dilucidado el papel de muchos de los factores implicados, aún no está claro cuál es el papel exacto de otros, pues se trata de un proceso muy complejo y dinámico, en el que la interrelación de todos ellos es clave y flexible. Así, no siempre se puede atribuir una función exacta a un determinado factor, sin considerar el contexto, esto es, el estadio del proceso, la presencia o ausencia de otras moléculas implicadas, etc. (Tabla 1).

Proteína reguladora

actividad

VEGF

estimula la vasculogénesis estimula el remodelado angiogénico estimula el brote vascular promueve la supervivencia de las ECs (inhibe su apoptosis y la regresión vascular

FGFb

promueve la maduración vascular promueve la formación de la matriz extracelular

Ang-1

insensibiliza a los vasos nuevos a la presencia o ausencia del VEGF promueve el crecimiento radial de los vasos

Ang-2

desestabiliza los vasos maduros sensibiliza los vasos al VEGF

Angiostatina

inhibe la migración de ECs induce regresión de la vasculatura tumoral

Endostatina

inhibe la migración de ECs induce regresión de la vasculatura tumoral

TSP-1

promueve apoptosis de ECs

Efrina-B2

involucrada en la maduración vascular expresada específicamente en vasos arteriales

Tabla 1. Función de los factores reguladores clave en la vasculogénesis y angiogénesis.

El VEGF es el principal factor conductor de los procesos de vasculogénesis y angiogénesis (Fig. 2) (Yancopoulos GD y cols., 2000; revisado por Jain RK, 2003; Lewis NL y Meropol NJ, 2003). El control de la angiogénesis por el VEGF es uno de los mecanismos responsables del mantenimiento fisiológico del grado de vascularización tisular (Shibuya M, 2001; Ferrara N y cols., 2003). Durante la embriogénesis es fundamental su expresión para el desarrollo de la vasculatura: la alteración de ambos alelos es letal y da lugar a ausencia casi

Introducción

7

___________________________________________________________________________ total de vascularización y la deleción de uno de ellos produce anormalidades vasculares letales (Carmeliet P y cols., 1996; Ferrara N y cols., 1996; Carmeliet P y cols., 1999).

vasculatura primaria

VEGF

VEGF, Ang-1 y Eph-B2

vena

arteria

Ang-1 Eph-B2

vasos inmaduros inestables

vasos maduros estables

VEGFR-1 y -2 R Tie-1 y -2 R Eph-B2

+ VE GF

4 desestabilización

GF vasos - VE

inestables

Ang-2

vasos estables

3 maduración y estabilización por Ang-1

2 remodelado angiogénico

1 vasculogénesis

5 regresión

vasculatura remodelada

6 recorte angiogénico

Figura 2. Representación esquemática del papel del VEGF, Ang-1, Ang-2 y Eph-B2 durante la vasculogénesis, remodelado angiogénico y angiogénesis. Modificado de Yancopoulos GD y cols., 2000.

El VEGF también está involucrado en el remodelado angiogénico de los vasos inmaduros producidos mediante vasculogénesis (Shibuya M, 2002; Ferrara N y cols., 2003; Jain RK, 2003). En la angiogénesis postnatal, el VEGF induce el brote angiogénico sobre los vasos inestables (de nueva formación) y de este modo evita la apoptosis de las ECs de estos vasos inmaduros. En ausencia del VEGF, los vasos inmaduros involucionan (Gerber HP y cols., 1999). Otros factores con funciones clave en la regulación de la angiogénesis son la Ang-1 y la efrina-B2 (Eph- B2). Ambos son necesarios para el remodelado posterior y maduración de los nuevos vasos (Yancopoulos GD y cols., 2000; Jain RK, 2003) (Fig. 2). La Eph-B2 se expresa específicamente en arterias y se le atribuye un papel potencial en la diferenciación de los vasos sanguíneos en arterias y en la interacción con el músculo liso para formar la pared vascular de éstas (Adams RH y cols., 1999; Yancopoulos GD y cols., 2000). La Ang-1 participa en el mantenimiento de la estabilidad vascular, y es necesaria para que los vasos maduros sean insensibles al VEGF. También puede promover el crecimiento circunferencial de los vasos (Suri C y cols., 1998; Thurston G y cols., 1999).

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___________________________________________________________________________ En condiciones de angiogénesis activa, una región de los vasos maduros se hace inestable y sensible al VEGF. La Ang-2 desempeña un papel clave en esta desestabilización, actuando como un antagonista de la Ang-1 (Holash J y cols., 1999). El vaso desestabilizado sufre un brote angiogénico en presencia del VEGF, o involuciona en ausencia de este factor. 1.3.2 Receptores para factores angiogénicos Como se mencionó anteriormente, la mayoría de los factores angiogénicos son factores de crecimiento cuya actividad está mediada por la unión a receptores específicos en las ECs. Estos receptores son proteínas de membrana que poseen un dominio de tirosinaquinasa en el interior celular. La unión del ligando a su receptor activa a la tirosina-quinasa y comienza la cascada de transducción de señales. El VEGF se une al receptor-2 de VEGF (VEGFR-2), Ang-1 y Ang-2 se unen al receptor Tie-2 y Eph-B2 se une a Eph-B4. No obstante, ciertos receptores comparten un mismo ligando, por ejemplo: VEGFR-1 y neuropilina-1 para el VEGF, Tie-1 para Ang-2 y Eph-B2 y -B3 para Eph-B2. Sin embargo, el papel que desempeñan estos receptores durante la angiogénesis parece ser secundario. 1.4 FAMILIA DEL VEGF 1.4.1 Miembros de la familia del VEGF El VEGF es una glicoproteína homodimérica de 34-46 KDa sintetizada por diferentes tipos celulares en respuesta a diversos estímulos. Actúa sobre las ECs vasculares a través de su unión a receptores de membrana específicos. Esta unión activa una serie de vías de transducción de señales que finalizan en una serie de efectos entre los que se incluyen la proliferación y migración de células del endotelio vascular, supervivencia de las ECs inmaduras y aumento de la permeabilidad vascular. Estos efectos poseen una importancia clave en angiogénesis, y el VEGF, como se mencionó anteriormente es considerado como el mediador clave de este proceso. Así mismo, este factor también ejerce efectos sobre las ECs linfáticas y células efectoras del sistema inmune. Se han identificado, hasta la fecha, 6 miembros de la familia VEGF (Fig. 3A). El VEGF, también conocido como VEGF-A o, anteriormente, vasculotropina o factor de permeabilidad vascular (VPF) (Senger DR y cols., 1983; Ferrara N y Henzel WJ, 1989), es el miembro mejor estudiado de la familia de ligandos del VEGF (Achen MG y Stacker SA, 1998; Ferrara N, 2000, 2001; Shibuya M, 2001). Estas proteínas forman parte de la familia

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___________________________________________________________________________ VEGF-factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Ferrara N y cols., 2003), un grupo de proteínas que comparten una estructura similar que presenta uniones inter e intramoleculares covalentes a través de puentes disulfuro para producir una estructura característica en forma de nudo (Wiesmann C y cols., 1997) (Fig. 3B). El VEGF es un ligando para los receptores VEGFR-1 y -2, también conocidos como Flt-1 y KDR o Flk-1 respectivamente (Ferrara N y cols., 2003). El VEGF-A, el VEGF-B, el VEGF-E y el factor de crecimiento de placenta (PlGF), ejercen su efecto de forma preferencial, pero no exclusivamente, sobre ECs vasculares, mientras que el VEGF-C y el VEGF-D lo hacen sobre ECs linfáticas (Shibuya M, 2001). El VEGF-A, el VEGF-B y el VEGF-E están implicados en la angiogénesis, siendo el VEGF-A el factor más importante en este proceso. El VEGF-C y el VEGF-D participan en la linfangiogénesis (Achen MG y Stacker SA, 1998; Gerwins P y cols., 2000), sin embargo, estudios recientes demuestran la implicación del VEGF en la formación de vasos linfáticos tumorales, bien directamente o a través de los factores anteriores tradicionalmente implicados (Hirakawa S y cols., 2005). A Ligando

Receptor

Enfermedad

VEGF (VEGF-A)

receptor-1 del VEGF receptor-2 del VEGF neuropilina-1

angiogénesis, mantenimiento vascular

VEGF-B

receptor-1 del VEGF

no establecida

VEGF-C

receptor-2 del VEGF receptor-3 del VEG

linfangiogénesis

VEGF-D

receptor-2 del VEGF receptor-3 del VEGF

linfangiogénesis

VEGF-E (factor viral)

receptor-2 del VEGF

angiogénesis

PlGF

receptor-1 del VEGF neuropilina-1

angiogénesis e inflamación

B Figura 3. La familia del VEGF. A: miembros de la familia del VEGF y sus funciones. B: estructura del VEGF.

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___________________________________________________________________________ El gen VEGF-A, humano y murino, consta de 8 exones separados por 7 intrones y 14 Kb de región codificante. Existen, al menos, 4 isoformas del VEGF humano y 3 del VEGF de ratón, generadas mediante distintas formas de procesamiento (“splicing” alternativo) del ARNm del VEGF: VEGF121/120, VEGF165/164, VEGF189/188 y VEGF 206 (revisado por Ferrara N, 2001; Ferrara N y cols., 2003). El subíndice indica el número de aminoácidos de la proteína para humano y ratón respectivamente. El VEGF165/164 es la isoforma predominante. La diferencia más importante entre las isoformas es su afinidad por la heparina, que afecta a su unión a la superficie celular y a la matriz extracelular. La isoforma 165 tiene una afinidad reducida por esta molécula y por tanto, se encuentra fundamentalmente unida a la superficie de las células mientras otra proporción está soluble (Achen MG y Stacker SA, 1998; Ferrara N, 2001) (Fig. 4). Se desconoce la importancia fisiológica de cada isoforma, pero existen evidencias experimentales de la participación selectiva de las VEGF121 y VEGF165 en el desarrollo de hemorragias asociadas con determinados tumores (Cheng SY y cols., 1997). E1

E2

E3 VEGFR-2

E4

E5

VEGFR-1

E6a

E6b

E7

E8

heparina

VEGF206 VEGF

189/188

VEGF 165/164 VEGF 121/120

Figura 4. Estructura de las distintas isoformas del VEGF-A humano y murino. VEGFR-2: sitio de unión al receptor-2. VEGFR-1: sitio de unión al receptor-1. Heparina: región de unión a la heparina. Caja gris: región Nterminal. Caja rayada: secuencia señal.

1.4.2 Actividad biológica del VEGF El VEGF presenta cuatro funciones biológicas principales, todas ellas implicadas directamente en la inducción de angiogénesis y han sido ampliamente estudiadas (revisado por Ferrara N, 2000, 2002; Neufeld G y cols., 2001; Ferrara N y cols., 2003): • crecimiento y proliferación de ECs vasculares. • migración de ECs. • prevención de la apoptosis en ECs inmaduras (supervivencia). • aumento de la permeabilidad vascular en capilares.

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___________________________________________________________________________ También se ha visto que juega un papel en la linfangiogénesis (Nagy JA y cols., 2002) y actualmente son muchos los trabajos que investigan en este campo (Dadras SS y cols., 2005; Hirakawa S y cols., 2005; Liersch R y cols., 2006). Además de las ECs, también se han observado efectos sobre otros tipos celulares (revisado por Ferrara y cols., 2003), como por ejemplo células derivadas de médula ósea (promoción de quimiotaxis de monocitos, inhibición de la maduración de células dendríticas, aumento de la producción de células B, generación de células mieloides inmaduras) y queratinocitos (Wilgus TA y cols., 2005; Mimura K y cols., 2006). El VEGF también podría estar involucrado en la supervivencia de células progenitoras hematopoyéticas durante la repoblación hematopoyética (Gerber HP y cols., 2002). La expresión del gen VEGF está regulada por distintos factores, incluyendo hipoxia, pH, factores de crecimiento, transformación celular, hormonas y oncogenes. La hipoxia es el más conocido y estudiado de estos factores. En condiciones de falta de oxígeno, los factores de transcripción inducidos por hipoxia HIF-1α y HIF-2β son estabilizados y transportados al núcleo donde interactúan con HIF- β. Este complejo se une después a una secuencia específica del gen VEGF llamada elemento de respuesta a hipoxia (ERH), que estimula la transcripción del gen (Ikeda E y cols., 1995). La regulación de la expresión del VEGF por la presión de oxígeno también podría relacionar a la proteína supresora tumoral VHL (Von Hippel-Lindau). Otros factores de crecimiento, citoquinas y hormonas inducen la expresión del VEGF bien a nivel transcripcional o post-transcripcional (Fig. 5). Estas moléculas actúan a nivel tejido específico y posiblemente sea el resultado de la activación específica de oncogenes, que interrumpen la regulación normal de la expresión del VEGF: EGF (factor de crecimiento epidérmico), TGF- β, KGF-1 (factor de crecimiento de queratinocitos 1), IGF-1 (factor de crecimiento tipo insulina 1), IL1- α , IL-6, prostaglandina E2, hormona estimulante de tiroides (TSH), angiotensina II y la adrenocorticotrófica (ACTH) (Frank S y cols., 1995; Ben-Av P y cols., 1995; Cohen T y cols., 1996; Soh EY y cols., 1996).

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___________________________________________________________________________ IGF-1

PDGF

EGF

H2O2

IL-8 bFGF

liberación VEGF

unión y activación del receptor VEGF

hypoxia ↑ COX-2 ↑ NO ↑ oncogenes ↑

expresión aumentada (MMP, tPA, uPA, uPAr, eNOS, etc.)

P– P–

supervivencia

–P –P

proliferación

migración

ANGIOGÉNESIS

permeabilidad

Figura 5. Factores que estimulan la producción del VEGF. Modificado de monografía “Entendiendo el VEGF y la angiogénesis”, Roche.

Los efectos biológicos del VEGF parecen producirse principalmente mediante la unión al receptor-2 (VEGFR-2), cuya expresión está restringida casi exclusivamente a las ECs vasculares (revisado por Shibuya M y cols., 2006). Este receptor pertenece a una familia de receptores con actividad tirosina-quinasa, posee alta afinidad por el VEGF y forma homodímeros. La unión del VEGF a su receptor y la homodimerización posterior del mismo, son esenciales para la transducción intracelular de señales subsiguiente. El VEGFR-2 también es receptor para el VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E. También se han identificado otros dos miembros de la familia del receptor del VEGF. El receptor-1 (VEGFR-1) se une con más afinidad al VEGF que el VEGFR-2 (de Vries C y cols., 1992). Sin embargo, su actividad tirosina quinasa es débil y se ha observado que el VEGF presenta mayor actividad mitogénica y quimiotáctica en las células que expresan únicamente el VEGFR-2 (Waltenberger J y cols., 1994). Esto indica que el VEGFR-1 no está directamente implicado en la regulación de los efectos del VEGF en ECs, pero puede modular otros efectos de este factor en tipos celulares distintos (Clauss M y cols., 1990; Gabrilovich DI y cols., 1996; Wilgus TA y cols., 2005). En cualquier caso, la expresión tanto del VEGFR-1 como el -2 parece estar aumentada por hipoxia y por el propio VEGF (revisado por Ferrara N, 1999). El tercer miembro identificado es el receptor-3 de VEGF (VEGFR-3 o Flt-4). Este receptor no se une al VEGF pero tiene una alta afinidad por el VEGF-C y el VEGF-D. En

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___________________________________________________________________________ adultos, su expresión queda confinada únicamente al endotelio linfático. Por tanto, participa en la regulación de la linfangiogénesis. La isoforma predominante del VEGF, VEGF165/164, no sólo se une a los VEGFR-1 y -2, sino también a neuropilina-1. Esta unión parece potenciar la unión de esta isoforma al VEGFR-2, lo que explicaría la mayor actividad biológica de dicha isoforma (Ferrara N, 2001). Tras su unión al VEGFR-2, el VEGF produce sus efectos por diferentes vías de transducción de señales intracelulares. La secuencia de etapas es similar a la observada para otros receptores tirosina-quinasa. Se ha demostrado que el VEGF activa, in vitro, a la mayoría de las vías de transducción de señales identificadas, que son diferentes según el tipo celular del que se trate (Gerwins P y cols., 2000; Bates DO y Harper SJ, 2002). A través de estudios detallados, mediante la utilización de inhibidores de moléculas de varias vías, se sabe que el VEGF, mediante su unión al VEGFR-2, ejerce su efecto mediante tres vías principales de transducción de señales intracelulares (Shibuya M, 2001; revisado por Shibuya M, 2006). La primera vía involucra a la molécula de transducción de señales inositol-1,4,5 trifosfato (IP3) y el diacilglicerol (DAG) media la segunda y tercera. Todas ellas pueden explicar la mayoría de las actividades biológicas del VEGF en las ECs, es decir, proliferación celular endotelial, supervivencia y permeabilidad. Sin embargo, la vía estimulada por VEGF/VEGFR-2 probablemente no involucre activación de la vía del oncogén Ras, utilizada por muchos otros receptores tirosina-quinasa, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Shibuya M, 2001; Viloria-Petit A y cols., 2003). 1.5 ANGIOGÉNESIS TUMORAL La angiogénesis, cuyo papel está limitado a procesos fisiológicos en adultos, contribuye sin embargo de forma importante en muchas enfermedades que afectan a diferentes sistemas y órganos: vasos sanguíneos (arteriopatías), tejido adiposo (obesidad), piel (psoriasis, dermatitis alérgica), ojos (retinopatía diabética, retinopatía del prematuro), sistema respiratorio (asma, hipertensión pulmonar, pólipos nasales), sistema gastrointestinal (colon irritable), sistema reproductor (endometriosis, quistes ováricos), huesos y articulaciones (artritis, sinovitis).

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___________________________________________________________________________ La enfermedad más estudiada probablemente es el cáncer, en el cual la angiogénesis es esencial para el desarrollo y la progresión maligna de tumores sólidos y el desarrollo de enfermedades hematológicas malignas (Bergers G y Benjamin LE, 2003; Jain RK, 2003). La primera relación entre angiogénesis y desarrollo tumoral fue hecha por Folkman hace más de treinta años (Folkman J, 1971). Hasta entonces, se creía que los tumores avanzaban a través de una red de vasos preexistentes y se desconocía que en el interior del tumor se produjeran procesos de angiogénesis. Posteriormente se comprobó que sin la creación de estos vasos, los tumores apenas crecían. Además, si se bloquea químicamente el desarrollo de estos nuevos vasos, aunque el tumor continúe creciendo algo más, la masa tumoral no llega a expandirse y una gran proporción de células muere por apoptosis. Los tumores producen un grupo de factores pro-angiogénicos que estimulan el crecimiento de vasos sanguíneos (el VEGF y el FGF se consideran los mediadores más importantes en la angiogénesis tumoral). Estos vasos son anormales en estructura y función: formas irregulares, dilatados y de diámetro irregular, tortuosos, incorrectamente alineados con las ECs (que presentan separaciones y son más permeables que las normales), no siempre conectan con otros vasos, la circulación es caótica y el flujo irregular. Además, los vasos sanguíneos tumorales no están organizados en vénulas, arteriolas y capilares definidos, sino que poseen características de todos estos tipos de vasos. Esto es debido al constante crecimiento de nuevos vasos en el tumor bajo el estímulo de factores de crecimiento derivados del propio tumor (Dvorak HF, 1986). Como resultado de esta estructura caótica, en los vasos tumorales el flujo sanguíneo generalmente es irregular, su desplazamiento es más lento y oscilante, lo que conduce frecuentemente a que los capilares sean disfuncionales. Una característica de los tumores malignos es su rápido crecimiento, lo que implica un mayor consumo de oxígeno y nutrientes que los suministrados por la sangre, y por tanto mayor demanda de los mismos. Así pues, tanto la vascularización anormal como el crecimiento tumoral generan áreas de hipoxia que, a su vez, estimulan una mayor formación de vasos. Según la hipótesis de Folkman la angiogénesis tumoral consta de dos fases (Fig. 6): en un principio las células tumorales, se mantienen en un estado avascular quiescente. Durante esta fase avascular, el tumor permanece estacionario y no alcanza un tamaño mayor de 1-2 mm de diámetro, los nutrientes llegan a las células tumorales por difusión, no pudiendo estar separados los vasos más de 100 ó 200 µm. El crecimiento permanece en un

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___________________________________________________________________________ estado estable donde la proliferación y la apoptosis están equilibradas. Para progresar más allá de esta etapa se requiere de la vascularización, que permite el crecimiento exponencial del tumor (Brown LF y cols., 1999). Esta transición se denomina switch angiogénico. Cuando las células tumorales adquieren el "fenotipo angiogénico", comienzan a segregar factores que desencadenan la angiogénesis. Estos factores inducen la formación de nuevos vasos y posibilitan el crecimiento del tumor. Estudios realizados con varios modelos tumorales sugieren que el switch angiogénico ocurre en diferentes momentos durante la progresión del tumor en diferentes tipos de tumores (Bergers G y Benjamin LE, 2003). Sin embargo, una vez que el tumor pasó esta etapa, continúan formándose nuevos vasos mientras el tumor crece (Fig. 6).

tumor pequeño (1–2mm) • avascular • latente

tumor más grande • vascular • potencial metastásico

switch angiogénico induce sobreexpresión de señales pro-angiogénicas como el VEGF

Figura 6. El switch angiogénico en el desarrollo tumoral. Modificado de monografía “Entendiendo el VEGF y la angiogénesis”, Roche.

La hipoxia en las áreas necróticas del tumor garantiza el estímulo para este crecimiento, asegurando que las células tumorales reciban los nutrientes necesarios y proporciona, además, una ruta para el transporte de células tumorales a sitios distantes, donde puedan formarse metástasis (Neufeld G y cols., 2001). Los tumores pueden desarrollarse en tejidos muy vascularizados, a pesar de lo cual permanecen en un estado quiescente. Esta quiescencia se debe a la regresión de los vasos ya existentes que se produce en el interior del tumor (Holash J y cols., 1999; Yancopoulos GD y cols., 2000). Sólo cuando el tumor es capaz de contrarrestar la regresión vascular se produce el crecimiento y la diseminación de las células tumorales.

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___________________________________________________________________________ A grandes rasgos, los procesos que determinan la entrada de un tumor en una vascularización activa son (Fig. 7): - activación de genes de respuesta a hipoxia: este proceso se desencadena cuando desciende el aporte de oxígeno a las células como consecuencia de la falta de riego sanguíneo. Estos genes codifican para factores de crecimiento como el VEGF y el PlGF (factor de crecimiento de placenta). - secreción de enzimas proteolíticas: tanto las células tumorales como las endoteliales secretan enzimas proteolíticas: metaloproteinasas (MMPs) y serina proteasas, que actúan degradando la matriz extracelular. A ésto hay que añadir la expresión en las células endoteliales de moléculas de adhesión celular del tipo de las integrinas (αVβ3 y αVβ5) que median interacciones con la matriz extracelular y contribuyen a este proceso angiogénico. - producción de estimuladores angiogénicos: las ECs producen localmente otros estimuladores angiogénicos inespecíficos como el TGF -α y -β (factor del crecimiento transformante), PDGF (factor del crecimiento derivado de plaquetas) que inducen un fenotipo invasivo. Esta inducción de citoquinas y quimioquinas también recluta monocitos y leucocitos produciendo reacciones locales inflamatorias que contribuyen en el proceso. Además en las células se sobreexpresan receptores de tirosina quinasa (VEGFR1 y 2), junto con receptores de angiopoietinas (Tie-1 y Tie-2).

estado premaligno

tumor maligno

(tumor avascular)

(switch angiogénico)

crecimiento tumoral

invasión vascular

micrometástasis latentes

(intravasación de (diseminación a (tumor vascularizado) células tumorales) órganos distantes)

metástasis establecidas (angiogénesis secundaria)

etapas de la progresión tumoral en las que la angiogénesis desempeña un papel clave

Figura 7. La angiogénesis participa en la tumorigénesis, crecimiento tumoral y metástasis. Modificado de Poon RT y cols., 2001 y monografía “Entendiendo el VEGF y la angiogénesis”, Roche.

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___________________________________________________________________________ En conclusión, cuando un tumor da la señal para que se active la formación de vasos, la membrana basal y la matriz extracelular que rodea los vasos sanguíneos preexistentes se degradan. Las moléculas de adhesión interaccionan con la matriz extracelular y se producen factores estimuladores y de crecimiento para asegurar el crecimiento de los vasos. Numerosos estudios de vascularización de tumores en pacientes así como investigaciones in vitro e in vivo con agentes antiangiogénicos, demuestran la importancia de la angiogénesis en el desarrollo tumoral. Varios autores han demostrado que existe una correlación entre la densidad capilar en tumores y el carácter maligno de los mismos (indicativo de la evolución clínica). La inhibición de la angiogénesis en injertos tumorales en animales de experimentación, con agentes antiangiogénicos, ha resultado eficaz para la prevención del crecimiento tumoral y la metástasis, y en algunos casos, produjo la regresión del tumor (Sledge GW y Millar KD, 2002). En definitiva, estas observaciones sugieren que la angiogénesis es esencial para el crecimiento tumoral y define cuán agresivos son los tumores. Este crecimiento podría bloquearse inhibiendo la inducción de factores angiogénicos o bloqueando sus efectos biológicos. La terapia antiangiogénica, probablemente en el momento del switch angiogénico, si bien no destruye por completo el tumor, sí es capaz de reducir la masa tumoral a un tamaño relativamente pequeño (1 ó 2 mm) y evitar que continúe creciendo. En contraposición, la acción contra la proliferación de las ECs en tumores establecidos, podría ser eficaz para la prevención de metástasis y el bloqueo del crecimiento del tumor primario (Bergers G y cols., 1999). Actualmente se están desarrollando agentes antiangiogénicos dirigidos contra distintos factores y /o etapas de la regulación de la formación de vasos. Alguno de ellos se encuentra en fase III de ensayo clínico e incluso aprobado para su uso en el tratamiento de determinados tumores (Tabla 3) (www.cancer.gov/search/clinical_trials/). Uno de los abordajes más prometedores es la utilización de agentes dirigidos contra el VEGF y de pequeñas moléculas inhibidoras de tirosina quinasa que bloquean el/los receptor/es del VEGF.

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Tabla 3. Fase de ensayo clínico de las drogas en desarrollo dirigidas contra el sistema VEGF. Fuente: www.cancer.gov/search/clinical_trials/ y Roche, 2006.

1.5.1 El VEGF y la angiogénesis tumoral El VEGF desempeña un papel crucial en el desarrollo y mantenimiento de los tumores, principalmente sólidos, aunque también

está implicado en la formación y

estimulación de tumores hemotopoyéticos (He R y cols., 2003; Hirakawa S y cols., 2005). Diferentes estudios en pacientes con tumores sólidos humanos han demostrado que la expresión de VEGF está elevada en tejidos tumorales o en la circulación, y los niveles se correlacionan con la extensión de la vascularización del tumor (Guidi AJ y cols., 1995; Takahashi Y y cols., 1995; Amaya H y cols., 1997; Giatromanolaki A y cols., 1998; O`Byrne KJ y cols., 2000). Se incluyen melanoma (Ugurel S y cols., 2001), carcinoma gastrointestinal (Brown LF y cols., 1993; Wong MP y cols., 1999), de mama (Brown LF y cols., 1995), de sistema nervioso central (Berkman RA y cols., 1993), de ovario (Boocock CA y cols., 1995), de cuello uterino (Guido AJ y cols., 1995), de pulmón (O`Byrne KJ y cols., 2000), de hígado (Suzuki K y cols., 1996), de cabeza y cuello (Eisma RJ y cols., 1997) y de riñón (Jacobsen J y cols., 2000; Takahashi A y cols., 1994; Wong MP y cols., 1999). Estos estudios muestran que también está aumentada la expresión del receptor del VEGF en las ECs de los vasos sanguíneos cercanos, y que existe una asociación significativa entre los niveles plasmáticos del VEGF y el estadio de la enfermedad o la metástasis (Karayiannakis AJ y cols., 2003; Minagawa N y cols., 2002). En el interior del tumor, la expresión del VEGF es más alta en áreas de necrosis tisular pues son regiones hipóxicas (Brown LF y cols., 1993; Suzuki K y cols., 1996; Wong MP y cols., 1999).

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___________________________________________________________________________ Como se ha dicho, la expresión del VEGF ha sido relacionada con la probabilidad de metástasis o con la supervivencia libre de recaída en muchos tipos tumorales, incluyendo cáncer colorrectal, cáncer de mama y melanoma. El desarrollo de metástasis requiere el ingreso de células tumorales individuales en los vasos sanguíneos que irrigan el tumor. Evidencias experimentales indican que la angiogénesis, y también la linfangiogénesis, participan en la diseminación del tumor (Weidner N y cols., 1996; Greenlee RT y cols., 2001), pues las células tumorales metastásicas pueden inducir linfangiogénesis en el interior de los nódulos linfáticos, favoreciendo así su propia diseminación. Este tema ha sido objeto de numerosas investigaciones recientes (Oliver G y Detmar M, 2002; Kunstfeld R y cols., 2004; Dadras SS y cols., 2005; Hirakawa S y cols., 2005; Liersch R y cols., 2005). La principal fuente del VEGF en tumores son las propias células malignas, pero también pueden contribuir las células del estroma tumoral e incluso las del endotelio vascular, particularmente en regiones de hipoxia (Brown LF y cols., 1993; Fukumura D y cols., 1998; Wong MP y cols., 1999; Zheng H y cols., 2003). Como se ha mencionado, la expresión del VEGF se correlaciona con el grado de angiogénesis tumoral, confirmándose así su papel clave en este proceso. Estudios de inhibición de este factor, in vitro y mediante videomicroscopía intravital, han evidenciado que anticuerpos anti-VEGF inhiben el crecimiento y el desarrollo de metástasis en tumores ya establecidos (Kanai T y cols., 1998; Melnyk O y cols., 1999; Okamoto K y cols., 1999; Borgstrom P y cols., 1999; Soffer SZ y cols., 2001). También han demostrado que el VEGF desempeña un papel importante en la estimulación de cambios morfológicos en los vasos sanguíneos tumorales, reduciendo su permeabilidad, diámetro y tortuosidad capilar (Yuan F y cols., 1996; Pham CD y cols., 1998). 1.5.2 ¿Qué estimula la expresión del VEGF en el tumor? Numerosos estudios han demostrado que la hipoxia es un efectivo estimulador de la expresión del VEGF, actuando mediante el aumento de su transcripción y estabilización del ARNm resultante, así como de otros factores proangiogénicos como la Ang-2 (Forsythe JA y cols., 1996; Dachs GU y cols., 2000; Fukumura D y cols., 2001; Pichiule P y cols., 2004). Sin embargo, algunos tumores, en condiciones de presión normal de oxígeno, expresan altos niveles de VEGF, por lo que la hipoxia no es el único regulador de la expresión de VEGF en el tumor (revisado por Dvorak HF, 2002).

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___________________________________________________________________________ Varios oncogenes y genes supresores de tumores promueven la producción del VEGF en ausencia de hipoxia (Rak J, 2000). Mutaciones en el gen supresor de tumor VHL están asociadas con un aumento en la producción de HIF-1 y VEGF (Siemeister G y cols., 1996; Kaelin WF y cols., 1998; Na X y cols., 2003). Otros genes supresores de tumores que están asociados con la producción del VEGF son p53, p73 y p16INK4a (Linderholm BK y cols., 2001; Vikhanskaya F y cols., 2001). Se sabe que algunos oncogenes, como ras, raf, HER2/erbB2 (neu) y src, también están asociados con una expresión aumentada del VEGF (Grugel S y cols., 1995; Rak J y cols., 1995; Larcher F y cols., 1996; Petit AM y cols., 1997; Chiarugi V y cols., 1998; Harada H y cols., 1999) En definitiva, los tumores tienden a volverse hipóxicos a consecuencia de su rápido crecimiento, situación que estimula la expresión del VEGF tanto por las células tumorales como por las células normales cercanas. A su vez, el aumento de la permeabilidad vascular inducido por este factor puede exacerbar la hipoxia local. Esta situación unida al efecto positivo sobre la expresión del VEGF de los oncogenes tumorales activados, crea un ambiente local favorecedor de la angiogénesis. Este ambiente es vital para el crecimiento del tumor (Fig. 8). Oncogenes activados y/o genes supresores de Tumores inactivados

TUMOR Crecimiento Hipoxia

VEGF

Proliferación y supervivencia de ECs

Permeabilidad vascular Depósito de fibrina

Angiogénesis

Crecimiento tumoral continuado

Figura 8. Representación esquemática de los mecanismos desencadenantes de la angiogénesis tumoral. Genes supresores tumorales/oncogenes activados versus hipoxia. Modificado de Conti CJ, 2002.

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___________________________________________________________________________ La primera actividad in vivo del VEGF es aumentar la permeabilidad de los capilares para las macromoléculas circulantes, lo que conlleva: 1) el escape de proteínas plasmáticas (como fibrinógeno y otras proteínas de la coagulación, con la consecuente formación de un estroma provisional proangiogénico (Dvorak HF, 2002); 2) la elevación de la presión intersticial. La permeabilidad vascular y la presión aumentadas facilitarían la entrada de las células tumorales al torrente sanguíneo y por tanto 3) la diseminación de metástasis. El aumento de presión intersticial también impide la difusión de moléculas grandes como agentes quimioterapéuticos o anticuerpos anti-tumorales al interior del tumor (Jain RK, 2002). Los efectos del VEGF sobre la presión intersticial y morfología de la vasculatura tumoral también son responsables de que el suministro de oxígeno al tejido tumoral no sea homogéneo, y por tanto se generan áreas hipóxicas que son resistentes a la radiación en determinados tratamientos con radioterapia. Así pues, aunque la vascularización tumoral es anormal e ineficiente, resulta esencial para el crecimiento del tumor y para el desarrollo de metástasis, como se ha demostrado por el efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tumores con terapias anti-VEGF en animales portadores de xenoinjertos tumorales (Kanai T y cols., 1998; Okamoto K y cols., 1998; Melnyk O y cols., 1999; Soffer SZ y cols., 2001). Finalmente, el VEGF produce otros efectos adicionales que podrían ser importantes para la supervivencia y el crecimiento del tumor, así como para la terapia antitumoral, incluyendo efectos antiapoptóticos, además de sobre ECs, sobre las células tumorales (Von Marschall Z y cols., 2000; Bachelder RE y cols., 2001; Pidgeon GP y cols., 2001) y supresión de la respuesta inmune antitumoral (Gabrilovich DI y cols., 1998; 1999). 1.6 ANGIOGÉNESIS CUTÁNEA 1.6.1 La piel La piel es un órgano altamente especializado cuya función principal es la de barrera entre el organismo y el exterior, por tanto proporciona protección frente a agresiones externas y mantenimiento de los sistemas internos. Consta de dos compartimentos bien definidos: la epidermis (más superficial, derivado ectodémico) y la dermis (subyacente, derivado mesodérmico) (ver apartado 1.6.2) (Fig. 9).

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Estrato córneo Estrato granuloso Estrato espinoso Estrato basal Membrana basal Epidermis papilar vasculatura Dermis inervación queratinocitos basales epidérmicos

célula epitelial macrófago fibroblasto neutrófilo

reticular

colágeno matriz (glicosaminoglicanos) matriz proteica (fibronectina)

Figura 9. Anatomía de la piel humana. Representación esquemática de los componentes de los dos compartimentos cutáneos: epidermis y dermis.

La dermis es un tejido conectivo de soporte, histológicamente se compone de fibras de colágeno y fibras elásticas fundamentalmente, siendo el fibroblasto el tipo celular más abundante. Los vasos sanguíneos, terminaciones nerviosas, glándulas y folículos pilosos también se localizan en la dermis. La epidermis es un epitelio estratificado y queratinizado, dotado de una gran capacidad regenerativa, propiedad esencial para la función protectora que desempeña. Histológicamente está constituido por diferentes poblaciones celulares: queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans y células de Merkel. El queratinocito es uno de los prototipos de célula epitelial y el tipo celular más abundante (más del 80% en epidermis humana adulta). Se dispone en la epidermis de forma ordenada, organizado, según su grado de diferenciación, en cuatro capas o estratos: 1. estrato basal o germinativo: separado de la dermis por la membrana basal y anclado a ella mediante hemidesmosomas, de cuya integridad depende la unión dermis-epidermis. Las células presentan morfología cúbica y es en este estrato donde se localizan los

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___________________________________________________________________________ queratinocitos con capacidad proliferativa de la epidermis (Lavker RM y Sun TT, 1983; Potten CS y Morris RJ, 1988). 2. estrato espinoso: las células que constituyen este estrato poseen una morfología más variada y uniones intercelulares del tipo desmosomas, cuya apariencia bajo el microscopio óptico da nombre a esta capa celular. Estas uniones son complejos proteicos que conectan los citoesqueletos celulares para contribuir a la integridad del tejido y a la propiedad barrera de la epidermis. Además, el citoplasma de estas células contiene gránulos laminados, de naturaleza lipoproteica, que se vierten a los espacios intercelulares contribuyendo así a la impermeabilización de la piel. Las células de este estrato normalmente no se dividen. 3. estrato granuloso: las células se van aplanando, existen aún espacios intercelulares y contienen más gránulos laminados que en el estrato anterior. También contienen gránulos de queratohialina que le confieren un aspecto característico (Resing KA y Dale BA, 1991). Estos gránulos están formados por proteínas como la profilagrina, se mantienen unidos al citoesqueleto y, tras procesamientos proteolíticos, conducen a su agregación. Los otros gránulos liberan material lipídico mediante exocitosis alrededor de la célula, reforzando la función barrera de la epidermis (Grubauer G y cols., 1989). Se expresan también en este estrato otras proteínas estructurales como la loricrina y la involucrina. La enzima transglutaminasa une químicamente estas proteínas a otras de la membrana plasmática, organizando la envuelta celular cornificada del último estrato (Hashimoto K, 1969). 4. estrato córneo: cuando la epidermis es gruesa (por ejemplo, planta de los pies) se divide en dos estratos (lúcido y descamante), mientras que en el resto de las zonas sólo hay un estrato córneo descamante (por ejemplo, piel del rostro). Son células muertas, anucleadas, aplanadas con forma de escama, diferenciadas terminalmente, queratinizadas (contienen gránulos de eleidina, precursora de la queratina) y sin apenas uniones intercelulares. Son las responsables finales de la función protectora de la epidermis (Potts RO y Francour ML, 1991; Plewing G y cols., 1997; Kalinin AE y cols., 2002) y se desprenden de manera continua a medida que se da el recambio celular procedente de capas inferiores. Estos estratos se forman mediante un programa complejo de proliferación y diferenciación cuidadosamente regulado: los queratinocitos basales, no diferenciados y con capacidad mitótica, migran hacia la superficie al mismo tiempo que detienen su capacidad de división y se diferencian dando lugar a los estratos descritos. Durante la diferenciación, el queratinocito sufre cambios tanto bioquímicos como morfológicos, iniciando así la síntesis secuencial de diferentes proteínas y enzimas que caracterizan el estadio de diferenciación de

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___________________________________________________________________________ esta célula, y por tanto de su localización en un determinado estrato (Eckert RL y Rorke EA, 1989; Fuchs E, 1990; Yuspa SH, 1994). En el estrato basal coexisten dos poblaciones de queratinocitos que difieren en su capacidad de regeneración y expansión: las células madre o troncales (del inglés stem) y las células de proliferación transitoria (del inglés transient amplifying) (Hall PA y Watt FM, 1989; Alonso L y Fuchs E, 2003; Tumbar T y cols., 2004). Las células madre se caracterizan por su capacidad de autorrenovación, es decir, mediante divisiones asimétricas se generan dos células hijas: una retiene su capacidad stem y la otra, con limitada capacidad proliferativa (transient amplifying), sufre el proceso de diferenciación terminal para formar los distintos estratos epidérmicos anteriormente descritos. Las células madre, si bien poseen un alto potencial proliferativo, sólo una mínima parte de ellas sufre divisiones. Son las responsables de la renovación cíclica, no sólo de todas las células de la epidermis, sino de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas (Alonso L y Fuchs E, 2003; Amoh Y y cols., 2004). Las de proliferación transitoria son esenciales en procesos que requieren proliferación activa durante un tiempo limitado (por ejemplo, cicatrización de heridas) (Potten CS y Morris RJ, 1988; Hall PA y Watt FM, 1989; Kalinin AE y cols., 2002). Aunque ha sido objeto de controversia (Taylor G y cols., 2000; Ghazizadeh S y Taichman LB, 2001), actualmente se acepta la existencia de dos compartimentos en la piel donde se alojan las células stem: en el estrato basal de la epidermis interfolicular y en el folículo piloso (Morris RJ y cols., 2004; Levy V y cols., 2005; Claudinot S y cols., 2005). Otro tipo celular de la epidermis es el melanocito, que se localiza en el estrato basal sobre la lámina basal. Son células grandes, con muchas prolongaciones, contienen unos gránulos denominados melanosomas cuya función principal es la síntesis de melanina (responsable de la pigmentación de la piel). Además de factores genéticos y hormonales, la radiación solar favorece la formación de estos gránulos, es decir, los melanocitos son fotosensibles (absorben las radiaciones y los radicales libres derivados de la exposición a luz ultravioleta). Las células de Langerhans son un tipo de células dendríticas y por ello desempeñan funciones inmunológicas. Se originan en la médula ósea y migran a la piel atravesando la pared de los vasos sanguíneos mediante diapédesis, donde se distribuyen entre los queratinocitos y, en menor cantidad, en la dermis (Kimber I y cols., 2000). Finalmente, a las células de Merkel, situadas en el estrato germinativo, les llegan terminaciones nerviosas

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___________________________________________________________________________ libres, lo que les confiere una función de tipo sensorial (Fantini F y Johanson O, 1995; Ogawa H, 1996). En la piel madura de algunas especies, como el hombre y el cerdo, la unión entre la capa basal epidérmica y la dermis presenta ondulaciones denominadas crestas interpapilares o rete ridges (zonas epidérmicas que penetran en la dermis), y papilas dérmicas (zonas dérmicas penetrando en la epidermis). Como se mencionó anteriormente, el grado de diferenciación celular regula la expresión génica de determinadas proteínas que, en piel, se utilizan como marcadores de los diferentes estadios por los que atraviesa el queratinocito durante el proceso de diferenciación. Existen marcadores pertenecientes a las dos estructuras características del queratinocito: el citoesqueleto de filamentos intermedios y la envuelta celular cornificada. Las queratinas pertenecen a una familia de al menos 80 miembros específicos de tejidos y que, en la epidermis, forman los filamentos intermedios del citoesqueleto del queratinocito, donde se expresan en pares característicos según el grado de diferenciación (Moll R y cols., 1982; Yuspa SH, 1994). De este modo, en el estrato germinativo de la epidermis se expresa el par de queratinas 5 y 14 (K5 y K14). En el estrato espinoso son sustituidas por la expresión de las K1 y K10 (Fuchs E y Green H, 1980; Roop DR y cols., 1988; Stoler A y cols., 1988) que son utilizadas como marcadores clásicos de diferenciación temprana. Los marcadores característicos del estado de diferenciación del queratinocito postmitótico son evidenciados por la envuelta celular cornificada. En el estrato granuloso se activan, debido a un aumento de la permeabilidad celular y la entrada de cationes Ca2+, enzimas catalíticas como las transglutaminasas (Folk JE y Chung SI, 1973) que se unen covalentemente a proteínas que, al igual que las queratinas, establecen el grado de diferenciación epidérmica. La involucrina se sintetiza en las capas superiores del estrato espinoso y es la precursora de la envuelta celular cornificada (Rice RH y Green H, 1979). Filagrina y Loricrina son proteínas sintetizadas en el estrato granuloso (donde dejan de sintetizarse queratinas) y se consideran marcadores de diferenciación terminal. La filagrina forma parte de los gránulos de queratohialina y la loricrina de la envuelta celular (Dale BA y cols., 1985; Mehrel T y cols., 1990). Además, determinadas situaciones de hiperproliferación epidérmica inducen la expresión de marcadores característicos de epitelios mucosos. Por ejemplo, durante la reparación de heridas, enfermedades cutáneas como la psoriasis o procesos tumorales, en las

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___________________________________________________________________________ capas suprabasales de la epidermis se expresan las K6 y K16 (Weiss RA y cols., 1984). Por tanto, la caracterización molecular de la diferenciación epidérmica refleja la situación homeostática de la misma. 1.6.2 Organogénesis de la piel Durante las 3 primeras semanas de vida intrauterina, el embrión aún carece de piel y se encuentra revestido externamente sólo por una delgada capa de células ectodérmicas denominada epidermis presuntiva. Durante la siguiente semana esta monocapa dará origen a otra capa de células aplanadas y de mayor tamaño, conocida como peridermo, por debajo de la cual y otra semana más tarde, aparece una nueva hilera de célula cuboidales y de aspecto epitelial llamada capa germinativa o basal. Ambas capas, peridermo y basal, constituyen una incipiente epidermis bilaminar. Concomitantemente, el mesodermo subyacente se organiza en somites (acúmulos de células mesodérmicas dispuestas radialmente alrededor de una cavidad denominada miocele). La dermis se origina a partir de la región más externa del somite (dermatomo). Estas regiones se transforman en el mesénquima, que origina el tejido conectivo corporal, y cuyas células al migrar bajo la epidermis incipiente, conforman una dermis primitiva muy rica en células y matriz intersticial amorfa que carece aún de componente fibrilar. En las siguientes semanas esta matriz inicia un proceso de fibrogénesis activa (síntesis de colágeno y elastina) y reordenamiento celular progresivo y constante. Entre la quinta y sexta semana, por encima de la epidermis se sitúan los melanoblastos procedentes de la cresta neural (pigmentada), que transfieren sacos de pigmentos (melanosomas) a las capas subyacentes. Entre estas capas aparecen grupos de células poligonales muy ricas en glucógeno que constituirán un estrato intermedio y entre la octava y duodécima semanas, se presentan los primordios epiteliales (origen de folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas), comienzan a formarse redes vasculares (dispuestas en un solo plexo horizontal en el futuro límite dermo-hipodérmico) y la epidermis termina su estratificación. Más adelante, entre la decimotercera y decimoséptima semanas, glándulas sebáceas que han terminado su formación emiten secreción sebácea, y en las palmas y plantas aparecen esbozos de las glándulas sudoríparas ecrinas. Los primeros pelos en forma de lanugo emergen en mentón, labio superior y cejas. Para entonces, la queratinización epidérmica se ha iniciado en cabeza y regiones palmoplantares, al continuar y extenderse, provocará el desprendimiento y desaparición del peridermo hacia la semana 22. La formación de fibras de colágeno es un

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___________________________________________________________________________ evento temprano (semanas 4 a 8), mientras que las fibras elásticas sólo se evidencian a partir de la semana 24, su formación continúa aún después del nacimiento y durante los primeros años de vida. Finalmente, durante el ultimo trimestre y terminado ya el proceso de organogénesis activa, la piel aumenta de tamaño y volumen. La reorganización estructural y funcional son los hechos fundamentales en la formación de la piel. Aparecen crestas epidérmicas y papilas dérmicas en la unión de ambos compartimentos y se forman asas capilares papilares en el plexo vascular superficial. Poco tiempo antes del nacimiento también se produce un marcado engrosamiento de la capa córnea epidérmica, aumento del grosor dérmico y acumulación de grasa en la hipodermis (Gilbert SF, 1975; Moore KL, 1991). 1.6.3 La epidermis de ratón La morfogénesis de la piel de ratón comienza alrededor del día 13.5 de gestación y su maduración completa no termina hasta los primeros días después del nacimiento (Byrne C y cols., 1994) (Fig. 10). La función protectora de la epidermis frente a agresiones externas es esencial durante los primeros días de vida del animal, por ello, la epidermis de un ratón neonato se caracteriza por poseer varios estratos de queratinocitos en diferenciación y una activa proliferación en la capa basal. El proceso de maduración culmina alrededor de los 8-10 días de nacimiento y es entonces cuando se considera una epidermis madura. Esta epidermis se caracteriza por poseer uno o dos estratos epidérmicos, además del córneo. La capa basal posee un bajo nivel proliferativo, suficiente para mantener la integridad del tejido, además de ser un tejido con una elevada capacidad regenerativa para responder a las agresiones externas. La epidermis de ratón tiene una alta tasa de recambio, se renueva aproximadamente cada 2 ó 3 semanas. El proceso de diferenciación asegura la renovación continua de la epidermis, ya que las células diferenciadas, anucleadas y muertas son eliminadas mediante procesos mecánicos como la fricción. epidermis

folículos pilosos

H&E

x4

Figura 10. Sección histológica teñida con H&E de la piel de ratón adulto.

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___________________________________________________________________________ 1.6.4 Diferenciación epidérmica in vitro Una de las ventajas de la epidermis como modelo es la posibilidad de realizar cultivos primarios de monocapas de queratinocitos. La realización de una adecuada caracterización bioquímica in vivo del proceso de diferenciación epidérmica presenta dificultades. Por ello, se han desarrollado varios modelos de diferenciación in vitro. Por ejemplo, el incremento de la concentración de iones Ca2+ en el medio de crecimiento de los queratinocitos hace que éstos estratifiquen y expresen algunos de los marcadores de diferenciación temprana y tardía que se mencionaron anteriormente (Hennings H y cols., 1980; Stanley JR y Yuspa SH, 1983; Yuspa SH y cols., 1989). In vivo, los esfuerzos se han concentrado en tratar de generar cultivos organotípicos, mediante geles de colágeno y fibrina, donde se incluyen los dos tipos celulares más importantes de los compartimentos dérmico y epidérmico (Hager B y cols., 1999; Häkkinen L y cols., 2001). 1.6.5 Vascularización cutánea La vasculatura de la piel se dispone en forma de 2 plexos arteriovenosos horizontales denominados superficial y profundo (Fig. 11A). El primero está localizado entre la dermis papilar y reticular y el segundo en el límite dermo-hipodérmico, e interconectados por vasos comunicantes de disposición vertical. Los componentes del plexo superficial (arteriolas terminales, asas capilares papilares y vénulas postcapilares) poseen luces estrechas y paredes delgadas. Las arteriolas y vénulas colectoras, son

características del plexo profundo y

presentan luces más amplias y paredes más gruesas. Además, existen estructuras vasculares especializadas denominadas glomus, localizadas entre arteriolas y vénulas e inervadas por la rama simpática del sistema nervioso vegetativo. Son muy abundantes en nariz, pabellón auricular, punta de los dedos que actúan como intercambiadores de flujo entre ambos plexos. Puesto que la epidermis carece de vascularización, y el traspaso de gases y metabolitos en uno u otro sentido se hace por difusión, la existencia de un plexo vascular cutáneo con tan peculiar arquitectura anatómica, extraordinario desarrollo, complicada disposición y un volumen tal, que excede las necesidades del órgano, parecería no tener sentido si no se considerara el papel que la circulación sanguínea desempeña en la termorregulación. La sangre capta y traslada (por convección y conducción) el calor producido en el núcleo corporal hasta la superficie cutánea, donde éste se disipa total o parcialmente (por intercambio térmico contracorriente, radiación y evaporación). Las características morfológicas descritas permiten que el volumen y la velocidad de la sangre

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___________________________________________________________________________ puedan cambiar drásticamente en estos plexos, debido a la contracción o dilatación mediada por los puentes arteriovenosos y glomus, desviando así la corriente en uno u otro sentido (evitando o no el lecho capilar). De este modo, se facilita o dificulta la pérdida de calor por el organismo en función de sus necesidades y del calentamiento general o zonal cutáneo, según las condiciones medioambientales imperantes (Fig. 11B). A

B pérdida de calor por convección y radiación

retención de calor

capilar

epidermis plexo vascular superficial

dermis

vena

plexo vascular profundo grasa subcutánea

arteria entorno frío

entorno cálido

Figura 11. Arquitectura anatómica y funcional de los dos plexos vasculares dérmicos. A: El plexo superficial discurre en la dermis papilar y en la parte superior de la reticular. El plexo profundo se sitúa en el segmento más interno de la dermis reticular y en contacto con el tejido graso subcutáneo (límite dermohipodérmico). B: Termorregulación cutánea en función de las condiciones ambientales.

1.6.6 Angiogénesis cutánea fisiológica Como se mencionó en apartados anteriores, la actividad fisiológica normal del VEGF en la vida adulta es limitada. En condiciones normales, su función en la piel básicamente forma parte del mecanismo encargado de mantener el aporte sanguíneo necesario para su homeostasis, y adquiere relevancia cuando esta barrera protectora requiere ser reparada rápida y eficazmente debido a una agresión. En el proceso de cicatrización el VEGF es particularmente eficiente a la hora de promover la angiogénesis cutánea (Río MD y cols., 1999; Romano Di Peppe S y cols., 2002; Supp DM y cols., 2002).

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___________________________________________________________________________ Los queratinocitos epidérmicos constituyen la fuente principal del VEGF en la piel y expresan este factor de forma constitutiva (Ballaun C y cols., 1995; Weninger W y cols., 1996). En los procesos de reparación de heridas y enfermedades cutáneas inflamatorias, se ha observado sobreexpresión del VEGF por estas células (Brown LF y cols. 1992; Detmar M y cols., 1994; Brown LF y cols., 1995b; Brown LF y cols., 1995c). Sin embargo, otras fuentes pueden contribuir al incremento de los niveles del VEGF en la piel; por ejemplo, en situaciones de cicatrización se libera el VEGF de su unión a componentes de la matriz extracelular dérmica (revisado por Neufeld G y cols., 1999), y también se ha comprobado que los macrófagos dérmicos que migran a través del lecho de una herida producen este factor (Brown LF y cols., 1992). Por otra parte, otros factores y citoquinas, tales como el PlGF, FGF-2, y las angiopoietinas y trombospondinas, participan en la regulación de la angiogénesis cutánea (Bikfalvi A y cols., 1997; Suri C y cols., 1998; Detmar M y cols., 2000; Odorisio T y cols., 2002). Respecto a la angiogénesis tumoral (ver apartado 1.5), las células del estroma de un tumor, presentan elevada actividad del VEGF, sugiriendo que los tumores pueden regular su actividad angiogénica en células peritumorales no transformadas (Fukumura D y cols., 1998; Dong J y cols., 2004). Durante la cicatrización de heridas el proceso angiogénico es fundamental para asegurar la eficacia de la reparación tisular. Este proceso requiere del crecimiento de nuevos vasos, estimulado por la liberación de factores de crecimiento y citoquinas a partir de las plaquetas activadas en el lugar de la herida (Pierce GF y cols., 1988; Rappolee DA y cols., 1988; Schaffer CJ y Nanney LB, 1996). Inicialmente, se forma un gran número de vasos inmaduros que desarrollan brotes y maduran (Zawicki DF y cols., 1981). La participación del VEGF en este proceso fue demostrada por estudios inmunohistoquímicos (Bloch W y cols., 2000) y la angiogénesis se hace esencial y determina el éxito del proceso durante la formación del llamado tejido de granulación, ya que los vasos sanguíneos proporcionan el oxígeno y los nutrientes necesarios para mantener el metabolismo celular. La inhibición del VEGF también es esencial para la regresión de los vasos sanguíneos inmaduros en la reepitelización y durante la resorción de la herida y formación de la cicatriz (Bloch W y cols., 2000). En el proceso de cicatrización de una herida profunda se pueden diferenciar tres etapas (Martin P, 1997; Singer AJ y Clark RA, 1999; Martin P, 2003):

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___________________________________________________________________________ 1. Inflamación: debido a la ruptura de vasos sanguíneos se forma un coágulo de plaquetas, cuya desgranulación libera citoquinas y factores de crecimiento que disparan el proceso de reparación (Pierce GF y cols., 1988; Rappolee DA y cols., 1988; Schaffer CJ y Nanney LB, 1996). El coágulo mantiene unidos laxamente los bordes de la herida, protege al tejido desnudo y proporciona una matriz provisional de fibrina que permitirá la migración de células durante la reparación. La vasodilatación y el aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos estimulan la salida de neutrófilos y monocitos del torrente sanguíneo (Hubner G y cols., 1996), lo que conlleva a la acumulación de macrófagos en la herida (estas células son esenciales para que la cicatrización sea efectiva) (Leibovich SJ y cols., 1975). 2. Reepitelización y formación del tejido de granulación: los hemidesmosomas desaparecen y los queratinocitos basales, libres de su anclaje a la lámina basal, migran por la matriz provisional formada. A continuación, las células epidérmicas de los márgenes de la herida proliferan masivamente proporcionando la masa crítica de queratinocitos necesaria para que la reparación se complete. Paralelamente, macrófagos, fibroblastos y ECs invaden la matriz provisional formando el tejido de granulación (Hunt TK y cols., 1980). Durante la formación de este tejido la angiogénesis desempeña un papel clave y determinante del éxito del proceso. Para invadir la matriz provisional de fibrina y responder a las señales angiogénicas, las ECs cambian sus receptores de membrana: disminuye la expresión de receptores de colágeno y aumenta la de receptores para ligandos presentes en la matriz temporal, por ejemplo, la integrina αvβ3. Las células y vasos sanguíneos que migran al coágulo deben trazarse una ruta. Para ello expresan plasmina, cuya actividad fibrinolítica permite romper la barrera de fibrina. Posteriormente, esta matriz de fibrina es reemplazada por una matriz rica en colágeno, la mayoría de los vasos sanguíneos degeneran, y los vasos maduros que permanecen dejan de expresar la integrina αvβ3 y restauran la expresión de α2β1, receptor específico de colágeno (Tonnesen MG y cols., 2000). 3. Remodelación dérmica: los acontecimientos de esta fase se superponen a los descritos en la formación del tejido de granulación, y comprenden básicamente la remodelación de la matriz extracelular mediante procesos de apoptosis y maduración celular. Tanto la remodelación de la matriz extracelular como la maduración de la neoepidermis y el proceso angiogénico, comienzan en el borde de la herida mientras el tejido de granulación aún está invadiendo la lesión.

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___________________________________________________________________________ 1.6.7 Angiogénesis cutánea tumoral El 80% de las neoplasias son de origen epitelial, en concreto el cáncer de piel es uno de los más comunes en el mundo (se detectan más de medio millón de casos nuevos al año y su incidencia va en aumento más rápidamente que la de cualquier otro tipo de cáncer) (Fig. 12). Una de las ventajas de la epidermis como modelo de estudio es la posibilidad de realizar un protocolo de carcinogénesis química in vivo. Este modelo tiene una naturaleza secuencial tanto en la génesis como en la progresión tumoral, permitiendo observar estados secuenciales del desarrollo tumoral, y los tumores obtenidos son similares a ciertos tumores humanos (Yuspa SH y cols., 1991; DiGiovanni J, 1992).

célula tumoral célula normal célula premaligna

Ll

Transformación maligna

epitelio tumoral

L invasión

epitelio normal estroma normal

célula endotelial

estroma tumoral

fibroblastos matriz extracelular

ll

angiogénesis y células inmunes linfangiogénesis tumoral

Figura 12. Representación esquemática de la progresión tumoral epitelial.

La carcinogénesis de piel de ratón es una herramienta muy útil para dilucidar los mecanismos subyacentes de las neoplasisas en general y del cáncer de piel en particular. El protocolo de carcinogénesis química consiste en: i) iniciación: aplicación de un carcinógeno genotóxico (DMBA) que origina un cambio genético irreversible (mutación en el codón 61 del gen Harvey-ras, Hras) pero sin consecuencias fenotípicas (epidermis normal) (Balmain A y Pragnell IB, 1983; Quintanilla M y cols., 1986; Roop DR y cols., 1986; Brown K y cols., 1990), ii) promoción: múltiples aplicaciones tópicas de un promotor tumoral (TPA) que actúa como un estímulo hiperproliferativo provocando lesiones exofíticas premalignas, con demanda angiogénica (papilomas escamosos) (Slaga TJ, 1989) y finalmente, iii) eventual transición de la hiperplasia anterior a un fenotipo maligno (carcinoma epidermoide o SCC).

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___________________________________________________________________________ Los SSC presentan diferentes grados de malignidad y diferenciación. Los muy diferenciados conservan marcadores epiteliales y son prácticamente idénticos a los SCC de cabeza y cuello en la piel humana (Hennings H y Yuspa SH, 1985). Finalmente, los carcinomas epidermoides pueden progresar a carcinomas fusiformes, tumores muy indiferenciados de aspecto mesenquimal, con ausencia total de marcadores epiteliales, agresivos y altamente metastásicos. Representan el último estadio de la progresión tumoral de la carcinogénesis de piel de ratón. Este modelo, ha permitido estudiar los eventos moleculares implicados en el desarrollo tumoral en piel. Estudios previos en nuestro laboratorio evidencian la estrecha relación del oncogén Hras mutado con diversos factores angiogénicos en la angiogénesis cutánea tumoral (VEGF, PlGF, angiopoietinas, EGFR, Akt). La expresión del VEGF en tumores epidérmicos en ratones está incrementada y existe una relación entre la expresión del VEGF y un comportamiento maligno de las células, de manera que la expresión del VEGF in vitro es mayor en líneas celulares epidérmicas de ratón que representan estados de carcinogénesis más avanzados. Así mismo, el nivel de expresión de VEGF correlaciona con el tipo de tumor cutáneo (papiloma o carcinoma). Además, con el aumento de la tumorigenicidad no sólo aumenta el VEGF, sino EGFR, PlGF y Ang-2, por el contrario, la expresión de la Ang-1 está disminuída. La activación del oncogén Hras es un evento crítico en la formación de tumores cutáneos. Aunque muchas de las señales generadas por el VEGF no son dependientes de la activación de Hras, se ha demostrado la dependencia de este oncongén en la inducción angiogénica mediada por el VEGF, tanto en queratinocitos transducidos con el oncogén activado como en otros tipos celulares epiteliales (Rak J y cols., 1995b; Grugel S y cols., 1995; Larcher F y cols., 1996; Chin L y cols., 1999). Además, para la formación de vasos en tumores de piel, el oncogén Hras requiere un EGFR completamente funcional (Rho O y cols., 1994; Dlugosz AA y cols., 1997; Hansen LA y cols., 2000; Casanova ML y cols., 2002). Otros trabajos sugieren que la regulación del VEGF mediada por este oncogén varía en función del tipo celular (Rak J y cols., 2000b). Numerosos trabajos analizan la vasculatura de los diferentes estados secuenciales del desarrollo de tumores cutáneos. La densidad de vasos sanguíneos incrementa considerablemente en papilomas tempranos, no así en papilomas más avanzados y en SCC, en los que la densidad vascular se estabiliza pero las dimensiones de los vasos aumentan (Plate KH y cols., 1994; Bolontrade MF y cols., 1998). Resultados similares se han

Introducción

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___________________________________________________________________________ observado en la vasculatura dérmica de ratones transgénicos que expresan el VEGF120 bajo estímulos hiperproliferativos (Larcher F y cols., 1998). Los trabajos acerca de la función del VEGF en la tumorigénesis cutánea y su potencial metastásico se han visto dificultados por la imposibilidad de estudiar la ausencia de este factor in vivo, pues los ratones Knock-out para el VEGF son letales embrionarios (ver apartado 1.3.1). Únicamente es posible eliminar la expresión del VEGF de forma específica de tejido utilizando ratones knock-out condicionales (Rossiter H y cols., 2004).Con este tipo de estrategias se puede controlar de forma espacio-temporal la eliminación específica de una proteína en un tejido (revisado por Lewandoski M, 2001). Sin embargo, en estos estudios sólo se elimina la expresión epidérmica del VEGF y no posibilitan su eliminación del compartimento dérmico. Por otra parte, en la carcinogénesis química en piel de ratón raramente se alcanzan estados tumorales más avanzados y desarrollo de metástasis. Generalmente los estudios de angiogénesis cutánea se centran, mayoritariamente, en el compartimento epidérmico como fuente de factores para la vascularización, y la mayoría de las estrategias, tanto para eliminar como para sobreexpresar genes, han tenido como diana principal al queratinocito. Por tanto, la contribución de los elementos mesenquimales en los cambios vasculares ha sido pobremente caracterizada. En este trabajo se propone una herramienta para solventar el estudio, in vivo, de una piel sin el VEGF a nivel de cada uno de los compartimentos cutáneos, o en ambos simultáneamente.

2. JUSTIF ICACIÓN Y OBJETIVOS

Le t r a s s in v ir t ud s o n p e r la s e n e l mu la d a r M I G U EL D E C ER V A N TES

Justificación y Objetivos

39

___________________________________________________________________________ Numerosos trabajos han descrito la contribución del VEGF al desarrollo tumoral epitelial y actualmente la contribución angiogénica del componente estromal en el proceso tumoral es muy discutida. Sin embargo, este factor proangiogénico es letal en haploinsuficiencia, pues es esencial durante el desarrollo embrionario, lo que imposibilita, en su ausencia total, realizar estudios in vivo de tumorigénesis y metástasis, salvo los estudios realizados con animales deficientes de tipo condicional. Sin embargo, estos estudios de modelos animales deficientes de tipo condicional, presentan ciertas desventajas para analizar la funcionalidad de la proteína en tejido adulto, pues requieren complejos y elevados números de cruces de animales para obtener el fenotipo deseado (bloqueo, sobreexpresión o disminución de factores). Respecto al modelo de tumorigénesis en piel de ratón mediante una carcinogénesis química, si bien permite observar estados secuenciales del desarrollo tumoral, no posibilita el estudio de la progresión tumoral más avanzada y desarrollo de metástasis. Por otro lado, la contribución vascular de ambos compartimentos, dérmico y epidérmico, en la regeneración cutánea apenas ha sido abordada. Por tanto, la ausencia de estudios determinantes in vivo, nos llevó a generar una línea celular de queratinocitos de ratón deficiente en el VEGF, e inmortalizada espontáneamente, que posibilitara el estudio de este factor en los procesos de desarrollo tumoral y regeneración tisular. Para profundizar en el conocimiento de la acción del VEGF en la angiogénesis cutánea normal y patológica, y determinar su importancia fisiológica, se han planteado en la presente tesis doctoral los siguientes objetivos: 1. Desarrollar una herramienta que permita el análisis, in vivo, de la angiogénesis cutánea, normal y patológica, en ausencia del factor angiogénico más relevante. 2. Estudiar el grado de implicación del VEGF, como principal factor regulador de la angiogénesis, en la tumorigénesis, progresión tumoral cutánea y en su desarrollo vascular. 3. Caracterización del proceso de regeneración cutánea en ausencia del VEGF.

3. MATERIALES Y MÉTODOS Lo q ue c ue nt a e s e l va lo r d e l e xp e r ime nt o , no s u núme r o I S A A C N EW TO N

Materiales y Métodos

43

___________________________________________________________________________ 3.1 ANIMALES VEGF-LoxP Y GENOTIPADO Estos ratones fueron cedidos generosamente por el Dr. Claudio Conti (University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Texas, USA). Han sido generados en un fondo genético C57BL/6J y contienen, flanqueando el exón 3 en los alelos VEGF, dos secuencias correspondientes a sitios de reconocimiento específico de la recombinasa Cre: LoxP-1 y LoxP-3 (VEGF-LoxP o floxeado) (Gerber HP y cols., 1999). El genoma de ratón carece de secuencias LoxP, y la introducción de dos de estas secuencias en el mismo sentido flanqueando una región determinada de un gen, permitirá la eliminación de la misma en células donde se exprese la recombinasa Cre (ver más adelante apartado 3.2.2) (Fig. 13). Cre

exón A

exón C

exón B Lox P

Lox P

exón B Lox P

Cre

exón A

exón C

Lox P

Lox P

Cre exón A

exón C

exón B

Lox P Lox-P: ATAACTTCGTATAATGTATCGTATACGAAGTTAT

Figura 13. Sistema de recombinación específica Cre/LoxP. Representación esquemática de la recombinación específica mediada por la recombinasa Cre entre dos secuencias LoxP (34 pb) que flanquean una determinada región génica (Sternberg N y Hamilton D, 1981).

El genotipado de los animales se realizó por PCR mediante la reacción que se describe a continuación, en la que el molde es el ADN genómico extraído de la cola de los ratones: • ADN

1µl

• Tampón 10X

2.5µl

• dNTPs (2.5 mM)

2µl

• Oligonucleótidos (15 µM)

0.5µl

• MgCl2 (25 mM)

2.5µl

• Enzima Taq polimerasa 5 u/µl (Invitrogen)

0.2µl

• H2O destilada

15.8 µl

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ El proceso se realizó en un termociclador (PTC-100 MJ Research, Inc.) mediante el siguiente programa de reacción: • 4 minutos 94ºC • 1 minuto 94ºC • 1 minuto 56ºC

x 35 ciclos

• 1 minuto 72ºC • 4 minutos 72ºC

Los oligonucleótidos utilizados para el genotipado de los animales amplifican una región del intrón que flanquea al sitio LoxP-1: VEGF419.F: 5’ CCTGGCCCTCAAGTACACCTT 3’ VEGF 567.R: 5’ TCCGTACGACGCATTTCTAG 3’

Se obtiene un fragmento de 148 pb en el caso de animales homocigotos (las dos copias del gen VEGF floxeadas), 108 pb en los animales control (sin sitios LoxP) y ambos en los animales que poseen esta modificación en heterocigosis. Finalmente, los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa (D-1 low EEO, Pronadisa) al 2% en TBE 1X (89 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8), con 1 µg/µl de bromuro de etidio. Se mezcló el producto de PCR (25 µl) con tampón de carga (sacarosa 7%, azul de bromofenol 0.04% p/v y azul de xilenocianol 0.004% p/v) para conferir densidad a la muestra y visualizar el frente, cargamos las muestras en los correspondientes pocillos, así como un marcador de bajo peso molecular (fago ΦX 174 digerido con Hae III o marcador IX, Roche). A continuación conectamos el gel a una fuente electroforética a 70 V durante 1 hora y visualizamos las bandas de ADN en un transiluminador de luz ultravioleta. 3.2 OBTENCIÓN DE QUERATINOCITOS Y FIBROBLASTOS PRIMARIOS DE RATÓN Los queratinocitos y fibroblastos primarios se obtuvieron a partir de la piel de ratones neonatos (1-3 días postparto) (Hennings H y cols., 1980). Los procedimientos descritos a continuación de realizan en condiciones de esterilidad en cabina de flujo vertical. Tras sacrificar a los animales mediante intoxicación con CO2, se extrae la piel y se somete a digestión enzimática a 4ºC durante 16 h en una solución de tripsina al 0.25% en PBS 1x (Trypsin 1-300, ICN Biomedicals), tras lo cual, se separan fácilmente dermis y epidermis de forma mecánica (Fig. 14).

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ Para obtener fibroblastos se aísla la dermis, las células se individualizan mediante disgregación enzimática: incubación con colagenasa A (Boehringer Mannheim) al 0.25% en medio DMEM (GibcoBRL, Invitrogen, Life Technologies) a 37ºC durante 30 min. Tras centrifugar las células a 1000 rpm 7 min, se siembra el sedimento celular sobre frascos de plástico de cultivo de 25 cm2 (flask F25, NunclonTM surface, Nunc, Denmark) con medio DMEM (GibcoBRL) suplementado con 10% FBS (BioWhittaker) y 1% antibiótico (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) (Life Technologies, Rockville, MD). Se cultivan en una atmósfera saturada de humedad con 5% CO2 a 37ºC (incubador de CO2, NAPCO). Tras 24 h lavamos el cultivo con PBS para eliminar las células no adheridas y añadimos medio fresco. Para obtener queratinocitos se individualizan las células de la epidermis mediante disgregación mecánica. A partir de aquí introducimos variaciones respecto al método descrito por Hennings para optimizar, no el rendimiento en la extracción de queratinocitos, sino para prolongar en el tiempo el cultivo de estas células (limitado generalmente hasta que alcanzan la confluencia en el soporte de cultivo). Estas células crecen adheridas al soporte y se sembraron en frascos de cultivo F25 sobre una capa de fibroblastos de ratón 3T3-J2 ó 3T3-J2 feeder layer irradiados letalmente con rayos X (50 Gy) y sembrados de 2 a 24 h antes (1 x 106/F25) (esta línea celular fue cedida por el Dr. J. Garlick, Department of Oral Biology and Pathology, School of Dental Medicine, SUNY, Stony Brook, New York). El medio de siembra empleado es una mezcla 1:1 de medio con alta concentración de calcio (medio DMEM con 10% FBS, aproximadamente 1.3 mM Ca2+ para favorecer la adhesión celular al soporte) y medio condicionado de bajo calcio (0.03-0.07 mM Ca2+). El medio que denominaremos “de alto Ca2+” contiene: medio EMEM (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD) sumplementado con 3% de medio Ham’s-F12 (GibcoBRL, Paisley, Scotland, UK), 10 % de FBS tratado con resina Chelex (Chelex 100, BioRad Laboratories, Hercules, CA), hidrocortisona 0.5 mg/ml (Sigma, St Louis, MO, USA), insulina 5 mg/ml (Sigma), toxina colérica 8 ng/ml (Sigma) y antibiótico 1% (penicilina, estreptomicina y anfotericina B) (Life Technologies, Rockville, MD). El tratamiento del suero con la resina elimina el Ca2+ del mismo (500 ml de suero con 180 g de resina Chelex 100 en agitación a 4 ºC durante 1 h), de manera que se pueda calcular la concentración final de este catión en el medio. El medio de bajo Ca2+ es igual que el de alto Ca2+ suplementado con EGF humano 10 ng/ml (Sigma) y es el que denominaremos “medio de crecimiento completo”.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ Se denomina medio condicionado al medio procedente de un cultivo de 24 h preconfluente de fibroblastos de piel de ratón neonato en medio de crecimiento completo (bajo Ca2+ ) (ver en el apartado siguiente la obtención de estas células). Tras 24 horas de adhesión en una atmósfera con 5% CO2 a 37ºC, lavamos el cultivo con PBS para eliminar las células no adheridas y renovamos el medio anterior. Este medio, además de contener el bajo Ca2+ necesario para los queratinocitos, impide, por ese motivo, la proliferación de posibles fibroblastos contaminantes. El medio se renovó diariamente.

epidermis disgregación mecánica

Tripsina 16 h

dermis

0.5-0.7 mM Ca2+ adhesión

colagenasa 30 min 0.03-0.07 mM Ca2+ proliferación 0.03-0.07 mM Ca2+ proliferación

Figura 14. Obtención de cultivos primarios. Resumen esquemático del protocolo de obtención de queratinocitos y fibroblastos de ratones neonatos. Se relaciona además el rango de concentraciones de Ca2+ requeridas para la adhesión y proliferación de los queratinocitos.

3.2.1 Subcultivo de queratinocitos de ratón Cuando el cultivo alcanzó un 80-90% de confluencia procedimos a realizar el primer subcultivo, despegamos los queratinocitos del soporte mediante tratamiento con tripsina/EDTA (Life Technologies, Rockville, MD) y, tras 20 min a 37ºC, la inactivamos con medio de crecimiento completo (bajo Ca2+), centrifugamos las células y sembramos el sedimento sobre una capa de feeder 3T3-J2 con la mezcla 1:1 de medios anteriormente descrita. Hasta el pase 8 los subcultivos se realizaron a razón 1:2 sobre el feeder. A partir del décimo subcultivo, los siguientes se realizaron a razón 1: 4, la concentración de Ca2+ en el medio para detener la tripsinización del cultivo no afectó a las células, éstas se sembraron en frascos de cultivos sin feeder, y el medio de siembra contuvo únicamente medio de alto Ca2+. A partir de este momento, en cada subcultivo, los queratinocitos se siembran con este medio en superficies de cultivo mayores (frascos de 75 cm2, NunclonTM surface, Nunc, Denmark ) y tras 24 h se reemplazará por el medio de crecimiento completo (bajo Ca2+) que se renovará cada 2 días.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ Alrededor del subcultivo 12, las células son independientes de la necesidad de medio condicionado y poseen una tasa de crecimiento estable (un cultivo en frasco F75 alcanza la confluencia en aproximadamente 4 días y contiene 6 x 106 de células). Para su preservación, los cultivos de queratinocitos, en fase exponencial de crecimiento, fueron despegados del soporte, resuspendidos en FBS (BioWhittaker) y 10% de DMSO (Merk) como agente criopreservante, y congelados en nitrógeno líquido. Se congeló un lote de células en cada subcultivo a partir del subcultivo 5. Todos los medios de cultivos empleados desde la obtención de los queratinocitos primarios hasta su establecimiento como línea celular, contuvieron un 1% de antibiótico antibacteriano (penicilina-estreptomicina) y antimicótico (anfotericina B), así como ciprofloxacina para evitar contaminaciones por micoplasmas. Durante los subcultivos 6-10 se realizaron pruebas para la detección de contaminación por micoplasmas (Micoplasma Detection Kit, Boehringer Mannheim). 3.2.2 Infección adenoviral de queratinocitos y fibroblastos de ratón Los queratinocitos deficientes en el VEGF se obtuvieron in vitro, a partir de la piel de ratones neonatos VEGF-LoxP mediante transferencia génica de un adenovirus portador de la secuencia de ADNc de la recombinasa Cre. La amplificación del adenovirus codificante para Cre se realizó en células 293 en medio DEMEM (GibcoBRL) suplementado con 5% FBS (BioWhittaker) y 1% antibiótico antimicótico (Life Technologies) como se describe en el apartado 3.3. Para la infección de los queratinocitos VEGF-LoxP se cultivaron hasta alcanzar un 80-90% de confluencia (en flasks F75) y a continuación se infectaron con una MOI de 5000 del sobrenadante adenoviral diluído 1:1 en medio Optimen (GibcoBRL) con 8 µg/ml de polibreno y filtrado por 0.45 µm (MilliPore, Cork, Ireland) durante 2 h. Tras el ciclo de infección, se sustituyó el sobrenadante por el medio de crecimiento completo de queratinocitos (bajo Ca2+) que se renovó cada 2 ó 3 días. Para la infección de los fibroblastos VEGF-LoxP se procedió del mismo modo que con los queratinocitos. Posteriormente, procederemos a comprobar la pérdida del VEGF a nivel génico y proteico y al clonaje de las células.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ 3.2.3 Clonaje celular por dilución límite Para obtener poblaciones clonales de los queratinocitos y fibroblastos tanto VEGFLoxP (MK VEGF WT), como deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-), procedemos de la siguiente manera: 1) se ajusta la densidad celular a 106 de células/ml de medio. 2) se diluye la suspensión celular a 104 células/ml. De este modo, tendríamos 50 células en 5 µl, 100 células en 10 µl y 10000 células en 1000 µl. 3) Se preparan 50 células/10 ml, 100 células/10 ml y 10000 células/10 ml añadiendo 5, 10 y 1000 µl, respectivamente, a 10 ml de medio. 4) Se preparan 3 placas de plástico de 96 pocillos con 100 µl de medio de cultivo (“medio de crecimiento completo”) en cada pocillo, y se dispensan 100 µl de cada 10 ml de suspensión celular preparada (50, 100 y 10000 células) en cada pocillo de la placa correspondiente a cada suspensión. De esta forma, se obtienen 0.5 células/100 µl de la suspensión de 50 células, 1 célula/100 µl de la suspensión de 100 células y 100 células/100 µl de la suspensión de 10000. 5) Incubar las placas en un incubador con 5% CO2 a 37ºC y examinarlas al microscopio diarimente. Posteriormente, se amplificarán los clones obtenidos, de forma escalada, hasta obtener cantidades suficientes para realizar los diferentes análisis necesarios para comprobar la presencia o la pérdida del VEGF. 3.2.4 Curvas de crecimiento de queratinocitos de ratón Para analizar el crecimiento de los queratinocitos en cultivo (poblaciones clonales), se plaquearon

105 células en medio de crecimiento completo (bajo Ca2+) y tras 24 h de

adhesión celular al soporte y aclimatación al medio en atmósfera con 5% CO2 a 37ºC, se despegaron del soporte y se contaron diariamente en una cámara de Neubauer o hemocitómetro, utilizando un microscopio invertido. 3.2.5 Diferenciación de queratinocitos de ratón in vitro La diferenciación se indujo mediante la adición de Ca2+, hasta una concentración de aproximadamente 1.2 mM, al medio de cultivo (Hennings H y cols., 1980; Stanley JR y Yuspa SH, 1983; Yuspa SH y cols., 1989). El proceso de diferenciación celular se mantuvo durante 24 ó 72 h y todos los experimentos se realizaron por triplicado. Posteriormente se realizaron las inmunofluorescencias como se describe a continuación.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________

3.2.6. Inmunofluorescencia en queratinocitos de ratón Para realizar los procedimientos inmunohistoquímicos, los cultivos de queratinocitos (en proliferación, diferenciación o tras infección viral) se crecieron sobre cristales de 9 mm de diámetro y se fijaron en metanol/acetona (2:1) durante 7 min a 4 ºC. Tras un lavado con PBS y dos con PBS-BSA, los cristales se incubaron con los correspondientes anticuerpos primarios y secundarios durante 1 h, respectivamente, en una cámara húmeda a RT. Después del último paso de lavado en PBS, los cristales se montaron sobre portas utilizando Mowiol (Hoechst), como medio de montaje, y colorante nuclear DAPI (20 µg/ml), para detectar los ácidos nucleicos. La visualización se realizó en un microscopio de fluorescencia (Zeiss). Los anticuerpos primarios empleados fueron los siguientes: anti Cre (dilución 1:400, Novogen); anti K5 y anti K1 (dilución 1:500, clon Roop, Covance); anti K10 (dilución 1:30, clon k8.60, Sigma). Los anticuerpos secundarios se seleccionaron de acuerdo al origen del primer anticuerpo: anticuerpos secundarios conjugados con FITC y Texas Red (dilución 1:500 y 1:50 respectivamente; dilución 1:50 del FITC para anti-Cre) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). 3.2.7. Infección retroviral de queratinocitos de ratón El plásmido retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP fue construido como se describe más adelante en el apartado 3.4. Los retrovirus defectivos fueron generados mediante transfección transitoria de la línea celular 293T (ATCC) con este plásmido retroviral y un plásmido empaquetador ecotrópico (para infectar células de ratón) (Yang S y cols., 1999). El suero de los medios utilizados debe estar descomplementado o inactivado a 55ºC durante 45 min, para que el sistema del complemento no ataque al virus y la infección celular por parte de éste sea efectiva. Los queratinocitos, al 50-60% de confluencia, se transfectaron permanentemente mediante el método de transfección con fosfato cálcico, siguiendo las instrucciones del fabricante (Calcium Phosphate Transfection System, GibcoBRL, Inc. Gaithersburg, MD, USA) y en todas las transfecciones se utilizó el vector vacío como control. Los sobrenadantes retrovirales se obtuvieron en DMEM con 10% FBS y 1% antibiótico, se les añadió 8 µg/ml de polibreno y se filtraron por 0.45 µm. A continuación, se infectaron los queratinocitos durante 6 horas, tras las cuales se lavaron los cultivos en PBS y se les proporcionó su medio de crecimiento. Aproximadamente 24 h después de la transfección, se observó al microscopio

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ de fluorescencia que prácticamente todas las células expresaban la proteína GFP (marcador del transgén transfectado). La expresión de esta proteína como gen marcador permite seleccionar la población celular mediante cell sorting (Becton Dickinson) hasta lograr un elevado porcentaje de células positivas para el transgén (98%). 3.3

PRODUCCIÓN

DEL

VECTOR

ADENOVIRAL

PORTADOR

DE

LA

RECOMBINASA CRE El adenovirus codificante para la recombinasa Cre fue proporcionado generosamente por el Dr. Javier García Castro (Hospital Universitario Niño Jesús, Madrid). El suero del medio utilizado se inactivó a 55ºC durante 45 min. La amplificación del vector adenoviral se realizó mediante transducción de células 293 (ATCC) (sembradas en placas de plástico de 150 mm de diámetro) a un 90% de confluencia en medio DEMEM (GibcoBRL) con 5 ó 10% FBS durante 1 h en incubador con 5% CO2 a 37 ºC. Esta es una línea celular humana en la que se propaga el vector, pues suple las proteínas necesarias para la replicación viral (Graham FL y cols., 1977). El sobrenadante adenoviral va diluído 1:1 en un medio sin suero ni antibiótico (Optimen, GibcoBRL), con 8 µg/ml de polibreno y filtrado por 0.45 µm. Tras la infección se retira el sobrenadante y se dejan las células en DEMEM con 5 ó 10% FBS. A las 48-72 h de la infección, el efecto citopático del virus en las células fue evidente en la mayoría de ellas, se recogió el sobrenadante y el pellet de células y se conservaron a -80ºC hasta la utilización o purificación del adenovirus respectivamente. La purificación del vector adenoviral se realizó mediante gradiente en CsCl. Este método consiste en ultracentrifugar las células (infectadas con el sobrenadante adenoviral) en un gradiente preparado con diferentes concentraciones de CsCl a 35000 rpm a 10ºC durante 2 h (ultracentrífuga Beckman L8-55M). El contenido celular se distribuye en diferentes bandas en función de su densidad, de manera que podemos extraer del tubo, mediante una punción, la fracción que contiene el virus purificado libre de las cápsides (que poseen otra densidad). Finalmente, la purificación de la fracción recogida se realizó utilizando columnas PD10 (Amershan Pharmacia), se alicuotan las fracciones purificadas para testarlas y se conservan a -70ºC glicerinadas (1% de glicerol al 99%). La cuantificación del adenovirus purificado se determinó midiendo la A260 nm del ADN viral de las fracciones obtenidas (lisadas con SDS 5% para obtener el ácido nucleico), de manera que 1 unidad de A260 nm= 1012 partículas virales/ ml. A partir del volumen de

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ fracción de sobrenadante recogido, obtenemos la concentración del vector adenoviral como el número de partículas virales a las que exponemos cada célula: MOI (multiplicidad de infección). 3.4 DISEÑO Y PRODUCCIÓN DE VECTORES RETROVIRALES Para la construcción del vector retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP se utilizó el esqueleto del vector LZRS (Kinsella TM y cols., 1996; Yang S y cols. 1999) modificado en el Departamento de Biomedicina Epitelial del Ciemat, Madrid (Larcher F y cols., 2001). El ADNc del mutante V12 del oncogén Harvey-ras murino (Hras) se obtuvo mediante doble digestión enzimática con las enzimas de restricción Bam HI y Xho I (Roche, Viena, Austria), del plásmido pCDNA3 (5.4 Kb). A continuación esta secuencia del Hras V12 (1 Kb) fue clonada en los sitios de restricción Bam HI / Xho I del vector pLZR-IRES-GFP (14 Kb). De este modo, el ADNc del mutante V12 del Hras murino se coexpresó con GFP bajo el control de la secuencia IRES en un vector bicistrónico. Los retrovirus defectivos fueron generados mediante transfección transitoria de la línea celular 293T (ATCC) con el plásmido empaquetador correspondiente como se explicó más detalladamente en el apartado 3.2.7. 3.5 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO El protocolo de extracción de ADN genómico es, básicamente, el descrito por Laird PW y cols., 1991. Para proceder al genotipado de un ratón se parte de un pequeño fragmento de su cola. Para extraerlo de células en cultivo, se despegan del soporte con tripsina, se lavan en PBS, y se inicia el protocolo a partir del sedimento celular. En el caso de tumores subcutáneos, se inicia el protocolo tras su extracción y lavados en PBS. El protocolo consiste, brevemente: digestión en 700 µl de tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM pH 8.5, EDTA 5 mM, SDS 0.2%, NaCl 200 mM y proteinasa K 100 µg/ml) a 55ºC toda la noche en agitación. Precipitar el ADN con isopropanol (proporción 1:1) y lavar en etanol 70 % para eliminar sales residuales. Dejar secar el ADN manteniendo el tubo abierto y finalmente resuspenderlo en 100 µl de tampón TE (Tris HCl 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM pH 8). Determinar la concentración y calidad de ADN extraído mediante las medidas de A260 y A280 nm en un espectrofotómetro.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ Para la reacción de PCR en el genotipado, descrita en el apartado 3.1, se utiliza como molde 1 µl del ADN genómico extraído. Para el análisis de ADN a partir de células y tumores, se requiere una determinación más rigurosa de los µg de ADN necesarios para la realización del Southern blot, como se describirá en el siguiente apartado. 3.6 DISEÑO Y PRODUCCIÓN DE UNA SONDA PARA LA DETECCIÓN DEL EXÓN 3 DEL VEGF MEDIANTE EL ANÁLISIS POR SOUTHERN BLOT Se diseñó una sonda sobre la secuencia de ADN genómico del VEGF164 que cubriese una región de tamaño variable, en función de la presencia o no del exón 3, al digerirlo con una enzima de restricción (Sac I, Roche) (Fig. 15). Los oligonucleótidos utilizados amplifican una región de 422 pb entre el sitio LoxP-3 y el exón 4 de la secuencia génica del VEGF: sonda VEGF 5’: 5’ CCAAAGAAAGACAGAACAAAGC 3’ sonda VEGF 3’: 5’ CCAAGAAATCTCCTGGGACC 3’

Las condiciones de reacción de la PCR (termociclador PTC-200 MJ Research, Inc) y el programa son: • ADN (200 ng)

5µl

• 4 minutos 94ºC

• Tampón 10X

2.5µl

• 1 minuto 94ºC

• dNTPs (2.5 mM)

2µl

• 1 minuto 60ºC

• Oligonucleótidos (10 µM)

0.5µl

• 1 minuto 72ºC

• MgCl2 (25 mM)

2.5µl

• 4 minutos 72ºC

• Enzima Taq polimerasa 5 u/µl (Invitrogen)

0.2µl

• H2O destilada

11.8 µl

x 35 ciclos

Los productos de PCR se resolvieron en geles de agarosa (D-1 low EEO, Pronadisa)/ TBE 1X (89 mM Tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8) al 1% con 1 µg/µl de bromuro de etidio. Se mezclaron 20 µl del producto de PCR con colorante (sacarosa 7%, azul de bromofenol 0.04% y azul de xilenocianol 0.004%) y se cargaron las muestras en los correspondientes pocillos, así como un marcador de peso molecular (marcador λBstEII, Roche). Se conecta el gel a una fuente electroforética a 70 V durante 2 horas y visualizamos las bandas de ADN en un transiluminador de luz ultravioleta. Se reamplificó 1 µl del producto de PCR correspondiente a la banda de 422 pb y se resolvió en un gel al 1% de agarosa más pura (Agarose D-1 Low EEO-G QT, Pronadisa).

Materiales y Métodos

53

___________________________________________________________________________ Visualizamos y cortamos la banda de ADN en un transiluminador y la purificamos mediante el Kit Gel Extraction QIAEX II (Quiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Obtenemos una concentración de la sonda VEGF164 de 8 ng ADN/µl. El resto del producto de PCR inicial se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega) siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Se utilizó la cepa de bacterias competentes XL1-blue con resistencia a ampicilina para la transformación. La selección de las colonias portadoras del vector con el inserto se realizó por color (operón lacZ). Los plásmidos se purificaron a pequeña escala (minipreps) mediante el método de lisis alcalina. Para conservar la sonda clonada se procedió a una purificación a mayor escala (maxiprep) mediante columnas de purificación (Kit GFII, Q-BioGene). Las bacterias del cultivo fresco se conservaron en 20% de glicerol 50% a -70ºC.

cI Sa 488 11

cI Sa 851 1 1

cI Sa 000 16

4 kb Sonda 422 pb

Exón 3

Exón 2

cI Sa 13 6 18

-

Exón 4

Lox 1

Lox 3

12000

14000

I

I

2 kb

0 00 16

Sa c

11 85 1

c Sa

S 18 ac 61 I 3

Ad-Cre

Sonda 422 pb

Exón 2

Exón 4

Figura 15. Detección de la ausencia o presencia del exón 3 del gen VEGF164. La sonda diseñada sobre ADN genómico cubre una región de 422 pb entre el sitio LoxP-3 y el exón 4 sobre la secuencia génica del VEGF164. En el Southern blot revelará una banda 2 Kb menor si el exón 3 ha desaparecido. Se relaciona además la localización de los diferentes sitios de restricción sobre la secuencia génica del VEGF murino para la enzima empleada.

3.7 SOUTHERN BLOT Para verificar, a nivel génico, la deleción del exón 3 del gen VEGF (debido a la recombinación en los sitios LoxP de este exón), se realizaron Southerns blots mediante transferencia alcalina. El DNA genómico, fue digerido con la enzima de restricción Sac I (Roche) y separado por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% en TBE 1X teñidos con

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ bromuro de etidio. Los ADNs (entre 10 y 20 ng por muestra) se desnaturalizaron en HCl 0.25 M y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-N+ , Amershan Pharmacia Biotech) en NaOH 0.4 N. Las membranas se hibridaron a 42ºC durante toda la noche con 1520 ng de sonda marcada radiactivamente con α32P-dCTP, utilizando el sistema de marcaje Rediprime II (Amershan Pharmacia Biotech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los filtros hibridados se lavaron en diferentes condiciones de astringencia (soluciones con distinta concentración de sal y a diferentes temperaturas): SSC 2X/ 0.1% SDS a RT durante 10 min, a continuación se realizaron dos lavados con SSC 0.2X/ 0.1% SDS a RT 10 min y a 42ºC 15 min respectivamente, por último un lavado en SSC 2X. Finalmente se procedió al revelado (Molecular Imager FX, BioRad) y adquisición de imágenes (programa de análisis de datos Quantity One, BioRad). 3.8 DETECCIÓN DE PROTEÍNA EN LOS MEDIOS CONDICIONADOS Para verificar, a nivel proteico, la pérdida del VEGF se determinó la concentración de este factor secretado al medio condicionado de los cultivos de clones de queratinocitos tratados con el Ad-Cre y seleccionados para su estudio. Se utilizó un kit comercial de ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante (Quantikine Mouse VEGF Immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). La isoforma murina reconocida por el kit es la VEGF164. Para realizar las medidas, se recogieron medios condicionados de 48 h de cada frasco de cultivo (n=3 por grupo) casi confluente y se conservaron a -70 ºC hasta su utilización. 3.9 CARIOTIPO ESPECTRAL MULTICOLOR Se realizó un cariotipo espectral multicolor (SKY-FISH) en 20 metafases correspondientes a un cultivo, en pase 38, de un clon de queratinocitos deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-). Las células han de estar sincronizadas respecto a la fase del ciclo celular. Este método se basa en la utilización de colorantes fluorescentes que se unen a regiones específicas de los cromosomas de ratón. A través de una serie de sondas conjugadas con estos colorantes y específicas de cada cromosoma, éstos exhiben características espectrales únicas. Este análisis se realizó en el Departamento de Citogenética Molecular del CNIO, Madrid.

Materiales y Métodos

55

___________________________________________________________________________ 3.10 ENSAYOS TUMORAL Y METASTÁSICO En ambos estudios se utilizaron, como animales de experimentación, ratones desnudos hembras de 6 semanas de edad (nu/nu, modelo de animal inmunodeficiente, Nehls M y cols., 1994). Como control para la formación de tumores se transdujeron clones de queratinocitos VEGF-Lox P (MK VEGF WT) y deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-) con el vector retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP y el vector control pLZR-IRES-GFP. El clon de elección para todos los experimentos es el 42A8F5 para los MK VEGF -/-, clon 8 para los MK VEGF WT, clones 6D7 y 6C12 para los MK VEGF-/-Hras y clones 5A11 y 5C10 para los MK VEGF-Hras. Para los estudios de tumorigenicidad, igual número de MK VEGF -/- y MK VEGF WT, se inyectaron subcutáneamente en los flancos de los ratones (106 células resuspendidas en 100 µl de PBS / inyección). Así mismo, se inyectaron también ambos tipos celulares transducidos con el vector retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP y el vector control pLZR-IRESGFP. Cada tipo celular se inoculó en 6 ratones/experimento (los animales recibieron una inyección del mismo tipo celular en ambos flancos) y los experimentos se realizaron por duplicado. Los tumores se midieron periódicamente con un calibre, y el volumen tumoral se calculó mediante las fórmulas: ∏r3 si son esféricos y (longitud x anchura2)/2 si son irregulares (Lin AW y cols., 2001). Los animales se sacrificaron mediante intoxicación con CO2 y se procesaron los tumores (congelación a -80 ºC y fijación en formol 4% o etanol 70%) para los estudios de inmunofluorescencia en tejido, inmunohistoquímica e histología convencional descritos más adelante en el apartado 3.13. Para los ensayos de metástasis se inyectaron intravenosamente, por la vena de la cola de los animales, los mismos tipos celulares que en el estudio tumoral (5x105 células resuspendidas en 100 µl de PBS). Para evaluar la aparición y evolución de las metástasis en diferentes órganos, se sacrificaron los animales y se realizaron necropsias a distintos tiempos de los órganos críticos. Pulmones, hígado y cerebro se iluminaron con luz azul (λ 490 nm) para detectar metástasis fluorescentes bajo una lupa estereoscópica con un filtro para GFP (Olympus). Los órganos se diseccionaron y fijaron (etanol 70% o formol 4%) para su análisis mediante histología convencional e inmunohistoquímica.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ 3.10.1 Ensayo de permeabilidad vascular La permeabilidad vascular se analizó de acuerdo con lo descrito por Blázquez C y cols., 2003. A los animales del estudio tumoral (ver apartado 3.10) se les inyectó el colorante azul de Evans (en PBS 1% 100 µl/ratón) a través de la vena de la cola. A continuación se sacrificaron y extrajeron los tumores. La visualización del colorante en los tejidos del animal es inmediata a simple vista. 3.11 INCORPORACIÓN DE BrdU IN VIVO Para determinar el índice de proliferación celular en un tejido o tumor del animal, se midió el grado de incorporación de BrdU mediante su inyección intraperitoneal en los animales sujetos al estudio (0.1 mg de BrdU 10 mg/ml por gramo de peso del animal en 0.9% NaCl). Los animales se sacrificaron 2 h después de la inyección, los tejidos u órganos se fijaron en formaldehído 4% en PBS y se incluyeron en parafina. Para detectar la incorporación de BrdU, los cortes posteriores de tejido se desparafinan y pretratan in HCl 1N durante 1 h a 37ºC, así se favorece la desnaturalización del ADN y se detecta mejor la molécula de BrdU incorporada en el mismo. A continuación se procede a los estudios convencionales de histología e inmunohistoquímica descritos más adelante en el apartado 3.13. 3.12 TRASPLANTES DE EQUIVALENTES CUTÁNEOS En estos estudios se utilizaron, como animales de experimentación, ratones desnudos hembras de 6 semanas de edad. Los trasplantes se realizaron en las condiciones de esterilidad requeridas para una cirugía de este tipo en animales de experimentación. Se empleó un protocolo de anestesia disociativo, seguro, eficaz y reversible inducido por una combinación de sedantes: 20 µl/ratón de medetomidina 1mg/10 ml (Pfizer) y 50 µl/ratón de ketamina (Rliône Mérieux). Como agente reversor de los anestésicos se utilizó 10 µl/ratón de atipamezol 5mg/ml (Pfizer). Para hacer los geles de fibrina se utilizó fibrinógeno procedente del crioprecipitado del plasma de la sangre de cerdo (Meana A y cols. 1998). El plasma fue proporcionado por la Unidad de Medicina y Cirugía Experimental del Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid) y fue congelado a -80ºC durante al menos 2 h, y descongelado a 4ºC para

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ obtener el crioprecipitado. Éste se centrifuga a 3500 rpm durante 15 min a 4ºC, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 10 ml de NaCl 0.9%. Antes de utilizarlo, se incuba a 37ºC para disolver completamente el fibrinógeno. El componente celular de los equivalentes dermo-epidérmicos, en los dos tipos de trasplante descritos a continuación, lo forman todas las combinaciones posibles de clones de queratinocitos y fibroblastos tanto VEGF -/- como VEGF WT. Los queratinocitos se transdujeron con el vector retroviral pLZR-IRES-GFP, para la detección y seguimiento de las células en cultivo y de los trasplantes en los animales. Éstos se detectan bajo una lupa con filtro para la proteína GFP (luz azul λ 490) nm). El clon de elección para todos los experimentos es el 42A8F5 para los MK VEGF -/-, clon 8 para los MK VEGF WT y clon B7 para los fibroblastos sin el VEGF (MF VEGF -/-).

Combinaciones de clones de queratinocitos y fibroblastos de ratón trasplantados MK VEGF -/- + MF VEGF -/- (queratinocitos ratón clon 42A8F5 + fibroblastos ratón clon B7) MK VEGF WT + MF VEGF WT (queratinocitos ratón clon 8 + fibroblastos ratón) MK VEGF -/-

+ MF VEGF WT (queratinocitos ratón clon 42A8F5 + fibroblastos ratón)

MK VEGF WT + MF VEGF -/- (queratinocitos ratón clon 8 + fibroblastos ratón clon B7)

3.12.1 Trasplante en cámaras de silicona Cada combinación celular se trasplantó en 3 ratones y los experimentos se realizaron por duplicado. Tras anestesiar a los animales se realiza, en la parte dorsal, una incisión sobre la piel de 1 centímetro de diámetro sin penetrar en el fascículo muscular. Se retira la piel y en el lugar de la herida se implantan las dos piezas que forman la cámara de silicona (CRD culture chambers, Renner, Darmstadt, Germany) (Fig. 16). Se puede dar un punto de sutura para mayor sujeción si es necesario. Estas cámaras tienen un orificio en la parte superior por donde se inoculan las células embebidas en una matriz de fibrina.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ pieza superior de la cámara

pipeta mezcla de queratinocitos y fibroblastos piel

fascículo muscular pieza inferior de la cámara

Figura 16. Esquema representativo de la cámara de silicona. Se implanta quirúrgicamente en el dorso del animal y contendrá la mezcla de queratinocitos y fibroblastos de ratón inoculados con una pipeta en la pieza superior de la cámara. Modificado de Wang CK y cols., 2000.

A continuación se preparan las células a trasplantar según el método descrito por Wang CK y cols., 2000 con modificaciones. Los queratinocitos y fibroblastos en cultivo se despegan del soporte (Tripsina, Sigma), se cuentan en un hemocitómetro y ajustamos la densidad celular de manera que, tras centrifugar las células y desechar el sobrenadante, el sedimento celular total contenga 6x106 de células (se mezclan 3x106 de queratinocitos y 3x106 de fibroblastos). Mantenemos las células (en tubos Eppendorf de 1 ml) en hielo mientras preparamos la matriz de fibrina en la que se van a embeber para ser trasplantadas en la cámara de silicona. Para producir la matriz de fibrina, se añaden 700 µl de fibrinógeno (crioprecipitado) al sedimento que contiene 6x106 de células (resuspendidas en 100 µl de medio de cultivo). Inmediatamente después se le añade a la mezcla 11 IU de trombina bovina (Sigma) diluida en 1ml de Cl2Ca 0.025 mM (Sigma). La mezcla se inocula en el orificio superior de la cámara de silicona y rápidamente solidifica adquiriendo la consistencia de un gel (Fig. 16). Una semana después del trasplante, se anestesia a los animales y se retiran las cámaras para evitar la acumulación excesiva de fluidos en su interior y permitir que la piel se seque. Dos semanas tras el trasplante se sacrifican los animales (mediante intoxicación con CO2) y se procesan los trasplantes (congelación en OCT a -80ºC y fijación en formol 4% o etanol 70%) para estudios de inmunofluorescencia en tejido, inmunohistoquímica e histología convencional descritos más adelante en el apartado 3.13.

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ 3.12.2 Trasplante de cultivos organotípicos de queratinocitos de ratón El procedimiento es similar al descrito en el apartado anterior, las diferencias principales son el número de células a trasplantar y el molde para la preparación de los geles de fibrina, así como la metodología del trasplante. Cada combinación celular se trasplantó en 6 ratones y los experimentos se realizaron por duplicado. Con los animales anestesiados se realiza, en la parte dorsal, una incisión sobre la piel de 2-2.5 centímetros de diámetro sin penetrar en el músculo. Se retira la piel y en el lugar de la herida se implantará el gel. La piel retirada se desvitaliza mediante sucesivos procesos de congelación y descongelación (en nitrógeno líquido y en baño a 37ºC respectivamente), y constituirá el vendaje biológico para cubrir y proteger el sustituto cutáneo, una vez trasplantado, durante el tiempo de toma del trasplante. Para preparar los equivalentes dermo-epidérmicos, se despegan los cultivos de queratinocitos y fibroblastos (Tripsina, Sigma), se cuentan en un hemocitómetro y se ajusta la densidad celular a 12x106 de células resuspendidas en 4 ml de medio de cultivo (se mezclan 6x106 de queratinocitos y 6x106 de fibroblastos). Mantenemos las células en hielo mientras preparamos la matriz de fibrina. Se añade 1 ml de fibrinógeno (crioprecipitado) a los 4 ml de medio con 12x106 de células. Inmediatamente después se le añade a la mezcla 11 IU de trombina bovina (Sigma) diluida en 1ml de Cl2Ca 0.025 mM (Sigma), se siembra en placas de plástico de 6 pocillos y en pocos minutos solidifica. Con cada 5 ml de esta mezcla se preparan 2 geles de fibrina de 2.5 ml de volumen cada uno (un gel por pocillo). A continuación se despega el equivalente cutáneo de la superficie del pocillo y se trasplanta ortotópicamente a la herida generada en el ratón (Del Río M y cols., 2002). Se cubre con la piel desvitalizada que se había retirado para generar el lecho receptor del trasplante y se sutura (MERSILKR Seda Trenzada 5-0. Ethicon). Esta piel desvitalizada se desprenderá por sí sola a lo largo del proceso de toma del trasplante. Tras 6 semanas se sacrifican los animales y se procesan los trasplantes para los estudios histológicos descritos a continuación.

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___________________________________________________________________________ 3.13 PROCEDIMIENTOS HISTOLÓGICOS Se realizaron cortes histológicos de órganos y tejidos: 1. Fijados en formaldehído 4% en PBS o etanol 70% y embebidos en parafina. Las secciones de 5 µm fueron teñidas con H&E o procesadas para técnicas inmunohistoquímicas (ver siguiente apartado). 2. Congelados embebidos en OCT (Tissue-Tek). Las criosecciones de 8-10 µm se fijaron con acetona a 4ºC durante 10 minutos para técnicas de inmunofluorescencia (ver siguiente apartado). 3.13.1 Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia Para el análisis inmunohistoquímico, se desparafinaron los cortes y se preincubaron durante 30 minutos a RT con BSA 1%-HS 5%- PBS-Tritón 0.1% para bloquear uniones inespecíficas. Seguidamente, se incubaron con el correspondiente anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC y con el secundario durante 45 min a RT. Entre el paso de bloqueo y cada una de las incubaciones con los anticuerpos, se realizaron 3 lavados en PBSTritón 0.1% (PBS-Tween 0.1% para BrdU). La dilución correspondiente de cada anticuerpo se hizo en BSA 0.2%- HS 1%-PBS-Tritón 0.1% (PBS-Tween 0.1% para BrdU). Los

anticuerpos

primarios

utilizados

en

las

inmunohistoquímicas

e

inmunofluorescencias se detallan en la tabla. La elección de la especificidad del anticuerpo secundario se hace de acuerdo al origen del primario. Los anticuerpos secundarios empleados van conjugados con biotina, FITC o Texas-Red y se utilizaron a las diluciones 1:500, 1:500 y 1:50 respectivamente (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA). Anticuerpos primarios Especificidad

Origen

Dilución

Casa comercial o cedido por

CD31

monoclonal de ratón

1:100

Pharmingen (clon MEC13.3)

K5

policlonal de conejo

1:500fluoresc / 1:100inmunohistoquímica

Covance

K8

monoclonal de rata

1:10

SMA

monoclonal de ratón

1:300

Dra. A Alonso, Institute of Experimental Pathology, German Research Center, Heidelberg, Alemania (clon TROMA-1) Sigma (clon 1A4)

K10

monoclonal de ratón

1:75

Sigma (clon k8.6)

Materiales y Métodos

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___________________________________________________________________________ Anticuerpos primarios Especificidad

Origen

Dilución

Casa comercial o cedido por

Filagrina

policlonal de conejo

1:500

Covance

Loricrina

policlonal de conejo

1:1000

Covance

Vimentina

monoclonal de ratón

1:50

Sigma (clon LN-6)

GFP

policlonal de conejo

1:100

Molecular Probes

BrdU

monoclonal de ratón

1:5

Roche (clon 9318)

Ki67

monoclonal de conejo

1:200

Labvision

Se utilizó el anti-SMA para el estudio del proceso de maduración de los vasos sanguíneos en los tumores subcutáneos y en los trasplantes de piel. Los anticuerpos anti-K5, anti-K10, anti-filagrina y anti-loricrina para el estudio de maduración del epitelio en los trasplantes de piel. Los anticuerpos anti-K5 y anti-vimentina informan sobre la naturaleza epitelial o fibroblastoide de un tumor, anti-K8 como marcador de progresión tumoral. El estudio de incorporación de BrdU, como se explicó en el apartado 3.11, determina el grado de proliferación celular. También se utilizó anti-Ki67 como marcador de células proliferativas. La tinción con anti-GFP confirma la expresión de este marcador visualizada previamente en los tejidos (al iluminarlos con luz azul

λ 490 nm bajo una lupa

estereoscópica con un filtro para GFP). Las inmunohistoquímicas en las que la detección del anticuerpo primario se realizó mediante el sistema avidina-estreptavidina/peroxidasa, requieren, antes del bloqueo de uniones inespecíficas, la inactivación de la peroxidasa endógena mediante incubación con peróxido de hidrógeno/metanol (1:100) durante 10 minutos. Dicha detección se realizó utilizando el kit ABC (Avidin-Biotin Complex) Vectastain Elite (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) y para localizar los anticuerpos se añadió DAB (Vector Laboratories) como sustrato cromogénico para la peroxidasa. Esta reacción química se detiene con agua, controlando la intensidad de tinción bajo un microscopio óptico. Finalmente se realizó una contratinción de los núcleos celulares con hematoxilina suave. La maduración de la dermis en los trasplantes cutáneos se analizó por tinción con rojo Picrosirius de cortes histológicos desparafinados. Brevemente, se tiñen las secciones con el colorante rojo Picrosirius previamente preparado: 0.5 g de rojo Sirius F3B en 500 ml de solución acuosa saturada de ácido pícrico (1g/75 ml). A continuación se realizan dos lavados con ácido acético (5ml/1l H2O) y tres deshidrataciones en etanol 100%. Finalmente un lavado

Materiales y Métodos

62

___________________________________________________________________________ en xileno y se procede al montaje de las muestras. La observación de las mismas se realiza bajo un microscopio con luz polarizada, para lo cual se utiliza un filtro adecuado (Olympus). Las inmunofluorescencias se realizaron en cortes por congelación, tras la fijación del tejido con acetona fría, se incubaron con el anticuerpo primario y secundario durante 2h a RT (en el caso de las dobles inmunfluorescencias los dos anticuerpos primarios se incuban juntos e igualmente para los secundarios). Entre las incubaciones se realizaron 3 lavados con PBS y finalmente se montaron con Mowiol (Hoechst) al que se le añadió en proporción 1:40 el colorante nuclear DAPI (20 µg/ml), para detectar los ácidos nucleicos. La visualización se realizó en un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axiophot). Para la captura de imágenes se utilizó una cámara digital (Apogee) y el programa de análisis de datos Microimage (Olympus). Mediante este método, se determinó la densidad de vasos sanguíneos en los tumores y trasplantes de piel utilizando el anti-CD31 y anti-SMA. 3.14 ANÁLISIS ESTADÍSTICO El procesamiento y tratamiento estadístico de los datos se han realizado utilizando los programas informáticos Excel (Microsft Office 2003, Microsoft Corporation) y Statgraphic Plus (Maugistics Inc., Rockville, MD, EEUU). Los datos se han representado como la media aritmética ± desviación estándar de cada muestra. Por las características de las poblaciones a comparar, el análisis de datos respecto a la significación de las diferencias entre los grupos fue determinada mediante el estadístico t de Student. Se han considerado diferencias estadísticamente significativas aquellas con p < 0.05.

4. RESULTADOS

En lo s c a mp o s d e la o b se r va c ió n, e l a za r no fa vo r e c e s ino a lo s e sp ír it us p r ep a r ad os LO UI S P AS TEUR

Resultados

65

___________________________________________________________________________ 4.1 OBTENCIÓN DE LÍNEAS CELULARES DE QUERATINOCITOS DE RATÓN VEGF-LoxP Y VEGF -/4.1.1 Modelo de inmortalización del cultivo de queratinocitos de ratón El cultivo primario de queratinocitos humanos y de ratón se encuentra muy estandarizado desde hace muchos años (Rheinwald JG y Green H, 1975; Hennings H y cols., 1980). Sin embargo, el cultivo serial a largo plazo (long term) de queratinocitos de ratón presenta serias dificultades, a pesar de que algunos trabajos describen diferentes métodos tanto para mantener el cultivo de estas células más allá de dos subcultivos, como para tratar de ensamblar un cultivo organotípico (Hager B y cols., 1999; Caldelari R y cols., 2000). El estudio de genes y su función, que en ocasiones, en modelos animales presenta ciertas limitaciones, generalmente puede solventarse in vitro mediante las técnicas de cultivos celulares. En el caso de estudios en piel de ratón, la dificultad estriba en la necesidad de realizar cultivos primarios para cada experimento, pues como ya se ha mencionado, poseen un tiempo de vida y posibilidad de expansión limitados. Entre las dificultades que presenta el cultivo primario de queratinocitos de piel de ratón se encuentran: 1) La dificultad per se de la propia metodología, pues son células que se diferencian por Ca2+ y que, por tanto, necesitan un medio de cultivo cuya concentración en este catión no exceda unos límites normalmente insuficientes para otros tipos celulares. Su crecimiento sobre una feeder layer, que proporcione sustrato y factores de crecimiento al cultivo como en el caso de los queratinocitos humanos, es controvertido. Además, se hace necesario llevar un cultivo de fibroblastos en paralelo para la producción de medio condicionado. En nuestro modelo, hemos comprobado que las células se benefician de este aporte. Por tanto, es necesario trabajar valorando y comprobando en el cultivo, constantemente, los beneficios y riesgos de cada variable. 2) La preparación de estos cultivos consume mucho tiempo tanto por el procedimiento de extracción de la piel de los ratones e individualización de las células (ver apartado 3.2 de “Materiales y Métodos”), como por los requerimientos de medios especiales y sustratos para su cultivo anteriormente descritos. 3) Los cultivos de queratinocitos de ratón no se subcultivan, es decir, poseen un tiempo de vida muy limitado. Esto implica la necesidad de realizar todo el proceso cada vez que se necesitan células para realizar un experimento.

Resultados

66

___________________________________________________________________________ 4) Las camadas de los ratones homocigotos VEGF-LoxP son muy reducidas, se obtienen 2 ó 3 ratones en cada parto. Considerando que, con el método descrito, se obtienen 3x106 de queratinocitos por ratón (en condiciones óptimas), esto supone una dificultad añadida a la hora de diseñar experimentos, pues hay que disponer de bastantes cruces para obtener un número considerable de animales, y por tanto de células, que nos permitan realizar los experimentos rigurosamente. En este trabajo, se han introducido variaciones respecto al método descrito por Hennings para optimizar, no tanto el rendimiento en la extracción de queratinocitos, sino para prolongar en el tiempo el cultivo y la expansión de estas células. Las estrategias empleadas, básicamente, se han basado en variaciones sutiles en la concentración de Ca2+ en momentos críticos y de estrés para el cultivo celular, y en el empleo de diferentes sustratos y medios más suplementados para proporcionar a las células un ambiente más enriquecido en factores y nutrientes. En nuestro protocolo proporcionamos, desde el primer momento, a los queratinocitos primarios de ratón un sustrato celular de fibroblastos de ratón o feeder layer, mitóticamente inertes y metabólicamente activos debido a un tratamiento de irradiación. También enriquecemos los medios de siembra y crecimiento con factores normalmente descritos para el cultivo de queratinocitos humanos. Los diferentes procesos de adhesión y proliferación se han realizado a concentraciones de Ca2+ diferentes y óptimas para cada proceso. De este modo, se ha logrado realizar subcultivos seriados de estas células, de una manera cada vez más sistemática y estandarizada, hasta lograr: 1) un crecimiento de las mismas independiente de la necesidad del sustrato y del suministro de medio condicionado (proporcionado por un cultivo de fibroblastos de ratón en paralelo), 2) expansiones celulares que permitan realizar diferentes experimentos celulares complejos para no sólo la caracterización de estas células como presunta línea celular, sino para introducir variaciones tales como la pérdida de un gen de interés, en nuestro caso el VEGF, 3) generar una herramienta potencial para ensayos ex vivo sobre aspectos fisiológicos o patológicos de la biología cutánea.

Resultados

67

___________________________________________________________________________ 4.1.2 Aislamiento de las líneas celulares de queratinocitos de ratón VEGF-LoxP y VEGF -/En nuestro protocolo, disgregamos las células de la piel de ratones neonatos VEGFLoxP mediante tratamiento enzimático y mecánico. El cultivo de los queratinocitos se inició tal y como se describió en el apartado 3.2 de “Materiales y Métodos”. Al iniciar los primeros subcultivos, la células sufrieron una crisis/proceso de senescencia, en la que muchos queratinocitos

exhibieron

características

morfológicas

aberrantes:

tamaño

mayor,

aplanamiento y finalmente se despegaron del soporte. Sin embargo, algunas células parecieron resistir este proceso, conservando fundamentalmente su tamaño original. Estos queratinocitos resistieron varios pases sin mostrar nunca signos de senescencia. Finalmente, se obtuvieron varios subcultivos sucesivos en los que la población celular había sobrevivido al período de crisis y continuaba exhibiendo características propias de un cultivo de queratinocitos primarios de ratón (Fig. 17). Inicialmente, las células crecieron despacio, y no fue hasta el quinto subcultivo cuando la densidad celular nos permitió congelar parte del cultivo, a partir del pase 8 se hizo posible, tanto la criopreservación como la amplificación sistemática, facilitándose ésta sustancialmente por la independencia de varios factores: la concentración de Ca2+ en el medio para detener la tripsinización, del sustrato (feeder layer) y del medio condicionado por fibroblastos, así como por una tasa de crecimiento estable. La viabilidad postcongelación de las células a partir del subcultivo 10 fue mayor del 90%, un valor característico de líneas celulares estables. Los estudios realizados por otros autores concluyen que la viabilidad celular consecutiva a la descongelación constituye un rasgo particular de cada línea celular, el eflujo de agua es la clave en estos procesos y existen varios factores que la afectan, de ahí que los resultados sean diferentes y carezca de interés su comparación con la viabilidad postcongelación en otras líneas celulares (McAteer JA y Davis J, 1994). Hasta la fecha se han realizado 67 pases en cultivo. Los queratinocitos en todo momento no han dejado de exhibir características morfológicas o proliferativas que no fuesen típicas de un cultivo de este tipo celular en baja concentración de Ca2+, a saber, fenotipo epitelial, crecimiento individual (no formación de colonias) y bordes celulares refringentes bajo el microscopio óptico correspondientes a un estado no diferenciado (Fig. 17A). Para determinar si los queratinocitos crecían en condiciones óptimas y expresaban los marcadores adecuados, se realizaron curvas de crecimiento en las que se observó un

Resultados

68

___________________________________________________________________________ modesto incremento en la tasa proliferativa respecto al control (queratinocitos primarios) (ver Fig. 21 del apartado 4.2.1). Por otro lado, se observó que todas las células del cultivo expresaban las queratinas K5 y K14, características del queratinocito proliferativo del estrato basal (Fig. 17B). Además, la inducción de diferenciación en la células mediante el incremento en la concentración de Ca2+ indujo la expresión de marcadores de diferenciación tempranos como las queratinas K1 y K10 (ver Fig. 22 del apartado 4.2.2). A

B

K5/DAPI

x10 K14

Figura 17. Características morfológicas y proliferativas de los queratinocitos in vitro. A: en cultivo con baja concentración de Ca2+ el queratinocito exhibe un fenotipo epitelial, crecimiento individual y bordes celulares refringentes al microscopio óptico. B: tinción de inmunofluorescencia frente K5 e inmunohistoquímica frente a K14, queratinas características de queratinocitos proliferativos. Se utilizó DAPI como colorante nuclear en las inmunofluorescencias.

Para la eliminación génica del VEGF, el tratamiento de las células se hizo mediante transferencia génica transitoria con un adenovirus portador de la recombinasa Cre. Esta recombinasa de 38 KDa aislada del bacteriofago P1, no está presente en células eucarióticas. Se espera que Cre, a través del reconocimiento de la secuencias específicas LoxP que flanquean el exón 3 del VEGF en los queratinocitos, catalice una recombinación conservada entre estas dos secuencias, lo que conducirá a la pérdida del gen codificante y por tanto, de expresión de este factor (ver Fig. 13 apartado 3.1 de “Materiales y Métodos”). Para introducir esta modificación genética en las células, se ha utilizado un vector de transferencia génica no integrativo como es el vector adenoviral, pues para nuestro propósito sólo es necesaria la presencia de la recombinasa durante un tiempo limitado para que realice la modificación genética de interés (pérdida del VEGF). La expresión proteica resultado de una transferencia génica adenoviral se mantiene durante 24-72 h, aunque puede variar en función de la proliferación de las células transducidas.

Resultados

69

___________________________________________________________________________ Para optimizar la infección de los queratinocitos de ratón, estos se incubaron con el Ad-Cre a distintas MOIs y durante períodos de tiempo variable. Las condiciones óptimas para la infección de estas células con este adenovirus consistieron en una MOI de 5000 del sobrenadante viral durante 2 h. El alto contenido en Ca2+ (1.6 mM) del sobrenadante adenoviral (ver apartados 3.2.2 y 3.3 de “Materiales y Métodos”) favorece la expresión proteica a través de la activación del promotor del citomegalovirus (CMV) de este vector adenoviral. En nuestro laboratorio hemos observado que en estas condiciones de diferenciación celular, la infección y excisión por la recombinasa Cre ocurren prácticamente de manera simultánea y la eficacia de transducción es elevada. La detección de esta proteína en las células VEGF-LoxP in vitro, se realizó mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para ella y localizamos su presencia en el núcleo de las células infectadas (Fig. 18). La medida de la eficiencia de la infección, de las condiciones ensayadas, vino determinada por la densidad de fluorescencia en el canal verde del microscopio de fluorescencia (debido a la tinción FITC para la detección nuclear de Cre) (ver apartado 3.2.6 de “Materiales y Métodos”). Cabe esperar que la detección de esta proteína en los queratinocitos tratados, conlleve la ejecución de su función, para ello comprobamos la ausencia del VEGF a nivel génico y de expresión (ver más adelante apartados 4.1.4 y 4.1.5).

x10

DAPI

Cre

Figura 18. Infección adenoviral de los queratinocitos con la recombinasa Cre. Tinción de inmunofluorescencia para la detección de Cre en el núcleo de las células infectadas. Se utilizó DAPI como colorante nuclear.

Resultados

70

___________________________________________________________________________ 4.1.3 Clonaje de los queratinocitos deficientes en VEGF y WT Para asegurar que todas las células, bien deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-), bien WT (MK VEGF WT), constituyen una población celular homogénea, y por tanto, obtener datos rigurosos sobre la ausencia o presencia de este factor en el queratinocito de ratón, se hace necesario trabajar con poblaciones clonales. Además, la detección de la recombinasa Cre al microscopio de fluorescencia, no nos permite asegurar que la totalidad de la población celular esté infectada. Cabe mencionar que el clonaje de queratinocitos primarios de ratón, a diferencia de los humanos, sólo puede realizarse en una línea celular inmortalizada debido a las dificultades que presenta su cultivo como se ha comentado anteriormente (ver apartado 4.1.1). Se clonaron mediante dilución límite, tanto los MK VEGF WT (procedentes del cultivo primario de la piel de ratones VEGF-LoxP), como los MK VEGF -/- (procedentes del tratamiento con la recombinasa Cre del cultivo primario de la piel de dichos ratones). La probabilidad de obtener clones celulares es mayor si el número de células de partida es bajo (ver apartado 3.2.3 de “Materiales y Métodos”), y pese a esto, al igual que otros métodos de aislamiento de clones celulares, esta técnica no garantiza la procedencia monoclonal de las colonias obtenidas. Para asegurar un mayor rendimiento, se realizó un segundo ciclo de clonaje a partir de los clones obtenidos. Inicialmente, las poblaciones clonales en cultivo, tardaron entre 13 y 20 días en cubrir completamente el pocillo. El cultivo de cada uno de los clones se fue amplificando hasta que se hizo posible transferirlo a soportes de mayor superficie y, por tanto, iniciar la escalada a frascos de cultivo (flasks) donde disponer de un mayor número de células para los estudios a nivel génico y proteico (ver siguientes apartados). El tiempo medio de obtención de un número suficiente de células para realizar dichos estudios fue de dos meses para cada población clonal. De los resultados del subclonaje, se obtuvieron en total 192 clones de MK VEGF -/-, de los que se analizaron 40 y finalmente en 12 clones se confirmó la pérdida del VEGF en los ensayos a nivel génico y proteico. 4.1.4 Recombinación homóloga del exón 3 del VEGF en los clones de queratinocitos VEGF-LoxP in vitro La pérdida del gen VEGF en las células tratadas con la recombinasa Cre se confirmó mediante Southern blot. La sonda utilizada para la hibridación, comprende una región (entre el sitio LoxP-3 y el exón 4 de la secuencia génica del VEGF) que desaparece si tiene lugar la

Resultados

71

___________________________________________________________________________ excisión del exón 3 (ver Fig. 15 apartado 3.6 de “Materiales y Métodos”). En la Fig. 19 se muestran los resultados de varios Southern blots representativos, confirmando la presencia de una banda de 2 Kb en las células tratadas con el Ad-Cre y una banda de 4 Kb en las células que no han perdido el VEGF.

VEGF WT

4 Kb

∆ VEGF clon 8

4 Kb 2 Kb

clon 42A8F5

VEGF WT

∆ VEGF

4 Kb

∆ VEGF

Figura 19. Análisis de Southern blot de los clones obtenidos de MK VEGF -/- y MK VEGF WT. Se muestran varios resultados representativos. La banda de 4 Kb indica la presencia del gen VEGF en los queratinocitos y la de 2 Kb la ausencia del mismo. Se indica el nombre de los clones MK VEGF -/- y MK VEGF WT que seleccionaremos para análisis posteriores.

4.1.5 Pérdida de la expresión del VEGF164 por clones de queratinocitos modificados genéticamente Los niveles del VEGF secretados por los queratinocitos se midieron mediante un ELISA específico para esta proteína, en medios condicionados de 48 h, de células infectadas con el Ad-Cre y WT. No se detectó VEGF en los sobrenadantes de las células infectadas, mientras que en las WT se detectaron unos niveles similares a los controles (VEGF= 540 ± 18.7 pg/ml / 75 cm2/ 48 h vs 653.9 ± 12.3 pg/ml / 75 cm2/ 48 h) y de hasta 20 veces superiores respecto a las poblaciones policlonales con pérdida parcial del VEGF procedentes del primer clonaje (VEGF= 540 ± 18.7 pg/ml / 75 cm2/ 48 h vs 45.4 ± 1.2 pg/ml / 75 cm2/ 48 h) (Fig. 20). Por tanto, los clones de células tratados con el Ad-Cre (y confirmado por Southern blot) no secretan cantidades detectables del VEGF164. A partir de este momento, seleccionamos un clon de cada tipo celular para los estudios posteriores. El clon de elección para los MK VEGF -/- fue el 42A8F5 y para los MK VEGF WT el clon 8.

m V E G F (p g /m l) Las flechas indican los clones de queratinocitos (MK VEGF -/- y MK VEGF WT) seleccionados para los análisis posteriores.

Figura 20. Detección del VEGF mediante ELISA en los clones obtenidos de MK VEGF -/- y MK VEGF WT. Se muestra un ensayo representativo. L

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

cl o cl n 2 o 4 c l n 24 E1 2 o c n A l o 24 8 cl n 14 H 8 o cl n 8 7G on cl 5A o 1 c l n 24 1 o E c l n 24 8 o cl n 2 A6 o 4 cl n 5 F5 C o c l n 241 0 o cl n 1 A8G o 4 c n 7 5 l o 24 H cl n 1 F8 o c l n 24 5 D o 4 cl n 1 F6 o 4 M n 1 11C K 4 c l C T R1 1 B o c n L l o 24 c l n 1 A7 o 4 c l n 1 41 0 E o cl n 1 6C o 4 cl n 2 6F o 4 cl n 2 C8 4 o cl n 2 G6 o 4 c l n 2 4C 8 on G cl 24 5 o A cl n 2 8A o 4 6 c l n 24H 5 on A c l 24 8C on A 10 cl 24 8E 8 on A8 cl 24 F 8 o A m n 2 8E e 4 7 c l d io A 8 F o c 5 n c l 24 u lti o A v cl n 2 8D o o 4 9 cl n 2 A8C o 4 cl n 2 A8D5 o 4 6 n cl 24 A8F o A 1 cl n 2 8E 1 o 4 1 c n A 2 l o 24 8B c l n 2 A 8 A1 2 o 4 c l n 24A8G 11 on A 7 cl 24 8F o A 1 cl n 6C 8G 2 on 1 1 cl 6D 2 0 o n 7 B7

___________________________________________________________________________ Resultados

72

Resultados

73

___________________________________________________________________________ 4.2 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS LÍNEAS CELULARES DE QUERATINOCITOS DE RATÓN VEGF-LoxP Y VEGF -/4.2.1 Análisis de la capacidad proliferativa Para analizar in vitro la capacidad proliferativa de los clones de MK VEGF WT y MK VEGF -/-, respecto a queratinocitos primarios (control), se realizaron curvas de proliferación en estas células. Se plaquearon un total de 105 células de cada tipo y se realizaron contajes celulares diarios. Tanto los MK VEGF WT, como los MK VEGF -/- no mostraron diferencias en la velocidad de crecimiento, sin embargo, sí se observó un moderado incremento, a partir del segundo día, en la tasa de crecimiento de ambos clones respecto a los queratinocitos primarios utilizados como control (Fig. 21).

nº de células

300000 250000 200000 150000 100000 50000 0

1

2

3

días post-plaqueo MK VEGF WT

MKs primarios

MKs VEGF -/-

Figura 21. Curvas de proliferación de los queratinocitos de ratón. Se utilizó un cultivo de queratinocitos primarios como control. Los MK VEGF -/- corresponden al clon 24A8F5 y los MK VEGF WT al clon 8.

Este resultado indica que el leve incremento en la tasa proliferativa de los queratinocitos sometidos a las condiciones de un cultivo de larga duración, se debe a su adaptación a dichas condiciones, exhibiendo pues un comportamiento similar al de una línea celular. En este sentido, estudios realizados en queratinocitos humanos han demostrado un incremento en las proteínas que controlan el ciclo celular durante la inmortalización espontánea de estas células, si bien nosotros no hemos realizado este tipo de estudios (Rice RH y cols., 1993). Los miembros de la familia del VEGF no están implicados en procesos directamente relacionados con el ciclo celular. Sin embargo, estudios recientes describen un papel estimulador del VEGF para la proliferación in vitro de queratinocitos epidérmicos humanos (Wilgus TA y cols., 2005). Nuestros resultados en los queratinocitos de ratón indican que la pérdida del VEGF no produce alteraciones proliferativas in vitro.

Resultados

74

___________________________________________________________________________ 4.2.2 Análisis de la capacidad de diferenciación El aumento de la concentración de iones Ca2+ en el medio de crecimiento, de aproximadamente 0.03-0.07 mM a 1.2 mM, es un estímulo diferenciador ampliamente caracterizado en queratinocitos (Hennings H y cols., 1980; Jensen PK y cols., 1990). En respuesta a este aumento, las células establecen contactos célula a célula debido al ensamblaje de uniones adherentes para formar desmosomas (Garrod D y cols., 1996; Kowalczyk AP y cols., 1996), detienen su proliferación y estratifican para comenzar a expresar marcadores de diferenciación tempranos como las queratinas K1 y K10 (Hennings H y cols., 1980; Stanley JR y Yuspa SH, 1983; Yuspa SH y cols., 1989). Para comprobar si la expresión de marcadores de diferenciación tempranos ocurría en los queratinocitos de ratón sometidos a cultivo de larga duración (clones seleccionados), y si la presencia o ausencia del VEGF alteraba este proceso, las células se mantuvieron en alto Ca2+ durante 24 ó 72 h. Se comprobó que, tanto los cultivos de larga duración como los queratinocitos primarios,

expresaban

ambos

marcadores

en

condiciones

de

diferenciación

e

independientemente de la pérdida del VEGF (Fig. 22). MK primarios

MK VEGF WT

24 h

MK VEGF -/-

72 h

K1 K10 Dapi

x25

Figura 22. Capacidad de diferenciación in vitro de los queratinocitos de ratón. Análisis, mediante inmunofluorescencia, de la expresión de marcadores de diferenciación tempranos (queratinas K1en verde y K10 en rojo) ante un estímulo de alto Ca2+ en el medio de cultivo. Las imágenes muestran una superposición de las inmunofluorescencias con cada marcador y la tinción nuclear con DAPI. Tras 24 h de estímulo, los MK VEGF -/- no han iniciado el proceso de diferenciación. Tras 72 h los dos clones de queratinocitos expresaron ambos marcadores, independientemente de la presencia o ausencia del VEGF. El cultivo de queratinocitos primarios utilizado como control a las 24 h expresó ambos marcadores y su ausencia a las 72 h se debió a la pérdida casi completa de las células adheridas por el exceso de Ca2+.

Resultados

75

___________________________________________________________________________ Los cultivos mantenidos en bajo Ca2+ no expresaron ninguno de estos marcadores. Por tanto, los queratinocitos de ratón en cultivo de larga duración mantienen su capacidad de diferenciación in vitro. La pérdida del VEGF no produce alteraciones en este proceso. 4.2.3 Análisis citogenético Se realizó un cariotipo espectral multicolor (SKY) para identificar las previsibles alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales, que poseen las células que han adoptado características de línea celular (Goldaber ML y cols., 1990; Pandis N y cols., 1993; Rice RH y cols., 1993; Han K y cols., 1994). El estudio se llevó a cabo en el clon seleccionado de MK VEGF -/- (42A8F5), dado que uno de los objetivos de este trabajo consiste en estudiar el proceso de regeneración tisular en ausencia de este factor vascular. Sin embargo, si bien no hemos estudiado la población parental MK VEGF WT (VEGF-LoxP) es previsible que también presenten alteraciones, al tratarse igualmente de una línea celular. Por otra parte, la posibilidad de que la recombinasa Cre cause anomalías citogenéticas se ha descrito en células de mamíferos, donde la genotoxicidad es debida al sistema de modificación genética utilizado (transducción retroviral) (Loonstra A y cols., 2001; Silver D y cols., 2001). En nuestro sistema, el empleo de un vector de transferencia génica no integrativo (vector adenoviral), limita la duración e intensidad de la expresión de Cre a la necesaria para la deleción génica (ver apartado 4.1.2), y por tanto, elimina la posibilidad de aberraciones cromosómicas mediadas por una sobreexpresión contínua de esta recombinasa. Se examinaron 20 metafases correspondientes a un cultivo de dicho clon en pase 38. La visualización del espectro de emisión de cada cromosoma, tras la hibridación in situ con fluorescencia, reveló en todas las metafases analizadas un número variable de cromosomas en el rango triploide-tetraploide (63-82 cromosomas; en ratón 2n=40) (Fig. 23).

Resultados

76

___________________________________________________________________________

Figura 23. Análisis citogenético mediante cariotipo espectral multicolor. Se analizaron las metafases de un cultivo en pase 38 correspondiente al clon 24A8F5 de MK VEGF -/-. El número de cromosomas resultó variable en el rango 3n-4n.

En todas las metafases se encontraron alteraciones numéricas y estructurales, siendo clonales las fusiones centroméricas de los cromosomas 1 y 19, así como una translocación que afecta al cromosoma 8 y a un fragmento de pequeño tamaño cuyo origen más probable pueden ser los cromosomas 2 ó 10. Aunque no hemos investigado la estabilidad de estas aberraciones cromosómicas, la adquisición de anormalidades adicionales en pases posteriores ni identificado genes específicos implicados en conferir inmortalidad, no se ha descrito asociación alguna entre inmortalización y las alteraciones anteriormente descritas, así como su presencia en otras líneas celulares de queratinocitos de ratón inmortalizadas espontáneamente. Sí se han descrito frecuentes alteraciones aneuploides (normalmente mitosis hiperdiploides), en líneas celulares epidérmicas de ratón derivadas de tumores benignos (papilomas) y portadoras de un oncogén mutado (Aldaz CM y cols., 1988a). En cualquier caso, como se explicará en el apartado siguiente, las alteraciones tanto numéricas como estructurales descritas, no parecen estar asociadas con una conversión maligna de las células. 4.2.4 Propiedades tumorigénicas de las líneas celulares Para determinar si la inmortalización de las líneas celulares de MK VEGF WT y MK VEGF -/- (clones 8 y 24A8F5 respectivamente) podía asociarse a la aparición de un fenotipo transformado, se pretendió evaluar el crecimiento de tumores subcutáneos en ratones atímicos estudiando la tasa de crecimiento y el volumen tumoral. Cada tipo celular se inyectó en los 2 flancos de 6 animales y el experimento se realizó por duplicado. Se estudiaron un total de 24 animales y el seguimiento se realizó cada 5 días a partir del día de la inyección.

Resultados

77

___________________________________________________________________________ El estudio se mantuvo durante 8 semanas y durante este tiempo, no apareció ningún tumor en los ratones (Fig. 24). Por tanto, las líneas celulares de queratinocitos de ratón no tienen propiedades tumorigénicas independientemente de la presencia o ausencia del VEGF.

Genotipo

Tumorigenicidad

Histología

MK VEGF WT

0/6

no tumor

MK VEGF -/-

0/6

no tumor

A

B

Figura 24. Ensayo de tumorigenicidad. Las líneas celulares de queratinocitos de ratón no tienen propiedades tumorigénicas independientemente del VEGF. El estudio se mantuvo durante 56 días. A: MK VEGF WT; B: MK VEGF -/-.

Resultados

78

___________________________________________________________________________ 4.3 PAPEL FUNCIONAL DEL VEGF EN EL DESARROLLO TUMORAL Los resultados obtenidos indican que los clones de MK VEGF WT y MK VEGF -/presentan características propias de línea celular inmortalizada espontáneamente y no tumorigénica. Sin embargo, aunque se acepta que la mayor fuente del VEGF la constituyen las células tumorales, diversos estudios evidencian la diversidad de opiniones respecto a la contribución del VEGF producido por las células del estroma del tumor (donde el tipo celular predominante es el fibroblasto) (Hlatky L y cols., 1994; Ferrara N y cols., 1996b; ViloriaPetit A y cols., 2003; Meadows KN y cols., 2004; Rossiter H y cols., 2004; Dong J y cols., 2004). Además, si bien se han desarrollado estrategias para eliminar la expresión de una proteína específica en un tejido (de forma controlada en espacio y tiempo) (revisado por Lewandoski M, 2001), esta aproximación in vivo limita los estudios funcionales con el VEGF en la tumorigénesis cutánea y capacidad de metastatizar. El estudio de la ausencia de este factor in vivo es muy complejo, pues su deleción causa letalidad embrionaria (Carmeliet P y cols., 1996; Ferrara N y cols., 1996; Carmeliet P y cols., 1999), y en el modelo secuencial de desarrollo tumoral mediante carcinogénesis química tanto la progresión tumoral hacia estadios indiferenciados, así como la aparición de metástasis, es infrecuente. 4.3.1 Papel funcional del VEGF en el desarrollo tumoral El Hras es el oncogén crítico en la tumorigénesis en piel de ratón. Además se ha descrito que existe una correlación entre el grado de agresividad de estos tumores cutáneos y los niveles de Hras activado (Quintanilla M y cols., 1986). Nuestro propósito ha sido investigar el grado de implicación del VEGF en el desarrollo y la progresión tumoral. Para ello se ha estudiado el impacto de la deleción del VEGF en la capacidad de formar tumores, evaluando la tasa de crecimiento y el volumen tumoral de tumores subcutáneos en ratones atímicos, por clones de MK VEGF WT y MK VEGF -/- transducidos con el vector retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP y el vector control pLZR-IRES-GFP (clones 6D7 y 6C12 para los MK VEGF-/-Hras y 5A11 y 5C10 para los MK VEGF-Hras). Cada tipo celular se inyectó en los 2 flancos de 6 animales y el experimento se realizó por duplicado. Se estudiaron un total de 24 animales. El seguimiento se realizó mediante la representación gráfica del volumen tumoral (en mm3) cada 5 días a partir del día de la

Resultados

79

___________________________________________________________________________ inyección. El estudio se mantuvo durante 8 semanas, pues dado el volumen de determinados tumores fue preciso sacrificar a los animales. A

B

Genotipo

Tumorigenicidad

Histología 56 d

MK VEGF-Hras

6/6

carcinomas indiferenciados

MK VEGF -/- Hras

5/6

carcinomas indiferenciados

volumen tumor (mm3)

C

1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

b

b’

MK VEGF -/- Hras clon 6C12 MK VEGF WT Hras clon 5C10 MK VEGF WT Hras clon 5A11 MK VEGF -/- Hras clon 6D9

16

21

26

31

36

41

46

51

días post-inyección

Figura 25. Papel funcional del VEGF en la tumorigénesis y desarrollo tumoral. A: número y tipo de tumores según los clones celulares inoculados subcutáneamente. B: visión macroscópica de los tumores subcutáneos a los 56 días post-inyección, b: tumores derivados de los clones MK VEGF WT- Hras 5C10 y 5A11 (de izquierda a derecha), b’: tumores derivados de los clones MK VEGF -/- Hras 6C12 y 6D9 (de izquierda a derecha). C: representación gráfica del crecimiento tumoral en términos de volumen (en mm3) durante las 8 semanas de estudio.

Únicamente los queratinocitos transducidos con Hras desarrollaron tumores, independientemente de la presencia o ausencia del VEGF (Fig. 25A y B). Sin embargo, los tumores debidos a las células portadoras de dicho oncogén, pero deficientes en el VEGF (MK VEGF -/- Hras), mostraron retraso en su crecimiento, en términos de volumen, respecto a los MK VEGF-Hras (Fig. 25C). Inicialmente, hasta el día 16 post-inyección, prácticamente no hubo crecimiento tumoral detectable visualmente en ningún animal. A continuación, hasta el día 23 post-inyección, la tasa de crecimiento y el volumen de la masa tumoral fue similar en los tumores Hras, independientemente de la presencia o ausencia del VEGF. A partir de este momento, los tumores portadores del oncogén mutado y del factor angiogénico dispararon su

Resultados

80

___________________________________________________________________________ crecimiento respecto a los deficientes en el factor vascular. Por tanto, se puede decir que aunque la ausencia del VEGF no impide el desarrollo de tumores por queratinocitos portadores del Hras, su presencia acelera significativamente el crecimiento tumoral. Tras 8 semanas, al sacrificar los animales, extraer los tumores e iluminarlos con luz azul (λ 490 nm) bajo una lupa estereoscópica, comprobamos que la masa tumoral era fluorescente, y que por tanto, su origen se debía a las células inyectadas (portadoras del marcador GFP del transgén) (Fig. 27A). En los estudios histológicos posteriores se confirmó, igualmente, la presencia del marcador mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo dirigido contra la proteína GFP (Fig. 26). Así mismo, comprobamos que el tamaño de los tumores debidos a los MK VEGF -/- Hras era notablemente más pequeño que los tumores VEGF-Hras. Además de la diferencia de tamaño, una característica destacada, y observada únicamente en los tumores VEGF-Hras, fue su apariencia enrojecida, delatando la naturaleza fuertemente angiogénica de dichos tumores. A

B

C

GFP

H&E

Vimentina

A’

B’

C’

H&E

Vimentina

GFP

x10

56 d

Figura 26. Papel funcional del VEGF en la histopatología de tumores subcutáneos. Se muestran los resultados correspondientes a tumores de 56 días. Paneles superiores A, B y C corresponden a secciones histológicas de tumores VEGF-Hras. Paneles inferiores A’, B’ y C’ a secciones histológicas de tumores VEGF /- Hras. A y A’: tinción inmunohistoquímica frente a GFP. B y B’: tinción con H&E. C y C’: tinción inmunohistoquímica frente a vimentina. Nótese en los tumores VEGF-Hras teñidos con H&E (B) la presencia de lagunas sanguíneas y la expresión de vimentina en la inmunohistoquímica frente a este marcador (C). En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Resultados

81

___________________________________________________________________________ Los análisis histológicos revelaron que, en ambos casos, se trataba de tumores muy indiferenciados, sin signos de necrosis, aunque los tumores debidos a MK VEGF -/- Hras presentaban pequeñas áreas de diferenciación, que podría corresponder con su crecimiento retardado in vivo. Por otra parte, se realizaron análisis inmunohistoquímicos para detectar la presencia de determinados marcadores como la queratina K5, localizada en células epiteliales normalmente basales; K8, marcador de progresión y vimetina, proteína principal de los filamentos intermedios en células mesenquimales. Ambos tumores Hras dieron resultado negativo en la detección de las queratinas K5 y K8 y sólo los tumores debidos a MK VEGF /- Hras, presentaron un estroma más colagenoso aunque revelaron un estado de transición epitelio-mesénquima (prácticamente negativos para vimentina) hacia un estado menos indiferenciado. A

as s ra Hr H T -/W F G EGF E V rV or o RL um um T C T T

B 56 d

luz blanca y azul

4 Kb

VEGF WT

2 Kb

∆ VEGF

Figura 27. Detección del VEGF mediante análisis de Southern blot de los tumores subcutáneos. A: masa tumoral fluorescente debido a la presencia del transgén portador del marcador GFP. B: análisis mediante Southern blot de la presencia del VEGF en cultivos celulares reestablecidos a partir de cada tipo de tumor. La banda de 4 kb en las células procedentes de los tumores VEGF -/- Hras indica la aportación de VEGF por un tipo celular distinto al clon de queratinocitos VEGF -/- inyectado.

El significado funcional de la producción del VEGF por las células del estroma en un cáncer está sujeto a mucha controversia. Nuestros resultados indican que la ausencia del VEGF no impide el desarrollo de tumores por queratinocitos portadores del oncogén mutado Hras, si bien la presencia del factor angiogénico acelera el crecimiento tumoral debido al soporte vascular proporcionado. Entonces, se puede decir que la presencia del VEGF (de origen tumoral) per se, no es suficiente para que se desencadene el proceso tumoral estudiado en este modelo y que la contribución del VEGF por parte de las células transformadas no es determinante en un desarrollo tumoral forzado por la presencia del Hras mutado, posiblemente debido a que las células del estroma podrían ser una fuente del VEGF en el

Resultados

82

___________________________________________________________________________ caso de tumores deficientes en este factor. Aunque histológicamente los tumores observados no presentaban mucho estroma, la presencia del VEGF en los cultivos celulares reestablecidos a partir de los tumores VEGF-/-Hras, avala esta posibilidad (Fig. 27B). Como se comentará más adelante en la “Discusión”, estos resultados no coinciden plenamente con otros estudios similares realizados (Rossiter H y cols., 2004). 4.3.2 Análisis de la vasculatura tumoral Para evaluar la vascularización del tumor debe tenerse en cuenta que los vasos neoformados difícilmente pueden reconocerse con la tinción habitual H&E en un corte del tejido y deben utilizarse otros métodos de tinción que permitan discriminar entre vasos maduros y vasos formados de novo en el proceso de angiogénesis tumoral (Benjamin LE y cols., 1999; Kerbel RS y cols., 2000). Los tumores deficientes en el VEGF presentan un aspecto más pálido, lo que denota un aporte sanguíneo insuficiente, responsable posiblemente, del menor crecimiento respecto a los WT. Se realizó un análisis de la vasculatura tumoral tanto funcional como cuantitativo. Los ensayos de azul de Evans son indicativos de la permeabilidad de la vasculatura tumoral, y demostraron una severa reducción de la permeabilidad en los tumores deficientes en el VEGF (Fig. 28A). En el análisis histológico se observa que los tumores VEGF están muy vascularizados, con vasos de gran tamaño, sobretodo en la periferia del tumor (Fig. 26B). La detección de CD31 (antígeno endotelial) y SMA (marcador de células periendoteliales, indicador de la madurez vascular) en los tumores reveló diferencias en la densidad y tipo vascular: una considerable disminución de la neovascularización (tinción CD31) en los tumores carentes del VEGF respecto a los WT, y una mayor cantidad de vasos maduros (tinción SMA), es decir, de vasos preexistentes que favorecieron el crecimiento inicial del tumor. Por el contrario, en los tumores formados a expensas de queratinocitos con el VEGF, se detectó un incremento en el número de vasos lacunares, formando una red de vasos inmaduros (negativos para SMA), dilatados e irregulares, es decir, una organización característica de vasos en remodelación, concomitante con el incremento en la tasa de crecimiento de estos tumores (Fig. 28C). Por tanto, los tumores deficientes en el VEGF muestran, como era de esperar, una disminución de la neovasculatura (Fig. 28B).

Resultados

83

___________________________________________________________________________ A

B a

56 d

CD31

luz blanca

x25 SMA

CD31/SMA

x25 SMA

CD31/SMA

x40 SMA

CD31/SMA

b

vasos CD31 + /campo

C

80

* p=0.04

70

CD31

60

b’

50 40 30 20

CD31

10 0

MK VEGF WT1 MK VEGF -/-

D

a

vasos SMA + / campo

2,5

b

p=0.34

2,0

x20

1,5 1,0 0,5 0,0

SMA

x10

MK VEGF WT1 MK VEGF -/-

Figura 28. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la vasculatura tumoral en tumores subcutáneos. Se muestran los resultados correspondientes a tumores de 56 días. A: ensayo de permeabilidad (azul de Evans). Tumor VEGF-Hras (izquierda) y VEGF -/- Hras (derecha). B: detección de la microvasculatura tumoral mediante tinción doble de inmunofluorescencia frente al marcador de vasos neoformados CD31 y al marcador de vasos maduros SMA en a: tumores VEGF-Hras, b y b’: tumores VEGF -/- Hras. Los microvasos (CD31 positivos) se visualizan en verde y la cubierta periendotelial (SMA positivos) en rojo. C: cuantificación de las células CD31 positivas. D: tinción inmunohistoquímica frente a SMA y cuantificación de los vasos SMA positivos en a: tumores VEGF-Hras y b: tumores VEGF -/- Hras. Nótese que las diferencias son estadísticamente significativas (p< 0.05), respecto a la ausencia del VEGF, únicamente en la neovasculatura (vasos CD31 positivos). Los datos de las cuantificaciones son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Resultados

84

___________________________________________________________________________ 4.3.3 Análisis de la proliferación tumoral El análisis de la proliferación celular en los tumores subcutáneos se realizó mediante la detección inmunohistoquímica de BrdU (incorporada a las células proliferativas previamente al sacrificio del animal, ver apartado 3.11 de “Materiales y Métodos”). Los tumores de 56 días deficientes en el VEGF, mostraron menor incorporación de BrdU, en comparación con los tumores WT. Esta reducción fue estadísticamente significativa, lo cual corrobora la disminución en el crecimiento de estos tumores, muy posiblemente debido al déficit vascular (Fig. 29). 56 d

BrdU

x20

células BrdU + / campo

* p=0.03 70 60 50 40 30 20 10 0 MK VEGF WT

1

MK VEGF -/-

Figura 29. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la proliferación de tumores subcutáneos. Se evaluó la proliferación como incorporación de BrdU en tumores subcutáneos a las 8 semanas. Tinción inmunohistoquímica frente a BrdU de secciones correspondientes a tumores VEGF-Hras (izquierda) y VEGF -/Hras (derecha). Los datos de la cuantificación son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.3.4 Potencial metastásico Dado el fuerte incremento observado en la velocidad, volumen y, por tanto, sobrevida, de los tumores subcutáneos primarios de los queratinocitos VEGF-Hras, se decidió estudiar el efecto sobre la capacidad de metastatizar de estas células. Para ello, se empleó el modelo de metástasis de inyección de células tumorales por la vena de la cola de ratones inmunodeficientes. Cada tipo celular se inyectó en 6 animales y el experimento se realizó por duplicado. Se estudiaron un total de 24 animales. Se inyectaron los mismos clones que los empleados en el ensayo tumoral: MK VEGF WT y MK VEGF -/- transducidos con el vector retroviral pLZR-Hras-IRES-GFP y el vector control pLZR-IRES-GFP. Cincuenta días después de la inyección se sacrificaron los animales y se analizó, macro y microscópicamente, la diseminación tumoral en órganos críticos (pulmón, cerebro e hígado). Se observó que el 100% de los animales inyectados con las células VEGF-Hras, habían desarrollado nódulos pulmonares, visibles bajo la luz blanca y

Resultados

85

___________________________________________________________________________ azul de la lupa (fluorescencia GFP) (Fig. 30B). Y tras 100 días, el período de tiempo más prolongado del estudio, se detectó un progresivo incremento en el número y tamaño de las metástasis. Por el contrario, los animales que recibieron los queratinocitos VEGF -/- Hras se hallaron completamente libres de macrometástasis. Como era previsible, las células no tumorigénicas (no portadoras del oncogén mutado Hras), tampoco metastatizaron. El examen histológico y el análisis inmunohistoquímico de cortes seriados para la detección del marcador GFP, reveló la presencia de micrometástasis únicamente en los pulmones de los ratones inyectados con células VEGF-Hras (Fig. 30). En estas condiciones experimentales, a los 100 días post-inyección, sólo se observó desarrollo de metástasis pulmonares. Hígado y cerebro dieron resultado negativo en todos los grupos. A Genotipo

Metástasis

MK VEGF-Hras

6/6

MK VEGF-/- Hras

0/6

50 d

H&E

100 d

x4

H&E

x4

B b 50 d

b’ 100 d

b’’ 100 d

luz blanca y azul

gfp

x4

luz azul

gfp

x10

Figura 30. Potencial metastático de los queratinocitos de ratón VEGF-Hras y VEGF -/- Hras. A: datos del índice de metástasis pulmonares en los ratones inyectados con células portadoras del oncongén mutado H-ras con o sin VEGF. Tinción con H&E de secciones histológicas de pulmones de ratones inyectados con MK VEGF-Hras a 50 y 100 días. B: apariencia macroscópica y fluorescencia directa debida a GFP de pulmones de ratones inyectados con MK VEGF-Hras (b y b’) y MK VEGF -/- Hras (b’’). Tinción inmunohistoquímica frente a GFP de los pulmones enseñados en A. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Resultados

86

___________________________________________________________________________ En definitiva, si bien los resultados obtenidos en los ensayos tumoral y metastásico, son consistentes con estudios previos en los que se reporta la dependencia de Hras de la inducción tumoral por el VEGF (Rak J y cols., 1995a; Grugel S y cols., 1995; Larcher F y cols., 1996; Chin L y cols., 1999), podría cuestionarse la dependencia absoluta, no así la importancia, de este factor proangiogénico para el establecimiento, desarrollo inicial y la progresión de ciertos tumores en presencia de estímulos oncogénicos. No sucedería lo mismo con el potencial metastásico, donde el VEGF parece desempeñar un papel determinante en la diseminación de las células tumorales, dotándolas tal vez de características más agresivas (en cuanto a invasividad, supervivencia y colonización). Este resultado apoya a diversos estudios que relacionan la expresión del VEGF con la probabilidad de metástasis y las evidencias que indican que la angiogénesis participa en la diseminación del tumor primario (Weidner N y cols., 1991; Greenlee RT y cols., 2001; Hirakawa S y cols., 2005).

Resultados

87

___________________________________________________________________________ 4.4 CARACTERIZACIÓN DEL PROCESO DE REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL VEGF. Como se ha ido explicando a lo largo de este trabajo, el VEGF constituye uno de los factores esenciales en el proceso de angiogénesis y es crítico para determinados procesos de la fisiología cutánea, por ejemplo la reparación de heridas. El VEGF promueve la proliferación y migración de células endoteliales para la formación de nuevas redes de vasos sanguíneos. Por otra parte, en los estudios de angiogénesis en piel, los esfuerzos se concentran mayoritariamente en el compartimento epidérmico como fuente de factores para la vascularización, y la mayoría de las estrategias, tanto para eliminar como para sobreexpresar genes, han tenido como diana principal al queratinocito, y por tanto, la contribución de los elementos mesenquimales en los cambios vasculares ha sido pobremente caracterizada. En esta parte del trabajo se pretende estudiar, por un lado, el comportamiento organotípico/regenerador de la línea celular de queratinocitos deficientes en el VEGF como parte epidérmica de equivalentes cutáneos, en combinación con fibroblastos dérmicos deficientes en el VEGF o WT, así como su utilidad para el estudio de la fisiología de una piel sin este factor angiogénico. Dado que ha sido necesario trabajar también con fibroblastos de ratón tanto WT, como carentes del VEGF, se procedió con estas células del mismo modo que con los queratinocitos, tal y como se ha explicado detalladamente en diferentes apartados de “Materiales y Métodos”. Tras su tratamiento con un adenovirus portador de la recombinasa Cre para eliminar el exón 3 del gen VEGF, se realizó un clonaje y un posterior subclonaje para trabajar con poblaciones clonales. Todos los estudios han sido realizados utilizando un modelo en el que el componente celular de los equivalentes dermo-epidérmicos, lo forman todas las combinaciones posibles de clones de queratinocitos y fibroblastos tanto deficientes en el VEGF como WT (ver apartado 3.12 de “Materiales y Métodos”). Los queratinocitos se modificaron genéticamente para expresar el marcador GFP mediante transducción con el vector retroviral pLZR-IRESGFP. Esto permite, in vitro, tanto su detección y seguimiento, así como la identificación inequívoca del trasplante en el animal receptor. El clon de elección para todos los experimentos es el 42A8F5 para los queratinocitos deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-), clon 8 para los WT (MK VEGF WT) y clon B7 para los fibroblastos sin el VEGF (MF VEGF -/-):

Resultados

88

___________________________________________________________________________ Combinaciones de clones de queratinocitos y fibroblastos de ratón trasplantados MK VEGF -/- + MF VEGF -/- (queratinocitos ratón clon 42A8F5 + fibroblastos ratón clon B7) MK VEGF WT + MF VEGF WT (queratinocitos ratón clon 8 + fibroblastos ratón) MK VEGF -/-

+ MF VEGF WT (queratinocitos ratón clon 42A8F5 + fibroblastos ratón)

MK VEGF WT + MF VEGF -/- (queratinocitos ratón clon 8 + fibroblastos ratón clon B7)

Se trasplantaron 3 ratones con cada combinación bajo las condiciones especificadas en el apartado 3.12 de “Materiales y Métodos”, los experimentos se realizaron por duplicado. Se estudiaron un total de 24 animales en cada uno de los dos tipos de trasplante realizados. 4.4.1 Caracterización fenotípica de la piel de ratón trasplantada en cámaras de silicona Como se explicó en el apartado 3.12.1 de “Materiales y Métodos” las cámaras se retiran a los 7 días de su implante para evitar la acumulación excesiva de fluidos en su interior y permitir que la piel se seque. Este paso de exposición de los queratinocitos a una interfase aire-líquido es clave para su diferenciación en todas las capas epidérmicas. Tras 7 días más se obtiene una piel completamente formada. 4.4.1.1 Arquitectura epidérmica La visualización de los trasplantes bajo luz azul y la inmunohistoquímica para la detección del marcador GFP, permitieron distinguir inequívocamente, a las dos semanas post-trasplante, la piel de ratón regenerada a partir de las combinaciones celulares y descartar su origen fruto de una posible reepitelización del tejido circundante, así como su correcta posición en la epidermis (Fig. 31A y B). La tinción con H&E de los trasplantes reveló que la morfología de la piel reconstituida deficiente en el VEGF (queratinocitos y/o fibroblastos VEGF -/-) es muy similar a la de la piel WT (Fig. 31C). Notablemente, este análisis reveló que no existen diferencias significativas respecto a la arquitectura epidérmica, ya que todos los trasplantes mostraron una correcta estratificación. Se observan claramente los estratos basal, espinoso, granuloso y el córneo. La unión dermis-epidermis es limpia, separando claramente los fibroblastos dérmicos de los queratinocitos epidérmicos.

Resultados

89

___________________________________________________________________________ A

B

luz blanca

luz azul

gfp

x20

C MK VEGF WT

MK VEGF WT

MK VEGF -/-

MK VEGF -/-

MF VEGF WT

MF VEGF -/-

MF VEGF WT

MF VEGF -/-

H&E

x10

H&E

X20

Figura 31. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la arquitectura de la epidermis regenerada. A: apariencia macroscópica y fluorescencia directa debida a GFP de los trasplantes en cámara de silicona a las 2 semanas. B: tinción inmunohistoquímica frente a GFP del trasplante enseñado en A. C: tinción con H&E de secciones histológicas de los trasplantes de piel en cámaras de silicona correspondientes a las combinaciones de queratinocitos y fibroblastos representados. En la figura se muestra un experimento representativo realizado con 3 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.4.1.2 Proliferación epidérmica La regeneración de la arquitectura cutánea implica procesos de reparación que incluyen episodios de proliferación y migración celular. Se determinó la actividad proliferativa evaluando la incorporación de BrdU en la piel. Esta actividad se desarrolla en ambos compartimentos, epidérmico y dérmico: queratinocitos y fibroblastos incorporan esta molécula en su ADN. El estudio reveló un menor número de células positivas para BrdU y restringidas a la capa basal de la epidermis en la piel carente del VEGF respecto a la WT. Así mismo, en la piel WT se observó que la mayoría de las células basales expresaban BrdU y además también se detectaron células positivas en células suprabasales de la epidermis.

Resultados

90

___________________________________________________________________________ En cuanto a las pieles con una deficiencia selectiva del VEGF, es decir, en uno de los dos compartimentos, en la piel regenerada a expensas de queratinocitos sin el VEGF (MK VEGF-/- / MF VEGF WT), se observó un menor número de células BrdU positivas basales respecto a la WT y a la deficiente en el VEGF a nivel dérmico (MK VEGF WT / MF VEGF /-). La piel sin el VEGF (MK VEGF-/- / MF VEGF -/-) y la deficiente en el VEGF solamente a nivel epidérmico (MK VEGF -/- / MF VEGF WT), mostraron un escaso número de células BrdU positivas siempre limitadas a la capa basal, siendo las diferencias significativas (Fig. 32). La detección de menor actividad proliferativa en estos trasplantes se correlaciona con su aspecto de epitelio moderadamente menos trófico.

A

B

**p=0.005 p=0.6

BrdU

x10

D

x40

C

células BrdU + / campo

60 50 40

x10

*p=0.038

30 20 10 0

BrdU

**p=0.005

/-/ T/ T/ 1 -/-/ FFW F WGF WT EG F -/EG WT G E V V / VE F - K V GF MK VEGF MK VEG M VE MK VEG MF MF MF MF

x40

Figura 32. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la actividad proliferativa de la epidermis regenerada. Se evaluó la proliferación como incorporación de BrdU en trasplantes en cámaras de silicona a las 2 semanas. Tinción inmunohistoquímica frente a BrdU de secciones histológicas de A: trasplante MK VEGF WT / MF VEGF WT, B: trasplante MK VEGF WT / MF VEGF -/-, C: trasplante MK VEGF -/- / MF VEGF WT y D: trasplante MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. Los datos de la cuantificación son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 3 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Este resultado es indicativo de que las células de la piel con el VEGF, bien en ambos compartimentos, bien a nivel epidérmico solamente, se encuentran proliferando muy activamente en comparación con las células de las pieles totalmente deficientes en el VEGF o solamente con aportación dérmica de este factor.

Resultados

91

___________________________________________________________________________ Estos resultados son consistentes con datos publicados recientemente acerca de los efectos del VEGF, en los que se demuestra que este factor estimula la proliferación de los queratinocitos durante la reparación tisular y en condiciones basales, a través del receptor VEGFR-1 (Wilgus TA y cols., 2005). Por tanto, la deleción del VEGF total o selectivamente en el compartimento epidérmico disminuye la actividad proliferativa de los queratinocitos en la epidermis regenerada, pero sin comprometer la regeneración (ver apartado 5.4 de “Discusión”). 4.4.1.3 Diferenciación epidérmica Para estudiar la maduración del epitelio en la piel trasplantada, se realizaron estudios de inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para marcadores del proceso de diferenciación epidérmica (queratinas y proteínas estructurales epiteliales) (ver apartado 1.7.1 de “Introducción” y 3.13.1 de “Materiales y Métodos”). En todos los casos (piel VEGF -/- y VEGF WT) la expresión de la queratina K5 se restringió a la capa basal de las células epiteliales, y la K10 se detectó uniformemente expresada en estratos suprabasales, como corresponde a este marcador de diferenciación temprana. La detección de filagrina y loricrina en las capas más superiores evidenciaron los estratos epiteliales terminalmente diferenciados (Fig. 33). El correcto patrón de expresión de estos marcadores indica que la epidermis de la piel regenerada no presenta alteraciones en la diferenciación, independientemente de la deficiencia del VEGF en uno o ambos compartimentos, y a pesar de las diferencias observadas en la proliferación. Este resultado es coherente con una adecuada dinámica en los procesos de proliferación-diferenciación observados en todos los trasplantes. Además, la mayor actividad proliferativa observada en los trasplantes con el VEGF en ambos compartimentos o sólo en el epidérmico (MK VEGF WT / MF VEGF-/-), apenas se traduce en una discreta hiperplasia. Por tanto, no existe un desbalance claro a favor del proceso de proliferación. La expresión continua y correctamente localizada de los marcadores de diferenciación terminal, corrobora esta afirmación.

Resultados

92

___________________________________________________________________________ MK VEGF WT

MK VEGF WT

MK VEGF -/-

MK VEGF -/-

MF VEGF WT

MF VEGF -/-

MF VEGF WT

MF VEGF -/-

K5

x20

K10

x20

Filagrina

x20

Loricrina

x20

Figura 33. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la diferenciación de la epidermis regenerada. Tinciones inmunohistoquímicas de secciones histológicas, correspondientes a los trasplantes indicados en cámaras de silicona, frente a distintos marcadores de diferenciación epidérmica: queratinas K5 y K10, filagrina y loricrina. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 3 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.4.1.4 Maduración dérmica Respecto al compartimento dérmico, los trasplantes WT o con un aporte parcial del VEGF epidérmico (MK WT / MF VEGF -/-) parecen tener una dermis más celular con respecto a los deficientes totalmente (MK VEGF -/- / MF VEGF -/-) y los deficientes únicamente a nivel epidérmico (MK VEGF-/- / MF WT). Éstos mostraron un menor empaquetamiento celular y un aspecto más colagenoso. Como se ha mencionado anteriormente, se han descrito efectos proliferativos del VEGF en los queratinocitos (Wilgus TA y cols., 2005), que a su vez pueden secretar colagenasa durante su migración a través de matrices colagenosas in vitro e in vivo (Saarialho-Kere UK y cols., 1993; Inoue M y cols., 1995). Por tanto, cabe la posibilidad de que en los trasplantes que poseen el VEGF total o parcialmente en la epidermis, el colágeno

Resultados

93

___________________________________________________________________________ esté sometido a mayor degradación, dando como resultado una matriz más colagenosa en los trasplantes donde la pérdida del VEGF es total o parcial en la epidermis. Sin embargo, la tinción con H&E no permite distinguir claramente entre la deposición del tipo de colágeno (maduro e inmaduro). A

H&E

B

x20

D

C

Figura 34. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la dermis de los trasplantes en cámaras de silicona. Tinción con H&E de secciones histológicas de A: dermis de trasplante MK VEGF WT / MF VEGF WT, B: dermis de trasplante MK VEGF WT / MF VEGF -/-, C: dermis de trasplante MK VEGF -/- / MF VEGF WT y D: dermis de trasplante MK VEGF -/- / MF VEGF -/-.

Los resultados obtenidos en el modelo de trasplante ortotópico expuestos más adelante, complementarán y validarán los hallazgos anteriormente detallados. 4.4.1.5 Análisis de la vasculatura El análisis de la neovasculatura reveló una densidad de capilares (ECs CD31 positivas) significativamente mayor en el compartimento dérmico de los trasplantes WT respecto a los deficientes en el VEGF (Fig. 35A). La distribución espacial de los vasos sanguíneos indica que los capilares que nutren a los trasplantes deficientes en el VEGF se disponen paralelamente al epitelio, a diferencia de los vasos que se encuentran bajo la influencia de una piel con el VEGF, que lo hacen de forma perpendicular al epitelio y cercanos a la unión dermo-epidérmica. Esta localización y posición de la vasculatura en los trasplantes WT, posiblemente se deba al efecto quimiotáctico que ejerce el VEGF164 sobre las ECs (Yoshida A y cols., 1996; Larcher F y cols., 1998; Cleaver O y Krieg PA, 1998; Detmar M y cols., 1998).

Resultados

94

___________________________________________________________________________ A a

a’

***p=0.001 80

x40

b

x20 b’

vasos CD31 + /campo

CD31/K5

70 60 50 40 30 20 10 0

CD31/K5

x40

x20

WT GF T VE F W K M VEG MF

1

-/GF VE F -/MK VEG MF

B a

b *p=0 .05

d

x20

c

vasos SMA + / campo

SMA

p=0 .35

120

x40

100 80

p=0 .841 *** p=0 .0006

60 40 20 0 T -/ -/WT F T F W GF F EG F - / EG WT VE F W EG F - / V V F V G MK V E G M K VE G MK V E MK V E G MF MF MF MF

Figura 35. Efecto de la ausencia del VEGF sobre la vasculatura de los trasplantes en cámara de silicona. A: doble tinción de inmunofluorescencia frente al marcador de vasos neoformados CD31 para detectar la neovasculatura (en verde) y la queratina K5 de la capa basal epidérmica (en rojo) de los trasplantes a: MK VEGF WT / MF VEGF WT y b: MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. Cuantificación de las células CD31 positivas en dichos trasplantes. B: tinción inmunohistoquímica frente a SMA de secciones histológicas de a: trasplantes MK VEGF WT / MF VEGF WT, b: trasplantes MK VEGF WT / MF VEGF -/-, c: trasplantes MK VEGF -/- / MF VEGF WT y d: trasplantes MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. Cuantificación de los vasos SMA positivos (maduros) en dichos trasplantes. Los datos de las cuantificaciones son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 3 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Respecto al estudio de la madurez vascular, los trasplantes WT mostraron una reducción significativa de vasos maduros (SMA positivos), respecto a los deficientes en el factor angiogénico. La deleción parcial del VEGF bien a nivel dérmico o epidérmico reveló

Resultados

95

___________________________________________________________________________ una moderada disminución en la densidad de vasos maduros, sin significación estadística (Fig. 35B). Por tanto, la ausencia del VEGF en ambos compartimentos cutáneos disminuye significativamente la neovasculatura de los trasplantes. 4.4.2 Caracterización fenotípica de los trasplantes de cultivos organotípicos de ratón En el apartado anterior se han analizado los resultados de un modelo de trasplante descrito y utilizado en numerosos trabajos sobre regeneración cutánea (Fusenig NE y cols., 1978, 1983; Wang CK y cols., 2000). Sin embargo, este modelo conlleva la implantación, en la piel del animal receptor, de una estructura ajena a la anatomía del animal (cámara de silicona) y que debe permanecer colocada durante la mitad del tiempo que tarda en formarse completamente una piel. La regeneración cutánea, en este sistema, es un proceso que cursa en un contexto de estrés celular, exposición al ambiente y riesgo de infección, lo que podría acentuarse por la presencia de la cámara de silicona. El estrés de la regeneración epidérmica, junto a las condiciones poco favorables, podría dar como resultado una regeneración tisular con un gran componente inflamatorio, y en consecuencia, tal vez aberrante. Lo que conllevaría una producción adicional del VEGF, enmascarando así la regeneración de una piel cuyas células carecen completamente de este factor. Por este motivo, en este apartado se pretende por un lado desarrollar un sistema organotípico utilizando queratinocitos de ratón, lo que supone un desafío en sí, dadas los requerimientos en cultivo de estas células (ver apartado 3.2 de “Materiales y Métodos”) y que simultáneamente, salve la necesidad de implantar una estructura ajena donde se estructure el trasplante y que podría causar efectos secundarios a lo largo de todo el proceso. Como se explicó en el apartado 3.12.2 de “Materiales y Métodos”, las diferencias principales son, respecto al procedimiento de las cámaras, el número de células que forman el componente celular del trasplante, el molde para la preparación de los geles de fibrina y la metodología de la cirugía. Las pieles obtenidas se procesaron a las 6 semanas post-trasplante, y se realizaron prácticamente los mismos análisis que en el modelo de trasplante anterior. 4.4.2.1 Calidad histológica de la piel regenerada. Arquitectura epidérmica La detección del marcador GFP en todos los trasplantes corrobora el correcto posicionamiento de los queratinocitos en la piel, así como el origen de la misma a expensas de las células manipuladas in vitro y no fruto de una reepitelización (Fig. 36A).

Resultados

96

___________________________________________________________________________ No se observan diferencias significativas a nivel morfológico entre los trasplantes deficientes en el VEGF y los WT, salvo alguna zona de engrosamiento epidérmico en la piel WT quizá más evidente que en los trasplantes en cámaras de silicona. Respecto a la arquitectura epidérmica, tampoco se observaron diferencias en la estratificación y se observan claramente todos los estratos epidérmicos (Fig. 36B). La separación de los compartimentos dérmico y epidérmico se encuentra correctamente definida. A

x20

luz blanca

luz azul

gfp

x40

B MK VEGF WT / MF VEGF WT

MK VEGF -/- / MF VEGF -/-

x20

H&E

x40

Figura 36. Arquitectura de la epidermis regenerada en los trasplantes de cultivos organotípicos. A: apariencia macroscópica y fluorescencia directa debida a GFP de los trasplantes a las 6 semanas. Tinción inmunohistoquímica frente a GFP del trasplante anterior. B: tinción con H&E de secciones histológicas de los trasplantes de piel correspondientes a las combinaciones de queratinocitos y fibroblastos representados. En la figura se muestra un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.4.2.2 Los trasplantes deficientes en VEGF tienen alteraciones en la proliferación epidérmica El impacto de esta deleción del VEGF sí adquiere relevancia en cuanto a la actividad proliferativa en la epidermis. La detección de células para el marcador de proliferación Ki67 fue signifcativamente menor en los trasplantes sin el VEGF respecto a los WT (Fig. 37). Este resultado, como se comentó previamente, puede asociarse al novedoso papel del VEGF como estimulador de la proliferación del propio queratinocito epidérmico (Wilgus TA y cols., 2005). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en el primer tipo de trasplante.

Resultados

97

___________________________________________________________________________

MK VEGF WT / MF VEGF WT

MK VEGF -/- / MF VEGF -/-

*p=0.023 células BrdU + / campo

30

Ki67

x20

25 20 15 10 5 0

T W GF WT VE GF M K VE F

1

-/GF -/E F V K EG M FV M

Figura 37. Actividad proliferativa de la epidermis regenerada en los trasplantes de cultivos organotípicos. Tinción inmunohistoquímica frente a Ki67 de secciones histológicas de los trasplantes indicados. Los datos de la cuantificación son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.4.2.3 Los trasplantes deficientes en VEGF no presentan alteraciones en el programa de diferenciación epidérmica Se observó igualmente que la epidermis, en el trasplante de cultivo organotípico, estaba compuesta por una capa de células basales y capas de células suprabasales que mostraron las típicas características morfológicas de diferenciación celular y estratificación epidérmica (Fig. 38) El estudio de la expresión de las queratinas epiteliales no reveló diferencias significativas entre los trasplantes VEGF-/- y WT. La filagrina y la loricrina se expresaron en los estratos superiores más diferenciados. La queratina K10 se expresó en los estratos suprabasales y la queratina K5 en el estrato germinativo. Por tanto, al igual que en el modelo de trasplante anterior, la diferenciación epidérmica de la piel regenerada a partir de trasplantes deficientes en el VEGF, es correcta y prácticamente indistinguible de la que se observó en los equivalentes WT.

Resultados

98

___________________________________________________________________________ A

B

K10

Filagrina

A’

B’

K10

Filagrina

C

Loricrina

C’

Loricrina

Figura 38. Diferenciación epidérmica en los trasplantes de cultivos organotípicos. Tinciones inmunohistoquímicas de secciones histológicas de trasplantes frente a marcadores de diferenciación epidérmica. Paneles superiores A, B y C: trasplantes MK VEGF WT / MF VEGF WT. Paneles inferiores A’, B’ y C’: trasplantes MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. A y A’: tinción frente a la queratina K10. B y B’: tinción frente a filagrina. C y C’: tinción frente a loricrina. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

4.4.2.4 Los trasplantes deficientes en VEGF presentan alteraciones en la organización y maduración dérmica Los resultados obtenidos en el modelo de trasplante ortotópico sí revelan diferencias respecto al componente dérmico dependiendo de la presencia de estímulo angiogénico. Sin embargo, en los trasplantes en cámara de silicona, las leves y variables diferencias observadas en la dermis de dichos trasplantes se atribuyeron únicamente a razones de la propia metodología empleada, es decir, la presencia de la estructura delimitando el trasplante que se sumase a la supuesta dificultad añadida de los trasplantes deficientes en el VEGF para la regeneración tisular. La deficiencia total del VEGF en la piel afecta a la organización y maduración dérmica de los trasplantes (Fig. 39). En el proceso de cicatrización de una herida, cuando el número de fibroblastos del tejido de granulación es adecuado, se frena su actividad proliferativa y comienza la síntesis de colágeno (Piteiro AB, 2003). La observación microscópica con luz polarizada de los cortes teñidos con rojo Picrosirius permite reconocer algunos tipos de colágeno. Las fibras de colágeno tipo I son las más abundantes en la dermis, constituyendo el que se denomina colágeno maduro, se observan gruesas y fuertemente birrefringentes con colores que varían entre el amarillo, naranja y rojo. Las de colágeno tipo

Resultados

99

___________________________________________________________________________ III, en tejido conjuntivo laxo y dermis, se ven menos birrefringentes y aparecen de color verde. Como se observa en la figura 39, el contenido de colágeno tipo I en el compartimento dérmico de los trasplantes VEGF WT es mayor que en el de los VEGF -/-. Aunque en ambos casos la densidad celular observada en la tinción con H&E es similar (Fig. 36B), la coloración amarilla de las fibras en los trasplantes VEGF WT, así como su birrefringencia bajo luz polarizada, denotan el mayor contenido en colágeno maduro característico de un tejido conectivo denso. MK VEGF WT / MF VEGF WT

MK VEGF -/- / MF VEGF -/-

polarizado

dermis

Rojo Picrosirius

x20

Figura 39. Maduración dérmica en los trasplantes de cultivos organotípicos. El depósito de colágeno se analizó mediante tinción con rojo Picrosirius de secciones histológicas de los trasplantes de 6 semanas. Nótese el menor depósito de colágeno tipo I, maduro, en los trasplantes deficientes en el VEGF. En éstos el color verde corresponde con el colágeno menos birrefringente, de tipo III, observado bajo un microscopio de luz polarizada. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Este resultado indica que la presencia del VEGF en los trasplantes aceleraría el proceso de maduración dérmica. Otros grupos han descrito resultados similares en otros modelos, en los que se relaciona al VEGF con procesos de regeneración cutánea (Falabella AF y Valencia IC, 2000; García M y cols., 2004; Roth D y cols., 2006). 4.4.2.5 Los trasplantes deficientes en VEGF muestran una disminución de la neovasculatura Respecto a los vasos de nueva formación, la detección de CD31 reveló una densidad significativamente mayor de capilares en el compartimento dérmico de los trasplantes VEGF WT respecto a los VEGF -/-. Igualmente se observaron en estos trasplantes las mismas diferencias, en cuanto a la localización y distribución espacial de los vasos sanguíneos, entre los trasplantes carentes del VEGF y los controles (WT). Los vasos sanguíneos que se

Resultados

100

___________________________________________________________________________ disponen espacialmente por debajo de los trasplantes VEGF WT, parecen acudir a la “llamada” emitida por los mismos a juzgar por su disposición casi perpendicular al epitelio y su cercanía a la epidermis (Fig. 40A). Así pues la deficiencia total del VEGF en la piel disminuye significativamente la neovasculatura de los trasplantes cutáneos. Se detectó una densidad significativamente menor de vasos maduros (SMA positivos) en la dermis de los trasplantes VEGF WT respecto a los VEGF -/- (Fig. 40B). Por tanto, de nuevo los resultados fueron similares a los obtenidos en el modelo anterior. A a’

CD31/K5

`

x40

b

x20 b’

CD31/K5

x40

vasos CD31 + / cam po

a

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

b

x40

x20

vasos SMA + / campo

60

SMA

MK VEGF WT 1 MK VEGF -/MK VEGF WT MF VEGF -/-

x20

B a

**p=0.006

*p=0.028

50 40 30 20 10 0 MK VEGF WT MF VEGF WT

1

MK VEGF -/MF VEGF -/-

Figura 40. Análisis de la vasculatura en los trasplantes de cultivos organotípicos. A: doble tinción de inmunofluorescencia frente al marcador de vasos neoformados CD31 para detectar la neovasculatura (en verde) y la queratina K5 de la capa basal epidérmica (en rojo) de los trasplantes a: MK VEGF WT / MF VEGF WT y b: MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. Cuantificación de las células CD31 positivas en dichos trasplantes. B: tinción inmunohistoquímica frente a SMA de secciones histológicas de a: trasplantes MK VEGF WT / MF VEGF WT y b: trasplantes MK VEGF -/- / MF VEGF -/-. Cuantificación de los vasos SMA positivos (maduros) en dichos trasplantes. Los datos de las cuantificaciones son el resultado de la media del contaje de 6 campos de diferentes secciones. En la figura se muestran imágenes de un experimento representativo realizado con 6 ratones en cada grupo. Resultados similares se obtuvieron en otro experimento independiente.

Resultados

101

___________________________________________________________________________ En definitiva, estos resultados indican que el VEGF, principal factor en la angiogénesis tumoral, no desempeña un papel crítico en la fisiología de la célula epidérmica en cuanto a regeneración normal de la piel. Lo que sugiere la posible existencia de estímulos angiogénicos VEGF-independientes capaces de proporcionar un adecuado mantenimiento de la piel in vivo.

5. DISCUS IÓN

S i d is c ut e s muc ho p a r a p ro ba r t u sa b id ur ía , p r o nt o mo s t ra r á s t u igno r a nc ia . M O UC HARRI F ED- DIN S AADI

Discusión

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___________________________________________________________________________ 5.1 EL VEGF EN LA ANGIOGÉNESIS CUTÁNEA FISIOLÓGICA Y TUMORAL El correcto funcionamiento de los tejidos del organismo requiere un suministro sanguíneo adecuado y ordenado, a través de un sistema de capilares, arterias y venas, que garantice el aporte de nutrientes esenciales para sobrevivir. El VEGF-A o VEGF es el miembro mejor estudiado de la familia de ligandos del VEGF-PDGF (Ferrara N y cols., 2003) y es el principal factor conductor de los procesos de formación de vasos sanguíneos: vasculogénesis y angiogénesis (Yancopoulos GD y cols., 2000; Jain RK, 2003; Lewis NL y Meropol NJ, 2003). El control de la angiogénesis por el VEGF es uno de los mecanismos responsables del mantenimiento fisiológico del grado de vascularización tisular (Shibuya M, 2001a; Ferrara N y cols., 2003). La principal fuente de este factor en la piel es el queratinocito, donde lo expresa de forma basal constitutiva, salvo en situaciones patológicas donde existe sobreexpresión del VEGF además por otros tipos celulares (Brown LF y cols. 1992; Detmar M y cols., 1994; Brown LF y cols., 1995a; Brown LF y cols., 1995b; Ballaun C y cols., 1995; Weninger W y cols., 1996). Respecto a la angiogénesis tumoral, el VEGF se expresa en células transformadas de varios tumores (revisado por Dvorak y cols., 1995b), incluyendo tumores de piel como lo demuestran estudios previos en nuestro laboratorio (Larcher F y cols., 1996) y otros (Weninger W y cols., 1996). La principal fuente de VEGF la constituyen las células tumorales y su papel en el desarrollo de un tumor parece estar relacionado fundamentalmente con su necesidad de aporte sanguíneo. Debido a que tan sólo la alteración de uno de los alelos del VEGF conlleva anormalidades vasculares letales (Carmeliet P y cols., 1996; Ferrara N y cols., 1996a; Carmeliet P y cols., 1999b), se imposibilita realizar estudios in vivo de tumorigénesis y metástasis en animales deficientes totales. Respecto a la regeneración tisular, no se ha profundizado suficientemente en el estudio de la contribución del VEGF epitelial y mesenquimal en este proceso, a diferencia del desarrollo tumoral. Además las estrategias empleadas in vivo para analizar la deficiencia de VEGF en los procesos anteriormente mencionados, presentan ciertos condicionantes y limitaciones en mayor o menor grado. Por este motivo, el trabajo de esta tesis doctoral se ha dirigido al desarrollo de una herramienta que permitiese, en ausencia del principal factor angiogénico, el análisis in vivo de la tumorigénesis, progresión y desarrollo vascular tumoral, así como del proceso de regeneración cutánea.

Discusión

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___________________________________________________________________________ 5.2 DESARROLLO DE UNA LÍNEA CELULAR DE QUERATINOCITOS DE RATÓN

DEFICIENTE EN VEGF COMO HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO DE LOS PROCESOS DE TUMORIGÉNESIS Y REGENERACIÓN TISULAR Las técnicas de cultivos celulares generalmente constituyen una herramienta in vitro que permite solventar el estudio de aquellos genes y su función que en modelos animales presenta ciertas limitaciones. En el caso de estudios en piel de ratón, las técnicas reproducibles de aislamiento y cultivo a largo plazo de queratinocitos epidérmicos de ratón neonato constituyen una importante necesidad. Desde hace muchos años el cultivo primario de queratinocitos de ratón se encuentra bien estandarizado (Hennings H y cols., 1980; Leigh IM y Watt FM, 1994). Sin embargo, el cultivo seriado de larga duración (long term), así como su ensamblaje en un cultivo organotípico, presentan serias dificultades. Si bien numerosos trabajos describen diferentes técnicas (Morris RJ y cols., 1994; Bickenbach JR y Chism E 1998; Hager B y cols., 1999; Caldelari R y cols., 2000; Häkkinen L y cols., 2001), aún prevalece la falta de consenso y con frecuencia impera la necesidad de realizar cultivos primarios, de duración limitada, para cada experimento. En este estudio se describe un modelo para la inmortalización del cultivo de queratinocitos de ratón introduciendo variaciones, respecto al método descrito por Hennings, fundamentalmente para prolongar la permanencia en cultivo de estas células. La realización de subcultivos es una de las principales dificultades y en este trabajo se ha tratado de optimizar los requerimientos de un factor determinante in vitro para el crecimiento del queratinocito de ratón, la concentración de Ca2+, en momentos críticos y de estrés para el cultivo celular como es el subcultivo. La composición del medio de cultivo es hasta ahora el factor más importante en el cultivo de células animales (Cartwright T y cols., 1994), pues las principales funciones de los medios de cultivo celulares son mantener el pH y la osmolaridad esenciales para la viabilidad celular, así como aportar los nutrientes y energía necesarios para el crecimiento y la multiplicación celular. A este respecto, hemos introducido modificaciones tanto en la composición del medio de cultivo como en el empleo de sustratos respecto a lo descrito en trabajos previos, asemejando los requerimientos a los descritos para el cultivo de queratinocitos humanos. Es comúnmente aceptado que la mayoría de medios basales para el crecimiento de cultivos celulares deben contener, por regla general, un suplemento de 10% de suero (concentración de Ca2+ de 3 mM) (Bird BR y Forrester FT, 1981; Cartwright T y cols., 1994). Para el cultivo de queratinocitos de ratón empleamos esta concentración de

Discusión

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___________________________________________________________________________ suero fetal bovino previamente tratado con una resina quelante de cationes Ca2+ (trabajamos a concentraciones de 0.03-0.07 mM Ca2+). Cuando se cultivan células de órganos y tejidos en medios nutrientes suplementados con suero, los fibroblastos crecen con rapidez a partir del explanto, y suelen convertirse en el tipo celular predominante, pues son las células menos difíciles de propagar en medios que continen suero y alto Ca2+ (Sato JD y cols., 1994). Los cultivos primarios tienen una mezcla de distintas poblaciones celulares, sin embargo, el predominio de células epidérmicas en el cultivo primario de queratinocitos de ratón, es evidente tras varios días en cultivo, pues sus mínimos requerimientos de Ca2+ prácticamente imposibilita la viabilidad de fibroblastos contaminantes durante el proceso de aislamiento de la epidermis. Del mismo modo, esta necesidad de bajo Ca2+, ha facilitado el aislamiento de los queratinocitos y el reestablecimiento de su cultivo a partir de tumores subcutáneos. Adicionalmente se han incluido en el medio de cultivo suplementos, recomendados para los queratinocitos humanos, que proporcionan un ambiente más enriquecido en factores y nutrientes: toxina colérica, insulina e hidrocortisona. Hasta el subcultivo 30 no se decidió dar por obtenida la línea celular de queratinocitos de ratón deficiente en el VEGF, pues hasta el décimo subcultivo las células recibieron medio condicionado por fibroblastos, feeder layer como sustrato, y no se pudo forzar el subcultivo más allá de 1:2 sin poner en riesgo la supervivencia celular. A partir de ahí se independizaron de estos requerimientos y se estandarizó el cultivo tal y como hemos descrito en apartados anteriores (ver 3.2.1 de “Materiales y Métodos”). Además, entre los subcultivos 20-30 se procedió al clonaje y subclonaje de las células tratadas previamente con la recombinasa Cre y por tanto, supuestamente deficientes en el VEGF. Actualmente, en este trabajo se ha llegado hasta el subcultivo 67, realizando la caracterización biológica de la línea celular entre los subcultivos 35 y 50. Trabajos de otros grupos han reportado la posibilidad de llevar a cabo entre 19 y 26 subcultivos de este tipo celular, destacando, como ventaja fundamental, la simplicidad del método propuesto por no requerir una feeder layer como sustrato. Sin embargo, en esos estudios las células requieren la presencia permanente de un sustrato, durante todos los subcultivos, con componentes de la matriz extracelular como el colágeno tipo IV (Bickenbach JR y Chism E 1998; Hager B y cols., 1999). En el método descrito por Häkkinen y cols., se requiere colágeno y fibronectina solamente durante el primer subcultivo, pero mantienen la necesidad de realizar cultivos de fibroblastos para suministrar medio condicionado a los queratinocitos durante los 26 subcultivos. En nuestro caso, la necesidad

Discusión

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___________________________________________________________________________ de sustrato y de medio condicionado únicamente se mantuvo durante los 10 primeros subcultivos de las células. Cabe mencionar un breve trabajo publicado por Caldelari y cols., 2000 en respuesta al método de Hager en el que no siguen el método tradicional descrito por Hennings para el cultivo específico de estas células, sino que describen un método de aislamiento y cultivo de larga duración de queratinocitos embrionarios de ratón, a partir de un protocolo para el cultivo de queratinocitos caninos. Estos autores reportan 61 subcultivos destacando la ausencia de cualquier tipo de sustrato, la escasez de suplementos en el medio de cultivo y el manteniemiento de la capacidad de diferenciación. Sin embargo, refieren la mayoría de estos datos a observaciones no publicadas y no son citados

por otros autores en trabajos

posteriores. La escasez de trabajos acerca de líneas celulares de queratinocitos de ratón inmortalizadas espontáneamente, es indicativo de lo laborioso de su obtención, por lo que la conducta seguida parece haber sido adecuada para salvar las dificultades durante los subcultivos seriados que formaron parte de este trabajo. Además, las pocas líneas epidérmicas inmortalizadas, más o menos tumorigénicas, proceden de tumores (Yuspa SH y cols., 1986). La caracterización biológica de la línea celular, se ha realizado entre los subcultivos 35 y 50. Los queratinocitos en todo momento no han dejado de exhibir características morfológicas o proliferativas que no fuesen típicas de un cultivo de este tipo celular en baja concentración de Ca2+ (fenotipo epitelial, crecimiento individual y bordes celulares refringentes bajo el microscopio óptico correspondientes a un estado no diferenciado) (Fig. 17A). La tasa proliferativa, tan sólo moderadamente incrementada respecto a la de un cultivo primario, y la expresión de las queratinas K5 y K14, determinaron que las células mantenían las características del queratinocito proliferativo y que este proceso no presentaba alteraciones in vitro. Así mismo, la expresión de marcadores de diferenciación tempranos (queratinas K1 y K10), en respuesta a un aumento de la concentración de Ca2+ en el medio de crecimiento, demuestra que estas células mantienen la propiedad de diferenciar in vitro bien caracterizada en queratinocitos (Hennings H y cols., 1980; Jensen PK y cols., 1990) (Fig. 22). En este sentido, en otros trabajos se ha visto que los queratinocitos de ratón pierden la capacidad de diferenciar en pases tempranos, aunque logren realizar muchos más subcultivos (Hager B y cols., 1999). La condición de inmortalidad se alcanzó tanto para los queratinocitos parentales (MK VEGF WT o VEGF-LoxP), como para los deficientes en el VEGF (MK VEGF -/-). Este

Discusión

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___________________________________________________________________________ resultado nos permite asegurar que la pérdida del VEGF no interfiere ni con los mecanismos habituales de escape de la senescencia, ni con la capacidad de proliferación y diferenciación in vitro. El análisis del cariotipo en el pase 38 de la línea de queratinocitos deficiente en el VEGF, mostró en todas las metafases analizadas un número de cromosomas variable en el rango triploide-tetraploide (63-82 cromosomas; en ratón 2n=40) (Fig. 23), lo cual es compatible con el resultado tetraploide que documentan otros estudios con líneas celulares de queratinocitos murinos (Ueda M y cols., 1995). Además son previsibles alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales en las células que han adoptado características de línea celular (Goldaber ML y cols., 1990; Pandis N y cols., 1993; Rice RH y cols., 1993; Han K y cols. 1994). Las células analizadas exhiben fusiones centroméricas de los cromosomas 1 y 19, así como una translocación que afecta al cromosoma 8 y a un fragmento de pequeño tamaño cuyo origen más probable pueden ser los cromosomas 2 ó 10. Aunque no hemos investigado la estabilidad de estas aberraciones cromosómicas, la adquisición de anormalidades adicionales en pases posteriores ni identificado genes específicos implicados en conferir inmortalidad, no se ha descrito asociación alguna entre inmortalización y las alteraciones anteriormente descritas, así como su presencia en otras líneas celulares de queratinocitos de ratón inmortalizadas espontáneamente. Sí se ha observado un elevado nivel de inestabilidad genética en líneas celulares epidérmicas de ratón derivadas de lesiones premalignas (papilomas), en las que las alteraciones aneuploides (generalmente mitosis hiperdiploides) son frecuentes (Aldaz CM y cols., 1988a). Como se discutirá más adelante, el perfil cromosómico aneuploide de los queratinocitos analizados, no conduce a una conversión maligna de los mismos. Adicionalmente, se ha descrito en células de mamíferos la posibilidad de que la recombinasa Cre cause anomalías citogenéticas (Loonstra A y cols., 2001; Silver D y cols., 2001), pues aunque el genoma de ratón carece de secuencias LoxP y por tanto, la expresión de la recombinasa sería inocua, se han descrito secuencias pseudo-LoxP entre las que puede darse una recombinación ilegítima. Además, en estos trabajos, el sistema de modificación genética utilizado (transducción retroviral) proporciona elevados niveles de expresión de Cre, lo que causa la genotoxicidad. Así mismo, varios estudios in vivo han descrito que la sobreexpresión de esta recombinasa puede causar reordenamientos cromosómicos, a través de secuencias pseudo-LoxP, conduciendo a fenotipos no deseados (disfunciones orgánicas en

Discusión

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___________________________________________________________________________ ratones transgénicos) (Schmidt E y cols., 2000; Adams D y van der Weyden L, 2001; Forni PE y cols., 2006; Buerger A y cols., 2006). En nuestro sistema, hemos empleado un vector de transferencia génica adenoviral (no integrativo en el genoma huésped) para la modificación genética de las células, lo que limita la duración e intensidad de la expresión proteica a la necesaria para la deleción génica del VEGF (ver apartado 4.1.2 de “Resultados”). Esta estrategia elimina la posibilidad de inestabilidad genómica consecuencia de la expresión persistente de la recombinasa. Respecto al estudio de la potencial tumorigenicidad de la línea de queratinocitos de ratón deficiente en el VEGF, se acepta el ensayo in vitro (formación de colonias celulares en medio semisólido) como válido en la determinación de la tumorigenicidad celular. Si bien muchos trabajos utilizan sólo este método (Morier L y cols., 2004) o como complementario al ensayo in vivo (Swason SK y cols., 1988; Allen-Hoffmann BL y cols., 2000), se optó por utilizar el sistema in vivo, más restrictivo, de inyección subcutánea, pues se ha visto, por ejemplo, que las células HaCaT (línea celular de queratinocitos humanos inmortalizada espontáneamente) exhiben esa característica maligna o transformada in vitro, pero no son tumorigénicas en ratones inmunocomprometidos (Breitkreutz D y cols., 1998; Boelsma E y cols., 1999; Schoop VM y cols., 1999). El ensayo de tumorigenicidad in vivo con la línea de queratinocitos deficiente en el VEGF y la línea parental se mantuvo durante 8 semanas. La ausencia de tumores durante este tiempo en los ratones nos permite afirmar que las células sometidas a este estudio, no sólo carecen de propiedades tumorigénicas, sino que además la presencia del VEGF endógeno no constituye un evento que conduzca a la manifestación de un fenotipo transformado en células inmortalizadas. Este resultado es compatible con el de numerosos estudios que demuestran la necesidad de activación oncogénica para la malignización (Rak J y cols., 1995b; Grugel S y cols., 1995; Larcher F y cols., 1996; Chin L y cols., 1999). En el siguiente apartado se discutirán estas cuestiones de manera más exhaustiva. En definitiva, los resultados obtenidos indican que los clones de queratinocitos deficientes en el VEGF se originan de tejido normal, se mantienen normales a través de los subcultivos y no se muestran invasivos, por lo tanto, presentan características compatibles con las de línea celular inmortalizada espontáneamente y no tumorigénica.

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___________________________________________________________________________ 5.3 PAPEL FUNCIONAL DEL VEGF EN LA TUMORIGÉNESIS CUTÁNEA Tumores subcutáneos Como se mencionó en el apartado 1.5 de “Introducción”, tanto el crecimiento tumoral como la formación de metástasis, son acontecimientos estrictamente dependientes de la formación de nuevos vasos sanguíneos, pues éstos aportan los nutrientes necesarios para la supervivencia tumoral y el medio de diseminación a otros lugares del organismo. En ausencia de neovascularización, un tumor sólido tendrá serias dificultades para crecer y metastatizar, de ahí las terapias antiangiogénicas actuales, encaminadas a bloquear la vascularización de los tumores, además de las terapias tradicionales contra las células tumorales. Diferentes mecanismos pueden ser responsables de la neovascularización de un tumor dependiendo del tipo de tumor, su estado de desarrollo y su localización anatómica. El estímulo angiogénico aparece ante un desbalance entre los factores reguladores de la angiogénesis, y en un tumor este desbalance puede ser consecuencia de la hipoxia en el interior del mismo o de alteraciones genéticas como la inactivación de genes supresores de tumores o la activación de oncogenes (Rak J y cols., 2000a). Aunque en piel humana el oncogén Ras no parece jugar un papel preponderante, la activación de este oncogén está implicada en todos los aspectos relacionados con el fenotipo maligno de las células cancerosas, incluyendo proliferación celular, transformación, invasión y metástasis (revisado por Malumbres M y Barbacid M, 2001). Sin embargo, en piel de ratón, la activación del oncogén Ras parece ser el evento fundamental tanto en la iniciación como en la progresión tumoral (Balmain A y Pragnell IB, 1983). Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que, además de un papel señalizador activando vías que conducen a proliferación celular, la activación de este oncogén también induce la expresión del VEGF en queratinocitos (Larcher F y cols., 1996). Esta asociación indujo a pensar que un aumento de la vascularización sumado a la presencia de estímulos proliferativos, podrían desencadenar un desarrollo tumoral. Sin embargo, estudios posteriores de sobreexpresión del VEGF en piel de ratones transgénicos, demostraron que no es suficiente cualquier estímulo proliferativo (Larcher F y cols., 1998), y que, además, otros factores angiogénicos como el PlGF podrían desempeñar un papel importante en el proceso angiogénico. Si bien la fuente del VEGF la constituyen las células tumorales y su papel en el desarrollo de un tumor parece estar relacionado fundamentalmente con su necesidad de aporte sanguíneo, en el transcurso de esta tesis se han publicado estudios que evidencian la diversidad de opiniones respecto al significado funcional de la producción del VEGF por los

Discusión

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___________________________________________________________________________ fibroblastos del estroma tumoral. De aquí la importancia relativa de los compartimentos epitelial y mesenquimal en la angiogénesis mediada por este factor (Hlatki H y cols., 1994; Ferrara N y cols., 1996b; Viloria-Petit A y cols., 2003; Meadows KN y cols., 2004; Rossiter H y cols., 2004; Dong J y cols., 2004). En este punto se hacía necesario realizar ensayos funcionales en los que la abolición de la influencia del VEGF, desenmascarase la participación de otros factores en la ecuación angiogénica. Estos estudios emplean modelos animales deficientes de tipo condicional para analizar la ausencia de una determinada proteína en un tejido específico. Se impone esta necesidad cuando la proteína eliminada es esencial para el desarrollo embrionario y produce letalidad previa al nacimiento, como es el caso del VEGF, y por tanto es imposible utilizar animales deficientes convencionales (Carmeliet P y cols., 1996; Ferrara N y cols., 1996a; Carmeliet P y cols., 1999). Sin embargo, la deficiencia condicional utilizando el sistema Cre/LoxP (Sauer B y Henderson N, 1988), presenta ciertas desventajas para analizar la funcionalidad de la proteína en tejido adulto, pues requiere complejos y elevados números de cruces de animales para obtener el fenotipo deseado. Además, varios estudios in vivo han demostrado que niveles elevados de expresión de esta recombinasa, en un tejido específico, pueden causar disfunciones orgánicas en los ratones transgénicos (Schmidt E y cols., 2000; Adams D y van der Weyden L, 2001; Forni PE y cols., 2006; Buerger A y cols., 2006). En este estudio nuestro propósito ha sido investigar el impacto de la deleción del VEGF en la tumorigénesis y progresión tumoral bajo un estímulo oncogénico, como es la presencia del oncogén mutado Hras (introducido en los queratinocitos a través de un vector retroviral). En nuestro sistema, no se observó crecimiento tumoral detectable durante el primer tercio del tiempo que duró el estudio, y lo que es más importante, durante la primera mitad del ensayo, todos los tumores (VEGF WT y VEGF -/-) se desarrollaron prácticamente igual en cuanto a volumen y velocidad de crecimiento, de manera que la ausencia del VEGF no sólo no dificultó el proceso de tumorigénesis, sino que no pareció contribuir significativamente en los estadios iniciales del desarrollo tumoral. Posteriormente, alcanzado un determinado volumen, el crecimiento de los tumores por queratinocitos VEGF -/portadores del oncogén Hras (MK VEGF-Hras) se desmarcó notablemente, es decir, el soporte vascular proporcionado por la presencia del factor angiogénico posiblemente acelere el crecimiento tumoral

en esta etapa del desarrollo. El análisis histopatológico

correspondiente al máximo tiempo de estudio (8 semanas), demostró que los tumores VEGFHras se caracterizan por: i) mayor actividad proliferativa medida por la incorporación de

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___________________________________________________________________________ BrdU y ii) mayor grado de indiferenciación medido como un incremento en la expresión de vimentina (Figs. 26 y 29). Respecto a la vasculatura, los tumores formados a expensas de queratinocitos VEGFHras, mostraron una organización característica de vasos en remodelación (capilares pequeños y vasos inmaduros, dilatados e irregulares), concomitante con el incremento en la tasa de crecimiento de estos tumores. Los tumores VEGF -/- Hras muestran, como es previsible, diferencias en la densidad y el tipo vascular: una disminución de la neovasculatura a favor de vasos preexistentes maduros y menos permeables que favorecieron el crecimiento inicial del tumor. Nuestros resultados indican que el VEGF parece prescindible en cuanto al estadio primario de formación del tumor. Sin embargo, su papel resulta crítico en el mantenimiento de un crecimiento tumoral rápido y sostenido una vez sobrepasado un punto crítico, que se establece alrededor de los 15-20 días post-inyección. Estos resultados son, en parte, consistentes con los obtenidos en el modelo in vivo de deficiencia condicional del VEGF en epidermis (Rossiter H y cols., 2004), aunque difieren sustancialmente en cuanto al desarrollo tumoral temprano, pues en dicho ensayo se produce una abolición total del mismo. En este sentido, los resultados obtenidos in vivo encajan bien con el modelo establecido por Bolontrade y cols., 1998, en el que se demuestra que la explosión angiogénica (asimilable al switch angiogénico tumoral establecido por Folkman y cols., 1971), coincide con el desarrollo temprano de tumores benignos (papilomas) en el modelo de carcinogénesis química. Si bien los papilomas de piel de ratón, dependientes de un switch angiogénico temprano, pueden alcanzar volúmenes considerables, el desarrollo neoplásico cutáneo humano es más parecido al modelo de crecimiento radial de tumores generados por inyección subcutánea. Por tanto, en ese sentido nuestro hallazgo (desarrollo tumoral temprano en ausencia del VEGF) podría ser relevante para la clínica. Es decir, la posibilidad de que exista cierto grado de desarrollo tumoral susceptible de switch angiogénico posterior e independiente del VEGF, debería considerarse a la hora de establecer pautas terapéuticas. Otra consideración importante y controvertida es la etiología del tumor y el grado de asociación del tejido tumoral con su estroma. Observaciones previas sugieren tanto la autorregulación por los tumores de su propia actividad angiogénica en células peritumorales no transformadas, debido a la elevada actividad del VEGF en las células estromales (Fukumura D y cols., 1998; Dong J y cols., 2004), como la existencia de otras señales como las mediadas por el EGF o Akt, que parecen modular las respuestas angiogénicas durante desórdenes hiperproliferativos de la piel (Casanova ML y cols., 2002; Segrelles C y cols.,

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___________________________________________________________________________ 2002; Vosseler S y cols., 2005). En nuestro modelo tumoral, la contribución angiogénica del VEGF parece ser más efectiva durante la progresión tumoral que en los estados iniciales de la tumorigénesis, donde posiblemente al switch angiogénico contribuya tanto el VEGF de origen estromal como mecanismos angiogénicos alternativos e independientes de este factor. Aunque histológicamente los tumores observados no presentaban mucho estroma, la presencia del VEGF en los cultivos celulares reestablecidos a partir de los tumores VEGF-/Hras, avala esta posibilidad (Fig. 27). Resultados similares se han obtenido en estudios que investigan el mecanismo de escape del tumor tras la inactivación del VEGF. Viloria-Petit y cols., 2003 utilizan fibroblastos deficientes en este factor para demostrar que el VEGF estromal desempeña un modesto papel en la angiogénesis tumoral por oncogenes. En un modelo similar concluyen que el estroma del tumor es una fuente importante del VEGF y de otros factores angiogénicos e identifican un posible mecanismo de señalización utilizado por las células tumorales VEGF -/- para el reclutamiento de los fibroblastos del estroma (vía receptor del PDGF) (Dong J y cols., 2004). Así mismo, es importante destacar que tanto el modelo in vivo (deficiente condicional) como nuestro modelo ex vivo se basan en la activación del encogen mutado Hras. Este evento molecular es muy infrecuente en el cancer cutáneo (no melanoma) humano. Como se explicó en el apartado 1.5.2 de “Introducción”, uno de los mecanismos primarios que desencadenan la formación de nuevos vasos sanguíneos es la hipoxia o disminución de la tensión de oxígeno. En los tumores generalmente ocurre en las zonas menos vascularizadas, con elevada tasa de crecimiento y desemboca en la aparición de necrosis. La hipoxia, a través del HIF (factor de transcripción sensible a la disminución de oxígeno), es un fuerte inductor del VEGF, y éste a su vez, incrementa la permeabilidad de los vasos neoformados. El incremento en la permeabilidad vascular permite la deposición de una matriz extravascular de fibrina que sostiene el crecimiento endotelial, lo que a su vez conduce al incremento del tamaño tumoral por el aporte sanguíneo y la consiguiente formación de áreas hipóxicas (Senger DR y cols., 1983; Dvorak HF y cols., 1987, 1995). De nuevo la falta de oxígeno es un estímulo para la producción de más VEGF. De los resultados del análisis in vitro de la capacidad proliferativa (Fig. 21), se desprende que tanto las células MK VEGF WT como las MK VEGF -/- deberían ser capaces de generar un crecimiento tumoral a un ritmo similar si el aporte de oxígeno y nutrientes fuese el adecuado. En nuestro caso, el crecimiento de los tumores VEGF -/-Hras se encuentra claramente inhibido respecto al de los VEGF-Hras (Fig. 25C). Sin embargo, tanto en los

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___________________________________________________________________________ tumores VEGF-Hras como en los VEGF -/- Hras no observamos áreas necróticas detectables, por lo que la hipoxia no parece ser crítica como factor estimulador de la superproducción del VEGF. Aunque no se descarta, pues en los tumores VEGF -/- Hras que mostraron un estroma moderado (parece requerir menos aporte de oxígeno por la ausencia de necrosis), el estímulo suministrado por el eje EGFR/Hras está abolido por la falta del gen VEGF. En este sentido, en tumores cutáneos SCC inducidos por Hras activado se ha demostrado que la hipoxia no constituye un estímulo angiogénico (Carmeliet P y cols., 1996 y 1999; Ferrara N y cols., 1996c). La disminución significativa de la tasa proliferativa de los tumores VEGF -/- Hras implicaría entonces algún tipo de autorregulación o que la falta del VEGF ejerciese un efecto directo sobre la proliferación celular, tal como postula un trabajo reciente que demuestra la presencia del receptor VEGFR-1 en queratinocitos epidérmicos (Wilgus TA y cols., 2005). Metástasis El proceso por el cual las células tumorales salen del tumor y acceden a los tejidos adyacentes se denomina invasión. El proceso de metástasis consiste en una colonización secundaria de un tejido distante de la lesión primaria. Completa una cascada de acontecimientos que implican interacciones entre las células tumorales y el organismo huésped: despegue de las células tumorales del tumor primario, migración a través de la membrana basal y estroma circundante, entrada y supervivencia en el torrente sanguíneo, adhesión y extravasación de la pared vascular del tejido a colonizar y finalmente invasión e implantación en el nuevo tejido. La metástasis se verá comprometida si las células tumorales tienen dificultades para superar alguna de estas etapas. Ambos eventos, invasión y metástasis, son los responsables más frecuentes de la letalidad del cáncer y están gobernados por complejos mecanismos. Aunque, como se ha mencionado anteriormente, las vías de señalización activadas a través del oncogén Ras están implicadas en la adquisición del fenotipo maligno de las células tumorales epidérmicas de ratón, los estudios han profundizado más en la fase inicial de formación del tumor (proliferación descontrolada por desregulación del ciclo celular y supervivencia celular), y su contribución en los fenómenos de invasión y metástasis son menos conocidos (revisado por Campbell PM y Der CJ, 2004). El modelo metastásico comúnmente empleado es el de inyección de células transformadas por la vena de la cola del ratón (Bradley MO y cols., 1986). Este modelo permite la observación posterior de los subsecuentes nódulos en distintos tejidos huésped, y

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___________________________________________________________________________ por tanto, el estudio de las últimas etapas del proceso metastásico (supervivencia en el torrente circulatorio e invasión y crecimiento en tejidos distantes). La conversión de muchos tipos celulares de tejidos humanos y murinos en células invasivas y/o metastásicas por introducción de un gen Ras mutado ha sido ampliamente descrita (Pozzatti R y cols., 1986; Fetherston JD y cols., 1989; Brunner G y cols., 1989; Warburton MJ y cols., 1986; Bonfil RD y cols., 1989; Ochieng J y cols., 1991; Gelmann EP y cols., 1992; Boghaert ER y cols., 1994; Keely PJ y cols., 1999; Fujimoto K y cols., 2001). En nuestro estudio hemos inyectado por la vena de la cola de ratones inmunodeficientes queratinocitos de ratón, deficientes en el VEGF y WT, transducidos con el oncogén Hras mutado (MK VEGF-/-Hras y MK VEGF-Hras respectivamente). En nuestro sistema no se detectaron células transformadas deficientes en el VEGF en pulmón, en ninguno de los tiempos de estudio post-inyección (50 y 100 días), a diferencia de las VEGFHras que ya eran visibles macroscópicamente a los 50 días (Fig. 30). Sin embargo, dado que estas células, deficientes en el VEGF, sí originaron tumores primarios, parecería que el proceso tumoral se hubiese detenido en ese punto o que, al menos, las últimas etapas del proceso metastásico estuviesen comprometidas por la ausencia del VEGF. Sin embargo, si bien otros modelos in vivo no nos permiten estudiar mecanismos angiogénicos en estadios tumorales tan avanzados, el modelo metastásico empleado facilita en sí mismo la llegada de las células tumorales a uno de los principales focos de colonización. Una vez en el pulmón, las células deficientes en el VEGF, podrían haber experimentado al menos un discreto crecimiento, por ejemplo, a través de la cooptación de los propios vasos pulmonares (mecanismo descrito por Holash y cols., 1999a en modelos experimentales con inyección de células tumorales, posiblemente aplicable al caso de tumores hematológicos como los linfomas, donde las células tumorales circulan y se desarrollan a través de los vasos). La ausencia de micrometástasis a nivel histológico en los pulmones deficientes en el VEGF, podría indicar que fuese el anidado de estas células lo que estuviese de algún modo comprometido, pues en otros estudios se ha demostrado la presencia de células de melanoma no metastásicas en los pulmones de los animales (García M y cols., 2004). Un análisis para la detección génica de estas células en los pulmones nos habría ayudado a descartar la ausencia del anidamiento. Uno de los principales efectos descritos del VEGF en las ECs es estimular su supervivencia, lo que explicaría el efecto metastático facilitado, sin duda, por el establecimiento de una adecuada red vascular. El VEGF posee efectos adicionales que

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___________________________________________________________________________ podrían ser importantes para la supervivencia y el crecimiento del tumor, así como para el desarrollo de metástasis, incluyendo efectos antiapoptóticos sobre las células tumorales (von Marschall Z y cols., 2000; Bachelder RE y cols., 2001; Pidgeon GP y cols., 2001). Estudios recientes asocian la disminución de diversos efectores para la invasión y formación de metástasis, como el factor de transcripción SSC-S2 y las metaloproteinasas de la matriz extracelular MMP-1 y MMP-9, con una disminución en la expresión del VEGFR-2 en células tumorales y en ECs de la microvasculatura pulmonar, lo que conlleva la pérdida de viabilidad de éstas (Zhang C y cols., 2006). Otros estudios han descrito la contribución en la angiogénesis y diseminación metastásica en cáncer de pulmón de componentes derivados de plaquetas, que aumentan la expresión en las células tumorales de factores proangiogénicos (MMP-9 y VEGF entre otros) (Janowska-Wieczorek A y cols., 2005). Sin embargo, las hipótesis más plausibles son, por un lado, la falta de acción autocrina del VEGF sobre el queratinocito, y paracrina sobre las células del parénquima pulmonar (del mismo modo que las células tumorales facilitan el propio crecimiento tumoral a través de sus efectos paracrinos en las células del estroma, Dong J y cols., 2004). Como se comentó en el apartado 1.4.2 de “Introducción”, el VEGF-A se ha considerado únicamente como un factor angiogénico para la vasculatura sanguínea tumoral, que ejerce su acción a través de su receptor-2 (VEGR-2) y posiblemente a través del -1 (VEGFR-1), expresados en los vasos sanguíneos tumorales. La reciente disponibilidad de marcadores específicos de vasos linfáticos (LYVE-1 y Prox1) ha facilitado investigar los efectos de este factor en la formación de vasos linfáticos asociados a tumores y metástasis (Oliver G y Detmar M, 2002). El estudio realizado por Hirakawa y cols., 2005, proporciona el hallazgo más importante a este respecto: los tumores inducen tanto el crecimiento de vasos sanguíneos como linfáticos, y el VEGF-A promueve esta linfangiogénesis tumoral, bien directamente o modulando la expresión de otros miembros de la familia tradicionalmente implicados como el VEGF-C. Además, el VEGF-A promueve la linfangiogénesis tanto en el tumor primario como en los nódulos linfáticos, lo que facilitaría sustancialmente la diseminación tumoral a través del sistema linfático. Se sugiere entonces la posibilidad de que los tumores primarios “preparen” sus futuros focos metastásicos mediante la producción de factores linfangiogénicos, que a su vez mediarían el transporte eficiente a los nódulos centinelas en primer lugar. Estos resultados abren la posibilidad de que en el moderado éxito de la terapia anti-VEGF-A sistémica (Bevacizumab) en cánceres metastásicos colorrectal y renal, pueda

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___________________________________________________________________________ estar implicada la inhibición de la angiogénesis en vasos linfáticos del tumor primario y de los ganglios linfáticos. Es previsible que, en nuestro modelo, las células deficientes en el VEGF que han formado un tumor primario, no tengan comprometido el anidado en el parénquima pulmonar, sino una disminución en la capacidad de migración-invasión por la falta del factor angiogénico. Esta incapacidad para migrar, per se, limitaría tanto el establecimiento del tumor primario como la formación de metástasis, ejerciendo en esto último un papel determinante. Se impone pues la necesidad de estudiar más adelante estos aspectos en los tumores primarios obtenidos. 5.4 CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DEL PROCESO DE REGENERACIÓN CUTÁNEA EN AUSENCIA DEL VEGF En la piel, el queratinocito epidérmico constituye la fuente principal del VEGF y lo expresa de forma basal constitutiva (Ballaun C y cols., 1995; Weninger W y cols., 1996), salvo en diversos procesos cutáneos inflamatorios y de reparación de heridas que cursan con sobreexpresión de este factor (Brown LF y cols. 1992; Detmar M y cols., 1994; Brown LF y cols., 1995a; Brown LF y cols., 1995b). Sin embargo, en un contexto de cicatrización, en el que el papel angiogénico del VEGF es crítico, fuentes distintas pueden incrementar los niveles de este factor en la piel, por ejemplo, la liberación proteolítica del VEGF unido a componentes de la matriz extracelular dérmica (revisado por Neufeld G y cols., 1999) o por los macrófagos dérmicos que migran a través del lecho de la herida (Brown LF y cols., 1992). Otros factores y citoquinas como el PlGF, FGF2, y las angiopoietinas y trombospondinas, participan en la regulación de la angiogénesis cutánea (Bikfalvi A y cols., 1997; Suri C y cols., 1998; Detmar M y cols., 2000b; Odorisio T y cols., 2002). El VEGF es particularmente eficiente a la hora de promover la angiogénesis cutánea (Larcher F y cols., 1998; Río MD y cols., 1999; Romano Di Peppe S y cols., 2002, Supp DM y cols., 2002) y generalmente, los estudios a este respecto se centran mayoritariamente en el compartimento epidérmico como fuente de factores para la vascularización. La mayoría de las estrategias de sobreexpresión o eliminación génica tienen como diana principal al queratinocito, y por tanto, la contribución de los elementos mesenquimales en los cambios vasculares se encuentra menos caracterizada.

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___________________________________________________________________________ Por este motivo, en el presente estudio se propuso evaluar la contribución relativa del VEGF en la fisiología del proceso de regeneración cutánea, mediante su eliminación específica del componente epitelial epidérmico y/o dérmico. Dada la dificultad que presentan los queratinocitos de ratón para desarrollar modelos de diferenciación in vivo mediante cultivos organotípicos, como se explicó en el apartado 1.6.4 de “Introducción”, hemos utilizado un sistema basado en la capacidad morfogénica intrínseca de las células individuales para adherirse preferencialmente a células de su mismo tipo, cuando se combinan con otros tipos celulares (Moscona A y cols., 1952; Townes PL y Holtfreter J, 1955; Weiss P y cols., 1960). En las células de la piel, las moléculas de adhesión median este efecto (Shimoyama Y y cols., 1989) y se ha descrito que los queratinocitos y fibroblastos humanos pueden reconstituir una piel humana a partir de una población heterogénea (Wang CK y cols., 2000). En el presente estudio hemos comprobado cómo este fenómeno, conocido como spontaneus autocell sorting, es efectivo para que los dos tipos celulares principales de la piel de ratón, se organicen en un equivalente cutáneo atendiendo a sus propiedades de adhesión inherentes e independientemente de la influencia del principal factor angiogénico para este proceso. En un primer ensayo, hemos utilizado cámaras de silicona implantadas en el dorso del animal para inocular las células (Fusening NE y cols., 1978, 1983; Wang CK y cols., 2000). Así mismo, se ha logrado un modelo de trasplante ortotópico de cultivo organotípico basado igualmente en el ensamblaje autónomo de las células. Se ha concebido para validar o complementar los resultados obtenidos en el primer modelo respecto a la regeneración epitelial en ausencia del VEGF, y en segundo lugar, para descartar posibles alteraciones en este proceso debidas a la presencia de una estructura potencialmente influyente en la regeneración de una piel carente de este factor. En ambos modelos de trasplante, el análisis histológico de la piel regenerada no mostró diferencias significativas en cuanto a la morfología de la piel reconstituida deficiente en el VEGF (a nivel epidérmico y/o dérmico) respecto a la de la piel WT (Figs. 31C y 36B). La arquitectura epidérmica muestra signos de normalidad y se identifican claramente las capas basal, espinosa, granulosa y un estrato córneo de células queratóticas en la superficie. La unión dermo-epidérmica es limpia, separando claramente los fibroblastos dérmicos de los queratinocitos epidérmicos.

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___________________________________________________________________________ La introducción en los queratinocitos, a través de un vector retroviral ecotrópico, del gen codificante para el marcador GFP, nos permitió su detección mediante visualización directa de los trasplantes bajo luz azul e inmunohistoquímica. Su localización confinada en la epidermis asegura el origen regenerativo de la misma y no como consecuencia de una reepitelización a partir de los márgenes del trasplante (Figs. 31A y B, 36A). En el modelo de trasplante en cámaras de silicona, los trasplantes permanecen sin esta estructura durante la última semana para facilitar la exposición de los queratinocitos a una interfase aire-líquido. Este paso es clave para obtener una completa diferenciación de todas las capas epidérmicas. Los estudios inmunohistoquímicos para la detección de marcadores del proceso de diferenciación epidérmica (queratinas y proteínas estructurales epiteliales), demostraron la correcta diferenciación de la epidermis en la piel reconstituida, independientemente de la deficiencia del VEGF en uno o ambos compartimentos (Fig. 33). En todos los casos la expresión de la queratina K5 correspondió aproximadamente a su localización normal en células epiteliales basales, y la K10 se detectó en estratos suprabasales, como corresponde a este marcador de diferenciación temprana. Los anticuerpos contra la filagrina y la loricrina evidenciaron los estratos epiteliales diferenciados. El correcto patrón de expresión de estos marcadores indica que la epidermis de los ratones trasplantados con una piel deficiente en el VEGF, no presenta alteraciones en el programa de diferenciación. Este resultado es coherente con una dinámica adecuada en los procesos de proliferación-diferenciación observados en todos los trasplantes. Cabe mencionar que, en los trasplantes en cámara de silicona, los que tienen el VEGF en ambos compartimentos o sólo en el epidérmico (MK WT / MF VEGF-/-), presentaron un epitelio de aspecto moderadamente más trófico. Esta observación se correlaciona con la detección en esos trasplantes de mayor actividad proliferativa, pero no con un desbalance en detrimento del proceso de diferenciación, a juzgar por la expresión correcta y no parcheada de los marcadores característicos de dicho proceso. Respecto al compartimento dérmico en el primer modelo de trasplante, en la piel sin el VEGF (deficiente en dermis y epidermis) y en la deficiente solamente a nivel epidérmico (MK VEGF-/- / MF WT), se observa un menor empaquetamiento celular y un aspecto más colagenoso. Sin embargo, estas diferencias fueron sutiles y variables dependiendo del campo observado.

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___________________________________________________________________________ Los resultados obtenidos en el modelo de trasplante ortotópico revelan diferencias significativas en cuanto a la maduración dérmica (Fig. 39). A este respecto cabe destacar que la regeneración tisular, en este caso a partir de un trasplante, siempre es un proceso que sucede en un contexto de estrés celular e inflamación, que en el primer modelo podría acentuarse por la presencia de la cámara de silicona. Por tanto, estas condiciones podrían ser responsables de la organización dérmica moderadamente alterada. Además, al tratarse de diferencias leves, nos obligó a ser cautos en cuanto a su relación con la ausencia de estímulo angiogénico y a descartar la caracterización más a fondo del componente dérmico desde el punto de vista de la remodelación. El hallazgo de diferencias a este respecto en el segundo modelo de trasplante (ortotópico) mediante una tinción específica para la detección de la cantidad y tipo de colágeno dérmico (Fig. 39), es indicativo de que la presencia del VEGF en los trasplantes aceleraría el proceso de maduración dérmica. Otros trabajos señalan la vascularización dérmica como un fenómeno crítico para el proceso de fibroplasia (Falabella AF y Valencia IC, 2000; García M y cols., 2004; Roth D y cols., 2006). Estos resultados indican que en ausencia del VEGF, el proceso de remodelación dérmica estaría enlentecido en el contexto de un trasplante ortotópico. En ambos modelos de trasplante, el análisis cuantitativo de la neovasculatura mediante la detección del antígeno específico de ECs murinas CD31/PECAM-1, reveló una densidad de estas células significativamente mayor en la dermis de los trasplantes WT respecto a los VEGF -/- (Figs. 35A y 40A). En cuanto al análisis cualitativo y la distribución espacial de los vasos sanguíneos, los capilares que nutren a los trasplantes deficientes en el VEGF se disponen paralelamente al epitelio (distribución análoga a la que presentan en la piel normal), a diferencia de los que se encuentran bajo la influencia de una piel con el VEGF, que lo hacen de forma perpendicular al epitelio e incluso muy cercanos a la unión dermoepidérmica en ocasiones. La ubicación y posición de la vasculatura, cercana a la unión dermo-epidérmica en los trasplantes VEGF WT, posiblemente se deba al efecto quimiotáctico que ejerce el VEGF164

sobre las ECs: el VEGF secretado por los

queratinocitos es capaz de penetrar en la membrana basal como se demostró en estudios previos (Detmar M y cols., 1998) y en la dermis, donde promueve la vascularización a partir de las ECs de la misma.

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___________________________________________________________________________ Como dato anecdótico, durante el procesamiento de los trasplantes, al realizar la resección de los VEGF WT, se advirtió una mejor resistencia mecánica respecto a los VEGF -/-, así como un aspecto más vascularizado en general. Los resultados de la neovascularización son coherentes con la detección significativamente menor, en ambos modelos, de vasos maduros (no dependientes del VEGF) en los trasplantes WT respecto a los deficientes en el factor angiogénico (Figs. 35A y 40A). La deleción parcial de VEGF bien a nivel dérmico o epidérmico reveló una moderada disminución en la densidad de vasos maduros, sin significación estadística. Se puede afirmar entonces que únicamente la deficiencia del VEGF a nivel de los compartimentos dérmico y epidérmico disminuye significativamente la neovasculatura de los trasplantes cutáneos, aunque parece suficiente para obtener regeneración cutánea. Evidentemente existe un nivel crítico de vascularización alcanzado aún en ausencia del VEGF. Posiblemente el compromiso de la vasculatura más interna, como ocurre en los quemados graves, sea el que realmente desafíe la posibilidad de regeneración. En un estudio reciente utilizando un modelo de ratón deficiente en el VEGF a nivel de la epidermis, se han obtenido resultados similares respecto al impacto, fundamentalmente a nivel vascular, de la ausencia del VEGF epidérmico. Se propone una dependencia parcial del VEGF secretado por los queratinocitos para la biología normal de la piel y el proceso de cicatrización (Rossiter H y cols., 2004). Otros estudios han demostrado la importancia del VEGF durante este proceso dada su sobreexpresión por los queratinocitos en una piel dañada. Algunos datos sugieren que otras fuentes pueden sustituir su efecto, por ejemplo, componentes de la matriz extracelular liberados por proteasas secretadas por plaquetas, secreción por macrófagos infiltrados y citoquinas (FGFs, PDGF, TGF β, IL-8, PlGF derivado de queratinocitos y FGF 2) (Kurita Y y cols., 1992; Tonnesen MG y cols., 2000; Failla CM y cols., 2000). Por otra parte, en situaciones que requieren la realización de injertos o trasplantes de piel (úlceras crónicas, quemaduras corporales extensas), la angiogénesis juega un papel crucial en la vascularización del lecho receptor del trasplante, tanto para la toma, como para la supervivencia del mismo. La falta de un lecho vascular contribuye al fallo en la toma del trasplante por dilatar el tiempo de isquemia y deprivación de nutrientes del lecho receptor (Boyce ST y cols., 1995). Sin embargo, se desconoce el papel del VEGF en la morfogénesis y mantenimiento de la piel sana. Estudios sobre la formación del estroma y de nuevos vasos sanguíneos

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___________________________________________________________________________ cutáneos en un contexto no patológico proponen mecanismos angiogénicos adicionales que implican citoquinas angiogénicas, como el FGFb y PDGF-B, que serían liberadas en respuesta a un entorno celular activado y en un compartimento tisular adecuado (Gruss CJ y cols., 2003). En definitiva, si bien los estudios in vivo utilizando la ablación del VEGF epidérmicaespecífica han sido numerosos respecto a su papel en el desarrollo tumoral y procesos de reparación cutánea, no lo han sido así tanto en el desarrollo y mantenimiento de una piel normal. Por otra parte, la mayoría de las estrategias para estudiar la angiogénesis en piel se centran mayoritariamente en el queratinocito como fuente de factores vasculares y por tanto, la contribución de los elementos mesenquimales en los cambios vasculares aún no ha sido suficientemente caracterizada. En este trabajo se ha generado una versátil herramienta in vitro que nos ha permitido estudiar la influencia de la deleción del principal factor angiogénico a nivel de los dos compartimentos cutáneos. Los resultados obtenidos indican que el VEGF no es un factor determinante en el proceso de morfogénesis y regeneración de una piel normal. Sin embargo, el papel actual de otros mediadores, directos o indirectos en la angiogénesis cutánea, como resultado de vías específicas de señalización, aún no han sido suficientemente investigados respecto al VEGF. Así pues, la posibilidad de diseccionar las respuestas angiogénicas en ausencia de la fuerte influencia del VEGF, tanto en el compartimento epidérmico como dérmico, podría ser de gran utilidad para desentrañar otras posibles rutas angiogénicas, así como establecer un mapa comprensible de los diferentes estímulos angiogénicos en piel y tratar de evaluar el impacto individual de cada uno de ellos.

6. CONCLUS ION ES

N o ha y na d a má s fe c und o q ue la i gno r a nc ia c o ns c ie nt e d e s í m is ma J O S É O R T E G A Y G A SS E T

Conclusiones

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___________________________________________________________________________ En esta tesis doctoral se ha realizado un estudio sobre el papel e importancia fisiológica del VEGF en el proceso de angiogénesis cutánea normal y patológica. Se exponen a continuación las conclusiones resultantes de este trabajo: 1. Se ha desarrollado una línea celular de queratinocitos de ratón deficiente en el VEGF. Esta herramienta ha posibilitado el estudio, ex vivo, de la influencia de la deleción del principal factor angiogénico en los procesos de tumorigénesis y regeneración cutánea. 2. La caracterización fenotípica de los queratinocitos de ratón deficientes en el VEGF, demuestra que estas células se originan de tejido normal, se mantienen normales a través de los subcultivos y no se muestran invasivas, por lo tanto, presentan características compatibles con las de línea celular inmortalizada espontáneamente y no tumorigénica. 3. La línea celular de queratinocitos de ratón deficientes en el VEGF, transducida con el oncogén mutado Hras e inyectada subcutáneamente en ratones inmunodeficientes, genera tumores significativamente menores en términos de volumen y velocidad de crecimiento. Estos tumores presentan una reducción significativa en su densidad vascular acompañada por una disminución de la proliferación de las células tumorales. La disminución del crecimiento tumoral se debe, fundamentalmente, a la ausencia de estímulo angiogénico sobre los vasos sanguíneos tumorales. 4. En nuestro modelo tumoral la dependencia de la contribución angiogénica por parte del VEGF, no es absoluta en los estados iniciales de la tumorigénesis donde posiblemente al switch angiogénico contribuya tanto el VEGF de origen estromal como mecanismos angiogénicos alternativos e independientes de este factor. Así mismo, la implicación de este factor parece ser más efectiva en los procesos de mantenimiento y progresión tumoral. 5. En el modelo experimental de metástasis por inyección de células tumorales por la vena de la cola de ratones inmunodeficientes, el VEGF parece ejercer un papel determinante en la formación de metástasis, aunque no limite el establecimiento del tumor primario. Dicho efecto podría deberse a una disminución en la capacidad de

Conclusiones

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___________________________________________________________________________ migración-invasión de las células por la falta del factor angiogénico, sin descartar posibles efectos directos sobre la proliferación-supervivencia celular. 6. El VEGF no desempeña un papel crítico en la fisiología de la célula epidérmica para los procesos de morfogénesis y regeneración normal de la piel, como lo demuestra la correcta morfología y arquitectura cutáneas en los dos sistemas de trasplantes empleados. Sin embargo, este factor repercute favorablemente en la remodelación dérmica. Estos resultados sugieren la posible existencia de estímulos angiogénicos VEGF-independientes capaces de proporcionar un adecuado mantenimiento de la piel in vivo. 7. La deficiencia total del VEGF en la piel disminuye significativamente la neovasculatura de los trasplantes, aunque parece suficiente para obtener regeneración cutánea. Posiblemente el compromiso del plexo vascular más interno sea el que realmente desafíe la posibilidad de regeneración.

7 . B IB LIO GR AF ÍA

El q ue le e muc ho int e nt a r á a lg ún d ía e s c r ib ir W I LLI A M C O W P ER

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