LABORATORIO Nº 3 FENÓMENOS DE MEMBRANAS Y MICROSCOPIA Objetivos 1. Explicar cómo la difusión y la osmosis son importantes para las células. 2. Mencionar factores que afectan la velocidad de difusión. 3. Explicar qué son soluciones hipotónicas, hipertónicas e isotónicas. 4. Identificar las partes del Microscopio. Las membranas celulares son barreras selectivas que separan las células y forman compartimientos intracelulares. Entre sus funciones están: - Regular el transporte de moléculas que entran o salen de la célula o del organelo. - Generar señales para modificar el metabolismo. - Adherir células para formar tejidos. La membrana celular está formada por una capa doble de fosfolípidos, proteínas y carbohidratos. Cada fosfolípido está compuesto por glicerol, ácidos grasos y fosfato, que en conjunto crean una barrera hidrofóbica entre los compartimientos acuosos de la célula. Las proteínas permiten el paso de moléculas hidrofílicas a través de la membrana, determinan las funciones específicas de ésta e incluyen bombas, canales, receptores, moléculas de adhesión, transductores de energía y enzimas. Las proteínas periféricas están asociadas con las superficies, mientras que las integrales están incrustadas en la membrana y pueden atravesar completamente la capa doble. La función de los carbohidratos adheridos a las proteínas (glucoproteínas) o a los fosfolípidos (glucolípidos) es la de adhesión y comunicación intercelular. El colesterol, que es un esteroide (lípido), determina la fluidez de la membrana. Para que la célula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la célula. Las membranas de la célula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partículas (moléculas, átomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de fosfolípidos de la membrana. La manera en que las moléculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las moléculas hidrofóbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a través de la capa de lípidos, mientras que moléculas hidrofílicas, o polares, incluyendo el agua, y las moléculas de mayor tamaño, pasan a través de Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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canales formados por proteínas transportadoras. La regulación del transporte de las moléculas, o la dirección en que se mueven depende de su gradiente de concentración (diferencia en concentración entre dos lugares). Transporte Pasivo: Las moléculas se mueven constantemente debido a su energía cinética y se esparcen uniformemente en el espacio disponible. Este movimiento, llamado movimiento browniano, es la fuerza motriz de la difusión. La Difusión: Se define como el movimiento natural de las partículas de un área de mayor concentración a un área de menor concentración hasta alcanzar un equilibrio dinámico, en el cual el movimiento neto de partículas es cero. La difusión no requiere gasto de energía por parte de la célula y por lo tanto es un movimiento pasivo. Cuando la célula transporta sustancias en contra de un gradiente de concentración (de un área de menor concentración a un área de mayor concentración) se requiere energía (ATP) y sucede movimiento activo. La ósmosis: Es un fenómeno físico relacionado con el movimiento de un solvente a través de una membrana semipermeable. Tal comportamiento supone una difusión facilitada a través de la membrana, sin gasto de energía. La ósmosis del agua es un fenómeno biológico importante para el metabolismo celular de los seres vivos. El componente principal de la célula es el agua, que actúa como solvente (el agente que disuelve) de solutos orgánicos e inorgánicos. El movimiento de agua a través de una membrana selectivamente permeable se llama osmosis (difusión de agua) y sucede siempre del área de mayor concentración de agua (con menor concentración de soluto) al área de menor concentración de agua (con mayor concentración de soluto) (Figura 7.2). El agua se moverá entonces, a favor de un gradiente de concentración hacia el área de mayor concentración de soluto (donde hay una menor concentración de moléculas de agua libres). Cuando la célula contiene una concentración de solutos mayor que su ambiente externo, se dice que la célula está en una solución hipotónica, y como consecuencia, el agua entra a la célula causando que se expanda (Fig. 7.3a). Si la concentración de solutos es mayor fuera de la célula, se dice que la célula está en una solución hipertónica; la célula pierde agua y se encoge (Fig. 7.3c). Si las concentraciones de soluto son iguales en ambos lados de la membrana, se dice que la célula está en una solución isotónica, donde el movimiento neto es cero (Figura 7.3b). La diálisis: Es un proceso que consiste en la movilización de líquidos y partículas de un compartimiento líquido a otro a través de una membrana semipermeable. Clínicamente, la Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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diálisis es el proceso mecánico de eliminar productos residuales del metabolismo proteico sin alterar el equilibrio hidroelectrolítico y restableciendo el equilibrio acido/básico en pacientes con compromiso de la función renal. Por consiguiente, el aparato de diálisis constituye un riñón artificial. Las partículas coloidales pueden separarse de aquellas soluciones verdaderas por diálisis. Transporte activo: Es la que se realiza en contra del gradiente y consumo de energía. Para que ocurra esto, es fundamental lo siguiente:  Existencia de proteínas transportadoras, las que actúan como bombas, impulsando solutos en contra de su gradiente.  Consumo de energía, implicando la hidrólisis de ATP, producto de la fosforilación oxidativa de las mitocondrias. Para este proceso existen dos tipos de proteínas:  La bomba Na+ - K+ que actúa bombeando en contra del gradiente, sacando Na+ hacia el exterior e introduciendo K+ hacia el interior y tiene actividad ATPasa.  Canal de fuga de K+, permitiendo la salida de K+ de la célula a favor de su

gradiente de concentración. Este canal es también ligeramente permeable al Na+.

ACTIVIDADES PRÁCTICAS: A. DIFUSION: 1.- SÓLIDO EN LÍQUIDO:  Llene dos tubos de ensayo con 5 ml de agua destilada, añade un terroncito de sacarosa en el tubo 1 y en el otro un caramelo de preferencia de color.  Deje el tubo en la gradilla y obsérvelo cada 10' hasta que termine el laboratorio. Observe y anote los cambios. 2.- LIQUIDO EN LÍQUIDO:  Deje caer una gota de tinta en un vaso pp que contenga 100 ml de agua y tome el tiempo de difusión. 3.- GAS EN LÍQUIDO:  En un tubo de ensayo coloque 2 ml de amoniaco (precaución reactivo irritante) y tapone el tubo con una mota de algodón embebido con azul de bromo-timol. Observe. B. OSMOSIS EN UNA MEMBRANA ARTIFICIAL:  Amarre 1 bolsitas de diálisis en un extremo fuertemente e introduzca en el interior hasta que quede llena de una solución de sacarosa al 30% más rojo congo (colorante), amarre bien el otro extremo formando una pastilla, entonces lave varias veces con agua destilada para evitar contaminación.  Luego sumérjalo en un vaso pp que contenga 150 ml de agua destilada, tratando que el nivel del agua cubra la pastilla formada por la bolsa.  Déjelo hasta el final del laboratorio observando cada 10' que va sucediendo con la bolsita y el nivel de la solución contenida en el vaso. Después de pasado el tiempo realice EL TEST DE BENEDIC a una muestra del agua del vaso. Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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C. DIÁLISIS:  Introduzca en una bolsa de diálisis amarrada en un extremo una solución de clara de huevo más una solución de cloruro de sodio al 30%, hasta que la bolsa quede llena.  Luego amarre el otro extremo y lave prolijamente la bolsita con agua destilada varias veces.  Realice la prueba del biuret y del nitrato de plata antes de introducir la bolsita dentro del vaso pp, luego montar el aparataje. Esto se realiza para verificar que el agua destilada que está utilizando este libre de iones.  Sumerja la bolsita en un vaso pp con 150 ml de agua destilada y deje reposar durante 1 a 2 horas. FENÓMENOS DE MEMBRANAS: Hemólisis, y crenación  Enumere 3 porta objetos bien limpios, con una lanceta pinche el dedo medio y agregue una gota de sangre en cada porta objetos.  Cada alumno debe colocar su sangre o bien uno de cada grupo, no se debe compartir la muestra de sangre.  Luego añada una gota de las diferentes soluciones: - Nº1 Cloruro de Sodio: = 0,9%, - Nº2 Agua Destilada = 0 % - Nº3 Cloruro de Sodio= 5%. Observe al microscopio.  Realice sus anotaciones de sus observaciones MICROSCOPIA El microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a simple vista. Ello se consigue mediante un sistema óptico compuesto por lentes de cristal, que al ser atravesadas por los rayos de luz reflejados por el objeto, forman una imagen amplificada de él. Los microscopios se pueden clasificar desde un punto de vista muy sencillo en: Simples y compuestos. Se le da el nombre de microscopio simple a todas aquellas lentes con montura o sin ella, de distintos espesores y diámetros, biconvexas o plano convexas, que nos permiten amplificar los objetos, comúnmente conocidas como lupas. Un microscopio compuesto está constituido por la combinación de dos sistemas de lentes convergentes. Uno próximo al ojo del observador, por lo cual se llama ocular y que actúa como microscopio simple. Otro próximo al objeto denominado objetivo. Descripción del microscopio compuesto: 1.- Sistema Mecánico: a.- Pie o base: Su función es dar estabilidad al microscopio y soporte a las demás Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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partes que lo integran. b.- Platina: Es una pieza metálica cuadrada con un orificio central por el cual pasa la luz, posee a su vez un carro móvil, llamado Carro de Vernier, con una pinza que sujeta la muestra permitiendo su movilización para la observación. c.- Brazo: Es el soporte que va desde la base hasta el sistema óptico, es el sostén de dicho sistema. d.- Tornillo macrométrico o de enfoque rápido: Se utiliza para conseguir un ajuste aproximado de la imagen a observar. e.- Tornillo micrométrico o de enfoque fino: Su desplazamiento es mucho más lento y permite enfocar claramente nuestra imagen. f.- Tornillo de carro de Vernier: Se utiliza para desplazar el portaobjetos sobre la platina hacia los lados, hacia atrás y hacia delante. 2.-Sistema óptico: a.- Oculares: Son lentes que se encuentran en el cabezal del microscopio, separados por un diafragma que permite el movimiento de estos para obtener una imagen con mejor calidad y comodidad de visión. b.- Objetivos (seco 4X, 10X, 40X e inmersión 100X): Es la parte más importante del microscopio, se conforman por varias lentes que corrigen las aberraciones, se encuentran en la parte baja del cabezal sujetos a un carrusel o revolver que permite el cambio de un objetivo a otro. 3.- Sistema de iluminación: a.- Fuente luminosa: Es la luz proporcionada por una lámpara ubicada en la base del microscopio, la cual pasa a través de la platina proporcionando iluminación a la muestra. b.- Condensador: Es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación. c.- Diafragma: Es un dispositivo ubicado el interior del condensador, también denominado diafragma-iris cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos con mayor desviación. CUIDADOS PARA EL MICROSCOPIO  El microscopio deberá guardarse cubierto con su funda, para protegerla del polvo.  No debe trasladarlo de un lugar a otro, de hacerlo debe pedir ayuda a algún profesor.  Deberá de cerciorarte que las lentes se encuentran limpias de polvo antes de utilizarlo, de no ser así, deben limpiarse cuidadosamente utilizando para ello un papel especial para lentes, el cual se obtiene en las ópticas o bien un paño de batista de uso exclusivo. Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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 Las lentes no deberán quitarse del sitio que les corresponde para que no se llene de polvo el interior del equipo.  Cuando se utilice aceite de inmersión deberá limpiarse las lentes una vez terminada la observación, ya que si llegara a secarse sería difícil de limpiarse, esto puedes hacerlo con el paño y un poco de solución de limpieza.  Las lentes podrán limpiarse con solución de limpieza, partes metálicas o plásticas del microscopio deberán limpiarse con un trapo de algodón y se les da brillo con aceite mineral.  Todas las preparaciones que se hagan y se tengan que teñir, limpiarlas del reverso para que no pierdan nitidez.  Al terminar la observación, deberás limpiar perfectamente las lentes y dejar en posición de descanso en microscopio.  En caso de tener alguna duda en el cuidado del equipo o alguna falla mecánica o eléctrica, deberás de dar aviso a los profesores del laboratorio. FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO 1.- Lavar las lentes con alcohol. 2.- Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia. 3.- Usar papel para limpiar las lentes. 4.- Poner los dedos sobre las lentes. 5.- Guardar los objetivos del microscopio con aceite de inmersión 6.- Transportar el microscopio de un lado a otro.

BIBLIOGRAFIA: 1.- De Robertis/Hig-Ponzio, "Biología celular y molecular", 2010 MATERIALES: - TOALLA NOVA, AZUCAR, FOSFOROS, CARAMELO O PASTILLAS CON COLOR, PAPEL CELOFAN INCOLORO. - LAPIZ GRAFITO, GOMA, COMPAS y PAÑO DE BATISTA (20x20 cm). Dra. Delia Laime C., Lic.Aída Cofré F. ; Depto. de Biología ; Facultad de Ciencias

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