INTRODUCCION Las levaduras son microorganismos unicelulares , que se reproducen asexualmente por gemación en la mayoría de los casos , aunque también lo hacen por fisión sexualmente por formación de esporas, estas al multiplicarse con facilidad en la naturaleza , su aislamiento requiere de tiempo ya que las diferentes especies de levaduras se encuentran entremezcladas , de modo que integran comunidades mixtas. Por esta razón, para poder estudiar un tipo de levadura, especifico es necesario producir un cultivo puro, es decir , un cultivo en el que solo haya una especie, en el laboratorio es posible cultivar levaduras en un medio agar (sustancia solidificante que se extrae de algas marinas )enriquecido con nutrientes apropiados. Ese medio puede se vertido en un tuvo de ensayo o caja petri (un recipiente plano de vidrio o plástico cubierto con una tapa), cuando el medio de agar esta caliente su estado es liquido pero conforme se enfría va gelificandose hasta que se convierta en un materia sólido. En ese medio sólido, las levaduras no pueden moverse ni muy lejos ni muy rápido. HIPOTESIS El aislamiento y purificación de levaduras se puede realizar partiendo de la flora epifítica que se encuentra en la superficie de frutas (pomelo). MICROORGANISMOS Todos pertenecen al reino vegetal y son sumamente sencillos (mono o pluricelulares) se llaman Hongos mohos, o levaduras , siendo el grupo mas importante el de los hongos. La fermentación alcohólica se practica sembrando dichos microorganismos en los líquidos que han de fermentar bajo la forma de levaduras prensada. Se clasifican las levaduras en dos grandes grupos : altas y bajas , que se distinguen entre si por la temperatura a la cual son capaces de provocar la fermentación alcohólica ( 6 °C a 10°C para las bajas y de 15 °C a 20 °C para las altas) además del hecho que las latas (aerobias ) tienden a reunirse en la superficie de los líquidos que fermentan , mientras que las baja se depositan (anaerobias) En las fabricas de alcohol se usan generalmente los fermentos de altas por se mas activos mientras que en la elaboración de la cerveza se eligen los fermentos de bajo por influir la lentitud de la operación sobre la calidad del producto. Fase 1ª 2ª 3ª Vino hecho

1960 C. pulcherrima S. rosei S. ellipsoideus S. oviformis

1985 K. apiculata S. rosei S. ellipsoideus S. oviformis

1997 K. apiculata Schiz. japonicus S. ellipsoideus Brettanomyces bruxellensis

CARACTERISTICAS DEL POMELO • Familia: Rutaceae. • Género: Citrus. • Especie: Citrus paradisi Macf. • Porte: Reducido Tronco corto y copa compacta. Brotes color púrpura. Escasa espinosidad. 1

• Hojas: medio−grandes, algo vellosas, con alas grandes, nervios muy marcados y olor típico. • Flores: grandes de color verdoso y estambres reducidos. • Fruto: Hesperidio. Consta de: exocarpo (flavedo: presenta vesículas que contienen aceites esenciales), mesocarpo (albedo: pomposo y de color blanco) grueso y endocarpo (pulpa: presenta tricomas con jugo) blanco, rosa o rojo. De tamaño grande y forma redonda y algo aplastada. Superficie con glándulas prominentes con aceites. VARIEDADES Las variedades de pomelo pueden clasificarse en dos grupos. En el primer grupo se incluyen las variedades blancas o comunes, siendo la variedad Marsh la más importante. En el segundo grupo engloba las variedades pigmentadas, que están adquiriendo mayor popularidad entre los consumidores. MATERIALES Y DISEÑO DE EXPERIENCIAS MATERIAL DE LABORATORIO. • Matraz Erlenmeyer • Pipetas de 1 y 10 ml. • Tubos de ensayo • Algodón • Cajas petri • Vaso de precipitado • Asa • Gradilla • Mechero EQUIPOS DE LABORATORIO.− • Autoclave • Estufa • Microscopio REACTIVOS. • Metabisulfito de sodio • Alcohol 98 % • Agar • Estracto de malta PROCEDIMIENTO PREPARACION DEL PIE DE CUBA. 1.− Obtener el mosto de pomelo 2.− Distribuir el mosto en frascos erlenmeyer hasta 2/3 de capacidad tapar con algodón y esterilizar. 3.− Inocular en un ambiente estéril la cepa seleccionada a 48 hrs. A temperatura ambiente. PREPARACION DEL MOSTO.−

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• Seleccionar y pelar el pomelo • En un vaso de precipitado estrujar el pomelo hasta obtener un jugo (despapillado ) mosto virgen . • Filtrar el mosto • Colocar 200 ml del jugo al matraz erlenmeyer • Agregar cierta cantidad de bisulfito. • Tapar con algodón la boquilla. • Dejar fermentar por 24 horas. PREPARACION DE LA MALTA Y EL MEDIO DE CULTIVO Preparar 450 ml. de agua + 150 malta en un erlenmeyer. Calentar 38 − 40 −−−− 20 min. 50 − 55 −−−− 20 min. 70 − 75 −−−− 20 min. Luego filtrar con tela Colocar para cada 100ml de malta 1,8 g de agar Calentar la malta hasta ebullición y colocar el agar Colocar 10 ml de medio de cultivo a las cajas petri y tubos de ensayo Esterilizar las cajas petri y tubos de ensayo con agar durante 1 hora. Dilución 1:10 Sembrado SEMBRADO Colocar 9 ml de agua a cada tubo de ensayo y tapar con algodón Esterilizar en autoclave Utilizar 3 tubos de ensayo y colocar al primer tubo 1 ml del mosto Del primer tubo sacar 1ml y colocar al segundo tubo Del segundo tubo sacar 1ml y colocar al tercero tubo Luego realizar el sembrado del tercer tubo a la caja petri 0,5 ml Al dia siguiente volcar la primera caja petri y a los 2 días siguientes observar la presencia de levaduras. Realizar el mismo procedimiento para cada caja petri

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CRECIMIENTO Y SELECCIÓN DE LEVADURAS Observar al microscopia las 4 cajas petri para el reconocimiento de levaduras Seleccionar 4 colonias de levaduras como máximo Repicar las 4 colonias de levaduras a otra caja petri divididas en 4 partes haciendo el sembrado por estrías A los 3 días observamos al microscopio Se toma 4 puntos de cada estría y repicar para ver si son puras PURIFICACION Observar al microscopio y si son puras realizar dilución Hacer una dilución 1:10 de la concentración de levaduras Sembrar la dilución de levaduras en cajas petri Esperar 2 días el crecimiento de diferentes especies de levaduras para el aislamiento y purificación Separar las diferentes fases de levaduras Repicar las diferentes fases ya purificadas en tubos de ensayo. RESULTADOS Días 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 20

Actividades Preparación de mosto y preparación de tubos Toma de la primera muestra Toma de segunda muestra Volcar la primera caja y toma de la tercera muestra Toma de la cuarta muestra, observar la primera caja y volcar la segunda Volcar la tercera caja y observar la segunda caja Volcar la cuarta caja y observar la tercera caja Observar la cuarta caja observación microscópica de las 4 cajas petri Repetimos las actividades Observación microscópica de las 4 cajas petri

Personas

Observaciones

Todos Todos Todos Todos Todos

Observamos bacterias en la primera caja

Todos

Observamos bacterias en la segunda caja

Todos

Observamos bacterias en la tercera caja

Todos

Observamos bacterias en la cuarta caja No se observo por presencia de bacterias en todas las cajas

Todos Todos Todos

Solo se observo una porque las de mas se contaminaron con bacterias y hongos.

Todos 4

Observación de la única caja que obtuvimos ( 4 cepas)

Las levaduras observadas no eran puras por lo tanto se tubo purificar (mezcla de primera y segunda fase.

21

Preparación de medio de cultivo para purificación de levaduras

Todos

22

Sembrado de cepas a cajas petri

Todos

24 25

Observación al microscopio Repique a los tubos Observar

Todos Todos

26

Se hizo una dilución de 1:10 para obtener cepas puras Se obtuvo cepas puras de segunda fase

Todos

Contaminación con hongos

Todos

Se obtuvo cepas puras de segunda fase y libres de contaminación.

Repetir el repique a otros tubos 28

Observación de los tubos repicados

CAJA No 1 COLONIA N° 1 ( caja petri sin bacterias utilizamos para purificar levaduras de segunda fase por tener mayor cantidad ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − +++ − −

Campo 2 + +++ − −

Campo 3 − +++ − −

COLONIA N° 2 ( caja petri sin bacterias utilizamos para purificar levaduras de segunda fase por tener mayor cantidad ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − +++ − −

Campo 2 − +++ − −

Campo 3 + +++ − −

COLONIA N° 3 ( caja petri sin bacterias utilizamos para purificar levaduras de segunda fase por tener mayor cantidad ) Fases 1ra 2da 3ra

Campo 1 + ++ −

Campo 2 − ++ −

Campo 3 − ++ − 5

Bacterias

−

−

−

Campo 2 − − − −

Campo 3 − + − −

COLONIA N° 4 (descartado pocas levaduras ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − −

CAJA No 2 COLONIA N° 1 ( muestra descartada porque tiene muchas bacterias) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 + ++ − ++

Campo 2 − + − +++

Campo 3 + ++ − +++

Campo 4 − ++ − +++

Campo 3 ++ ++ − +++

Campo 4 + + − +++

Campo 3 − + − +++

Campo 4 − − − −

COLONIA N° 2 ( muestra descartada porque esta contaminada con bacterias) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − ++

Campo 2 + +++ − +

COLONIA N° 3 (Muestra descartada porque esta contaminada con bacterias) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 + ++ − +

Campo 2 + − − +

COLONIA N° 4 ( Muestra descartada porque esta contaminada con bacterias )

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Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Muestra 1 − + − +++

Muestra 2 + +++ − +++

Muestra 4 − ++ − +++

Muestra 3 + ++ − −

CAJA No 3 COLONIA N° 1 ( muestra descartada porque tiene muchas bacterias) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − ++

Campo 2 + +++ − +

Campo 3 − − − +

Campo 4 + ++ − +++

COLONIA N° 2 ( muestra descartada porque esta contaminada con bacterias ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − +++ − ++

Campo 2 + ++ − +

Campo 3 ++ + − ++

Campo 4 − +++ − +++

Campo 3 − ++ − +++

Campo 4 − ++ − −

Campo 3 − +++ − +++

Campo 4 ++ ++ − −

COLONIA N° 3 ( muestra descartada porque esta contaminada con bacterias ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 + ++ − +

Campo 2 + + − +

COLONIA N° 4 ( muestra descartada porque esta contaminada con bacterias ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − +++

Campo 2 + + − +++

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CAJA No 4 COLONIA N° 1 ( campo descartado por la presencia de bacterias y hongos ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 + − − ++

Campo 2 + + − ++

Campo 3 − + − ++

Campo 4 − + − +

COLONIA N° 2 (Campo cubierto con bacterias) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − Predominante

Campo 2 − − − Predominante

Campo 3 − + − Predominante

Campo 4 + − − Predominante

Campo 2 + − − Predominante

Campo 3 − − − Predominante

Campo 4 − − − Predominante

Campo 2 + − − Predominante

Campo 3 − − − Predominante

Campo 4 + − − Predominante

COLONIA N° 3 ( Campo cubierto de bacterias ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − Predominante

COLONIA N° 4 ( Campo cubierto de bacterias ) Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − − − Predominante

RESULTADOS DE LA OBSERVACION DEL MICROSCOPIO * CAJA N° 1 (Inoculamos del campo 1 y 2 para purificar de la segunda fase)

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* CAJA N°2 (Descartada por la presencia de bacterias) * CAJA N° 3 (Descartada por la presencia de bacterias) *CAJA N° 4 (Descartada por la presencia de bacterias) PURIFICACION SACAR DE LA CAJA N° 1 del campo 1 o 2 para purificar de segunda fase Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − +++ − −

Campo 2 − +++ − −

Campo 3 − +++ − −

Campo 4 − +++ − −

Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − −

Campo 2 − +++ − −

Campo 3 − + − −

Campo 4 − ++ + −

Fases 1ra 2da 3ra Bacterias

Campo 1 − + − −

Campo 2 − + − −

Campo 3 − ++ − −

Campo 4 − + − −

Luego de la observación tomar en cuenta una colonia representativa de cada fase (2da fase,) que sean puras (libre de bacterias y que sean uniformes), esta colonia tomarla con un asa en punta y diluirla en una solución de H2O estéril (10ml), de esta primera solución sacar 0,5ml y diluirla en H2O de 9 ml. De agua estéril, de esta segunda solución sacar 0,5ml y diluirla en H2O estéril, de 9 ml. ésta tercera solución sacar 0,7ml (solución final) y colocarla en una caja petri con agar para lograr un aislamiento de levaduras. Este procedimiento se realiza para cada fase. • Luego de haber sembrado las cajas petri con la solución de la muestra diluida, de 2−3 días ya se observa el crecimiento de las colonias de levaduras que son muy separadas, entonces logramos aislarlas. Comprobar que las colonias se an de una sola morfología a través de la observación por un microscopio y que carezcan de bacterias. Caja petri de 1ra fase Caja petri de 2da fase

No se observo

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Caja petri de 3ra fase CONCLUSIONES

Todas las colonias son uniformes y carecen de bacterias. (100% puros). No se observo

Después de realizados los estudios comprobamos la hipótesis de nuestro trabajo de investigación . En esta práctica no pudimos cumplir totalmente con los objetivos planteados debido a que en los diferentes sembrados realizados se presento una contaminación por bacterias y hongos lo que impidió diferenciar claramente y purificar, las diferentes fases de crecimiento de las levaduras (levaduras de segunda fase). En estos trabajos es común observar este tipo de inconvenientes por lo que el proceso experimental que concluye con la purificación de una cepa, lleva un largo periodo de tiempo, con el que no se contó en esta oportunidad

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