MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

Práctica 4 Fraccionamiento de inmunoglobulinas mediante precipitación en sal Semestre B 2010 Introducción Las moléculas de proteínas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteínaproteína, proteína- agua, proteína-ión. La solubilidad de una proteína depende del balance relativo entre las interacciones proteínasolvente, lo cual tiende a mantenerla en solución y de las interacciones proteína-proteína, las cuales hacen que la proteína se agregue y precipite. La fuerza iónica de las soluciones es de particular importancia para especificar cual de estos tipos de interacciones predomina. Las proteínas son solubles en un medio acuoso debido a que sus aminoácidos que contienen grupos hidrofílicos, expuestos sobre a superficie de la proteína, interactúan con las moléculas de agua del medio, formando una capa de solvatación. Estos grupos hidrofílicos son proporcionados por los aminoácidos básicos (arginina, histidina y lisina), ácidos (aspartato y glutamato) y neutros (asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína). Cualquier compuesto que interfiera con estas interacciones entre los grupos laterales de los aminoácidos hidrofílicos de la proteína y las moléculas de agua, reducirá la solubilidad de la proteína. A medida que las interacciones de la proteína con el agua decrece, las interacciones entre proteína-proteína se vuelven mas importantes, y la proteína se agrega, y precipita de la solución. Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína-agua es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - agua es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteínaproteína o disminuya la interacción proteína-agua disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación). Un variado número de métodos bioquímicos pueden ser utilizados para reducir las interacciones hidrofílicas y propiciar la precipitación selectiva de proteínas, tales como: • Fraccionamiento de proteínas por salado. • Precipitación selectiva con un solvente inorgánico que reduce el agua de hidratación y también reduce la constante dialéctica de la solución. El fraccionamiento con etanol es comúnmente utilizado para separar fracciones de proteínas del plasma sanguíneo • Precipitación selectiva utilizando polímeros no-iónicos como el polietilenglicol, el cual opera reduciedo la disponibilidad de las moléculas de agua, así como interactuando con algunas proteínas de la mezcla En el fraccionamiento por salado, grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína-agua porque le quita la capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteína, lo

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

2

que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las proteínas. Si este proceso se lleva a cabo a baja temperatura (alrededor de 4ºC), las proteínas precipitan sin que se desnaturalicen. Luego, las proteínas precipitadas pueden separarse mediante centrifugación y posteriormente pueden ser re-disueltas en una solución buffer y dializada por varias días para eliminar el sulfato de amonio. El método de precipitación con sulfato de amonio es uno de los más utilizados para preparar fracciones crudas de inmunoglobulinas a partir del suero. Las fracciones crudas contienen todas los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgM, IgA, IgE IgD), además de otras proteínas contaminantes, tales como, las β globulinas, ciertas proteínas de alto peso molecular, así como proteínas atrapadas en el precipitado floculento. La concentración de sulfato de amonio a la cual los anticuerpos precipitan varía entre las especies. La mayoría de los anticuerpos de conejo precipitan en un 40% de saturación, mientras que los anticuerpos de ratón necesitan de 45 a 50% de saturación. Precipitaciones con sulfato de amonio al 33.3% de saturación generan preparaciones mas puras pero con menor rendimiento. Las fracciones crudas de inmunoglobulinas, luego de dializarlas con una solución tampón adecuada, pueden ser utilizadas directamente. En otras situaciones, las fracciones crudas constituyen el primer paso en la producción de preparaciones altamente purificadas de inmunoglobulinas. El objetivo de la práctica es obtener la fracción de inmunoglobulinas totales (γ-globulinas) del suero de conejos inmunizados empleando la técnica de precipitación de proteínas por sulfato de amonio al 40%. PROCEDIMIENTO Preparación de la solución saturada de sulfato de amonio: Prepare con anticipación la solución de sulfato de amonio ya que requiere varias horas para que la solución se sature completamente. 1.

Diluya 500g de sulfato de amonio (grado para análisis) en 500 ml. de agua destilada.

2.

Caliente la mezcla a 50°C con agitación continua, hasta que la sal se disuelva completamente y filtre rápidamente mientras la solución está aún caliente. Deje enfriar la solución durante varias horas o durante la noche a temperatura ambiente mientras el sobrenadante se satura. En este proceso se formaran cristales y estarán presentes en el envase mientras esté saturada la solución. El contenido de sulfato de amonio en la solución saturada depende de la temperatura (d=1.2450 a 25°C). El pH de esta solución es aproximadamente 5 y debe ser ajustado a pH 7.2 añadiendo amonio para evitar la adición de iones extraños.

3.

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

3

Método de precipitación de inmunoglobulinas totales del suero 1.

Determine el volumen del suero a procesar ( X ml).

2.

Diluya el suero 1:2 en PBS para obtener un volumen final de 2X ml.

3.

Transfiera el suero diluido (2X ml) a un vaso de precipitación sobre un baño de hielo. Añada la barra de agitación y colóquelo sobre un agitador magnético. Con una bureta deje caer lentamente y con agitación continua 2X ml de una solución saturada de sulfato de amonio a pH 7.8 (ajustado justo antes de usarla), para obtener una concentración final de sal de 50% de saturación. El sulfato de amonio debe ser añadido lentamente para asegurar que la concentración local en el sitio donde cae la gota no exceda la concentración de la sal deseada, evitando así la precipitación instantánea de la albúmina junto con la fracción de γ globulinas precipitada. Agite continuamente la solución evitando la formación de burbujas y espuma.

4.

Mantenga la muestra precipitada durante 30 minutos a 4°C.

5.

Resuspenda la fracción de γ globulinas precipitada agitando moderadamente durante 5 minutos.

6.

Centrifugue la mezcla a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C.

7.

Descarte cuidadosamente el sobrenadante que contiene la fracción de albúmina y resuspenda la fracción de γ globulinas precipitada en un volumen de PBS igual al de la muestra original (X ml). Si existe algún material insoluble centrifugue para eliminarlo.

8.

En el baño de hielo y con agitación continua reprecipite la fracción de γ globulinas añadiendo lentamente un volumen equivalente a dos terceras partes del volumen de la muestra (2/3 X ml) de solución saturada de sulfato de amonio para obtener una saturación final de la sal al 40%.

9.

Mantenga la fracción de γ globulinas precipitada a 4°C durante 30 minutos o más.

10. Centrifugue a 10.000 g durante 15 minutos a 4°C. 11. Repita los pasos del 7 al 11 de reprecipitación en solución saturada de sulfato amonio al 40%, dos veces más.

de

12. Descarte el sobrenadante (fracción de pseudoglobulina) y resuspenda la fracción de γ globulinas precipitada en PBS, 1/10 X ml. del volumen original. 13. Transfiera la fracción de γ globulinas a una bolsa de diálisis previamente agua destilada.

lavada

14. Dialice contra solución salina 0.85% realizando 6 cambios de la misma durante horas a 4°C, hasta que el sulfato de amonio no sea detectable.

con

24a 36

15. Examine el dializante para verificar la presencia de sulfato de amonio de 2 a 3 horas después de cambiar la solución salina: i) A una pequeña cantidad de dializante añada

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

4

igual volumen de cloruro de bario saturado. i) Si aparece un precipitado continúe la diálisis. ii) si no aparece, la fracción de globulinas es satisfactoria para realizar la determinación de proteínas. Si va a proseguir con la purificación de las inmunoglobulinas utilizando la matriz de DEAE (técnica de Batch), realice los últimos dos cambios de diálisis en PBS pH8. 16. Después de completar la diálisis retire la solución de γ -globulinas del tubo de diálisis y centrifugue para remover cualquier partícula insoluble, a 1400 g durante 10 minutos. 17. Determine la concentración de las proteínas de una dilución 1/10 de la fracción de γ globulinas utilizando el método de Lowry (ver Anexo) o mida su absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro equipado con luz U.V. Nota para el cálculo de proteínas: a 280 nm una D.O.=1 tiene una concentración de 0.74 mg/ml γ globulinas. 18. Almacene la fracción de γ -globulinas concentrada en presencia de azida de sodio al 0.02%.

Materiales, equipo y reactivos necesarios 2 Vasos de precipitación de 250 ml y 100 ml Baño de hielo Cilindro graduado de 25 ml Pipetas Pasteur y bulbo Bureta de 50 ml y soporte Agitador magnético/ barra de agitación Bolsas de diálisis pH metro Centrifuga equipada con refrigeración 4 Tubos de centrifugación de 50 ml, 15ml Spectronic 20 Reactivos del Lowry Solución de (NH4)2 SO2 saturado Solución diluida de amonio o NaOH para ajustar el pH del (NH4)2 SO2 Solución buffer fosfato 0.0 M (PBS), pH 7.2 Solución salina 0.85%, 4 litros Muestra de suero de conejo inmunizado Solución de cloruro de bario saturado Es esencial preparar una curva estandar de calibración con muestras de una proteína con concentración conocidas en paralelo con la solución de proteína desconocida o muestra problema a fin de determinar cuantitativamente la concentración de la proteína problema. Cuantificación de proteínas según el método de LOWRY El método de Lowry permite la cuantificación colorimétrica de proteínas en solución mediante el uso del reactivo de fenol Folin-Ciocalteu, el cual reacciona con los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas para producir una solución de color azul que puede ser leida en un colorímetro o espectrofotómetro. Debido que la intensidad del color azul desarrollado puede variar con diferentes proteínas, es esencial trazar una curva estandar de calibración haciendo reaccionar muestras de diferentes concentraciones conocidas de una proteína con el reactivo Folin-Ciocalteu en paralelo con

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

5

muestras de la solución de proteína desconocida. La intensidad del color de las muestras se mide en un espectrofotómetro de tubos, a una longitud de onda de 750 nm o 550 nm. La curva estandar se construye con los valores obtenidos de absorbancia (A750) versus los µg o concentración de la proteína conocida. La concentración desconocida de la muestra de proteína problema puede estimarse utilizando como referencia la curva estandar. Para generar la curva estandar se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones: • Todas las muestras deben ser leidas secuencialmente después de la aparición del color. • Cada ensayo de una solución de proteína desconocida debe estar acompañada por una nueva curva estandar. • Las muestras se deben ensayar por duplicado o triplicado. • La curva estandar permanece lineal sólo en el rango de 5µg-100µg de albúmina de suero bovino (BSA). • Después de determinar la absorbancia a A750, se construye una curva estandar con los valores promedios de A750 versus µg (o concentración) de proteína estandar. En la gráfica la cantidad de BSA se expresa como µg en el eje de las abcisas (eje x), mientras que los valores promedio de la A750 se grafican en el eje de las ordenadas (eje y). Este método es un ensayo confiable para la cuantificación de proteínas en solución, con pocas variaciones entre diferentes clases de proteínas. Sin embargo, tiene la desventaja que la reacción es lenta y algunas sustancias pueden causar interferencias.

Reactivo y equipo para el método de Lowry: 1mg/ml Albúmina de suero bovino cristalizada (BSA) 20 g Carbonato de sodio (Na2CO3), PM=105,99 g/mol 0,1 N Hidróxido de sodio (NaOH), PM=40 g/mol 1 g Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 ⋅ 5H2O), PM=249,68 g/mol 2 g Tartrato de sodio Na2C4H4O6(2 H2O), PM=230,089 g/mol Reactivo de fenol Folin-Ciocalteu Agua destilada Espectrofotómetro ( Spectronic 20) 13 Tubos de ensayo de 5 ml de capacidad (13x 100 mm) pipetas gradilla vortex parafilm Prepare las soluciones siguientes: 1.

Solución A, 1 litro Na2CO3 al 2% en 0,1 N de NaOH Agregue agua destilada hasta completar 1 litro

2.

Solución B1, 100 ml CuSO4⋅ 5H2O al 1% en agua Agregue agua destilada hasta completar 100 ml

3.

Solución B2, 100 ml

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

6

Na2C4H4O6(2 H2O) al 2% en agua Agregue agua destilada hasta completar 100 ml 4.

Solución C, 100 ml 98 ml Solución A 1 ml Solución B1 1 ml Solución B2

5.

Solución D, 5 ml 2,5 ml de reactivo de fenol Folin-Ciocalteu 2,5 ml de agua destilada

Estimación de la concentración de una proteína en solución 1.

Prepare una solución estandar de 1mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) en agua destilada.

2.

En 12 tubos de ensayo prepare por duplicado diluciones seriadas de la solución de albúmina bovina estandar (1mg/ml) en agua destilada, en 6 pasos entre 0 y 200 µg de proteína en un volumen final de 600 µl, como se indica en la tabla siguiente.

3.

Prepare por duplicado una dilución de la muestra de proteína que desea determinar su concentración. Como primera aproximación prepare 25µg:600 µl de agua.

Tubo 1 1’ 2 2´ 3 3´ 4 4´ 5 5´ 6 6´

M M’

µg Solución estandar BSA 1mg/ml 25 25 50 50 100 100 150 150 200 200

? ?

µl Solución estandarB SA 1mg/ml 25 25 50 50 100 100 150 150 200 200 µl Volumen muestra 25 25

µl H2O dest.

ml Solución C

ml Solución D

600 600 575 575 550 550 500 500 450 450 400 400

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ml Solución C 3 3

0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 ml Solución D 0.3 0.3

µl H2O dest. 575 575

4.

Agregue 3.0 ml de solución C a las muestras en cada tubo.

5.

Agite en el vortex y deje reposar a temperatura ambiente 10 minutos.

A750

A750

MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 4: Fraccionamiento de inmunoglobulinas con sulfato de amonio

7

6.

Agregue 0.3 ml de solución D. Agite vigorosamente en el vortex.

7.

Después de 30 minutos, cuantifique la absorbancia a 750 nm en el Spectronic 20. Si la absorbancia es mayor que 0,5 unidades, mida a 550nm.

8.

Grafique la curva estandar de absorbancia (color) versus µg o concentración de BSA, colocando la absorbancia A750 en las ordenadas y los µg o a concentración calculada de BSA en la abscisa. A partir de este gráfico determine la concentración de proteínas de la muestra problema.

9.

Si la absorbancia de la muestra de proteína desconocida se encuentra fuera del rango de sensibilidad del ensayo, el margen de error se hace muy grande. En tales circunstancias, la muestra de proteína de concentración desconocida debe diluirse o concentrarse, según sea el caso, y realizar un nuevo ensayo.

Bibliografía Practical Immunology por L. Hudson y F.C. Hay, segunda edición. Editoral Blackwell Scientific Publications, 1980. Antibodies. A laboratory Manual por E. Harlow y D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. pp 283 Handbook of experimental Immunology. Vol. 1. Immunochemistry. Tercera edición. Editado por D.M. Weir. Blackwell Scientific Publications. 1979. pp 7.1

Mc/MC Septiembre 2010