METODOLOGÍA GENERAL PARA EL ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS I y II

MEDIOS DE CULTIVO

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Definición: Medio de cultivo son ambientes nutritivos artificiales, que pueden ser líquidos, sólidos o semisólidos, que le proveen al microorganismo todos los requerimientos fundamentales, una fuente de energía y condiciones ambientales, para su crecimiento y multiplicación y, que se debe aproximar lo más posible a su habitat natural o nicho ecológico. Los medios de cultivo pueden ser clasificados: 1.- Por su consistencia: - líquidos (no permiten el aislamiento de colonias) - sólidos (permiten el aislamiento y observación de colonias) 2.- Por su origen: - sintéticos (químicamente definidos) - complejos (o naturales) Los medios sintéticos se preparan adicionando cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos a un volumen de agua destilada. Por lo tanto, se conoce la composición química exacta de un medio

definido. Los medios complejos se preparan a partir de sustancias

naturales de origen vegetal o animal de composición química no rigurosamente constante. Los medios complejos emplean levaduras

hidrolizados de caseína

u otras sustancias muy

(proteína de la leche), carne,

soja,

nutritivas. Tales hidrolizados están disponibles en el

comercio en forma de polvo y pueden ser preparados con facilidad y disueltos en agua destilada para preparar un medio de cultivo. 3.- Por su composición:- comunes: contienen una fórmula nutritiva básica que permiten el crecimiento de microorganismos poco exigentes. - enriquecidos: su calidad nutritiva mejora por el agregado de componentes tales como: sangre, huevo, líquido ascítico, extracto proteíco de cianobacterias, leche, y se utilizan en el cultivo de bacterias exigentes. 4.- Por su función: - medios de enriquecimiento: son medios de cultivo líquidos que sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la multiplicación de ciertos grupos

e inhiben el

desarrollo de las especies restantes. Incluyen compuestos químicos específicos o requieren condiciones físicas especiales como temperatura, pH. Ejs: caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece el crecimiento de especies de Salmonella y Shigella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC a 44,5º C temperatura que favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias; agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae e inhibe otros microorganismos presentes en la muestra. - medios selectivos: son medio sólidos que permiten el desarrollo de ciertos microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se logra alterando las condiciones físicas del medio de cultivo o adicionando compuestos químicos inhibidores. Ej: - cambiando el pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus se puede adicionar a los medios de cultivo ác. acético para lograr un pH de 5,4, inadecuado para otras bacterias acompañantes.

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- agregando antisépticos: colorantes como cristal violeta, eosina y verde brillante, se usan para inhibir gérmenes Gram positivos. También se usan con igual propósito las sales biliares. - agregado de antibióticos: en microbiología clínica, se usan antibióticos de espectro reducido que inhiben microorganismos cuyo estudio no interesa, pero que no afectan los gérmenes que se están investigando. - altas concentraciones osmóticas: el medio agar manitol salado (NaCl 7.5%) permite el desarrollo de Staphylococcus aureus. - medios diferenciales: permiten demostrar características metabólicas de un determinado grupo de microorganismos. Los medios de cultivo deben llevar incluidos en la fórmula

el

sustrato adecuado para la característica metabólica que se desea estudiar y un sistema indicador que refleje por cambio de color, los cambios que hayan tenido lugar. Ej: medios de cultivo para pruebas bioquímicas, Ej. triple azúcar hierro agar (TSI). - medio de transporte: se usan cuando transcurre un cierto tiempo entre la toma de muestra y el procesamiento.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN LOS REQUERIMIENTOS DE OXÍGENO

Las bacterias se pueden clasificar en: Aerobios - Estrictos: crecen con tensiones de oxígeno normales. Tipo de metabolismo: respiración aerobia. - Microaerófilos: son aerobios que necesitan bajas tensiones de O2 y una atmósfera enriquecida en CO2. Pueden realizar respiración aerobia. Anaerobios - Facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias (metabolismo respiratorio) como anaerobias (metabolismo fermentativo). - Estrictos: son inhibidos o incluso mueren en presencia de O2. Metabolismo: fermentativo o respiración anaerobia. - Anaerobios aerotolerantes: toleran el O2 y crecen en su presencia pero no pueden usarlo (metabolismo fermentativo).

Las bacterias anaerobias estrictas son destruidas por el oxígeno probablemente porque son incapaces de eliminar algún producto tóxico derivado del metabolismo del oxígeno como: el anión superóxido (O2 ), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO.). Además, las flavoproteínas, quinonas, tioles, y proteínas con hierro y azufre también

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pueden llevar a cabo la reducción de oxígeno a anión superóxido. El superóxido y el radical hidroxilo son los más reactivos de todas las formas tóxicas del oxígeno y pueden oxidar cualquier compuesto orgánico de la célula, como las macromoléculas. Enzimas que destruyen formas tóxicas del oxígeno El superóxido y el peroxido de hidrógeno son las formas tóxicas más frecuentes, de modo que las enzimas que destruyen estos compuestos están ampliamente distribuidas. La enzima catalasa ataca el peróxido de hidrógeno formando oxígeno y agua. Otra enzima que destruye el peróxido de hidrógeno es la peroxidasa en presencia de NADH para originar agua. El superóxido es destruido por la enzima superóxido dismutasa para formar una molécula de peróxido de hidrógeno y oxígeno. La acción conjunta de la superóxido dismutasa y de la catalasa pueden convertir el superóxido en en agua y oxígeno. Los microorganismos anaerobios obligados carecen de alguna de estas enzimas. En algunas Archaea anaerobias obligadas presentan otro método de eliminar el superóxido. Está presente la enzima

superóxido reductasa, que elimina el superóxido. Esta enzima

reduce el anión superóxido a H2O2 sin la producción de O2.

El H2O2 producido por la

superóxido reductasa , es eliminado por enzimas semejantes a las peroxidasas que producen agua como producto final. MEDIOS DE CULTIVO PARA BACTERIAS ANAEROBIAS

Los medios de cultivo para anaerobios en general no se diferencian mucho de los usados para aerobios, salvo que son mucho más ricos, habitualmente los requerimientos para el crecimiento pueden cubrirse agregando extracto de levadura, sangre (para medios sólidos), suero y líquido ascítico (para medios líquidos), vitamina K, hemina, hidratos de carbono fermentables, además deben contener agentes reductores, generalmente sulfuro ferroso, tioglicolato o cisteína capaz de reaccionar con el oxígeno reduciendolo a agua. También se adiciona un indicador de oxidoreducción como resazurina. La resazurina es incolora en su forma reducida y rosada en estado oxidado. Los medios (sólidos y líquidos) a usar deben ser frescos (recién preparados) o almacenados en un ambiente anaerobio hasta el momento de ser usados. La base nutritiva puede fraccionarse, autoclavarse y guardarse hasta el momento de ser usado. Luego se funde, se agregan los suplementos, se plaquea, y se siembra. Los medios líquidos (si no son pre-reducidos: PRAS) deben hervirse a Baño María durante 15 minutos antes de usarlos para eliminar el oxígeno disuelto en el medio de cultivo, y enfriar rápidamente bajo canilla para evitar que se reoxigenen. Usarlos inmediatamente.

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MEDIOS NO SELECTIVOS Se usan bases altamente nutritivas. Medios sólidos como agar sangre (sangre de carnero, conejo, caballo), agar sangre Brucella, agar infusión cerebro corazón suplementado (Vit K, hemina), y líquidos como caldo tioglicolato, medio de carne cocida, medio de carne cocidaglucosa. Dos suplementos fundamentales para el desarrollo de los anaerobios a ser incluidos en la preparación de los medios de cultivo para anaerobios son: -

Hemina

-

Vitamina K

MEDIOS SELECTIVOS Su fórmula básica es tan nutritiva como la de los medios no selectivos pudiendo incluir sangre, vit. K y/o hemina. Ej. agar yema de huevo-.neomicina (EYA+N) puede ser útil en el aislamiento de especies de Clostridium en poblaciones microbianas mixtas, agar sangre gentamicinavancomicina, agar SPS (sulfito-polimixina-sulfadiacina) y otros. La diferencia fundamental está en la incorporación de antibióticos o inhibidores del crecimiento de ciertos grupos de microorganismos: gentamicina, cicloserina-cefoxitina, amicacina, kanamicina-vancomicina. MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS De no tratarse de medios PRAS, es necesario en el momento de sembrar someterlos a ebullición (15 min), enfriar bajo canilla y sembrar de inmediato. Incubar en anaerobiosis. INDICADORES DE OXIDO-REDUCCIÓN A.- Resazurina: es incolora en su forma reducida y rosada en estado oxidado. Esta indicador se incorpora en la fórmula del medio de cultivo. B.- Azul de metileno: es incoloro al estado reducido y azul en su forma oxidada. Se pueden adquirir en el comercio en forma de tirillas indicadoras las que se pueden utilizar tanto en jarras como desecadores o bolsas especiales. A la temperatura de 35-37º C, el cambio de color se observa a las 5 h luego de la incubación. MÉTODOS PARA OBTENER UN AMBIENTE ANÓXICO (ANAERÓBICO) -

Sistema evacuación-reemplazo (E-R)

-

Jarra anóxica de Gas-Pak

-

Anaerocult

-

Cámara anóxica (o anaeróbicas)

-

Vaselina-Parafina (Vas-Par)

-

Medios pre-reducidos anaeróbicamente esterilizados (PRAS)

-

Sobre generador de CO2

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CULTIVO DE RICKETTSIAS, CLAMIDIAS Y VIRUS

Debido a que estos microorganismos son parásitos intracelulares obligados, es necesario cultivarlos en células vivas, ya sean provenientes de animales, huevos embrionados o cultivos celulares in vitro.

Cultivos celulares En un principio se creyó, que las células somáticas podían proliferar indefinidamente sin cambios, con sus características celulares originales siempre que las condiciones de cultivo fuesen favorables. Estudios recientes, han demostrado que se pueden establecer cultivos que proliferan en forma logarítmica por un cierto número de pasajes. Eventualmente, los cultivos entran en una fase estacionaria y luego se pierden. En este proceso, la tasa de crecimiento y el rendimiento total declinan a cero. Los cultivos celulares han reemplazado a los huevos embrionados como el tipo de medio de cultivo preferido para muchos virus.

Estos cultivos consisten en células desarrolladas en

medios especiales en el laboratorio, y como en general, son conjuntos de células bastantes homogéneos y se pueden propagar y manejar en forma similar a los cultivos bacterianos, es más conveniente trabajar con ellos que con animales o huevos embrionados. Cultivos celulares primarios. Son aquellos cultivos celulares obtenidos directamente de tejidos u órganos; conservan el número diploide característico del organismo que les dio origen, como así también las características morfológicas. Las células se obtienen por separación quirúrgica aséptica de tejidos normales, disgregación de las mismas mediante tratamiento enzimático (por ejemplo tripsina) que rompe el cemento intercelular. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras cuenta glóbulos (cámara de

Newbauer)

y se siembran en

botellas, placas o policubetas

de plástico o vidrio

(específicamente señaladas como “para cultivo celular”, ya que han sido tratadas

para

asegurar una mejor adhesión celular, no son tóxicos y presentan excelente calidad óptica). Todo el material a emplear debe estar estéril. Las células producen material glicoproteíco que permite su adhesión a las superficies del recipiente. Estas células se cubren con un medio de cultivo que les proporciona la presión osmótica, los nutrientes y los factores de crecimiento necesarios para que crezcan, y el cultivo se incuba a 37º C en una cámara de cultivo celular. Es importante adicionar antibióticos para impedir contaminaciones. Las células sedimentan, se adhieren al vidrio y luego empiezan a multiplicarse formando islotes que van cubriendo toda la superficie hasta formar una monocapa (capa de células crecidas sobre una superficie). Cuando dos islotes se unen, se inhibe su crecimiento y se produce el fenómeno que se

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denomina inhibición por contacto. Estas células pueden ser removidas mediante pasajes o subcultivos del recipiente de cultivo para obtener cultivos secundarios.

Subcultivo

-

El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal.

-

En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte a la inicial.

-

Las células adheridas a soportes sólidos ser despegadas de este soporte y separadas por tripsina. Se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Tripan) y se cuentan en cámara de Neubawer.

-

Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.

El mayor inconveniente de los cultivos primarios es que al cabo de unos pocos pasajes las células mueren y es necesario obtener un nuevo cultivo primario. Sin embargo, presentan un amplio espectro de sensibilidad a los virus por lo que son sumamente útiles en el laboratorio de diagnóstico virológico. En un cultivo en monocapa las células presentan aspecto ya sea fibroblástico (irregular) o epitelial (poligonales). Los cultivos primarios presentan una mezcla de los dos tipos. Los cultivos primarios más utilizados son los fibroblastos de riñón de mono, células embrionarias (de pollo o de riñón humano) o células amnióticas.

Características de un cultivo celular primario

-

Conservan la morfología de las células que le dieron origen

-

Fenómeno de inhibición por contacto

-

Mantiene el número diploide de cromosomas

-

Forman cultivo en monocapa

-

Su crecimiento es limitado

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Líneas celulares Los virus pueden cultivarse en líneas celulares primarias o continuas (Ver Fig 1). Las líneas celulares primarias, derivadas de cortes de tejidos, tienden a morir después de unas pocas generaciones. Ciertas líneas celulares diploides, desarrolladas a partir de embriones humanos, se pueden mantener durante unas 100 generaciones y se utilizan mucho para el cultivo de virus que requieren un huésped humano. Las líneas celulares continuas o inmortales, se trata de células transformadas (cancerosas) que se pueden mantener durante una cantidad indefinida de generaciones. La gran ventaja que presentan estas líneas celulares es que pueden repicarse un número ilimitado de veces en el laboratorio (múltiples pasajes), no siendo necesario recurrir a tejidos animales como es necesario hacer con los cultivos primarios. Una de estas líneas, es la línea celular HeLa, derivada de un carcinoma de cervix , o las HEP-2 de un carcinoma de laringe. Un problema importante con el cultivo celular es que las líneas celulares se deben mantener libres de contaminación microbiana. Las líneas celulares inmortales provenientes de células

neoplásicas o

transformadas

presentan una serie de características: -

Inmortalidad: pueden repicarse un número indefinido de veces en el laboratorio (múltiples pasajes).

-

Independencia del sustrato: o sea que pueden crecer en suspensión o formar colonias en sólidos.

-

Pérdida de inhibición por contacto: originan la aparición de multicapas

-

Bajo requerimiento de suero: pueden elaborar sus propios factores de crecimiento.

-

Alta eficiencia de plaqueo: capacidad de formar clones a partir de una célula aislada.

-

Corta tasa de duplicación, es el tiempo en que las células duplican su número.

-

Aneuploidía: alteraciones en el número de cromosomas

-

Tumorigenicidad: capacidad de generar tumores en animales de experimentación.

Requerimientos del crecimiento celular Para obtener un rendimiento óptimo del cultivo deben tenerse en cuenta una serie de requisitos como: -

Suministrar medios de cultivo recién preparados y con una composición adecuada para renovar nutrientes y eliminar productos tóxicos del metabolismo celular.

-

Establecer un equilibrio entre el volumen del medio de cultivo y el especio aéreo para permitir el intercambio gaseoso entre ambos y determinar distintas variables que

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favorezcan el desarrollo del cultivo como cantidad de suero del medio, pH, temperatura óptima, cantidad de células sembradas, etc. Requerimientos nutricionales -

Aminoácidos: se requieren para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos e incluso pueden actuar en el transporte de iones. Por la ausencia de ciertas enzimas, las células no pueden producir todos los aminoácidos necesarios. Son trece los aminoácidos considerados esenciales que no pueden ser producidos por la propia célula.

-

Carbohidratos: los azúcares proveen fuente de energía para las células. La glucosa es el azúcar más usado, puede ser reemplazada por galactosa.

-

Vitaminas: se requieren principalmente del grupo B. La mayoría forman parte de las coenzimas involucradas en el metabolismo.

-

Iones inorgánicos: son requeridos para regular la presión osmótica y el pH, como cofactores en diversos procesos enzimáticos y favorecen la adhesión de las células a la superficie del recipiente. Los iones esenciales son: sodio, potasio, fosfato esencial para la energía metabólica, bicarbonato que actúa como buffer y en varias funciones bioquímicas, calcio y magnesio. Los medios de cultivo son generalmente

tamponados (bicarbonato de sodio) para

mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen, además un indicador de pH como el rojo fenol que cambia de color a medida que aparecen catabolitos ácidos como resultado del metabolismo celular. -

Antibióticos: se suelen adicionar antibióticos (penicilina y estreptomicina) y antimicóticos (anfotericina) para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica, respectivamente.

-

Suero: numerosos tipos de suero (equino, bovino) han sido usados como complementos efectivos de los medios de cultivo para promover el crecimiento celular. El suero bovino es el más usado. El suero de animales jóvenes es el más efectivo y, el suero fetal es el preferido por carecer de actividad tóxica y de anticuerpos que puedan afectar el uso de los cultivos en experimentación viral. Requirimientos fisiológicos

-

Temperatura: la mayoría de las células toleran un pH entre 6,8-7,8. el pH óptimo para el crecimiento de células de mamíferos está entre 7,2-7,4.

-

Tensión de CO2: los cultivos crecen a una temperatura de 37º C en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de aire..

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-

Presión osmótica: la presión osmótica normal para células de mamífero es de alrededor de 7,6 atmósferas. En los medios de cultivo, el cloruro de sodio es el más contribuye al mantenimiento de la presión osmótica. Los iones inorgánicos y la glucosa también deben ser controlados a fin de regular este parámetro.

-

Humedad del incubador: considerando que es importante el rápido equilibrio entre el medio de cultivo y la fase gaseosa aire-CO2, los frascos de cultivo no se cierran herméticamente, por lo que hay que prevenir la evaporación para no variar la osmolaridad deseada. Se puede mantener la cámara de incubación con una humedad relativa cercana a la saturación, utilizando agua a la misma temperatura.

Medios de cultivo Para seleccionar un medio de cultivo, deben ser tenidos en cuenta varios factores: las células en sí mismo, su origen y adaptación previa y el propósito del cultivo, tiempo de supervivencia necesario, crecimiento requerido, etc. Podemos seleccionar un medio rico, o un medio de mantenimiento, o un medio con algún agregado requerido por el tipo celular. Ejs. de medios de cultivo:

-

Medio Basal de Eagle (BME) con los aminoácidos esenciales. Siempre se suplementa con suero fetal bovino al 10%

-

Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM) es el medio de uso más corriente, contiene más aminoácidos y mayor concentración que BME. Se usa para casi todos los tipos de células y requiere la adición de suero.

-

RPMI 1640: amplio rango de aplicaciones

-

MEM modificado por Dulbeco (DMEM). Etc.

Mantenimiento de rutina de una línea Un cultivo celular, tanto si es un cultivo primario, como una línea continua, necesita periódicos cambios de medio y en determinado momento es necesario realizar un subcultivo de las células que proliferan. Los intervalos entre cambios de medio y entre subcultivos, varían de una línea celular a otra, dependiendo de la tasa de crecimiento y del metabolismo. Por ej si trabajamos con células de crecimiento rápido, como las HeLa es necesario realizar subcultivos 1 o 2 veces por semana; en cambio, células de crecimiento lento pueden subcultivarse cada 15 días.

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La necesidad de un cambio de medio de nuestro cultivo está dada por cuatro factores principales: -

Caída de pH: la mayoría de las células dejan de crecer cuando el pH cae de 7,0 a 6,5 y pierde viabilidad entre 6,6 y 6,0. Con la práctica, el cambio de color del medio es indicador del pH.

-

Concentración celular: a muy alta concentración, los nutrientes del medio se agotan más rápidamente, debiendo ser renovados.

-

Característica celular: la mayoría de las células no transformadas detiene su crecimiento, a una concentración alta, cuando alcanzan a ocupar toda la superficie disponible. Este fenómeno de denomina inhibición por contacto. Las células transformadas en cambio continúan creciendo y deben ser subcutivadas con mayor frecuencia.

-

Morfología celular: se deben observar al microscopio, señales de deterioro celular, como granulación perinuclear, vacuolas citoplasmáticas, redondeo o desprendimiento celular.

Preparación de células, tejidos u órganos para cultivos primarios Para iniciar un cultivo, podemos partir ya sea de un órgano pequeño o trozo de órgano, de un tejido o fragmento de tejido o bien de células aisladas, para lo cual podemos emplear algunos de estos métodos: -

corte de tejido u órgano con tijeras o bisturí

-

disgregación por medios mecánicos: los tejidos mantenidos en medio de cultivo son forzados a pasar a través de tamices de malla cada vez más fina, hasta obtener pequeños agregados celulares que luego son diluidos y cultivados.

-

Disgregación enzimática: se utilizan enzimas a fin de disgregar las células que forman un tejido en unidades individuales. Por este método se logra el mayor rendimiento. Las enzimas comúnmente usadas son tripsina, colagenasa y otras, que se preparan en sol. salinas balanceadas, libres de calcio y magnesio, debido a que estos iones aumentan la estabilidad de la matriz intercelular. También se pueden agregar agentes quelantes (EDTA) para la captación de estos iones.

Conservación de células Las células vivas, pueden ser preservadas por largos períodos, conservándolas en estado de congelación. Grandes lotes de células se mezclan con glicerol o dimetilsulfóxido y se

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subdividen

en un cierto número de ampollas que luego se cierran herméticamente y se

congelan. Las temperaturas que pueden alcanzarse por los distintos métodos de enfriamiento oscilan entre -60º C y -190º C. Es conveniente guardarlas a menos de – 130º C, a fin de retardar el crecimiento de los cristales de hielo.

Condiciones de almacenamiento

Supervivencia estimada

Nitrógeno líquido -196º C

varios años

Nitrógeno gaseoso -150º C

varios años

Freezer con hielo seco -79º C

hasta 2 años

Freezer mecánico -45 a -65º C

hasta 1 año

Detección de los virus en cultivos celulares Puede reconocerse por: -

Su efecto citopático (ECP) o acción citopatogénica (ACP): muchos virus se replican produciendo alteraciones de las monocapas celulares. Otros virus producen inclusiones características localizadas en el núcleo o en el citoplasma de las células.

-

Algunos virus, si bien son capaces de replicar en cultivos celulares, no producen acción citopatogénica visible al microscopio. Sin embargo, como producto de la replicación viral se liberan al medio de cultivo proteínas de origen viral como por ej. hemaglutininas que pueden detectarse por reacciones de hemaglutinación u otros antígenos que pueden ponerse en evidencia por reacciones de fijación de complemento,etc.

HUEVOS EMBRIONADOS El uso de huevos embrionados de gallina para el estudio de virus y Rickettsias de reconocida patogenicidad para el hombre, data de 1931. Los huevos embrionados muestran frente a ciertos virus una susceptibilidad que no la ofrecen los animales de laboratorio más comunes, por ello se los utiliza para el aislamiento de algunos virus, en la detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes, en la producción de vacunas y antígenos de diagnóstico. Para que los huevos embrionados proporcionen las condiciones óptimas de multiplicación de los virus, es necesario que reúnan las condiciones apropiadas de edad y que el volumen del inóculo, la temperatura y tiempo de incubación, así como también la vía de inoculación sean las adecuadas.

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Cuidado de los huevos fértiles antes de la inoculación Los cuidados son necesarios para mantener la vitalidad del huevo joven, debiendo recogerse lo más pronto posible después de la postura y refrigerarse a 10º C y no a 4º C. A temperaturas menores de 25º C permanece en estado estacionario (inactivo). Para mantener la fertilidad no deben conservarse más de una semana antes de incubar.

Selección de los huevos Los huevos blancos son mejores que los oscuros o manchados ya que permiten

su

observación por transiluminación. Los quebradizos y de cáscara delgada se desecha por provenir de gallinas enfermas ya que son menos fértiles y fáciles de romper. Las aves óptimas para producir huevos son las que carecen de enfermedades y anticuerpos, se mantienen con dieta equilibrada y exenta de antibióticos, ya que los anticuerpos maternos y antibióticos alimentarios pueden pasar al vitelo e interferir la multiplicación de gérmenes sensibles. Incubación artificial Pueden usarse incubadores corrientes de laboratorio con las debidas modificaciones, o mejor aún las incubadoras automáticas de los criaderos de pollos. Condiciones de incubación -

Temperatura: Tem. óptima: 37º C Tem. excesiva letal: 40-43º C los primeros 5 días 45-47º C luego de los 5 días Tem. elevadas subletales: producen patas caidas, dedos torcidos, etc. Tem. menores a 37º C: retrasan el desarrollo pero los embriones las

toleran -

Humedad relativa: 60%

-

Presiones parciales: Conc. normal de aire: O2:21%, CO2: 0.5%

Se incuban con el extremo más abultado hacia arriba, que es por lo general por donde el pollo va nacer y donde se localizan los puntos de inoculación.

Exámen visual de los huevos incubados Los huevos se examinan al trasluz antes de la inoculación para determinar su desarrollo normal, y deben ser examinados todos los días después de la misma para comprobar su supervivencia. El exámen debe realizarse en una habitación oscura, usando una fuente luminosa potente. Se pueden observar las siguientes características: -

En huevos infértiles y en los incubados menos de 4 días:

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Se ve una sombra difusa por el vitelo, ligeramente móvil, rodeada por la albúmina a manera de halo claro. -

En huevos fértiles luego de 4 días de incubación: Se observa un borde fino de vasos sanguíneos dispuestos sobre la mancha oscura, junto a la cámara de aire y adherido a la cáscara. El vitelo tiende a girar, entonces el embrión se desarrolla en la parte superior. El embrión se visualiza como una sombra que se mueve desde el sexto día en adelante, realizando algún movimiento independiente. La vena umbilical que va desde la membrana corioalantoidea al embrión, puede distinguirse como un vaso sanguíneo flotante.

-

En embriones muertos desaparecen los vasos sanguíneos y puede verse un fino anillo dentado que son los glóbulos rojos ubicados en los vasos sanguíneos más inferiores.

-

Para embriones de más edad se puede ver el perímetro inmóvil del embrión muerto y los vasos sanguíneos son pocos o no se ven.

Inoculaciones en embriones de pollo El embrión de pollo

es un organismo muy sensible a las infecciones bacterianas y

micóticas, por lo tanto las inoculaciones deben realizarse adoptando medidas de esterilización, debiendo manejar con gran precaución el material a inocular porque contiene generalmente microorganismos patógenos. Vías de inoculación: -

Membrana corioalantoidea: la membrana corioalantoidea se forma por la fusión del corion y la alantoides (a partir del día 12). Se debe producir artificialmente una cámara de aire, para lo cual se desinfecta la cáscara en el sitio de inoculación (zona media) y se la abre cuidando de no lesionar la membrana corioalantoidea. Se hace otro orificio en la zona de cámara de aire y mediante una pera de goma se aspira hasta desprender la membrana produciéndose así una cámara artificial. El material a inocular es depositado sobre la

membrana corioalantoidea y luego se sella. Algunos virus (herpes virus,

poxvirus) producen en las células ectodérmicas pústulas visibles microscópicamente que incluso pueden valorarse por recuento. Muchos de estos virus producen inclusiones características en las células infectadas, demostrables en secciones histopatológicas. Otras aplicaciones son: el estudio de la morfología vírica, aislamiento de virus desde tejidos infectados (viruela), producción de virus de la vacuna para uso como vacuna.

-

Cavidad amniótica: se emplean embriones de 7-14 días de edad. Para realizar la inoculación se hace un orificio en la cáscara de aproximadamente 1.5 cm de diámetro, se debe transparentar la membrana corioalantoidea

con SF, se hace un pequeño

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orificio y se toma con pinza la membrana amniótica y se inyecta a través de la misma la preparación a estudiar. Este método se utiliza para cultivar el virus de la gripe, que produce graves alteraciones en el tracto respiratorio del embrión, donde se multiplica. -

Cavidad alantoidea: se realiza en huevos de 10 días de incubación por inyección directa en la cavidad alantoidea a través de un orificio de unos 3 mm por encima del borde del saco aéreo. Al cabo de 2 días de incubación, se extrae el líquido alantoideo con pipeta. Esta vía de inoculación se aplica para el cultivo de virus de Influenza y el virus de la parotiditis. Esta vía es útil cuando se necesita una gran cantidad de virus como en el caso de la producción de vacunas o preparación de antígenos para pruebas serológicas.

-

Saco vitelino: Se hace en embriones de 3-8 días, tiempo en que el saco vitelino llena casi totalmente el huevo. Se perfora el extremo de la cámara de aire y se introduce el inóculo con jeringa hasta una profundidad de 3 cm. Se usa para cultivar Rickettsias y Clamidias, que proliferan en forma de abundantes corpúsculos y cuerpos de inclusión.

. Fig. Vías de inoculación Fuente: Introducción a la Microbiología. Tortora, Funke, Case. 9ª ed. 2007.

ANIMALES DE LABORATORIO

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La ausencia de legislación en nuestro país en lo concerniente a la cría y uso de animales, a la investigación, docencia y diagnóstico ponen de relieve la necesidad de formular normas que contemplen las distintas situaciones que se presentan experimentando con animales. Existen legislaciones internacionales como la Legislación Europea y la Legislación Española con respecto a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos. Las inoculaciones en los animales de laboratorio se realizan con la finalidad de: -

Obtener sueros usados en reacciones inmunológicas

-

Obtener antisueros (o antitoxina) a partir de animales inmunizados de gran tamaño como caballos.

-

Cultivar ciertos virus (virus de la rabia)

-

Comprobar el poder inmunizante de algunos sueros

-

Actualmente el uso de animales de

experimentación como hospedadores para

propagación viral está limitado por razones éticas.

CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS

Los tres objetivos para conservar correctamente las cepas microbianas en el laboratorio de Microbiología son: -

que el cultivo a conservar se mantenga

puro, evitando que se produzcan

contaminaciones durante el proceso de conservación. -

que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, o sea mantener la viabilidad de los microorganismos.

-

que estas cepas permanezcan genéticamente estables o sea estabilidad genética.

Los dos primeros objetivos no son difíciles de lograr cuando se conoce bien la técnica de conservación, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación, y ninguno de ellos es de uso general.

Los métodos se pueden clasificar en: A) Métodos de conservación a largo plazo -

Conservación por congelación

-

Conservación por liofilización

B) Métodos alternativos -

Conservación por transferencia periódica

-

Conservación por suspensión en agua destilada estéril

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A) Métodos de conservación a largo plazo Conservación por congelación Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grado centígrado, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento.

Los

microorganismos se congelan rápidamente a temperaturas que varían entre -50 a -95. Este es un buen método de conservación, pero no es el adecuado para envió de cepas. Para la conservación, las células se almacenan en criotubos (tubos de plástico esterilizables resistentes a la congelación que cierran herméticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando un tubo para cada ocasión. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Los agentes crioprotectores son sustancias que protegen del daño que se pueda producir en las células microbianas en el momento de la congelación. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, entre ellos glicerol (15-20%), y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el tipo de microorganismos que se quiera conservar.

Conservación por liofilización Durante la liofilización (congelación-desecación), la suspensión de microorganismos se congela rápidamente a temperaturas que varían de -54 a -72º C y el agua se elimina por vacío elevado (sublimación). Producido el vacío, el recipiente que contiene los microorganismos liofilizados, se sella fundiendo el vidrio a alta temperatura. El residuo pulverulento que contiene los microorganismos sobrevivientes puede guardarse durante años. Los microorganismos pueden reconstituirse mediante la hidratación con un medio nutritivo líquido adecuado. Para este proceso se emplean los liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Es un método muy recomendado por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de cepas, pues una vez logrados los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18-20º C), con lo cual su envío es muy cómodo. Los factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización son:

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Tipo de microorganismos: hay muchos microorganismos que no resisten la liofilización.

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Concentración celular: lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentración del orden de 108 – 109 células/ml en el caso de bacterias y algo menor en el caso de hongos filamentosos y levaduras..

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Grado de deshidratación alcanzado: debe ser lo más alto posible.

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Ausencia de oxígeno en el tubo: las células liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las células.

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Condiciones de almacenamiento: temperatura de 18-20º C .

A) Métodos alternativos Son los métodos que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos a largo plazo porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

Conservación por transferencia periódica La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas liberan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y murete celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Es el peor método para conservar la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características genéticas. Si se va a utilizar este método es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los períodos entre las resiembras. Esto se puede conseguir disminuyendo la cantidad de inóculo y algunos nutrientes en el medio de cultivo, inoculando por punción los microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en presencia de oxígeno es más rápido y origina productos generalmente tóxicos y almacenando a 4-8º C. A veces también se suele recubrir el crecimiento con una capa de vaselina líquida estéril o aceite mineral estéril, con esto se evita la desecación del medio de cultivo. Conservación en agua destilada estéril Es un método alternativo muy utilizado y da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se va a conservar. Se pueden preparar en criotubos en una concentración aproximada a 104-105 células/ml.

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Cualquiera que sea el método empleado en la conservación de las cepas microbianas, cuando estas se recuperan para hacer nuevos lotes para su conservación o para trabajar con ellas, se recomienda no utilizar directamente las células que se han estado conservando, porque estas vienen de una situación de stress y por lo tanto no son adecuadas para ningún tipo de ensayo. Primer habría que revitalizarlas sembrándolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que asegure lo más posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede trabajar con ellas, cultivándolas en medios selectivos cuando sea necesario. NOTA LEER: - Explicación de Trabajos Prácticos: Medios de cultivo - Guía de Trabajos Prácticos: Medios de cultivo. Técnicas para obtener anaerobiosis - Fotocopias del libro Brock Biología de los Microorganismos, 12ª ed., pág.184-188

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Figura 1 EVOLUCIÓN DE LAS LÍNEAS CELULARES A PARTIR DE UN CULTIVO PRIMARIO

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