Profesor Patrocinante Dr. Bredford Kerr Fuentes Centro de Estudios Científicos. Profesor Copatrocinante Dra. Claudia Torres Farfán Facultad de Medicina Universidad Austral de Chile

ALTERACIÓN EPIGENÉTICA EN UN MODELO MUTANTE NULO PARA MECP2 Y GENERACIÓN DE UN RATÓN TRANSGÉNICO EXPRESOR DE LA PROTEÍNA CRE RECOMBINASA EN LAS NEURONAS DE PROOPIOMELANOCORTINA DEL NÚCLEO ARCUATO DEL HIPOTÁLAMO.

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.

Mirtha Alicia Rios Silva VALDIVIA – CHILE 2013

No sé de dónde vengo pero sé que siempre he estado aquí. No sé quién soy pero sé que lo que soy es lo que el otro es. No sé dónde estoy pero sé que este lugar no tiene límites. No sé adónde voy pero sé que a todas horas alguien me acompaña. No sé cuál es mi meta pero sé que para conocerla debo llegar a mí. No sé qué es lo que busco pero sé que lo que busco me busca. No sé lo que puedo recibir pero sé agradecer lo que me han dado. (“La escalera de los ángeles”, A. Jodorowsky)

AGRADECIMIENTOS La ejecución de esta tesis resultó en un aprendizaje el cual me es difícil plasmar en palabras; me ayudó a crecer en lo profesional y tremendamente en lo personal. En primer lugar quisiera agradecer al Dr. Bredford Kerr por la oportunidad de ser parte de su equipo de trabajo, por su dedicación y llegada. Me siento afortunada cuando digo que lo que aprendí fue por enseñanzas directas del Dr.Kerr. Agradezco su buena disposición para discutir sobre resultados, publicaciones, además de temas que fueron más allá de las ciencias biológicas. Quisiera agradecer también a la Dra Claudia Torres por su tiempo y visión constructiva de mi trabajo. Durante mi periodo de tesista, conocí a grandes personas dentro del equipo de trabajo, una de ellas fue Jessica Soto, su carisma y buena disposición enriquecieron tremendamente mi estadía. También quisiera reconocer a Rodrigo Moldenhauer por su entrañable amistad y sabios consejos durante tantos años. Agradezco especialmente a mi pololo Jorge, compartimos todos los buenos y malos momentos, su presencia, cariño y perspectiva en todo el proceso fue trascendental. Finalmente agradecer infinitamente a mis padres, Wladimir y Alicia, por su apoyo incondicional y valoración de mis logros. A mi hermano Fredy por todas sus buenas energías y a mi hermano Eduardo por brindarme una visión más espiritual del entorno. Este trabajo fue realizado en el Centro de Estudios Científicos (CECs) y fue financiado por el proyecto FONDECYT N°1100821.

i

ÍNDICE GENERAL 1. RESUMEN

1

1.1 SUMMARY

2

2. INTRODUCCIÓN

3

2.1 El Síndrome de Rett y su relación con la proteína de unión a islas CpG metiladas, MECP2.

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2.2. El Sistema de Melanocortinas, regulador del balance energético corporal.

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2.3. Sistema de recombinación para el desarrollo de modelos transgénicos, Cre/loxP.

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2.4. Marco teórico.

22

2.5. Propuesta de trabajo.

25

3. MATERIALES Y MÉTODOS. 3.1 Materiales

27 27

3.1.1 Reactivos y herramientas comerciales para biología molecular.

27

3.1.2 Plásmidos.

28

3.1.3 Partidores.

28

3.1.4 Herramientas bioinformáticas.

30

3.1.5 Animales de experimentación y eutanasia.

31

3.2 Métodos.

32

ii

3.2.1 Clonamiento.

32

3.2.1.1 Cultivos de bacterias y almacenamiento.

32

3.2.1.2 Transformación de células competentes.

32

3.2.1.3 Ligación de fragmentos de ADN.

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3.2.1.4 Electroforesis y cuantificación de ácidos nucleicos en geles de agarosa.

34

3.2.1.5 Extracción de ADN a partir de geles de agarosa.

35

3.2.1.6 Extracción de ADN plasmidial.

35

3.2.1.7 Ensayos de restricción, desfosforilación y fill-in de ADN plasmidial.

37

3.2.1.8 Construcción del transgén PomcArc Cre.

38

3.2.1.9 Purificación del transgén para microinyección.

41

3.2.1.10 Técnica de manipulación de embriones y microinyección del transgén.

41

3.2.1.11 Extracción de ADN para genotipificaciones e identificación de líneas transgénicas. 3.2.2 Epigenética.

43 44

3.2.2.1 Obtención de ADN genómico y modificación de ADN con bisulfito de sodio.

44

3.2.2.2 Análisis de patrones de metilación de ADN mediante MSP.

45

iii

4. RESULTADOS. 4.1 Identificación de islas CpG en el promotor de proopiomelanocortina.

46 46

4.2 Análisis epigenético del promotor de Proopiomelanocortina en animales silvestre y nulo para Mecp2.

48

4.3 Construcción del transgén PomcArc Cre.

51

4.4 Obtención y purificación del transgén PomcArc Cre.

59

4.5 Identificación de las distintas líneas transgénicas.

61

5. DISCUSIÓN.

64

6. BIBLIOGRAFÍA.

71

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Regulación de MECP2 en el remodelamiento de cromatina y transcripción.

7

Figura 2. Estructura del gen MECP2.

9

Figura

3.

Estructura

génica

y

procesamiento

post-traduccional

de

proopiomelanocortina (POMC).

15

Figura 4. Mecanismo de recombinación Cre/loxP sitio-específico.

20

Figura 5. Los ratones nulos para Mecp2 muestran un fenotipo de obesidad durante su desarrollo y una desregulación molecular en la homeostasis energética a nivel central.

24

Figura 6. El promotor del gen de proopiomelanocortina posee múltiples islas CpG.

47

Figura 7. El promotor de Pomc se encuentra hipermetilado en los ratones mutantes nulos para Mecp2.

50

Figura 8. Construcción teórica del transgén PomcArc Cre.

52

Figura 9. Subclonamiento del gen de la Cre recombinasa y la señal SV40 pA en el vector que posee los enhancers neuronales, nPEs.

54

Figura 10. Subclonamiento del promotor mínimo HSP68 flanqueado por sitios de restricción SmaI en un vector comercial. Figura 11. Subclonamiento del promotor mínimo HSP68 en el vector que

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v

contiene los nPEs, la secuencia de la Cre recombinasa y SV40 pA.

58

Figura 12. Purificación del transgén PomcArc Cre.

60

Figura 13. Identificación de líneas transgénicas PomcArc Cre mediante PCR.

63

Figura 14. Construcción del transgén ROSA26 EGFP.

67

vi

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Resumen del proceso de generación de las líneas transgénicas PomcArc Cre.

62

vii

LISTADO DE ABREVIATURAS

5’OH

5’Hidroxilo

5’UTR

Región no traducible 5’

A:T:C:G

Adenina: timina: citosina: guanina

ADN

Ácido desoxirribonucleico

AGRP

Péptido relacionado a agouti

ARC

Núcleo arcuato

BDNF

Factor neurotrófico derivado derivado de cerebro

cAMP

Adenosina monofosfato cíclico

CART

Transcrito en respuesta a cocaína y anfetaminas

CLIP

Péptido intermediario tipo corticotropina

CMV

Citomegalovirus

CpG

Citosina fosfato guanina

CREB

Elemento de unión en respuesta a cAMP

DMH

Hipotálamo dorsomedial

DNMTs

Dimetiltransferasas

EPACs

Proteínas de intercambio activadas por cAMP

HDACs

Histonas desacetilasas

Kb

Kilobases

KDa

KiloDalton

KO

Ratón mutante nulo para Mecp2

LB

Medio de cultivo líquido Luria-Bertani

viii

M

ADN metilado

MAPk

Quinasa mitógeno activado

MBD

Dominio de unión al ADN

MCRs

Receptores metabotrópicos de MSH

MECP2

Proteína de union a islas CpG metiladas 2

Mecp2loxP

Alelo de Mecp2 con locus floxeado.

MSH

Hormona melanocito estimulante

MSP

PCR específico para metilación

NLS

Señal de localización nuclear

NM

ADN no metilado

nPEs

Enhancers neuronales de POMC

NPY

Neuropéptido Y

Pb

Pares de bases

PC1/PC2

Propéptido convertasa 1 y 2

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

PKC

Proteína quinasa C

POMC

Preprohormona proopiomelanocortina

PVN

Núcleo paraventricular

RBE

Elemento de union a recombinasa

RPM

Revoluciones por minuto

RTT

Síndrome de Rett

SV40 pA

Señal de poliadenilación del papovirus SV40

TRD

Dominio de represión transcripcional

ix

WHO

Organización mundial de la salud

WT

Ratón silvestre

1

1. RESUMEN MECP2 es una proteína nuclear, la cual se une al ADN específicamente en islas CpG y regula la expresión de múltiples genes en el sistema nervioso central. Se ha observado que los ratones mutantes nulos para Mecp2 muestran sobrepeso y alteraciones en la expresión de genes asociados con la homeostasis energética. Sin embargo, no hay evidencias que correlacionen alteraciones epigenéticas en los promotores de estos genes relacionados a la homeostasis energética con la ausencia de Mecp2. En el desarrollo de esta tesis, identificamos islas CpG en el promotor de Pomc y propusimos la existencia de alteraciones en el patrón de metilación de este promotor en ratones mutantes nulos para Mecp2. Mediante la técnica MSP (Methylation specific PCR), comparamos los niveles de metilación del promotor de Pomc exhibidos por un ratón nulo para Mecp2 en relación a su hermano silvestre. Encontramos que el ratón nulo mostró una hipermetilación del promotor de Pomc en comparación con el animal silvestre. Esto podría explicar la razón por qué este gen se encuentra desregulado en ausencia de Mecp2. Además, generamos una herramienta molecular para suprimir genes en las neuronas Pomc del núcleo arcuato, la cual puede ser utilizada para generar un modelo nulo condicional de cualquier gen de interés. Particularmente, en nuestro laboratorio estamos utilizando este ratón transgénico para eliminar la expresión de Mecp2 específicamente en neuronas Pomc para determinar la participación de esta proteína en la homeostasis energética.

2

1.1 SUMMARY Methyl CpG binding protein-2 (MECP2) is a nuclear protein that belongs to a DNA binding proteins family. MECP2 binds to DNA specifically in methylated CpG islands and regulates the expression of multiple genes in the central nervous system. It has been observed that Mecp2-null mutant mice exhibit overweight and alterations in the expression of genes associated with energy homeostasis. Nevertheless, there is no evidence correlating epigenetic alterations in the promoter of genes related to energy homeostasis with the absence of Mecp2. In the development of this thesis work, we identified CpG islands in the Pomc promoter and we propose the existence of alterations in the DNA methylation pattern of this promoter in Mecp2-null mutant mice. Through MSP (Methylation specific PCR) technique, we compared the methylation level of Pomc promoter of Mecp2-null mutant mouse with that exhibited by its wild type littermate. We found that Mecp2-null mutant mouse exhibit a hypermethylation of Pomc promoter in comparison with wild type. This could explain the reason why this gene is deregulated in the absence of Mecp2. Further, we generated a molecular tool to delete genes in Pomc neurons of the arcuate nucleus, which could be used to generate a conditional null model of any gene of interest. Particularly, in our lab we are using this transgenic mouse to delete the expression of Mecp2 specifically in Pomc neurons to determine the participation of this protein in the control of energy homeostasis.

3

2. INTRODUCCIÓN

El alto grado de homología entre la información génica del humano con el ratón ha sido la base de un gran número de estudios identificando diversos genes coincidentes entre una especie y otra. Actualmente, incluso más interesante que identificar distintos genes, es el comprender cómo trabajan las redes de regulación génica, es decir cómo se expresarán bajo distintas condiciones o frente a diferentes estímulos. Las regiones regulatorias de los genes se componen de un número variable de secuencias cortas a los que pueden unirse activadores y represores, de manera tal que sus contribuciones integradas resultan en la correcta expresión del gen en cuestión. A pesar de la conservación de estos elementos de secuencia, análisis detallados de promotores de diversos genes han revelado un desconcertante nivel de complejidad en interacciones proteína-proteína y proteína-ADN, sugiriendo que podrían existir tantos genes como formas de regulación transcripcional (Antequera, 2003), lo que implica que cada promotor génico es probablemente único en su tipo y debe ser entendido y estudiado como tal. Uno de los principales puntos que justifican el estudio de la regulación de la expresión génica son las enfermedades genéticas. De hecho, se ha observado una asociación entre mutaciones en el genoma y la pérdida de función de proteínas partícipes de algún proceso celular esencial, tal es el caso del síndrome de Rett (Chahrour & Zoghby, 2007).

4

Puntualmente, el interés de la presente tesis, fue realizar un estudio epigenético que permita relacionar a la proteína de unión a islas CpG metiladas, Mecp2 con las neuronas de proopiomelanocortina, postulando que este factor de transcripción podría estar regulando la expresión de ciertos genes de primer orden en el balance energético corporal. Además, se desarrolló un modelo transgénico, expresor de la proteína Cre, que permitirá generar una descendencia nula condicional para Mecp2 en neuronas Pomc, mediante el sistema Cre/loxP.

2.1 El Síndrome de Rett y su relación con la proteína de unión a islas CpG metiladas, MECP2. El síndrome de Rett (RTT) es un desorden postnatal progresivo del neurodesarrollo que se manifiesta principalmente en niñas durante la infancia (Ravn, et al. 2011). Las pacientes con RTT presentan un fenotipo normal hasta los 6-18 meses de edad, desarrollando los hitos básicos apropiados, incluyendo la habilidad de caminar, incluso algunas pacientes logran decir unas pocas palabras. Uno de los indicadores tempranos de la participación neurológica en esta enfermedad es la desaceleración en el crecimiento del cráneo (Ricceri et al., 2012). Con la aparición del retardo en el desarrollo, la microcefalia adquirida se acompaña por un retardo general en el crecimiento, alteraciones en el peso corporal y debilidad postural provocada por hipotonía muscular (Chahrour & Zoghby, 2007). A medida que el RTT va progresando, las pacientes van perdiendo la utilidad de sus manos, desarrollando movimientos estereotipados. El aislamiento social y pérdida del lenguaje se vuelven aparentes en adición a la irritabilidad y el comportamiento auto-abusivo (Nomura et al., 2005). La

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condición alcanza un límite y los pacientes fallecen tempranamente, sin embargo aquellas pacientes con RTT que llegan a la adultez tienen una expectativa de vida promedio de 47 años según la Fundación Internacional de Síndrome de Rett (IRSF). Dado que la vasta mayoría de pacientes con RTT son mujeres, se postuló que este síndrome está ligado al cromosoma X a través de una herencia dominante, con consecuencias fatales en varones hemicigotos. El síndrome de Rett presenta una incidencia de aproximadamente 1/10.000 nacimientos femeninos vivos. Sin embargo, ya que más del 99% de los casos de RTT son esporádicos, en su momento resultó muy complejo lograr descifrar el locus ligado a la enfermedad. Utilizando información de distintos casos familiares se identificó el locus candidato Xq28, subsecuentemente se reveló que existían mutaciones en el gen que codifica para la proteína de unión a metilCpG 2, MECP2 (Amir et al., 1999). Esta proteína actúa como un regulador transcripcional necesario para el desarrollo neuronal apropiado. Tal como su nombre lo indica, MECP2 se une específicamente a secuencias metiladas en el genoma. La metilación dentro del ADN, es usada como una marca epigenética, en respuesta a distintas señales para modificar la expresión génica sin tener que alterar la secuencia misma. En esta línea, MECP2 al unirse al ADN metilado, es capaz de leer estas marcas epigenéticas en la información genética y traducirlo en efectos funcionales asociados a un cambio de la expresión génica (Zachariah & Rastegar, 2012), ya sea mediante represión o activación (Chahrour et al., 2008). Estructuralmente, MECP2 posee dos señales de localización nuclear (NLS) y tres dominios funcionales: un dominio de unión a regiones metiladas (MBD), un dominio de represión transcripcional (TRD) y el dominio C-terminal. El MBD específicamente se une

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a dinucléotidos CpG metilados, con preferencia a secuencias CpG con motivos ricos en A/T adyacentes (Klose et al., 2005). Funcionalmente, cuando MECP2 se une a dinucléotidos CpG metilados de genes blanco por medio de su MBD, el TRD recluta al correpresor Sin3A e histonas desacetilasas tipo 1 Y 2 (HDACs) (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998; Zachariah & Rastegar, 2012). La actividad represora transcripcional de MECP2 está asociada a la compactación de la cromatina, promoviendo el agrupamiento del nucleosoma a través del reclutamiento de HDAC y desacetilación de histonas (Figura 1) o por medio de interacciones directas entre el dominio C-terminal y la cromatina (Nikitina et al., 2007). Debe considerarse que la interacción con Sin3A no es estable y probablemente podría ser dependiente de la cantidad de MECP2 unido al ADN (Klose & Bird, 2004). Además de aquellas proteínas de interacción ya mencionadas, también existen otras reportadas como SWI/SNF, ADN metiltransferasa (DNMT1), histona metiltransferasa Suv39H1, entre otras (Kaludov & Wolffe, 2000; Kokura et al., 2001; Kimura & Shiota, 2003; Harikrishman et al., 2005; Nan et al., 2007). Adicional a su función como represor de la transcripción, se ha reportado que MECP2 posee una función activadora transcripcional mediante interacción con la proteína CREB1 (Chahrour et al., 2008). Sin embargo, las consecuencias funcionales precisas de las interacciones proteína-proteína permanecen siendo desconocidas.

7

Figura 1. Regulación de MECP2 en el remodelamiento de cromatina y transcripción. a) La transcripción es reprimida mediante la unión de CpGs metilados con MECP2 (panel izquierdo). MECP2 se une al ADN y recluta complejos de remodelamiento de cromatina que contienen Sin3A, BRM e histonas desacetilasas (HDACs). Cuando MECP2 no está unido al ADN metilado (panel derecho), el complejo que usualmente contiene MECP2, BRM, Sin3A y las HDACs no es reclutado. b) Estudios in vitro han evidenciado que MECP2 también es una potente proteína condensadora de cromatina y puede reprimir la expresión génica independientemente de la metilación del ADN (panel izquierdo). En los promotores donde la función de MECP2 está involucrada en la regulación de la expresión de forma independiente a la metilación de ADN, una deficiencia o ausencia de MECP2 lleva a una desorganización en la estructura de la cromatina, haciendo que la transcripción ocurra más probablemente (panel derecho) (Bienvenu & Chelly, 2006 (Adaptado)).

8

El gen MECP2 consta de 4 exones que codifican para dos isoformas distintas de la proteína, debido a un corte y empalme alternativo del exón 2 (Figura 2). Las isoformas de MECP2 difieren únicamente en su N-terminal; y la más abundante es MECP2-e1, la cual contiene 24 aminoácidos codificados por el exón 1 y carece de 9 aminoácidos codificados en el exón 2, mientras que el sitio de inicio de la transcripción de la isoforma MECP2-e2 está en el exón 2 (Kriaucionis & Bird, 2004; Mnatzakanian et al., 2004; Dragich et al., 2007; Itoh et al., 2012).

9

Figura 2. Estructura del gen MECP2. El gel que codifica para MECP2 contiene 4 exones y producto de corte y empalme alternativo existen dos isoformas de MECP2. El transcrito de la isoforma Mecp2-e1 excluye al exón 2, mientras que Mecp2-e2 incluye los exones 1 y 2, sin embargo es en el exón 2 donde se inicia la traducción en el codón ATG.

10

Mutaciones en MECP2, son encontradas en aproximadamente el 95% de los casos clásicos de RTT; la mayoría surgen de novo en la línea germinal paterna y, a menudo implican una transición de C a T en dinucleótidos CpG (Wan et al., 1999; Trappe et al., 2001). Además, existen una serie de mutaciones missense, nonsense y de cambios en el marco de lectura, que se concentran principalmente en sólo ocho tipos de mutaciones (Cristodoulou et al., 2003; Ravn et al., 2005; Archer et al., 2006; Pan et al., 2006). Aquellos casos donde las alteraciones génicas afectan la señal de localización nuclear (NLS) de MECP2 o que provocan truncamiento de la proteína, tienden a causar fenotipos aún más severos (Smeets et al., 2005). Ambas isoformas de MECP2 son de localización nuclear y co-localizan con el foci heterocromatínico metilado en células de ratón. Algunos reportes sugieren que MECP2 se transloca al núcleo durante la diferenciación neuronal (Miyake & Nagai et al., 2007). Ya que MECP2 es expresada en neuronas maduras y sus niveles incrementan durante el desarrollo postnatal, MECP2 podría jugar un rol modulando la actividad o plasticidad de neuronas maduras (Asaka et al., 2006; Nguyen et al., 2012). Consistente con esto, mutaciones del gen MECP2 no afectan la proliferación o diferenciación de precursores neuronales (Noriyuki & Macklis, 2004). Aunque los mecanismos que regulan el patrón de expresión del complejo MECP2 son desconocidos, algunos estudios identificaron el centro promotor y varios elementos regulatorios en cis, que dirigen la expresión de MECP2 (Liu & Francke, 2006). Estas secuencias regulatorias podrían dictar los patrones temporales y espaciales de la expresión de este gen. Debido a que el Síndrome de Rett es producido por la pérdida de función de MECP2, se quiso identificar posibles blancos de este factor de transcripción para tener

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señales claras de la patogénesis de esta enfermedad. Estudios de perfiles transcripcionales, usando tejido de cerebro de ratones nulos para Mecp2, no revelaron cambios significativos en la expresión génica, sugiriendo que MECP2 no sería un represor transcripcional global como originalmente se pensaba, sino más bien provocaría cambios sutiles en el patrón de expresión de genes (Tudor et al., 2002). Por otro lado, si MECP2 regula la expresión de un número seleccionado de genes en distintas

poblacionales

neuronales,

cada

cambio

transcripcional

estaría

poco

representado en muestras de tejido de cerebro que contienen una gran cantidad de distintos tipos neuronales. Distintos estudios han usado aproximaciones de genes candidatos o muestras de tejidos de ratón y humano, y se ha permitido la identificación de blancos de MECP2 que podrían ser muy relevantes en la patogénesis del RTT (Samaco et al., 2005; Deng et al., 2007; Itoh et al., 2007; Urdinguio et al., 2008). Algunos de estos han sido confirmados con estudios posteriores, como por ejemplo el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Chen et al., 2003; Martinowich et al., 2003; Wang et al., 2006), mientras que otros blancos de Mecp2 presentan a la fecha resultados discordantes entre diferentes grupos. El papel de MECP2 en la regulación de la expresión de algunos genes involucrados en la respuesta a estrés es consistente con su papel en la actividad neuronal alterada en aquellos pacientes con RTT y los modelos murinos nulos para Mecp2. El estrés corresponde a una respuesta fisiológica predecible que induce cambios dinámicos en la expresión de una variada cantidad de genes que controlan la actividad del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, y los genes efectores necesarios para

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modular la producción de glucocorticoides por la adrenal, modificando además la biodisponibilidad de sus receptores (Nuber et al., 2005). Además de lo anteriormente mencionado, los ratones mutantes nulos para MECP2 presentan otra característica fenotípica que llama la atención, existe un desbalance energético corporal que manifiestan estos modelos mostrando un aumento significativo en el peso. Nuestro grupo de trabajo ha planteado que la proteína MECP2, de alguna manera, podría estar regulando la expresión de genes que participan en la regulación de la homeostasis energética y su ausencia en estos modelos genera obesidad (Torres-Andrade et al., 2011).

2.2. El Sistema de Melanocortinas, regulador del balance energético corporal. proopiomelanocortina (POMC) es un precursor hormonal peptídico que forma parte de un complejo sistema llamado melanocortina (Gantz & Fong, 2003). Esta preprohormona se expresa predominantemente en neuronas del hipotálamo y células de la hipófisis.

POMC se expresa en altos niveles en el núcleo arcuato (Arc) del

hipotálamo y su función es principalmente la regulación de la homeostasis energética (Cone, 2005; Millington, 2007; Coppola & Diano, 2007). En la hipófisis existen dos poblaciones celulares que expresan POMC: los corticotropos que mediante la liberación de ACTH regulan la producción de glucocorticoides en la glándula adrenal (Millington, 2007), y los melanotropos cuya liberación de αMSH ha sido estudiada principalmente en Xenopus laevis (Jenks et al., 2003), pero no existe claridad qué ocurre en mamíferos. Torres-Andrade, Moldenhauer R., Soto-Covasich J, Rios-Silva M and Kerr B. (2011). Increased Body Weight And Altered Expression Of Genes Associated With Energetic Homeostasis in Mecp2- Null Mice. XXVI Reunión Anual Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas, Panimávida, Chile. Abstract O17.

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Particularmente en la región hipotalámica, la homeostasis energética está regulada por dos vías neuronales antagónicas. La primera se denomina vía anorexigénica, la cual está comandada por las neuronas que coexpresan POMC y CART (transcrito en respuesta a cocaína y anfetaminas) (Elias et al., 2001; Hill et al., 2010) y su señalización permite un direccionamiento en el metabolismo energético; es decir, una disminución en la ingesta de alimentos y un aumento en el gasto energético. La segunda vía es la orexigénica y la población responsable son las neuronas que coexpresan NPY (Neuropéptido Y) y AgRP (Péptido relacionado a Agouti), cuya actividad provocan un aumento en la ingesta de alimento y una disminución en el gasto energético (Hahn et al., 1998; Neary et al., 2004). Se ha sugerido que el principal regulador de todo el proceso de homeostasis enérgica es precisamente POMC. Estudios con modelos murinos nulo para Pomc presentan un fenotipo de obesidad e hiperfagia, mientras que los ratones mutantes nulos

para Agrp o Npy muestran un fenotipo normal en relación al peso corporal

(Challis et al., 2004; Qian et al., 2002). Las neuronas POMC hipotalámicas integran señales periféricas como insulina (Breen et al., 2005), glucosa (Parton et al., 2007) y principalmente leptina; una hormona proteica secretada por los adipocitos (Cowley et al., 2001; Forbes et al., 2001). Estas señales estimulan a las neuronas POMC y reprimen la actividad de las neuronas AGRP/NPY (Morrison et al., 2005). Al llegar una señal de estímulo a las neuronas POMC, estas sintetizan la preprohormona en el soma neuronal, la cual es transportada hasta los terminales, donde ocurre un modificación enzimática célula-específica que resulta en la secreción de distintos péptidos característicos de cada población celular

14

que expresa Pomc. El clivaje o procesamiento de POMC es producido por las enzimas propéptido convertasas PC1 y PC2, y ocurren en pares específicos de residuos básicos de lisina y arginina (Millington, 2007). PC1 sólo se expresa en hipófisis, por lo tanto PC2 es la encargada de producir hormonas melanocito estimulantes (MSH) y β-endorfinas en el hipotálamo (Figura 3).

15

Figura

3.

Estructura

génica

y

procesamiento

post-traduccional

de

proopiomelanocortina (POMC). El gen codificante para POMC en mamíferos consta de 3 exones, de los cuales el 2 y el 3 son traducidos. PC1 y PC2 cortan sucesivamente el péptido POMC en péptidos más pequeños por el clivaje de un par dibásico de residuos aminoacídicos que corresponden a lisina (K) y/o arginina (R). Los productos finales son generados de forma tejido-específica. Estos productos incluyen las melanocortinas (MSHs y ACTH), β-endorfina (β-end) y el péptido intermediario tipo corticotropina (CLIP). (Millington, 2007)

16

Las neuronas POMC del núcleo arcuato proyectan sus terminales al hipotálamo dorsomedial (DMH), hipotálamo lateral y predominantemente al núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN). En estos terminales ocurre el procesamiento del prepropétido donde uno de los productos en el hipotálamo es α-MSH, el cual es secretado y actúa como un ligando que se une a receptores metabotrópicos de MSH (MCRs). Existen cinco tipos de MCR, de los cuales dos son expresados en el hipotálamo, MC4R y MC3R, siendo MC4R el principal receptor de melanocortinas involucrado en el control del peso corporal (Tao, 2010). La noción inicial que la ingesta de alimento y el gasto energético iban directamente relacionados, es decir que el aumento de uno provocaba necesariamente la disminución del otro, recientemente fue refutada, utilizando un modelo de ratón mutante nulo

para el receptor MC4R, el cual presentaba un fenotipo marcado de

obesidad. Al re-expresar, en este ratón, de forma condicional el MC4R en el PVN y en una subpoblación de la amígdala, resultó en la reducción del fenotipo de obesidad exhibido por estos ratones (Balthasar et al., 2005). Además, los índices de ingesta de comida del ratón nulo para MC4R fueron recuperados, sin embargo el gasto energético reducido que presentaba este modelo nulo no fue afectado luego de la re-expresión de MC4R en el PVN. A partir de esto, se estableció que existe una divergencia en las vías de melanocortina en relación al control de la ingesta de alimento y el gasto energético (Balthasar et al., 2005), sin embargo aún no ha sido posible establecer en forma clara y precisa cuáles son las principales cascadas de señalización que se producen a nivel intracelular para que se produzca el efecto anorexigénico y tampoco si una de estas vías está asociada al control de la ingesta de alimento y otra distinta al control de gasto

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energético. Dentro de las señalizaciones que se han reportado están: cAMP-CREB, como una de las importantes vías reguladoras del gasto energético, MAPk, EPACs (Chiappini et al., 2011), PKC, entre otras. Las neuronas orexigénicas AGRP/NPY, actúan bloqueando estas cascadas de señalización, específicamente AGRP opera como antagonista del MC4R y existe disensión en su papel como agonista inverso de este receptor (Nijenhuis et al., 2001; Corander et al., 2011). Por otro lado la cascada de señalización NPY es independiente a los MCRs, y es mediada por receptores específicos para el neuropéptido Y (NPYR), y además de su influencia en la homeostasis energética, ha sido ampliamente estudiado debido a su relación con los niveles de estrés y comportamientos de ansiedad y depresión (Heilig, 2004). La diversidad de acciones y efectos de los derivados de POMC sin duda indujo la necesidad de caracterizar el promotor de POMC. Estudios de footprinting filogenético demostraron que en la región promotora de POMC, ubicada entre -13 mil y -9 mil pares de bases (kb) río arriba del sitio de inicio de la transcripción, existen dos regiones enhancers designadas como nPE1 (neuronal POMC enhancer 1, de 600 pb) y nPE2 (150 pb) que

regulan la expresión de Pomc exclusivamente en el hipotálamo (De

Souza et al., 2005); mientras que hace bastantes años, se encontraba reportado que el promotor proximal de POMC, a 400 pb dirige la expresión exclusivamente a la hipófisis (Liu et al., 1992). La comprensión de la especificidad de ciertas secuencias génicas dentro del promotor de POMC para conducir la expresión del gen es de vital importancia para el desarrollo de herramientas moleculares que nos permitan estudiar en forma independiente cuál es el rol de las neuronas POMC en el núcleo arcuato y/o de las células POMC en la hipófisis.

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2.3. Sistema de Recombinación para el desarrollo de modelos transgénicos, Cre/loxP. Uno de los recursos más ampliamente utilizados en el desarrollo de modelos transgénicos, incluido este trabajo, es el sistema de recombinación Cre/loxP, que corresponde al proceso de recombinación mediado por la proteína Cre recombinasa sobre regiones flanqueadas por secuencias loxP. El uso de este sistema ha proporcionado una herramienta útil para estudiar a distintos niveles las funciones de diferentes genes y loci en roedores, permitiendo un mejor entendimiento de la función de genes en poblaciones celulares específicas (Ghosh & Van Duyne, 2002). La proteína Cre recombinasa es una enzima derivada del bacteriófago P1 la cual cataliza eficientemente la recombinación de dos secuencias nucleotídicas que funcionan como sitios de reconocimiento para esta proteína, denominados sitios loxP. Esta proteína tiene un tamaño de 38 kDa, pertenece a la familia integrasa, específicamente tirosina recombinasas sitio-específicas. Los sitios loxP, son secuencias consenso de 34 pares de bases que consisten en una secuencia espaciadora central de 8 pares de bases, que de acuerdo a sus propiedades asimétricas define la orientación, y dos secuencias palindrómicas que flanquean a este espaciador de 13 pares de bases denominadas elementos de unión de recombinación (RBE, del inglés recombinase binding elements) (Abremski & Hoess, 1985; Ghosh & Van Duyne, 2002). Sobre el mecanismo molecular de recombinación, una sola molécula Cre recombinasa es capaz de reconocer y unirse a una de las secuencias RBE lo que genera en definitiva, un complejo tetramérico de moléculas cooperativas que gatillan la

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recombinación dentro del área espaciadora de los sitios loxP. Estas unidades enzimáticas permanecen adheridas a la hebra digerida de ADN hasta catalizar su unión con la hebra homóloga y el sitio loxP resultantes de la post-recombinación. Estudios de caracterización de este sistema han determinado que el residuo aminoacídico tirosina 324 (Y324) de la proteína Cre es el responsable en la catálisis del fragmento de ADN a modificar, flanqueando con su grupo funcional al primer nucleótido de la secuencia de 8 pb, originando el corte de la hebra de ADN, dando como resultado un producto intermediario covalente 3’-fosfotirosina. El producto de esta reacción deja libre un 5’hidroxilo en cada hebra, las cuales atacan nucleofílicamente a su hebra complementaria formando una estructura intermediaria denominada unión Holliday (HJ) (del inglés Holliday Junction). Después de ocurrida las uniones fosfodiéster de las hebras, las siguientes dos enzimas Cre continúan con el mismo principio de reacción enzimática terminado con la modificación de la secuencias de ADN. Esto ocurre en las dos hebras que se recombinarán o bien los dos sitios loxP de una misma hebra en donde se escinde un fragmento de ADN. El resultado de la re-asociación de las diferentes hebras provoca una modificación de la secuencia de ADN (Gosh & Van Duyne, 2002). Dependiendo de la orientación que tengan las dos secuencias asimétricas de 8 pb el fragmento de ADN de interés puede escindirse o rotar (Figura 4) (Abremski y Hoess, 1984).

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Figura 4. Mecanismo de recombinación Cre/loxP sitio-específico. a) La flecha roja indica la orientación del sitio loxP y los cuatro monómeros mostrado representan al complejo Cre recombinasa. b) Modelo de la vía de recombinación Cre/loxP. Cuatro moléculas Cre forman un tetrámero sináptico. La Y324 desde dos de ellos clivan al ADN. Los 5’ OH terminales forman un intermediario Holliday. Una segunda ronda de clivaje e intercambio de cadena resulta en productos de recombinación. c) Si dos sitios de recombinación están en la misma orientación, el intercambio de cadena lleva a una escisión. Si estos están en orientación opuesta el resultado es una inversión. (Tronche et al., 2002 (adaptado)).

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El sistema Cre/loxP demostró alta eficiencia para escindir ciertas regiones de ADN en células en cultivo e in vivo, en animales transgénicos (Sauer, 1998; Sauer, 2002). En organismos vivos, basta con realizar una cruza con un ratón que tenga en su información genética la secuencia del gen de la Cre recombinasa comandada por un promotor ubicuo que usualmente corresponde al del citomegalovirus (CMV), con otro ratón que contenga en su ADN la región de interés flanqueada por los sitios loxP. El resultado de esta cruza, es una descendencia que carece globalmente de la región que se encontraba flanqueada a los sitios loxP producto de la actividad recombinasa de la proteína Cre, y son conocidos como mutantes nulos. Luego, la necesidad de establecer líneas transgénicas en aquellos casos donde los animales transgénicos para ciertos genes resultaban inviables ya que no sobrevivían durante el desarrollo embrionario o juvenil (Nagy, 2000), abrió el paso para el desarrollo de transgénesis condicional mediada por Cre. El fundamento para el desarrollo de modelos nulos condicionales, similar al método tradicional, es utilizar un ratón que contenga dos sitios loxP flanqueando al gen blanco, el cual es cruzado con un ratón transgénico que contenga un promotor específico, para un tipo celular o una línea celular, seguido de la secuencia génica que codifica para la proteína Cre recombinasa. La descendencia de esta cruza resulta en ratones con una función génica normal excepto en el grupo celular donde se expresa la enzima Cre recombinasa, y por tanto hubo recombinación Cre/loxP. A partir de esta nueva metodología, surge además la necesidad de identificar y caracterizar distintos promotores génicos para dirigir la proteína Cre recombinasa en celulares (Nagy, 2000).

diferentes tipos

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La simplicidad que caracteriza a la herramienta Cre/loxP ha favorecido su implementación y masificado su utilización en múltiples áreas de investigación, especialmente en la generación de modelos murinos recombinantes como mutantes nulos condicionales, como es el caso de esta tesis.

2.4. Marco teórico. En nuestro grupo de trabajo hemos observado que los animales mutantes nulos para MECP2 presentan alteraciones en el balance energético corporal, tanto a nivel central como periférico. El fenotipo mostrado por estos animales es de un marcado sobrepeso a partir de la octava semana (Figura 5A). Estudios de expresión relativa nos han mostrado que existe un aumento significativo en los niveles de transcripción de leptina en el tejido adiposo blanco (Mancilla-Medina et al., 2012). El aumento en los niveles de producción de leptina sería consistente con la obesidad observada en el mutante nulo, sin embargo el mecanismo por el cual el tejido adiposo blanco produce más leptina es hasta la fecha desconocido, considerando que dicho tejido no expresa Mecp2 (Mancilla-Medina et al., 2012). Nuestra predicción era que los animales nulos para Mecp2, con fenotipo obeso, deberían mostrar un aumento en los niveles de Pomc y una disminución en los de Agrp en condiciones de ayuno, considerando que estos producen una mayor cantidad de leptina. Estudios de PCR en tiempo real evidenciaron una tendencia a la disminución en los niveles de transcrito de Agrp lo cual fue consistente con lo que esperábamos ver en estos modelos, no obstante los niveles de expresión relativa de POMC, se mantuvieron similar a los animales silvestres, apoyando Mancilla-Medina, C., Moldenhauer, R.A., Kerr, B. (2012). Alteración en la Expresión de Genes Asociados al Metabolismo Lipídico en Tejido Adiposo Blanco de Ratones Mutantes nulos para Mecp2. XXVII Reunión Anual Sociedad Chilena de Ciencias Fisiológicas, Puerto Varas, Chile. P49

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la idea de una relación regulatoria directa de expresión génica en las neuronas Pomc y Mecp2 (Figura 5B)

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Figura 5. Los ratones nulos para Mecp2 muestran un fenotipo de obesidad durante su desarrollo y una desregulación molecular en la homeostasis energética a nivel central. A) Los animales nulos para Mecp2 presentan un aumento en el peso corporal significativo a partir de la octava semana. B) Expresión relativa de Pomc y Agrp en animales nulos para Mecp2. Los animales fueron sometidos a ayuno toda la noche y todos fueron sacrificados a la misma hora (10:30 am) sin ningún tratamiento, KO n= 9 y WT n= 7. (Torres-Andrade et al., 2011).

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Otro punto a considerar, es que Mecp2 reconoce islas CpG metiladas y regula la expresión génica producto de dicha interacción. Por lo tanto, es posible especular que el aumento del peso corporal en estos animales podría estar relacionado a cambios en los patrones de metilación de genes primordiales para la homeostasis energética como consecuencia de la ausencia de este factor de transcripción.

2.5. Propuesta de trabajo. Considerando los antecedentes descritos se planteó la siguiente hipótesis: “La expresión de Pomc en el Núcleo Arcuato del hipotálamo es blanco de modificaciones epigenéticas y, en ausencia de Mecp2, la expresión de Pomc en esta región se altera e impide que las neuronas que lo expresan respondan adecuadamente a las señales metabólicas que regulan su expresión”. En base a la hipótesis propuesta, el objetivo general fue identificar posibles alteraciones en la metilación del ADN en las neuronas Pomc en ausencia de la expresión Mecp2 y generar un modelo transgénico para suprimir en forma específica la expresión de Mecp2 en neuronas POMC del núcleo arcuato del hipotálamo.

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Para desarrollar el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos:

I.

Identificación de posibles blancos de metilación en el promotor de Pomc. Investigar dentro del promotor de Pomc, posibles blancos de modificación epigenética mediante análisis in silico, que potencialmente pudiesen estar relacionados con la función de Mecp2.

II.

Determinación de diferencias en patrón de metilación de ADN para el promotor Pomc entre animales mutantes nulos para Mecp2 y silvestres. Estudiar cualitativamente las variaciones en la metilación de ADN en el promotor de Pomc de animales nulos para Mecp2 y silvestres a las 5 semanas mediante MSP (del inglés, Methylation specific PCR).

III.

Generación de un ratón transgénico como herramienta molecular célulaespecífica de acción in vivo que exprese la proteína Cre recombinasa exclusivamente en las neuronas Pomc del Núcleo Arcuato. Se generaran ratones transgénicos que contengan en su información genética el gen de la Cre recombinasa bajo el control de un promotor quimérico que dirige la expresión de esta proteína específicamente a las neuronas Pomc.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1 Materiales 3.1.1 Reactivos y herramientas comerciales para biología molecular. Extracto de levadura granulado (Merck), NaCl (Merck), HCl (Merck), Peptona de caseína (Merck), Ampicilina (Winkler), Agar (AppliChem), Wizard® Plus SV Miniprep Purification System (Promega), PureYield™ Plasmid Midiprep System (Promega), dATP (Promega), dCTP (Promega), dGTP (Promega), dTTP (Promega), 5x Green GoTaq Reaction Buffer (Promega), Nucleospin Acid and Protein Purification (Genexpress), GeneRuler 100pb DNA ladder (Fermentas), GeneRuler 1kb DNA ladder (Fermentas), 6x DNA Loading Dye (Fermentas), Agarosa (Lafken, Fermelo), Bromuro de Etidio 1 mg/ml (Sigma), Proteinasa K (Bioline), CpGenome™ Turbo Bisulfite Modification Kit (MilliporeMerck), GeneJET™ Genomic DNA Purification Kit (Fermentas), Kit de purificación de ácidos nucleicos Elutip-D Columns y Elutip-D prefilters (Whatman). Enzimas de restricción: SmaI, SalI, XhoI, EcoRV, ScaI, XmaI (Fermentas). AflII, BamHI, KpnI, NotI (New England Biolabs). Otras enzimas: Long PCR enzyme (Fermentas), T4 DNA Ligasa (Fermentas), Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Fermentas), Klenow Fragment (Fermentas).

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3.1.2 Plásmidos. El vector que contenía los enhancers neuronales de proopiomelanocortina corresponde a un esqueleto pBluescript II KS (+) (Fermentas). Para aquellos clonamientos T-A se utilizó el pGEM™ T-Easy vector system (Promega). La secuencia codificante para la proteína Cre recombinasa fue subclonada desde el vector pCEP4 (Invitrogen). La secuencia del promotor mínimo HSP68 estaba contenida en el vector pBS- HSP68- lacZ- B generado en el Centro de Estudios Científicos. 3.1.3 Partidores. Partidores diseñados para amplificar la secuencia del promotor mínimo HSP68 flanqueado por sitios de restricción SmaI por PCR convencional. 1 (sentido): 5’ CCCGGGGTATTCATTACAAGTGGCC 3’ 2 (antisentido): 5’ CCCGGGTGTAAAACGACGGGATCATCG 3’

Partidores utilizados para genotipificar ratones portadores del transgén PomcArc Cre o tipo silvestre por PCR convencional. 3 (sentido): 5’ TTCAGAACTGTGCGAGTTGG 3’ 4 (antisentido): 5’ GCCCGATAACCAGTGAAACAGCAT 3’

Partidores para amplificar Ciclofilina. 5 (sentido): 5’ GGCAATGCTGGACCAAACACAA 3’ 6 (antisentido): 5’ GTAAAATGCCCGCAAGTCAAAAG 3’

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Partidores obtenidos para el análisis de islas CpG del promotor Pomc mediante MSP. En paréntesis se muestran los partidores que reconocen regiones metiladas con una “M”, y aquellos que reconocen regiones no metiladas con un “NM”. Las citosinas subrayadas en los partidores metilados representan aquellas que predictivamente no deberían sufrir modificaciones por el bisulfito de sodio. Set 1: 7 (sentido): 5’ GTTTTAGCGGGTTTGTGTTAAC 3’ (M) 8 (antisentido): 5’ TAAACGTAACCTTCCTAACAACG 3’ (M) 9 (sentido): 5’ GTTTTAGTGGGTTTGTGTTAATGT 3’ (NM) 10 (antisentido): 5’ TAAACATAACCTTCCTAACAACACT 3’ (NM)

Set 2: 11 (sentido): 5’ GTTTTAGCGGGTTTGTGTTAAC 3’ (M) 12 (antisentido): 5’ TAAACGTAACCTTCCTAACAACG 3’ (M) 13 (sentido): 5’ GTTTTAGTGGGTTTGTGTTAATGT 3’ (NM) 14 (antisentido): 5’ AAACATAACCTTCCTAACAACACT 3’ (NM)

Set 3: 15 (sentido): 5’ TTAGCGGGTTTGTGTTAACGT 3’ (M) 16 (antisentido): 5’ CTTAAACGTAACCTTCCTAACAACG 3’ (M) 17 (sentido): 5’ GTTTTAGTGGGTTTGTGTTAATGT 3’ (NM) 18 (antisentido): 5’ TAAACATAACCTTCCTAACAACACT 3’ (NM)

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Set 4: 19 (sentido): 5’ GTTTTAGCGGGTTTGTGTTAAC 3’ (M) 20 (antisentido): 5’ AAACGTAACCTTCCTAACAACG 3’ (M) 21 (sentido): 5’ GTTTTAGTGGGTTTGTGTTAATGT 3’ (NM) 22 (antisentido): 5’ TAAACATAACCTTCCTAACAACACT 3’ (NM)

Set 5: 23 (sentido): 5’ GTTTTAGCGGGTTTGTGTTAAC 3’ (M) 24 (antisentido): 5’ CTAACAACGCTTCTACAACGAA 3’ (M) 25 (sentido): 5’ GTTTTAGTGGGTTTGTGTTAATGT 3’ (NM) 26 (antisentido): 5’ CCTTCCTAACAACACTTCTACAACA 3’ (NM)

3.1.4 Herramientas bioinformáticas. Para el análisis de secuencias nucleotídicas, identificación de secuencias blanco de modificaciones epigenéticas de distintos promotores génicos, diseño de partidores, construcción teórica de vectores y ensayos de restricción virtuales se utilizaron herramientas bioinformáticas existentes previamente. Las secuencias de ADN genómico se obtuvieron desde la base de datos de National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Para identificar las potenciales islas CpG en los distintos promotores génicos y obtención de partidores para MSP, se utilizó el software en línea dispuesto por The Li Lab, University of

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California,

San

Francisco

(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html).

Los

partidores fueron evaluados con el software Lasergene® (DNAstar) Para las construcciones teóricas, principalmente de vectores, se utilizó el Vector NTI® Software (Invitrogen). 3.1.5 Animales de experimentación y eutanasia. La generación de los ratones transgénicos se realizó por microinyección pronuclear en el laboratorio del bioterio del Centro de Estudios Científicos. Los ratones fueron mantenidos en racks ventilados en el bioterio del Centro de Estudios Científicos, acreditado internacionalmente por AAALAC (Association for Assessment and Acreditation of Laboratory Animal Care International), bajo condiciones SPF (Specific Patogen Free), a 21°C, en ciclos de 12 horas luz/oscuridad, con agua y alimentación ad libitum. El cuidado, utilización y métodos de eutanasia fueron aprobados por el comité de bioética del CECs. Los restos animales fueron eliminados por incineración. El método de eutanasia de ratones utilizado fue de dislocación cervical. Aquellos animales que al ser genotipificados se identificaron como silvestres y que no serían utilizados como controles fueron eliminados según la normativa del Bioterio, aprobadas por la comisión de manejo de animales del Centro de Estudios Científicos y que están de acuerdo por lo descrito en el documento “Guide for the care and use of Laboratory Animals” Octava edición, 2010.

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3.2 Métodos. 3.2.1 Clonamiento. 3.2.1.1 Cultivos de bacterias y almacenamiento. Todos los plásmidos con los que se trabajó presentaban resistencia al antibiótico ampicilina, el cual fue utilizado a una concentración final de 100 μg/ml. Los cultivos líquidos inoculados con bacterias, para alcanzar la fase exponencial, tenían un periodo de crecimiento entre 12 a 16 horas a 37°C con agitación orbital constante con medio líquido Luria-Bertani (LB) en tubos falcon de 15 o 50 mL. Aquellos cultivos en placas (LB agar), se trabajaron con las mismas fracciones de tiempo en hornos a 37°C con humedad ambiental. Una vez que los clones correctos fueron verificados por distintos ensayos de restricción, se agregaron 750 μl de cultivo de bacterias y 250 μl de glicerol 100% (Invitrogen) autoclavado en tubos de 1,5 ml, ambos componentes se homogeneizaron delicadamente y se guardaron rotulados en un freezer a -80°C. 3.2.1.2 Transformación de células competentes. Para amplificar los distintos vectores, estos fueron transformados en células competentes de Escherichia coli cepa DH5α cuyo orden de magnitud eran de 106 cfu/ug de ADN. Las alícuotas se encontraban almacenadas a -80°C. Para todas las transformaciones se utilizaron al menos 2 alícuotas; una para transformar la célula con el ADN plasmidial que deseábamos incorporar y otra alícuota como control negativo sin transformar. Las alícuotas de 100 μl fueron descongeladas en hielo durante 30 minutos,

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y luego inoculadas

con 2–5 μl de vector y dejadas nuevamente

en hielo por 30

minutos. A continuación, las alícuotas fueron sometidas durante 1 minuto a un choque térmico a 42°C e inmediatamente devueltas al hielo. En una campana estéril y con un mechero encendido, se agregaron 600 μl de medio LB a cada alícuota. Los tubos fueron incubados durante una hora a 37°C a 300 rpm. 50 μl del producto de transformación, fueron sembrados en la placa y distribuidos en forma homogénea. Las placas se incubaron a 37°C durante 12-16 horas. Las placas de LB agar, fueron preparadas con 20 ml de LB agar y ampicilina a 100 μg/ml. 3.2.1.3 Ligación de fragmentos de ADN. Las reacciones de ligación de los productos obtenidos, a partir de los distintos ensayos de restricción, fueron realizadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante, sin modificaciones. Para las ligaciones de fragmentos de ADN con extremos cohesivos o romos, se utilizaron 1,0 μl de la enzima T4 ADN Ligasa, 2 μl del tampón de la enzima, 50 ng de vector y una cantidad del fragmento a insertar en una proporción de 1:3 (ligación cohesiva) o 1:5 (ligación roma) con respecto al vector. La cantidad de inserto a agregar es determinado por la siguiente ecuación:

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Se trabajó con un volumen final de 20 μl y la ligación se realizó durante toda la noche a temperatura ambiente. 3.2.1.4 Electroforesis y cuantificación de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Los geles de agarosa se realizaron con tampón TAE 1x (10mM Tris-HCl pH 8,0, 1mM EDTA pH 8,0). Para que la agarosa logre disolverse en el tampón, se sometió a temperatura en un microondas hasta lograr una completa disolución de la agarosa, evitando la ebullición de la mezcla. Dependiendo del volumen del gel, se agregaron entre 2 – 5 μl de bromuro de etidio a una concentración de 1 mg/ml. Los porcentajes de geles oscilaron entre 0,8%

a 3%; estas variaciones

porcentuales son debido a las diferencias de los tamaños de fragmentos de ADN con los que se trabajó. Para todos los geles, el primer carril contenía el estándar de peso molecular de referencia de 100 bp o 1 kb. A las muestras de ADN se les agregó la cantidad correspondiente al tampón de carga 6x y éstas fueron sometidas a una migración electroforética de voltaje constante. El voltaje con el que se trabajó osciló entre los 70 y 100 mV trabajando con TAE 1x como tampón de corrida. Una vez finalizado el proceso electroforético, para lograr visualizar los fragmentos de ADN, los geles se introdujeron en un transiluminador de emisión UV (Ultraviolet Transilluminator BioImaging Systems). La incorporación del bromuro de etidio permite visualizar los distintos fragmentos de ADN debido a sus propiedades como agente intercalante de ácidos nucleicos, el cual al unirse al ADN emite una luz

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roja anaranjada visible a luz ultravioleta. Todas las imágenes fueron registradas digitalmente utilizando el software que viene acoplado al transiluminador (Gel Doc-it, Imaging System). La cuantificación de ADN a partir de geles de agarosa se hizo mediante procesamiento de imagen con el software Gel Doc-it, Imaging System. Los estándares de peso molecular tienen establecida la relación entre la cantidad de nanogramos y el tamaño molecular. Se realizó una comparación entre la cantidad de muestra de ADN agregada en el carril del gel de agarosa con el estándar de peso molecular del primer carril, relacionando el fragmento de interés que deseamos cuantificar con la banda de peso molecular más próxima al estándar de referencia. 3.2.1.5 Extracción de ADN a partir de geles de agarosa. Los fragmentos de ADN que se deseaban utilizar para experimentos posteriores fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa. El gel se sometió a un transiluminador UV durante un breve periodo, y el fragmento de interés fue removido del gel con ayuda de un bisturí. El fragmento de ADN contenido en la agarosa fue extraído utilizando un kit comercial de extracción de ADN a partir de agarosa siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.2.1.6 Extracción de ADN plasmidial. Para poder detectar aquellos plásmidos correctamente transformados y lograr verificar que los productos de ligación se encontraran en la orientación deseada, se trabajó con el método de extracción de ADN plasmidial TENS (Tris 10 mM a pH 7,5, EDTA 1mM a pH 8,0, NaOH 0,1m y SDS 0,5%.

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Para este protocolo se trabajó con 1,5 ml de cultivo de bacterias los cuales fueron centrifugados a temperatura ambiente en una microcentrifuga durante 1 minuto a 10,000 rpm descartando el sobrenadante y dejando un volumen residual de 50-100 μl. A cada muestra se le agregó 300 μl de solución TENS y agitadas en vórtex durante 30 segundos y luego se agregó 150 μl de acetato de sodio 3M pH 5,2 y agitadas en vórtex nuevamente y finalmente se centrifugó durante 5 minutos a 14,000 rpm. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo con 900 μl de etanol 100%, el tubo se centrifugó a 4°C durante 10 minutos a 14,000 rpm y el precipitado fue lavado con 500 μl de etanol 70% y centrifugado a temperatura ambiente durante 2 minutos a 14,000 rpm. El sobrenadante se descartó y el precipitado fue secado a temperatura ambiente durante

aproximadamente

30-40

minutos.

Finalmente

el

sobrenadante

fue

resuspendido en 30 μl de agua y calentado a 50ºC con agitación (800 rpm durante al menos 1 hora). Concluido este paso, las muestras fueron almacenadas a 4°C para ensayos a corto plazo, dado que a periodos de tiempos largos estas se degradan. Las extracciones y aislamientos de ADN de muestras para procedimientos posteriores se llevaron a cabo con el uso de kits comerciales de Mini Preps y Midi Preps, los cuales fueron trabajados según las indicaciones del fabricante. En el caso de las Mini Preps se trabajó a partir de un volumen de 5 mL de cultivo de bacterias en LB para obtener un volumen final de 100 μl de ADN plasmidial puro. Para las Midi Preps el volumen original fue de 150 ml de cultivo para obtener un volumen final de 600 μl de ADN.

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3.2.1.7 Ensayos de restricción, desfosforilación y fill-in de ADN plasmidial. Se realizaron diversos ensayos de restricción con cantidades variables de ADN dependiendo del experimento a realizar. Para realizar las ligaciones se utilizó 20 μg de ADN. Para la verificación de una correcta ligación, se utilizó cantidades de ADN del orden de nanogramos. El volumen agregado de enzima de restricción para cada caso se calculó considerando que una concentración de 10 UI/μl, donde 1 UI (unidad internacional de enzima) es capaz de catalizar la ruptura de 1 μg de ADN en una hora a la temperatura indicada por el fabricante, que usualmente corresponde a 37°C. Para cada caso se utilizó el tampón específico para cada enzima, el cual viene siempre a una concentración 10x. Para el caso de aquellos ensayos de restricción doble y que contenían enzimas de restricción con distintos tampones, se digirió entre 12-16 horas con una de las enzimas, se inactivó la reacción por incubación durante 20 minutos a la temperatura indicada por el fabricante. El ADN fue recuperado para la siguiente digestión por precipitación con isopropanol (2 volúmenes de isopropanol fueron agregados y se dejó precipitar a -20°C por 6 horas, centrifugando a 16,000 rpm por 20 minutos a 4°C, y el precipitado fue lavado con un volumen de etanol 70%, centrifugando a 16,000 rpm por 5 minutos a 4°C. Para la segunda digestión, se agregó la cantidad requerida de la segunda enzima, de tampón y se agregó la cantidad de H2O necesaria para igualar el volumen original que contenía el tubo cuando se hizo la primera digestión. Se dejó

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incubando, a la temperatura indicada para la enzima, durante el mismo periodo que la primera digestión. Para prevenir la religación de los productos de digestión que serían utilizados como vectores de ligación, se removieron los grupos fosfato de los extremo 5' del ADN utilizando la enzima SAP siguiendo el procedimiento de desfosforilación del vector fue llevado a cabo según las indicaciones del fabricante. Para aquellos ensayos de restricción que resultaron en extremos cohesivas y que son requeridos para ligaciones de carácter romo, se realizó fill-in utilizando el fragmento Klenow siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.2.1.8 Construcción del transgén PomcArc Cre. Para dirigir la expresión de la proteína Cre recombinasa a las neuronas POMC del núcleo arcuato, se diseñó una construcción transgénica en la cual su secuencia codificante, se encuentra rio abajo de un promotor quimérico compuesto por el promotor mínimo de expresión HSP68 y los elementos regulatorios de la expresión de Pomc nPE1 y nPE2. Para la generar la construcción del transgén se realizaron una serie de subclonamientos en un plásmido pBluescript II KS (+) que contenía los enhancers neuronales de Pomc flanqueados por los sitios NotI y BamHI. Este vector además, contenía un cassette de resistencia a ampicilina. El vector pCEP4 que contenía la secuencia del gen de la Cre recombinasa, el SV40 polyA más un cassette de resistencia a ampicilina fue amplificado, el cual fue utilizado para el subclonamiento posterior. Se realizó una digestión doble con las

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enzimas KpnI y SalI. A partir de este procedimiento se obtuvo un fragmento de ADN con la secuencia de la Cre recombinasa más la señal de poliadenilación SV40, la cual fue sometida a una reacción de fill-in para realizar una posterior ligación roma. Para realizar el subclonamiento del fragmento que contiene la secuencia de la Cre recombinasa con el SV40 pA en el vector pBluescript II KS (+) que contiene los enhancers neuronales de Pomc, este último vector fue digerido con la enzima EcoRV y posteriormente desfosforilado con la enzima SAP, con el objetivo de evitar la religación de los extremos del vector linearizado. Se realizó una ligación roma en el sitio EcoRV del vector con los enhancers. El producto de ligación obtenido fue utilizado para realizar una nueva transformación usando como controles negativos el vector desfosforilado y religado y otro control negativo sin vector. Para verificar que la ligación fuera direccional, se utilizó con una cantidad determinada de colonias, a las cuales se les realizó una extracción de ADN plasmidial por el método TENS. Una vez subclonada la secuencia génica de la enzima Cre recombinasa más el sitio de poliadenilación SV40 pA, se subclonó el promotor mínimo HSP68, el cual se encontraba en un vector llamado pBS- HSP68- lacZ- B. Debido a la incompatibilidad de sitios de restricción para un subclonamiento directo, la secuencia de ADN del HSP68 se amplificó mediante PCR con el uso de una enzima polimerasa de alta fidelidad. Los partidores diseñados incorporaron sitios reconocidos por la enzima de restricción SmaI en ambos extremos.

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El producto de la amplificación fue ligado en un vector pGEMT easy mediante clonamiento T-A, el cual consiste en una amplificación por PCR con una enzima polimerasa que deja un adenilato protuberante en los extremos 3’ de cada hebra del producto de PCR para posteriormente ser ligado en un vector que contiene timidilatos protuberantes complementarios. Esta ligación fue transformada y se seleccionaron algunas colonias las cuales fueron crecidas en medio LB para obtener un cultivo líquido y posteriormente realizar una extracción de ADN plasmidial por el método TENS. A partir de la extracción de ADN plasmidial se realizaron ensayos de restricción para monitorear qué colonias tenían SmaI-HSP68-SmaI en el vector pGEMTeasy. Finalmente, para subclonar el promotor mínimo HSP68, el plásmido pGEMTeasy SmaI-HSP68-SmaI fue digerido con XmaI, enzima que reconoce los mismos sitios de SmaI pero dejando extremos cohesivos. Para la obtención del inserto HSP68, se realizó una electroforesis para extraer la banda correspondiente al fragmento SmaI- HSP68SmaI y el fragmento correspondiente de ADN fue purificado a partir de un gel de agarosa con el uso de un kit comercial. Posteriormente, para efectuar el subclonamiento, se digirió el vector que contiene los elementos regulatorios nPEs y la secuencia de la Cre recombinasa con la enzima XmaI, este fragmento linearizado fue ligado por el procedimiento de ligación cohesiva con el fragmento SmaI-HSP68-SmaI. El producto de ligación fue transformado en bacterias DH5a y crecidas en placas de LB-agar. Se crecieron aproximadamente 15 colonias en cultivos líquidos, las cuales fueron utilizadas para realizar una extracción de ADN por el método TENS. Se realizaron ensayos de restricción para verificar la correcta direccionalidad del subclonamiento. Se seleccionó el cultivo líquido de una de las colonias direccionales,

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desde el cual se realizó una extracción de ADN plamidial por una reacción de MIDIprep y posteriormente una alícuota de 100 μl, a una concentración de 200 ng/μl, se envió a secuenciar a Macrogen. Esta secuenciación comprendía la construcción completa para ver la integridad de las secuencias de los enhancers, HSP68 y Cre recombinasa. 3.2.1.9 Purificación del transgén para microinyección. A partir del vector que contiene el transgén a microinyectar, se realizaron las digestiones necesarias para la obtención del ADN de interés, posteriormente

se

sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se realizó la extracción de ADN a partir de gel de agarosa ya descrita, con la única diferencia que la última elución fue realizada con 750 μl de Low salt buffer. Una vez obtenido el transgén, este fue purificado en solución con columnas y prefiltros Elutip-D (Whatman), método basado en la utilización de columnas que contienen una matriz donde el ADN se une en condiciones de baja concentración de sal y es eluído con una solución con alta concentración de sal. De esta manera, se logró una purificación más exhaustiva y se obtuvo el transgén con el pH necesario para la microinyección. Para esto se siguieron sin modificaciones las instrucciones del fabricante. Posteriormente el transgén fue precipitado con dos volúmenes de Etanol 100% y resuspendido con un buffer TE light pH 7,4. 3.2.1.10 Técnica de manipulación de embriones y microinyección del transgén. La microinyección del transgén fue llevada a cabo por personal especializado del CECs en la instalación específica para este efecto ubicada en la zona SPF del Bioterio.

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Para obtener suficiente cantidad de embriones para microinyectar la construcción transgénica las hembras fueron superovuladas. Para esto, se indujo un aumento del número de cohortes foliculares mediante la administración de 100 μl de una solución de PMSG (del inglés, Pregnant Mare Serum Gonadotrophin, 50 UI/ml) por vía intraperitoneal a hembras híbridas C57B6/6J x CBAF1 de 4-5 semanas de edad. 48 horas después del tratamiento de PMSG, se administró 50 UI/ml de HCG (gonadotrofina coriónica humana) para inducir la liberación de los ovocitos y 12 horas después, estas hembras fueron apareadas con machos híbridos de la misma cepa. A la mañana siguiente, se realizó una inspección de las hembras en busca de un tapón vaginal que evidenciara el coito. Las hembras que se habían apareado fueron sacrificadas y se realizó una incisión entre el ovario y el oviducto y otra entre el útero y el oviducto con el fin de liberar el oviducto. El oviducto fue transferido a una placa para la obtención de los embriones. Bajo un microscopio dotado de micromanipuladores, se procedió a microinyectar 1 pL de solución de ADN (500 mol/pL) en el pronúcleo masculino de las cigotas, las que posteriormente fueron transferidas al oviducto de hembras seudopreñadas. Para obtener hembras seudopreñadas se puso en apareo, la noche anterior a la recolección de cigotas, hembras jóvenes (entre 6-9 semanas) con machos vasectomizados. A la mañana siguiente se seleccionaron las hembras con tapón vaginal, las que por la tarde fueron anestesiadas para ser transferidas con los embriones microinyectados. Se transfirieron aproximadamente 10 a 15 embriones por oviducto. Después de 21 días las crías nacieron por parto normal y permanecieron con sus madres hasta la cuarta semana de vida.

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3.2.1.11 Extracción de ADN para genotipificaciones e identificación de líneas transgénicas. A los 14 días de vida de las crías se obtuvo una biopsia de cola, de aproximadamente 5 mm, para obtener el ADN genómico. Cada fragmento de cola fue incubado con 500 μl de tampón TEL (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM EDTA pH 8.0, 100 mM NaCl y 0.5% SDS) y 10 μl de proteinasa K 10 mg/ml por 4 a 12 horas a 55°C con agitación constante a 800 rpm. El tratamiento de tampón TEL y proteinasa K permite la desintegración del tejido, inhibición de nucleasas, manteniendo en buenas condiciones el ADN. Luego de la incubación, el homogenizado se centrifugó durante 10 minutos a máxima velocidad. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y mezclado con un volumen de etanol 100% para precipitar el ADN. Posteriormente, el ADN se centrifugó durante 10 minutos a 16000 rpm, el sobrenadante se eliminó, se lavó el precipitado con etanol 70% y se volvió a centrifugar por 5 minutos a 16000 rpm. El sobrenadante fue eliminado y se dejó secando el precipitado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, al ADN precipitado se añadieron 150 μl de tampón TE (10mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) y se resuspendió a 50°C durante 1 hora con agitación constante. El ADN genómico obtenido fue almacenado a 4°C para las posteriores determinaciones a corto plazo, y guardados a -20°C para experimentos a largo plazo. Para determinar las distintas líneas transgénicas obtenidas del proceso de microinyección del transgén PomcArc Cre, se realizó la genotipificación por PCR utilizando como templado el ADN genómico obtenido de las biopsias de colas. La estrategia comprende a un par de partidores que identifica exclusivamente una región de la secuencia nucleotídica del transgén. El oligonucleótido directo, designado con el número 3 en la sección de partidores, contiene 17 unidades homólogas a una región del

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promotor mínimo HSP68. El oligonucleótido antisentido número 4, posee 24 nucleótidos y reconoce la secuencia génica de la proteína Cre recombinasa. El fragmento de ADN amplificado a partir del PCR es de 1024 pares de bases.

3.2.2 Epigenética. 3.2.2.1 Obtención de ADN genómico y modificación de ADN con bisulfito de sodio. Para realizar los estudios de patrones de metilación se trabajó con 2 animales de la cepa 129S1; un animal silvestre de 5 semanas y un animal Knock-out 129 de 5 semanas. Estos ratones fueron sacrificados con el procedimiento descrito en “métodos de eutanasia”. Posteriormente a cada uno de los animales se le extrajo el Núcleo Arcuato y se almacenó en un tubo de 1,5 ml a -20°C para la posterior extracción de ADN genómico utilizando un kit comercial y siguiendo el procedimiento indicado por el fabricante. Posteriormente, se realizó un PCR para amplificar ciclofilina, un gen constitutivo, como control para comprobar que la extracción de ADN genómico fue correcta. El tratamiento con bisulfito de sodio se realizó con ayuda de un kit comercial y los procedimientos se llevaron a cabo según las indicaciones del kit sin modificación alguna. Debido al bajo volumen de elución (25 μl), las muestras fueron cuantificadas por absorbancia a 260 nm con 2 μl de muestra y 98 de agua doblemente destilada utilizando como blanco 100 μl de agua.

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3.2.2.2 Análisis de patrones de metilación de ADN mediante MSP. Para los estudios de metilación de ADN, mediante MSP, se utilizó como templado el ADN tratado con bisulfito de sodio. Los partidores usados fueron aquellos obtenidos utilizando un software en línea. Debido a que las regiones que se deseaban estudiar son ricas en GC, lo que aumenta en forma considerable la complejidad de las reacciones, se hizo un gradiente de temperatura y de concentraciones de DMSO entre el 1 y 5% además de los componentes convencionales añadidos para el correcto funcionamiento de la enzima taq polimerasa. Una vez que se seleccionaron los conjuntos de primers que lograban amplificar las regiones metiladas y las no metiladas, el ensayo se llevó a cabo con la enzima longPCR utilizando 280 nanogramoos de templado

y siguiendo las

instrucciones del fabricante para PCRs ricos en GC. Para visualizar los productos de PCR, se realizó una electroforesis en geles de agarosa TAE 1x al 3%, y se compararon las amplificaciones de aquellos partidores para identificar zonas metiladas de las no metiladas.

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4. RESULTADOS

4.1 Identificación de islas CpG en el promotor de proopiomelanocortina. Utilizando herramientas bioinformáticas investigamos si el promotor de proopiomelanocortina posee islas CpG que de alguna manera podrían ser blanco de regulación de expresión génica de Pomc. Para identificar zonas ricas en dinucléotidos CpG se utilizaron los siguientes criterios:  El tamaño de la región debe ser mayor a 100 pares de bases.  El porcentaje de GC debe ser mayor al 50%.  Debe contener una razón CpG observado: esperado mayor al 60%, donde esta razón es calculada según la fórmula:

Utilizando estos criterios, se identificó una región rica en islas CpG ubicada entre las regiones -250 pb y +55 pb con respecto al sitio de inicio de la transcripción del gen Pomc (Figura 6).

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Figura 6. El promotor del gen de proopiomelanocortina posee múltiples islas CpG. Se consideró un total de 1835 pares de bases que corresponden a 1273 pb antes del sitio de inicio de la transcripción y 563 después del sitio de inicio de la transcripción. La región donde se identificó una mayor concentración de islas CpG fue entre -250 y +55 marcada en color azul. La línea roja punteada corresponde al 50% de GC en la secuencia, uno de los criterios descritos para identificar la concentración de las islas CpG. Las líneas verticales rojas mostradas bajo el eje horizontal representan las regiones CpG que se identificaron en la secuencia.

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4.2 Análisis epigenético del promotor de proopiomelanocortina en animales silvestre y nulo para Mecp2. Considerando que Pomc es un buen candidato de regulación epigenética debido a la alta presencia de islas CpG. El mismo software utilizado para la identificación de islas CpG, sugirió partidores en la región de interés que permiten discriminar si el promotor se encuentra metilado o no metilado. El diseño de estos oligonucléotidos se basó en ubicar la secuencia sentido y antisentido en una región que contenga dos islas CpG para cada partidor. Considerando que las muestras han sido tratadas con bisulfito de sodio, aquellas que contengan sus islas CpG metiladas en el promotor de Pomc, van a mantener la secuencia original en estas islas y son reconocidas por los partidores “M”, los cuales también mantienen la secuencia original. Por otro lado, para lograr reconocer muestras que no se encuentran metiladas y que por lo tanto, han sufrido cambios en todas sus citosinas producto

de

la

reacción de

sulfonación,

la

secuencia

oligonucleotídica es modificada de citosinas a timinas. Los cinco sets de partidores utilizados se diferencian en añadir o quitar nucleótidos adyacentes a las regiones escogidas con el objetivo de favorecer las amplificaciones por MSP. De acuerdo al fenotipo de los modelos mutantes nulos para Mecp2 descrito, se compararon los niveles de metilación del promotor de POMC en un ratón nulo para Mecp2 y su hermano de camada silvestre mediante MSP a partir de biopsias de hipotálamo. Consistente

con

nuestra

hipótesis,

se

observó

que

el

promotor

de

proopiomelanocortina en el ratón nulo para Mecp2 presenta una hipermetilación en el ADN en comparación con el ratón silvestre. Consecuentemente, en el MSP para

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identificar las regiones no metiladas se observa mayor amplificación en el ratón silvestre (Figura 7).

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Figura 7. El promotor de Pomc se encuentra hipermetilado en los Ratones Mutantes Nulos para Mecp2. M: MSP realizado para identificar islas CpG metiladas en el promotor de Pomc. NM: MSP para amplificar islas CpG no metiladas. El amplicón para detectar islas CpG metiladas es de 141 pb al igual que el de islas no metiladas. KO5, corresponde al ratón mutante nulo para Mecp2 de 5 semanas de edad. WT5, es el ratón silvestre de 5 semanas de edad hermano del ratón KO utilizado. C (-) representa el control negativo de la reacción sin templado. Los valores numéricos que aparecen sobre los amplicones corresponden a

una cuantificación relativa, mediante

procesamiento de imagen, para comparar las alteraciones de los niveles de metilación del ADN entre animal silvestre y nulo para Mecp2.

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4.3 Construcción del transgén PomcArc Cre Para desarrollar un modelo transgénico que exprese la proteína Cre recombinasa particularmente en las neuronas POMC del núcleo arcuato del hipotálamo, se efectuaron los tres subclonamientos descritos en metodología. La construcción definitiva resulta en un plásmido que contiene un promotor quimérico capaz de dirigir la expresión de la proteína Cre recombinasa a la población neuronal POMC del Núcleo Arcuato (Figura 8).

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Figura 8. Construcción teórica del transgén PomcArc Cre. La construcción de un promotor quimérico que contiene los 4000 pb que contienen enhancers neuronales de Pomc junto al promotor mínimo HSP68 y la secuencia del gen de la Cre recombinasa, debería ser capaz de comandar la expresión de esta proteína en neuronas POMC del núcleo arcuato. SV40 pA corresponde a una señal de poliadenilación necesaria para que el ARN mensajero permanezca estable y logre traducirse a proteína.

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La secuencia de ADN de la proteína Cre recombinasa se encontraba subclonada en un vector comercial pCEP4 (Figura 9A). A continuación, se hizo una digestión doble de este plásmido, con las enzimas SalI y KpnI, para obtener la secuencia de Cre recombinasa con la señal SV40 pA y subclonarlos en el plásmido pBluescript II KS + que contiene los nPEs (Figura 9B). Se seleccionaron 10 colonias, a las cuales se les extrajo ADN plasmidial y se realizó un ensayo de restricción con la enzima XhoI para seleccionar aquellas colonias que contienen el vector del pBluescript con los nPEs más la Cre en forma direccional. De acuerdo a los resultados, se obtuvo 3 colonias direccionales: la 2, 3 y 8 (Figura 9C).

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Figura 9. Subclonamiento del gen de la Cre recombinasa y la señal SV40 pA en el vector que posee los enhancers neuronales, nPEs. A) Representación del vector Cre recombinasa SV40 pA/ pCEP4 con la ubicación de las enzimas utilizadas para obtener la región de interés. B) Representación del vector nPEs Cre recombinasa SV40 pA, con ubicación de la enzima XhoI, necesaria para evaluar la direccionalidad de la construcción. C) Electroforesis en gel de agarosa de ensayos de restricción de 10 colonias seleccionadas para evaluar la correcta orientación de la secuencia de Cre recombinasa –SV40. Al digerir con XhoI, aquellas construcciones subclonadas en dirección 5’  3’ entregaron fragmentos de 8641 y 444 pares de bases, mientras que las orientadas en 3’ 5’ muestran bandas de 7512 y 1473 pares de bases. Se consideró como bandas reporteras aquellas de menor peso molecular (subrayadas). En negrita se muestran las colonias positivas direccionales.

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El siguiente paso fue amplificar por PCR el promotor mínimo HSP68 flanqueado por sitios SmaI. El producto de PCR se insertó en un vector y se evaluó la correcta ligación con la enzima SmaI. De acuerdo a los resultados, la colonia 1, 2, 3 y 4 tienen el vector junto al HSP68 (Figura 10).

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Figura 10. Subclonamiento del promotor mínimo HSP68 flanqueado por sitios de restricción SmaI en un vector comercial. Se seleccionaron 5 colonias y se evaluó si el promotor HSP68 se encontraba correctamente subclonado en el vector mediante un ensayo de restricción con SmaI. Para las colonias positivas, se obtuvo una banda de 3015 pares de bases correspondientes al pGEM®-T Easy y otra de 944 pares de bases que es el HSP68. En negritas se muestran las colonias positivas.

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Finalmente para obtener el vector con la construcción PomcArc Cre se subclonó el promotor mínimo HSP68 en el plásmido que contenía los nPEs y la secuencia codificante para la Cre recombinasa y la SV40. Para esto, ambos vectores fueron digeridos con XmaI, enzima que reconoce el mismo sitio SmaI pero dejando extremos cohesivos, para posteriormente hacer la ligación. Para comprobar que el producto de ligación estuviera correctamente orientado, se realizó un ensayo de restricción doble con las enzimas AflII y SalI (Figura 11A). Según los resultados, las colonias 2, 4, 8 y 9 poseen la construcción direccional (Figura 11B). Para comprobar la integridad del ADN de la construcción, una de las colonias positivas fue enviada a secuenciar y se verificó que los componentes en el vector no presentaban mutaciones que pudiesen alterar la funcionalidad o especificidad de la expresión de la proteína Cre recombinasa.

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Figura 11. Subclonamiento del promotor mínimo HSP68 en el vector que contiene los nPEs, la secuencia de la Cre recombinasa y SV40 pA. A) Representación del vector nPEs HSP68 Cre SV40 pA pBluescript con la ubicación de las enzimas SmaI, AflII y SalI, estas dos últimas fueron necesarias para evaluar la direccionalidad del subclonamiento del promotor HSP68. B) Electroforesis en gel de agarosa de ensayos de restricción de 10 colonias seleccionadas para evaluar la correcta orientación de la secuencia; si la orientación es 5’ 3’ se esperaban fragmentos de 7470 y 2553 pares de bases, para la orientación 3’  5’ los fragmentos fueron de 7892 y 2100 pares de bases. Se consideró como bandas reporteras aquellas de menor peso molecular (Subrayadas). En negrita se muestran las colonias positivas direccionales.

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4.4 Obtención y purificación del transgén PomcArc Cre. El transgén PomcArc Cre fue purificado desde el plásmido pBluescript por digestión enzimática de ScaI en 5’ y SalI en 3’. El resultado de la digestión doble permitió obtener un fragmento lineal de aproximadamente 9000 pares de bases, que contenía a los enhancers neuronales con el promotor mínimo HSP68 y la secuencia de la Cre recombinasa con el SV40. (Figura 12). El transgén purificado fue cuantificado y enviado a microinyectar según lo anteriormente descrito en materiales y métodos.

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Figura 12. Purificación del transgén PomcArc Cre. Electroforesis en gel de agarosa del producto de digestión doble con las enzimas ScaI y SalI y posteriormente purificado para obtener el transgén con los enhancers neuronales, el promotor mínimo HSP68, la secuencia de la Cre recombinasa y la señal de poliadenilación SV40.

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4.5 Identificación de las distintas líneas transgénicas. Luego del periodo de gestación, posterior a la microinyección, nacieron 35 crías las cuales fueron genotipificadas mediante PCR utilizando como templado las biopsias de colas (Tabla I). La estrategia utilizada, para identificar a los fundadores de las distintas líneas transgénicas, constó de un partidor sentido que identifica una región del promotor mínimo HSP68 y otro antisentido que reconoce la secuencia de la Cre recombinasa generando un amplicón de 1028 bp (Figura 13A). A partir de la genotipificación, se identificaron 2 fundadores de distintas líneas transgénicas de PomcArc Cre denominados como d152 y d176 (Figura 13B).

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Tabla I. Resumen del proceso de generación de las líneas transgénicas PomcArc Cre. Se transfirieron 221 cigotas microinyectadas con el transgén PomcArc Cre linearizado a 13 hembras seudopreñadas. De este proceso nacieron 37 crías, de las cuales el 2resultaron ser ratones transgénicos, fundadores de dos líneas transgénicas independientes.

Cigotas

Cigotas

Hembras

Crías

Ratones

% de ratones

Microinyectadas

Transferidas

receptoras

nacidas

transgénicos

transgénicos

278

221

13

37

2

5,4%

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Figura 13. Identificación de líneas transgénicas PomcArc Cre mediante PCR. A) Representación de transgén PomcArc Cre y ubicación de partidores para identificar las líneas transgénicas mediante PCR. B) Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR de la genotipificación de las 35 crías nacidas. En negrita se muestran los ratones que contienen en transgén. MIX, corresponde al control negativo sin templado; WT, es un control negativo usando como templado el ADN de un animal silvestre; (+) es un control positivo usando como templado el transgén PomcArc Cre purificado.

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5. DISCUSIÓN.

Mecp2 pertenece a una familia de proteínas que se une específicamente a islas CpG metiladas, actuando como regulador de expresión de algunos genes (Martinowich et al., 2003). Su función como factor de transcripción, está relacionada con el estado de la cromatina y las modificaciones epigenéticas que puedan tener los distintos blancos de Mecp2 (Chahrour & Zoghby, 2007). A pesar que esta proteína tiene como propiedad unirse a ADN metilado, no se ha descrito de forma clara una correlación entre su pérdida de función y posibles alteraciones en los patrones de metilación del genoma. Uno de los objetivos de esta tesis fue determinar posibles modificaciones en la metilación del promotor de Pomc en un ratón juvenil mutante nulo para Mecp2. Nuestra premisa era que una alteración de metilación del ADN durante algún periodo en la adolescencia podría estar asociada al fenotipo de obesidad mostrado en ratones adultos nulos para Mecp2 como producto de una desregulación en los niveles de expresión de Pomc. Consistente con nuestra idea inicial, al realizar los estudios de MSP encontramos que existe una hipermetilación de las islas CpG del promotor de Pomc en el animal nulo para Mecp2. En esta

línea, estos resultados se correlacionan con

observaciones de nuestro grupo, donde ratones nulos para Mecp2 presentan una mayor expresión relativa de leptina (Mancilla-Medina et al., 2012) y el aumento en los niveles de esta hormona no se traduce en una mayor actividad del tono anorexigénico a nivel central (Torres-Andrade et al., 2011). Por lo tanto, la ausencia de este factor de transcripción durante la adolescencia podría estar provocando una alteración

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epigenética que genere como consecuencia, el desarrollo de obesidad durante el periodo adulto del ratón producto de una desregulación a nivel central. Al identificar la mayor concentración de dinucleótidos CpG, mediante análisis In silico, se detectó la isla CpG en la región entre -250 y + 55 pares de bases con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Dentro de Pomc, los 55 nucleótidos rio abajo del inicio de la transcripción corresponden al 5’UTR del gen. Se ha reportado que la mayor concentración de dinucleótidos CpG, dentro de esta isla, se encuentra entre -34 y +45 pb con respecto al sitio de inicio de la transcripción (Kuehnen et al., 2012). Cabe mencionar que existe otra región, dentro de la secuencia de Pomc, de mayor longitud y contenido de GCs, ubicada entre el intrón 2 y el exón 3 de Pomc (Kuehnen et al., 2012), la cual pudimos detectar sin inconvenientes con el software utilizado. Sin embargo, este trabajo se centró exclusivamente en ver el comportamiento de metilación en el promotor, quedando como proyección ver qué sucede dentro de la segunda isla CpG del gen de proopiomelanocortina. Cabe mencionar que la técnica MSP, resulta bastante útil como primera aproximación. Los MSP (M y NM) corresponden a PCRs de punto final, los cuales no son cuantificables, por lo que las comparaciones numéricas mostradas son procesamientos de imagen que representan una tendencia al posible comportamiento de estos modelos. Sin embargo el siguiente paso es utilizar técnicas de secuenciación por bisulfito que establezcan el número y lugar de las islas CpG que se encuentran metiladas, además de aumentar el número de animales de estudio que logre ser representativo a una población

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A partir del fenotipo de obesidad observado en ratones nulos para Mecp2 a las 8 semanas de edad, surgió la necesidad de estudiar la ausencia de este factor de transcripción de forma condicionada en grupos celulares definidos con el objetivo de identificar cuál es la contribución parcial de cada población celular al fenotipo exhibido en estos modelos. En esta tesis, se generó un ratón expresor de la proteína Cre recombinasa. Dado el diseño del promotor utilizado esperamos que esta enzima se exprese exclusivamente en las neuronas Pomc del núcleo arcuato. Actualmente, estamos realizando cruzas con ratones portadores del alelo Mecp2loxP. Por probabilidades mendelianas, en la descendencia de estos apareos deberían existir ratones doble transgénicos portadores de ambas construcciones y carecer de la proteína Mecp2 exclusivamente en las neuronas Pomc del núcleo arcuato del hipotálamo, región conocida por ser la principal moderadora de la homeostasis energética. Sin embargo, queda por caracterizar las dos líneas transgénicas PomcArc Cre y comprobar que la proteína Cre recombinasa no presente expresión ectópica. Para realizar la caracterización, en el laboratorio disponemos del modelo transgénico reportero ROSA26 EGFP (Figura 14), el cual posee el promotor ubicuo ROSA26 seguido por un cassette de detención de la transcripción flanqueado por sitios loxP y la secuencia que codifica para la proteína EGFP. El resultado de la cruza con cada una de las dos líneas PomcArc Cre, debería resultar en fluorescencia exclusivamente en el Núcleo Arcuato, usando como control negativo de fluorescencia a la glándula hipófisis; considerando que se generó un promotor quimérico con los nPEs que dirigen la expresión únicamente a las neuronas Pomc.

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Figura 14. Construcción del transgén ROSA26 EGFP. Este modelo transgénico es una herramienta útil como reportero de recombinación. La cruza del ROSA26 EGFP con un modelo que exprese la proteína Cre recombinasa va a permitir que el cassette stop de la transcripción flanqueado por sitios loxP, que porta el transgén ROSA26 EGFP sea depletado en aquellas células que expresen la Cre recombinasa, lo que se traduce en fluorescencia de la proteína EGFP específicamente en los tipos celulares donde se expresa la Cre recombinasa.

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Teóricamente, si Mecp2 estuviese regulando de forma directa la expresión de proopiomelanocortina en las neuronas del Núcleo Arcuato del hipotálamo, entonces en aquellos animales condicionales carentes del factor de transcripción en esta población celular, deberíamos esperar que el tono anorexigénico se encuentre desbalanceado y consecuentemente, desarrollen un fenotipo alterado en el peso corporal. Paralelo a esto, nuestro laboratorio también adquirió, desde el laboratorio Jackson, un modelo Agrp Cre, para poder suprimir Mecp2 de las neuronas Agrp del núcleo arcuato y ver las posibles alteraciones que podrían ocurrir con el tono orexigénico, teniendo en consideración que la mayor parte de las proteínas involucradas en ambas vías de señalización tienen funciones antagónicas entre las poblaciones Pomc y Agrp (Plum et al., 2006). Previamente, en nuestro laboratorio, se trabajó con modelos nulos condicionales para Mecp2 en las células POMC de la hipófisis, que corresponden a las corticotropas y melanotropas. Estas poblaciones celulares se diferencian por un clivaje alternativo del gen Pomc produciendo ACTH y αMSH respectivamente (Moran et al., 2011). Estudiando las distintas líneas transgénicas se observó que aquellos modelos que carecen de Mecp2 en los melanotropos muestran un fenotipo de obesidad, a pesar que siguen expresando Mecp2 adecuadamente dentro del hipotálamo (no publicado). Una hipótesis es que la expresión de Pomc en los melanotropos se encuentre afectada y que por un mecanismo de retroalimentación, alteraciones en la expresión de Pomc en los melanotropos, afecten la expresión de Pomc en las neuronas del núcleo arcuato, evento en el cual estarían involucrados los receptores MC3R, los cuales se expresan en esta región hipotalámica (Rediger et al., 2012), es decir que la ausencia de Mecp2 en el

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lóbulo intermedio provoque cambios en la expresión de Pomc y subsecuentemente αMSH y así, se alteraría la retroalimentación entre la hipófisis y el núcleo arcuato, impidiendo el correcto funcionamiento de Pomc en el hipotálamo como regulador de la homeostasis energética. No obstante, no existen reportes que hayan relacionado la liberación de hormonas de los melanotropos del lóbulo intermedio con una función retroalimentadora. A pesar que se ha reportado que los modelos murinos

de RTT presentan

sobrepeso, este fenotipo no se observa en la mayoría de las pacientes. Esto podría deberse a que la mayoría de las pacientes carecen de autonomía, por lo tanto, las niñas con RTT se encontrarían subalimentadas en relación a las demandas fisiológicas de su sistema. En cambio, pacientes con mutaciones que producen un fenotipo menos agresivo de RTT o con una inactivación del cromosoma X que favorece el silenciamiento del cromosoma portador de la mutación de Mecp2, podría asociarse a un mantenimiento de la autonomía y un aumento del peso corporal. La importancia de entender cuál es el rol de Mecp2 en la regulación de la función de las neuronas anorexigénicas y orexigénicas de primer orden, además de entender la contribución de estas poblaciones neuronales al fenotipo observado en pacientes con RTT, es encontrar un posible blanco terapéutico para un problema muy vigente en la actualidad a nivel mundial. La naturaleza global de la obesidad, como epidemia, fue formalmente reconocida por la organización mundial de la salud (WHO) en 1997 (Caballero, 2007). El sobrepeso y la obesidad representan una situación crítica en toda la humanidad (WHO, 2012). Los distintos reportes relacionados al mejor entendimiento del sistema regulador del balance energético, tanto a nivel molecular, celular y

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fisiológico, han entregado nuevas herramientas que permiten combatir este problema, relacionando cómo responde el organismo a las distintas señales periféricas en función a nuestra información genética particular. Tal como se ha señalado, este trabajo reporta una primera aproximación de posibles modificaciones epigenéticas que podrían estar ocurriendo en modelos mutantes nulos para Mecp2, específicamente de alteraciones en la metilación del ADN relacionándolo a un gen primordial en la homeostasis energética.

A pesar de los

múltiples reportes existentes para la proteína MECP2, previos a esta tesis, no se había relacionado la conducta epigenética del ADN en ausencia de este factor de transcripción. Una mejor comprensión de los mecanismos a través de los cuales Mecp2 participa en la homeostasis energética, entregará luces de la relación entre las interacciones entre el medio ambiente y el genoma mediadas por modificaciones epigenéticas y podría resultar de gran utilidad en la identificación de un nuevo blanco terapéutico para el tratamiento contra la obesidad.

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