Módulo 1 Mecanismos de la coagulación Anticoagulantes orales: interacciones con fármacos y fitoterapia

Mecanismos de la coagulación M. Dolores Tàssies Penella

RESUMEN La coagulación sanguínea es un proceso crítico para la vida de los organismos que poseen un sistema de circulación sanguínea. La coagulación en su conjunto comprende una serie de complejos mecanismos de activación y de desarrollo del producto de la misma, el coágulo. El modelo tradicional en el que se establecía la participación únicamente de elementos contenidos en el plasma se ha visto cuestionado y en el momento actual se acepta como más real un modelo bastante más complejo que incluye componentes plasmáticos y también elementos celulares. Por otro lado, la coagulación se encuentra sometida a un importante número de mecanismos reguladores. Estos mecanismos inhibidores de la coagulación son, en buena parte, redundantes entre sí para impedir que el proceso de la coagulación, cuando se ha iniciado, se extienda de forma descontrolada por todo el sistema vascular. También está relacionado el paso sucesivo de la fibrinolisis para deshacer el coágulo excedente. Por último, en este capítulo se revisan las principales pruebas de laboratorio que permiten evaluar el adecuado funcionamiento de estos mecanismos de la coagulación.

FISIOLOGÍA DE LA HEMOSTASIA La hemostasia fisiológica consta de varias fases que suelen considerarse sucesivas: vasoconstricción, formación de agregados plaquetarios, formación y estabilización de la fibrina, inhibición de la formación de trombina y fibrinolisis. 1 © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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VASOCONSTRICCIÓN La vasoconstricción es una respuesta vascular refleja que se produce en la zona lesionada. Esta vasoconstricción disminuye la pérdida de sangre y favorece la coagulación. En la regulación de este proceso intervienen múltiples mediadores endoteliales, como las prostaglandinas, en especial la prostaglandina I2 o prostaciclina (de acción vasodilatadora), el óxido nítrico (vasodilatador con efecto sinérgico con la anterior), la endotelina (vasoconstrictora) y la enzima conversora de la angiotensina, que transforma la angiotensina I en angiotensina II (un potente vasoconstrictor).

FORMACIÓN DE AGREGADOS PLAQUETARIOS Las plaquetas forman el trombo plaquetario sobre la lesión vascular. Este cúmulo de plaquetas es el sustrato preferente sobre el que se forma la fibrina. De forma esquemática, los pasos de la actividad plaquetaria en la formación de un trombo son, sucesivamente: a) contacto, b) adhesión plaquetaria y c) agregación plaquetaria. Para estas acciones las plaquetas emplean sus glucoproteínas (GP) de membrana; de ellas, las más importantes para esta función son la Ib-IX-V, la VI y la Ia-IIa. La principal en la fase de contacto es la GP Ib-IX-V, que se une al factor de von Willebrand del subendotelio. Por su parte, la GP Ia-IIa y la GP VI se unen directamente con el colágeno subendotelial. Tras unirse una de estas GP, preferentemente la Ib-IX-V, a un componente subendotelial, las plaquetas cambian de forma y se vuelven esféricas y emiten seudópodos, que ocupan la mayor superficie que les es posible. Este proceso se da por reorganización del citoesqueleto plaquetario, que es consecuencia de una rápida polimerización de la actina tras la activación. En la plaqueta en reposo hay un reservorio de monómeros de G-actina unidos a profilina y filamentos de F-actina. El flujo de calcio iónico intracelular se produce durante la adhesión plaquetaria1, causa la disociación de los complejos de actina-profilina, la polimerización de los fragmentos de F-actina y, a través de la proteína cinasa C, la fosforilación de la cadena ligera de miosina. Ello causa el desplazamiento de la miosina sobre la actina, con la consiguiente reorganización del citoesqueleto y el cambio de la forma de la plaqueta. Entonces, por un mecanismo de señalización intracelular, la GP IIb-IIIa cambia de conformación y adquiere la capacidad de interaccionar con sus ligandos en un proceso de transmisión bidireccional de señales entre ambas caras de la membrana (denominado inside-out y outside-in)2. En las plaquetas en reposo, la GP IIb-IIIa está presente en una conformación inactiva que la hace incapaz de unirse a sus ligandos, que son el fibrinógeno, que le permite formar puentes entre las plaquetas durante la agregación; el factor von Willebrand, que está unido al colá© Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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geno subendotelial; y también la trombospondina, la fibronectina y la vitronectina3. Después de iniciarse la activación plaquetaria, por acción de la proteína cinasa C, se produce la fosforilación de la porción intracitoplasmática de la GP IIb-IIIa, lo que causa un cambio conformacional extracitoplasmático, tras el cual la GP IIb-IIIa adquiere la capacidad de unirse a sus ligandos (es el proceso inside-out)4. Una vez que la GP IIb-IIIa se une a sus ligandos, se activa en el citoplasma plaquetario la fosforilación de proteínas al unirse su porción intracitoplasmática a la talina y a la vinculina (es el llamado mecanismo outside-in)2,4. Posteriormente se producen los agregados de plaquetas, para lo que la GP IIb-IIIa se une al fibrinógeno formando puentes interplaquetarios en presencia de calcio. También contribuyen el factor de von Willebrand y otros ligandos de la GP IIb-IIIa. De este modo se produce la deposición de capas sucesivas de plaquetas formando agregados sobre los que se forma la malla de fibrina de la coagulación plasmática. Debido al aumento del calcio iónico citoplasmático procedente del sistema tubular denso se activa una vía metabólica, dependiente de la fosfolipasa A2, que libera ácido araquidónico de los fosfolípidos, el cual, a su vez, puede metabolizarse por dos vías enzimáticas. La primera, dependiente de la lipooxigenasa, lo transforma en ácido hidroxiecosatetranoico (12-HETE), que es un inhibidor de la adhesión plaquetaria, y la segunda, regulada por la ciclooxigenasa, lo transforma en tromboxano A2 (TXA2), que es un vasoconstrictor y agonista de la agregación plaquetaria. Asimismo, en esta fase, las plaquetas liberan el contenido de sus gránulos, en los que hay ADP, ATP, serotonina, proteínas adhesivas, calcio, factores de coagulación y factores de crecimiento, de modo que aumenta de forma sinérgica el proceso de activación plaquetaria. Finalmente, las plaquetas contribuyen a sustentar la coagulación plasmática al exponer fosfolípidos aniónicos requeridos por los complejos enzimáticos de la coagulación.

FORMACIÓN Y ESTABILIZACIÓN DE LA FIBRINA La coagulación plasmática causa la formación del coágulo de fibrina al transformar el fibrinógeno (una proteína plasmática soluble) en fibrina (que es insoluble) por acción de la trombina. La trombina, que es la enzima clave de la coagulación, se forma a partir de la protrombina por activación de la coagulación y, a la vez que forma fibrina, también promueve la estabilización de la fibrina y numerosos pasos más de la hemostasia. Es importante señalar que la coagulación plasmática requiere un control fisiológico estricto para limitar el coágulo a la zona de la lesión y evitar su extensión excesiva, por lo que se han desarrollado sistemas de inhibidores naturales, que en ocasiones son redundantes entre sí. La trombina se genera in vivo por la activación de modo secuencial de un conjunto © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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de proteínas plasmáticas llamadas factores de la coagulación, que son proenzimas. Sin embargo, algunos procoagulantes, como los factores V y VIII, actúan como cofactores sin poseer actividad enzimática propia. La coagulación se organiza en una serie de reacciones en cadena en las que una proenzima inactiva, un factor de la coagulación, se convierte en su enzima activa, la forma activada del factor, que a su vez activa a otra proenzima en un mecanismo en cascada. Tradicionalmente, las secuencias de activación se denominan vías de la coagulación, que constan de una vía intrínseca y otra extrínseca. Ambas vías confluyen en la activación del factor X y se continúan en una vía común (fig. 1). Sin embargo, actualmente se sabe que este esquema tradicional no refleja adecuadamente lo que sucede in vivo, donde los elementos de origen celular desempeñan un papel muy importante. Además de las plaquetas, el endotelio y los leucocitos, recientemente se ha podido demostrar que fragmentos celulares de alrededor de 0,1 µm de diámetro, conocidos como micropartículas, pueden tener un papel relevante en la hemos-

Coagulación plasmática. Modelo tradicional Vía intrínseca XII

Vía extrínseca

XIIa 2+

Ca XI

XIa

IXa VIII FL

IX

X Vía común Fibrinógeno

Ca2+ Factor tisular VII

Ca2+ Xa V FL

II IIa Fibrina

Figura 1. Modelo tradicional de la coagulación plasmática. La formación de fibrina se produce por activación de la protrombina a trombina tras una activación en cascada sucesiva de los factores de la coagulación agrupados en una vía extrínseca, una vía intrínseca y una vía común. II, V, VII, VIII, IX y X: factores II, V, VII, VIII, IX y X de la coagulación; IIa, Va, VIIa, VIIIa, IXa y Xa: factores II, V, VII, VIII, IX y X activados. © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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tasia fisiológica y patológica. Estas micropartículas son fragmentos celulares que proceden de los elementos sanguíneos y de las células endoteliales, y las más relevantes para la hemostasia son las procedentes de las plaquetas, monocitos y células endoteliales5. Las micropartículas circulantes pueden tener un papel procoagulante porque pueden ser las portadoras de la mayoría del factor tisular requerido para el inicio de la coagulación plasmática, en vez de emplearse el expuesto en el subendotelio5,6. Las micropartículas con factor tisular se localizan en la zona de la lesión porque pueden expresar el ligando de tipo 1 de la P-selectina glucoproteína (PSGL-1), que es el receptor para la P-selectina y como las plaquetas activadas expresan P-selectina, procedente de sus gránulos alfa, las micropartículas se adhieren a las plaquetas del agregado y localizan allí el factor tisular7. La coagulación se activa en un proceso de fases sucesivas (fig. 2) con una primera fase de iniciación y otra posterior de amplificación8,9. En la fase de iniciación se impli-

Coagulación plasmática. Modelo plasmático y celular X FT

VIIa

II Xa

VIII/vWF V

Va

IIa

Monocito IX

VIIa IXa

VIIIa

Va

FT X

IXa VIIIa

Plaqueta

II Xa Va

IIa

Plaqueta activada

Figura 2. Modelo plasmático y celular y de la coagulación. Fase 1: aparición de factor tisular en la superficie de monocitos, el cual activa el factor VII, lo que lleva a la formación de una pequeña cantidad de trombina. Fase 2: esta trombina activa las plaquetas circundantes y los factores V y VIII, que se pueden difundir por el plasma contiguo. Fase 3: el factor IX se activa por el factor VII activado y el factor tisular, y se une a la superficie fosfolipídica de las plaquetas activadas, donde genera entonces grandes cantidades de trombina. FT: factor tisular; II, V, VII, VIII, IX y X: factores II, V, VII, VIII, IX y X de la coagulación; vWF: factor von Willebrand; IIa, Va, VIIa, VIIIa, IXa y Xa: factores II, V, VII, VIII, IX y X activados. © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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can los elementos celulares capaces de expresar factor tisular (monocitos, micropartículas circulantes) y los factores VII, X, V y II. La fase de iniciación empieza con la aparición de factor tisular en la superficie de monocitos o de micropartículas circulantes5, el cual activa el factor VII, que forma una pequeña cantidad de trombina que activa las plaquetas circundantes, las cuales entonces exponen sus fosfolípidos aniónicos, y los factores V y VIII. Esta pequeña cantidad de trombina formada en la fase inicial comienza la activación de modo «explosivo» de la coagulación (fase de amplificación) mediante la activación de las plaquetas que se convierten en el soporte necesario para la acción de los factores activados IX, VIII, X y V llevando a la formación de gran cantidad de trombina y a la consiguiente formación del coágulo de fibrina. En la fase de amplificación el factor IX, tras su activación por el factor VII activado y el factor tisular, se une a la superficie fosfolipídica de las plaquetas activadas provocando la activación de grandes cantidades de factor X y la producción masiva de trombina. La trombina, por su parte, también activa al factor XI en la superficie de las plaquetas, el cual realizará una retroalimentación positiva para la generación de trombina. Además, la formación de trombina es diferente en el plasma que en el interior del coágulo en formación, donde se acumulan los elementos celulares y se incrementa la concentración de factores procoagulantes, entre ellos la trombina recién formada. Así, se llega finalmente a la transformación del fibrinógeno en fibrina mediante la acción de la trombina que liberan los fibrinopéptidos A y B de las cadenas α y β del fibrinógeno, de modo que la molécula restante constituye el monómero de fibrina. Este monómero, por atracciones electrostáticas, genera polímeros de fibrina que son poco estables. El factor XIII, que es activado por la trombina, forma entonces enlaces covalentes en los polímeros y de este modo constituye la fibrina estable.

INHIBICIÓN DE LA FORMACIÓN DE TROMBINA Tras la activación de la coagulación plasmática, para regular su extensión, se activan los inhibidores fisiológicos de la formación de trombina. El sistema está modulado fundamentalmente a tres niveles: a) la antitrombina, que es el inhibidor más relevante de la trombina, y otros inhibidores de serinproteasas; b) inhibidor del factor tisular, principal regulador de la generación de factor X activado, y c) la proteína C activada, fundamental para la eliminación de los dos cofactores activados, los factores V y VIII10. La antitrombina es un inhibidor de serinproteasas que actúa sobre la trombina y el factor X activado, aunque también inhibe otros factores activados, como los IX, XI y XII, uniéndose a ellos formando complejos inactivos que se eliminan por el sistema mononuclear fagocítico. Su acción anticoagulante se potencia por las heparinas. También son inhibi© Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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dores de serinproteasas la α2-macroglobulina, la β1-antitripsina, el C1-inhibidor, el cofactor II de la heparina y la antiplasmina (aunque esta fundamentalmente actúa como inhibidora en la regulación de la fibrinolisis). El inhibidor de la vía del factor tisular, más conocido como TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor), es una proteína endotelial capaz de inhibir el factor VIIa tras formar un complejo cuaternario junto con factor X activado, factor VII activado y factor tisular. El sistema proteína C-proteína S actúa también en la regulación de la generación de trombina inhibiendo los factores activados V y VIII. Este sistema regulador consta de la proteína C y de la proteína S, que circulan en el plasma, y de la trombomodulina y del receptor endotelial de la proteína C, que están localizados en la pared vascular. La proteína C es una serinproteasa, y la proteína S actúa como su cofactor. La proteína C se activa tras la unión de la trombina con la trombomodulina en un complejo en el que participa el receptor endotelial de la proteína C.

FIBRINOLISIS La fibrinolisis destruye la fibrina que se ha formado durante la coagulación mediante la acción de la plasmina, una serinproteasa que se forma a partir del plasminógeno, su precursor inactivo. La plasmina, además de la fibrina, también digiere el fibrinógeno y los factores VIII y V. Como sucede en la coagulación plasmática, existen activadores e inhibidores de la fibrinolisis. El plasminógeno puede transformarse en plasmina a través de una vía iniciada por el factor XII que actúa por la urocinasa, que procede de la activación de la prourocinasa, o por otra vía iniciada por el activador tisular del plasminógeno (t-PA), que es liberado por las células endoteliales. Al igual que sucede en la generación de trombina, hay inhibidores fisiológicos de la fibrinolisis. Entre ellos, los inhibidores del t-PA, de tipo 1 (PAI-1) o de tipo 2 (PAI-2), que actúan formando complejos inactivos con el t-PA. El inhibidor de la fibrinolisis activable por la trombina (TAFI), por su parte, inhibe la activación del plasminógeno mediada por la fibrina. Finalmente, también hay inhibidores directos de la plasmina, como son la antiplasmina, de acción rápida, y la α2-macroglobulina, de efecto más lento.

EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA La realización de una historia clínica detallada es esencial para el diagnóstico de las alteraciones de la hemostasia. Es importante recoger la historia familiar, el tipo de síntomas y signos, la forma de inicio y si ha existido administración de fármacos, en especial © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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aquellos de acción anticoagulante o antiagregante o los tratamientos hormonales. De igual importancia es la cuidadosa exploración física. Los estudios de laboratorio de la hemostasia deben iniciarse con pruebas generales y, en función de sus resultados, se indicarán pruebas específicas. Las principales pruebas generales son: • Recuento de plaquetas. Se realiza en autoanalizadores hematológicos. Ocasionalmente los recuentos bajos pueden no ser reales, como sucede en la seudotrombocitopenia por ácido etilen-diamino-tetraacético (EDTA), en la que las plaquetas se aglutinan entre sí o con los leucocitos, o en las enfermedades que cursan con plaquetas muy grandes. Por ello, las trombocitopenias deben confirmarse con la observación directa al microscopio óptico. • Pruebas de agregación plaquetaria. Para evaluar la función plaquetaria se suele emplear un método basado en las variaciones de la densidad óptica de un plasma rico en plaquetas al añadirle inductores de la agregación, como por ejemplo ADP, colágeno, trombina, ácido araquidónico o epinefrina. Al mismo tiempo que se determina la densidad óptica, se puede estudiar la liberación de sustancias intraplaquetarias, como serotonina, β-tromboglobulina o TXA2. Recientemente se han introducido sistemas automatizados, como el PFA-100, que mide la función plaquetaria en sangre total citratada al hacerla pasar por una abertura practicada en una membrana a la que las plaquetas se adhieren y ocluyen. Se evalúa el tiempo de oclusión utilizando distintos agonistas. • Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa). Mide el tiempo que tarda en coagular un plasma obtenido en citrato al añadirle calcio iónico y fosfolípidos. Determina la actividad global de los factores de las vías intrínseca y común (fig. 3), y es sensible para detectar el efecto de la heparina no fraccionada. • Tiempo de protrombina. Mide el tiempo que tarda en coagular el plasma obtenido en citrato en presencia de un exceso de factor tisular y calcio. El tiempo de protrombina determina la funcionalidad de los factores de las vías extrínseca y común (fig. 3). Esta es la prueba que, expresada como razón internacional normalizada (INR, por sus siglas en inglés), se usa en el control del tratamiento anticoagulante con cumarínicos. • Tiempo de trombina. Mide el tiempo requerido para que se coagule un plasma obtenido en citrato tras añadirle trombina. Se altera en los déficits cuantitativos o cualitativos de fibrinógeno, en la hiperfibrinolisis y en presencia de heparina. • Tiempo de Reptilase®. Es similar al tiempo de trombina, pero empleando un veneno de serpiente que fragmenta directamente el fibrinógeno de un modo que no se ve influido por la presencia de heparina. © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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Coagulación plasmática. Pruebas generales Factores de contacto Tromboplastina

IX VIII Tiempo parcial de tromboplastina activado (25-30 s)

VII X

Tiempo de protrombina (12-14 s)

V II I

Tiempo de trombina (18-20 s)

Figura 3. Factores y vías evaluados por las principales pruebas globales de la hemostasia: vía intrínseca y vía común para el tiempo parcial de tromboplastina activado y formación de fibrina para tiempo de trombina; entre paréntesis el tiempo habitual de la prueba expresado en segundos.

• Cuantificación de fibrinógeno. Se mide por diferentes métodos de los que los principales actualmente son el coagulométrico, empleando trombina, y el fibrinógeno derivado, que se deduce de las características del coágulo formado durante la realización del tiempo de protrombina. • Valoración de los activadores y de los inhibidores de la coagulación. Los factores de la coagulación y sus inhibidores pueden medirse de forma individualizada por métodos coagulométricos, cromogénicos o de inmunoanálisis. Asimismo, mediante un procedimiento de electroforesis se puede evaluar la estructura multimérica del factor von Willebrand. También pueden emplearse estudios de biología molecular para detectar la presencia de mutaciones o polimorfismos genéticos. • Estudio de la fibrinolisis. La fibrinolisis puede cuantificarse globalmente por la medición de los productos de degradación del fibrinógeno (PDF) o del dímero D, neoantígeno originado por la acción de la plasmina sobre fibrina estabilizada por el factor © Editorial Glosa, S.L. Autorizado el uso en el ámbito académico o docente según lo previsto por la Ley de Propiedad Intelectual.

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XIII. Los PDF se emplean para evaluar hiperfibrinolisis y los dímeros D son útiles como parámetro con alto valor predictivo negativo en la enfermedad tromboembólica. Además, existen pruebas específicas para la medición de los componentes de la fibrinolisis o de sus inhibidores, que se realizan en segunda instancia para tratar de llegar a un diagnóstico. La actividad funcional de los componentes de la fibrinolisis se determina normalmente por medio de sustratos cromogénicos y su contenido antigénico por técnicas de inmunoanálisis.

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