UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

OPTIMIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO TPYG PAR4 LA PRODUCCION DE BIOMASA ACTIVA DE Bifidobacteriurn infantis

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E PARA

QUE

DOCTOR

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ALEJANDRO

MEXICO.

D.F.

OBTENER

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GRADO

DE:

BIOLOGICAS

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A L B E R T O ~ Z A O L A ESPINOSA

2000

idcl designado ]mr la División.de Ciencias Biológicas y de la Salud de la Unidad

niiico aprobó la

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tesis que presentó

ALEJANDRO ALBERTO AZAOLA ESPINOSA

~

g de mano de 2000.

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e Tutonal:

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DRA.SUSANA SAVAL BOHORQUEZ

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.: D R GERARD0 SAUCEDO CASTAÑEDA

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D R SERGIO HUERTA OCHOA

1: DR.GUSTA.VOGUTIERREZ LÓPEZ

1: DR.FRANCISCO R U E E R A N

AGRADECIMIENTOS

A la Dra.Susana Saval, por su guía y sobre todo, su amistad

Ai Dr.Gerard0 saucedo y Dr. Sergio Huerta,por sus enseÍíanzas Al Dr.Gustavo Gderrez y Dr.Francisco Ruiz, por sus desinteresados comentarios A la M. en C. Alma Rosa Cortés, por sus comentarios A Alma Rosa, MigueI y Norbert0 A mis compañeros de laboratorio, Paty, Rina, Teresita, Lino, Esteban y Pato A mi padre y Chelin A mi tía María A mis hermanos, Patricio, Juana,Laura, Victor, Sergio, Lorena, Manuel...

A mis hijos, David y Rochgo, por su amor y por haber nacido

A Carmen por ser y estar

Resumen Abstract ina0ducciÓn productos f-tados wtobacilos y bifidobacterias como probióticos Efstos de las bifidobacterias en la salud Consideracionestecnológicas deseables para las bifidobacterias M&xdismo de las bifidobacterias Requisitos nutrkionales y de cultivo r%&ucciÓrl hietodologia de Superficie de Respuesta ~ d estadístico o ortogonai central con puntos estrella (a) Aplicaciones biotecnológicas Justificación ObJhVO

Objetivos PaxíIcUkires Metodolo@a Microorganismo Medio de cultivo Conservación de la cepa Elaborxion de la curva estándar de peso seco 1's. absorbancia Fermentación Adaptación de la cepa Cultivo Métodos iinaiíticos Células viables o activas DiseiIos experimentales Resultados Producción de células Efecto de los componentes del medio TPYG Ausencia de un ingrediente Ausencia de sales minerales Ausencia de aminoácidos Andisis factorial de los ingredientes que aportan nitrógeno Diseño ortogond centrai con puntos estrella Medio M-l Medio M-2 Medio M-3 Medio qtimizado Medio Optunizado con amortiguador Discusión Conclusiones Bibliografia Anexos

1 3 6 7 8 12 15 16 17 23

25

29 31 33

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,;troiritestirial d i los humaiios es habitado por una comple-ia coleccion de inos. conocida mnio rriici oflora nonnal. Las especies predominantes son lbligaldos !,' tmtirir: ellos destaca el genero de las bifidobactenas o microtlora I?

género coloni;i:a el cokiln poco desputs del nacimiento !' esta presente en gran

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amamantados. pet'o los cambios en la alinientacion disrninu!en

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prediction of the composition of the growth media with speed and confidence.

The objective of this work is the optimization of a culture media for the production o bifidobacterium bioactive mass. The literature reports that most commons cultures media! have a complex composition, but the components effects as well as his interactions for thc biomass obtention are unknowned

A factorial design of the three nitrogenated components; casein peptone, soja peptone and

yeast extract has been perfomed. The results show that at first the presence o f all the ingredients was necesap.

i n order to observe the effect o f all the ingredients, a central orthogonal design was performed.

The result did not allo\\ the optimization of the culture medium, therefore three culture media with a variation of their ingredients were outlined. These culture media were named M-1, M-

2 and M-3 The highest biomass production was 4 gl In the M-3 medium and this also was observed in the subsequent runs to the factorial design maximum values.

A new orthogonal design was performed form the pre\IOUS results The concentrations were

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La fermentación es uno de los métodos más antiguos y utilizados para la conservación de alimeqtos. Prácticamente, todas las naciones tienen y conservan algun tipo de alimento tradilc imai fermentado principalmente por la acción de bacterias lácticas puras o en consorcios 3 ~ con or ~ $microorganismos.

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Los íilimentos fermentados terapéuticos o probióticos, son productos que utilizan un tipo

genéticmente, los cuales son insuficientes para cubrir la demanda de la industria de alimeriios, consumidores humanos y productores de ganado (Fuller, 1989; Ishibashi y Shimat-iiura, 1993).

El hor**lbreprimitivo no tenía el concepto de los mecanismos que envuelven a la fermentación y del papel de los lactobacilos. Fue hasta hace 300 años que Leeuwenhoek describió los

microh os y solo 116 años que Pasteur desarrolló el concepto de deterioro de los alimentos y fermerirscion. Al mismo tiempo, Koch demostró que los microbios pueden causar enfern-\mdadesespecíficas. Así, mucho de lo que ahora se conwe sobre los microorganismos y las f mentaciones, ha sido comprendido en los últimos 100 años ( I-http). $ -

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de sus mecanisr-ios de control de crecimiento y de sus vías metabólicas, pueden jugar un papel

importante en I 1 preservación de alimentos fermentados con BAL. Estas bacterias convierten los azucares en ácidos orgánicos como el lictico y acético, que provocan la disminución del

pH. producen wóxido de hidrógeno

>

metabolitos secundartios como las biocinas, que

ayudan a prever ir la posible contaminación por bacterias patógenas o enterotoxigénicas.

Los probióticos generalmente se refieren a microorganismos viables, cultivados en productos

lácteos o supler lentos alimenticios con BAL: y de pocos años a la fecha, de bifidobacterias. Los probióticos tienen un efecto benéfico en el huésped por mejorar la integridad de la flora I

I

intestinal normi I. Estos productos probióticos incluyen alimentos congelados, tabletas o cápsulas y recie qtemente, diferentes productos lácteos fermentados. Aunque la primer leche fermentada con iifidobacterias fue introducida al mercado hace más de 50 años, es a partir de la década de IC$ 70’s que se encuentran en el mercado más de 70 productos en varias presentaciones y aproximadamente la mitad de ellos son manufacturados en Japón (Tamime y col., 1995).

Lactobacilos y H ifidobacterias como probióticos

Ilya Metschnikoi 7 en 1908 (I-http) fue el primero que propuso el consumo de lactobacilos para evitar y

COI

trarrestar intoxicaciones internas (autointoxicación) causadas por un tipo

maligno de comp mentes en la flora intestinal y para prevenir distintos tipos de enfermedades. Ho! en día. se er cuentra en la bibliogafia una gran cantidad de investigaciones y protocolos 8

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alimeacdos COII leches de fórmula (Heinig y Dewey, 1996), esta diferencia relacioaada con la presencia de bifidobacterias.

para que las biñdobacterias puedan ejercer su efecto probiótico, primero acidez d$ tract0 gastrointestinal. Estudios en adultos (Bouhnik y col., 1996; HOW y col, 1994) y en niños (Langhendries y col., 1995; Hudault y col., 1994) confirman que dgunrs

cepas & bifidobarcterias son capaces de sobrevivir el paso por el tract0 gastrointestid psrs SU

sobrevivencia, se recomienda una ingesta tal que produzca un n i i m « o d~

bifidobsáerias en heces de lo6 a lo7 células viables por gramo de materia fecal. (Sanders 3

col., 19%) Para lograrlo, los productos comerciales deben tener altas concentracionts dt células viables.

Algunos productos comerciales son combinaciones de bifidobacterias con otras bacterias

Iácticas (BAL),principalmente con Lactobacillus acidophilus,pero la acidez producida por los Iacthcilos durante la fermentación, promueve una baja sobrevivencia de las pnmeras. lo que no permite tener una concentración recomendada para consumo humano de IO' a IO" células de bifidokterias por gramo de producto final (Blanchette y col., 1996). Las futuras formulacknes de probióticos deberán contener concentraciones altas de células, para que el consUmidor pueda mantener una dosis de lo9 a 10'' células por día y muestre efectos benéficus(Sanders y col., 1996).

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fnicto-oligosacáridos (FOS) (Muramatsu y coi., 1993; Dubey y Mistry, 1996) las bifidobacterias pueden crecer a partir de fuentes de carbono distintas a las que prefieren otras bacterias.

Las bitidobacterias presentan caractensticas tecnológicas complicadas para su producción a gran escala, ya que su crecimiento se presenta en ausencia de oxígeno y sus tiempos de generación son mayores que otros cultivos lácticos, además, sus requerimientos nutricionales son complejos y la baja tolerancia y sobrevivencia bajo condiciones de acidez, hace difícil su manejo y encarece su producción. (Corre y col., 1992)

Efectos de las bifidobacterias en la salud

Estudios recientes suguieren que las bifidobacterias pueden ayudar a mantener las funciones normales del tract0 intestinal. A este nivel, pueden actuar directamente por su actividad antibacteriami o indirectamente como activadores inmunológicos o al modificar la función de la microflora normal.

Bezkorovainy ( 1989) reporta que estudios

in

vitro han demostrado la capacidad de las

bifidobacterias para sintetizar vitamina Biz. piridoxina y ácido fólico. También, las bifidobacterias estimulan la respuesta inmune en el huésped, aumentando la producción de interferon (TNF-a)e interieucinas IL-6e IL-10.esto resultó en estudios con cepas vivas de H.

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iición de cepas enterotoxigénicas y enteropatógenas.

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iitrstinal (Thebaudin y col., 1997). Seki y col. (1978)

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I

carcinogénicas que producen cáncer de cólon (Kampmann y col., 1994) En estudios realizados en humanos existen evidencias de que el consumo de productos fermentados con bifidobacterias reduce los niveles de enzimas, como la glucoruniáasa, que está implicada en la conversión de compuestos precarcinógenos a carcinógenos (Bouhnik y col., 1996;Abdelali y col., 1995; Grill y col., 1995). Takiguchi y col. (1%) reportaron que metabolites derivados de la putrehión, como los indoles y el amonio se vieron reducidos por el consumo de

probiótiux con B. longum y S. thermophilus, así como aminas heterocíclicas (Orrhage y col., 1994). Sin embargo, Moore y Moore (1995)encontraron bifidobacterias asociadas a Cancer de cólon, pero los autores proponen la posibilidad

de un efecto benéfico a largo plazo de las

bifidobadenas en la prevalencia de esta enfermedad.

En estudios con ratas, Gailaher y col. (1996) demuestran que en tumores inducidos, la

administración de bifidobacterias provoca una disminución en la formación de lesiones preneoplásicas en cólon.

Saavedra y coi. (19!34), encontraron evidencias de que infantes alimentados con fórmula adicionada con B. brjidum y S. thermophilus, disminuye la incidencia de diarreas hospitalarias producidas por rotavirus, comparados con infantes alimentados con leche de fórmula. Existen numerosos estudios in vitro para demostrar el efecto antagónico de las bifidobacterias contra bacterias enteropatógenas como

E.coli (Fujiwara

y col., 1997; Gibson y Wang, 1994) que

proponen dos mecanismos de acción; la producción de ácidos orgánicos que disminuyen el pH y previenen la colonización de patógenos y la producción de sustancias antimicrobianas.

14

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Consideraciones tecnológicas deseables para Iris bifidobacterh

Existen una sene de factofes tecnológicos que deben ser tomados en cuenta en la producción de proáuctos lácteos fermentados con bifidobacterias. En particular, la pérdida de viabilidad

del producto en q u e 1 y la baja sobrevivencia en pH cercanos a 4.5 o en condiciones aerobias. Para asegurar su efecto probiótico, deben estar presentes en número adecuado (mínimo io6 cé~uiaspor mi) en ei momento de su

c011su1110,

pero actualmente no todos

10s

productos en el mercado cumplen con esta codción, por lo que es necesario el desarrollo de técnicas que valorem la presencia de Células vivas, especialmente ea productos con mezclas de bacterias. (Zhttp)

Las sustancias aníimicrobianas y los compuestos probióticos producidos por BAL, pueden ofiecer soluciones alternativas al desarrollo de aditivos para alimentos utilizadospsu31 control

de patógenos u otn, tipo de contaminantes peligrosos en alimentos. Cepas con capacidad de producir sustanck anfimicrobianas (biocinas), pueden ser

usadas como fuente de células

viables para ser incorporadas a la flora intestinal normal.

Estudios enfocados a explorar las bases genéticas de la sintesis de biocinas, abren nuevas oportunidades y posibilidades para incrementar la producción a escala industrial. Aunque las BAL

son

generalmente consideradas como seguras (GUS), estos compuestos

antimicrobianos necesitan ser evaluados para usarse como aditivos seguros.

3

hietabolhmo de las Bifidokcterias

Requisitos nutricionales y de cultivo. Las bifidobacterias Constituyen un grupo de

microorganismos con camcten‘sticas metabólicas muy particdares y requerimientos ambientales estrictos, que se deben considerar si se pretende aislarlas y manejarlas en el laboratorio para su estudio, producción y su uso como probióticos.

Se sabe que las cepas de lactobacilos cuyo producto final de la degraciaci6n de azúcares es el ácido láctico (homofermentadoras) degradan la gíucosa a través de la vía glucolítica; en cambio, las cepas heterofermentadores lo hacen a través de la nib de las hexosas monofosfato (DeVries y Stouhhamer, 1967a). Aunque en un principio se consideró a las bifidobgctenas en el género de los iactobacilos, su inclusión en este género no se justifica por el metabolismo de

carbohidnitosque presentan.

DeVries y coi. (1967b, 1968) y ScardoM (1981) detectaron ácido acético, ácido láctico, ácido fónnico y etanol como productos f i d e s del metabolismo de carbohidratos en bifidobacterias.

Ellos observaron que la producción de estos metabolites tiene lugar sin la liberación de COZ; lo cual indica que no es la ruta giucolítica donde se oxida la glucosa. De Vies y col. (1 967a) en un afán de ratificar sus observaciones, buscaron la enzima aldolasa (EC.4.1.2.7), enzima

tipica de la glucólisis, así como la actividad de la giucosa-ó-Pdeshidrogenasa (EC.1.1.1.49),

enzima característica de la ruta de las hexosas monofosfato. Los autores no detectaron estas actividades en ninguna de las cepas de bífidobacterias estudiadas. Pero también encontraron reportada una ruta alterna para la degradación de glucosa en Aceiobaciet xrlrnurn. Al realizar

-r ~iilvicción de 1,s

sidos orgknicos, sitúa a las bifidobacterias en COI

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condiciones reductoras del medio. En las Tablas 1 y 2 se muestra el

:

hamgemdad de grupos y en las Figuras 2 y 3 los gráficos de crecimiento.

En la Tabla 1 y la Figura 2 se observa como la ausencia de los sustratos afecta la

icieibn de

biomasa celular y la falta de glucosa tiene el efecto más importante en la disIYitnuc.tbn

% +-

crecimiento. Aunque las peptonas proporcionan azúcares al medio de cullitto,

concentrsción y tal vez la calidad de los azúcares es insuficiente para soportar un buen

I

Tabla 1. A d i s i s de grupos homogéneos por la ausencia de un ingrediente orgánico y de las d e s inorgánicas en el medio TPYG cada vez ingrediente ausente

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Figura 2. EFecto de h ausencia de un ingrediente del medio TPYG cada vez sohe d crecimiento de BIfidoboctenum i n $ ¿ . El crecimiento se muestra despub de 12 h de cultivo

La ausencia de los ingredientes que aportan prhcípalmente nitrógeno, como son peptonas de csscina y Qe soya así como extracto de levadura, también afectan la obtención de biomasa de

rmmerasignificativa. Estos microorganismos están muy bien adaptados a crecer en leche, por lo que posiblemente la ausencia de algunos componentes de la pepona de caseína afectan el

crecimiento, no así en el caso de la peqtona de soya y extracto de levadura. Petschow y Tabot

(1990; 1991) y Ventlig y Mistry (1993) reportaron que la leche completa es un pmotor óel

I

crecimiento en la producción de bifidoba~asy Venúig y Mistry (1993) cuando usaron leche

descmda con un

10% de sóiidos totaies y wncentrada (3x) aumentaron la producción de

biomasa de B. injüntis.

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I

í

I

I

I

C

l1:OydecreCreron los áci& s grasos de 16:1, 18:0, 18:l y 19:O. Cua

I

I litat0

1

a I )

I

1;

11s tres peptonas

i

I

I I

I

:I

~ : 6 .

;lmoli

"s!

que corn m e n el medio las aportan, no se encuentran aJgr

I

:rpenciade cisteína, Ekskoi ovainy y Miller-Catchpole (1988) reportaron

I

I

de nitrógeno orgánico n8s importante para B. brfidum, la cisteína es crecimiento. También, la falta del aminoácido afecta la condición

I

para lograr la anaerobios s, aurque bajo las condiciones del presente

I

I:tar porque el medio fue giseado con COZ.

l!ánicos en el medio TPY!?. Como puede verse, la ausencia de zinc no

(

i

tn

iiiaerales. En la Tabla 2 y :igura 3 se observa el efecto de la ausencia de

5 I

las células a 27rf

*l~xuadparir a el desavollo 4 iela bacteria

I

Í

f

aíumdos.Tambib cuando el autor &vó

I O,O,

de experimentos, la aui encía de todas las sales afectb t~~nbién el

;

:

y estearato), se incn mentaron los niveles de 16:O y

~ahonosyseincremeníannlosdecadenacarta.

I

I

I

C ~ ~ W( 3S ~

Tween 80 (monooléiccil: , aumentanw drásticw

2

I

fdm carece de la capacic ad de sintetizar hick

Izar ácidos grasos exógeras. Así, CuILllCio el aubr adici

iI

1

de Tween, el crecimi :nto también se vio

I

I

, pero la falta de cualquier ~trasal lo afecta significativamente.

43

-.

En el segundo bloque experimental, se estudió la ausencia del extracto de levaciura 1 juntas. Como se puede observar, su ausencia afecta el crecimiento

~

~

t

cisteina

coritrol c l con

el medio completo, &teniéndose una biomasa total a las 12 harm r j g n j f i c a t i ~ ~ t n tmas e pequeña. La li~eraturaindica que este género de bacterias necesim ~ cisteína. Las pq~onaspresentes en el medio aportan este amin&&,

~ m t i i i a d fe s de

pen, su ,WDcr=rmacion e] 10% (1 ahla 17 )

0.5%) y en el extracto de levadura la WnCentraci0,n

es pequefíao-(

de SU composición total de aminuácidos, por 10 que es necesario la m m i a &I aminoacido o

de la levadura en el medio de cultivo para la producción de biomasa

~3. injam1,-.

Tabla 2.Anáiisis de grupos homogéneos la ausencia de un &C?dimc inoqániw en el medio TPYG cada vez

KaQ4

c.c12.7H20 E. ievaduni y Cisteina

Mec12.7Hzo

Fe13

znS04.7H20

control T*eY m.05

3 3

3

3 3 3 3

1.97 2.11

2.27 2.35 2.48

2.81 2.83

X

X 3[

X

---

x

X

X

i

~

3

1: m

O

L,.o thewacicmes al microscaph mostraron que la falta de alguno de lm tres compuestos

w oil uuux nitrogcmdos no afecta la morfoogia microscbplca Se observaron células

__

tejante:* a la del medio contrd, siendo células Gram positivas,de b9ieei tamaño y a k p d a s ,

SI t

bll JfEBdas o en forma de baciios curvos en su mayor a I %tiacm la falta de cisteiaa y de d e s .

ri i~rfologíaGram variable, dc& I L

j

COII

1

La falta de @UGOIU produce en B. znfuntis una

uu importante porcentaje de &das Gram negativas (30%),

pequeñas y la falta de Tweea 80, muestra células muy pequeilas y delgadas, aunque

l;i uniayoriia scm Gram positks

br

me.El mismo comportamiento se

Ea m s dos úitimos casos,

no se observaron células

1rcada4~ sino todets en forma de bacilos rectos.

E I la Figura 4 se muestran las tasas de crecimiento en las primeras seis horas de cultivo para c a la medi o estudiado. Se observa que la tasa áe crecimiento disminuye entre el medio control 1

J

i

)s meduos con la ausencia de u11 ingrediente cada vez y es una manera de ver la calidad del

medio de cultivo, por lo que los resultados parecen indicar que las condiciones químicas para u11 bucn crecimiento no han sido establecidas.

-

05 0.4

8

1

I

*

0.1

I-

0.0

Figura 4. Tasas de crecimiento de BificibarrclenMI qtimtis en medio TPYG con ausencia de un ingrediente. El valor de p es entre ias O y 6 h de aiitivo. Modelo: &I = & Bx

Ailscieir de aminoácidos. Como se observa en la Figura 2 y en la Tabla 1, donde la ausencia

de uno de los tres ingredientes que aportan nitrógeno orgánico afectan la obtención de biomasa de B. mfiiis, y para analizar con mayor precisión, si es la carencia o la baja concentración de un aminoácido en particular, se realizó un estudio para analizar el efecto de la ausencia de un uninohcido.

Los medios utilizados fueron: medio mínimo con los 20 aminoácidos como

fiiiente de nitrógeno; medio mínimo con cloruro de amonio como fuente de nitrógeno y medio mínimo con ausencia de un aminoácido a la vez Los medios de cultivo para este estudio se

elabonuon de acuerdo al medio propuesto por Nuraida y col.( 1992). Cada frasco con el medio

de cultivo fue sometido a un flujo de C02 como se describe en material y métodos. Los resultados mostraron que este microorganismo crece en medios simples con todos los amhohcidos pero también puede crecer en un medio con amonio como fuente de nitrógeno,

pero adicionado de cisteína.

La Figuro 5 intenta mostrar de forma resumida los resultados de este experimento. Como se PIE&

observar en la Figura, el gráfico que representa la ausencia de un aminoácido a la vez es

un agmgado general de la ausencia de cada aminoácido y la desviación esiándar muestra los

1

límites eatre los cmimientos obtenidos. Estos valores se compsran con los cultivos control en medio mínimo con la presencia y la ausencia de los 20 aminoácidos. El análisis estadístico

muestra que no existe diferencia significativa (P

=

0.05) entre el medio control con los 20

amino8cidos, el medio control con cloruro de amonio como fuente de nitrógeno y el agregado a-

de la m i a de un aminoácido a la vez, pero si existen diferencias significa6$s (P < 0.05) -Li

entre el Control con todos los aminoácidos y el control con amonio como fuente de nitrógeno.

Estos resuItaBos no permiten concluir si en los ingredientes utilizaáos en este estudio, es la ausencia o la baja concentración de un aminOaCid0 lo que &wta el crecimiento de B. inj¿untis.

47

7

1.2 I

1'

I I

O

3

6

9

12

24

Tiempo (h)

Figura 5. Efectode la presencia y ausencia de aminoácidos en medio minimo para la obtencib de biomasa de B. ttfmtis Barras diagonales; medio mínimo con donir0 de amonio como fuente de nitrbgeno. Barras vacias, auscllcia de un aminoácido a la vez Barras con puntos puntos; presencia de los 20 aminoácidos

Los estudios anteriores d o permiten analizar el efecto de la ausencia de un componente, pero no permite analizar si existen interacciones entre los componentes que probablemente ejercen

un efecto acumuiativo o sinérgico en la variable de respuesta. El análisis factorial y de superficie de respuesta probablemente permitirá examinar estos efectos.

Análisis factorial de los ingredientes que aportan nitrógeno orgánico.

Para evaluar el efecto y las interacciones de íos tres ingredientes complejos en el medio de I

cultivo, se realizó un di&

factorial 23con los ingredientes peptona de caseina (xi), peptona

de soya (12) y extracto de levadura (13). cada ingrediente fue evaluado a un nivel alto (+l) y I

bajo (-1) respecto a u11 punto central (O), las fermentaciones se hicieron por iriplicado y crecimiento des@

ei

de 12 horn de cultivo se presenta en la Tabla 3.

-

+ + +

+ O

-

+ + + + O

0.48 2.07

2.32 2.54 1.19

1.72 1.26

2.74 1.83

Q*,

.-

peso seco ahilar después de 12 h de cuhivo

El ANOVA del &e&

firctorial indica.que los efectos significativos corresponden a los

ingredientes XI (P = 0.016), x2 (P = 0.018) y para la interacción ~ 1 x 2(P ~3 = 0.027), con un valor de R2 de 0.99. La respuesta para el crecimiento en este experimento esta dado por la ecuación p = -2.94 + x1 (0.34)+ x2 (0.801) + x3 (1.085) + xIx2x3 (0.018). El coeficiente de regresión de la variaMe x3 se toma en cuenta en la ecuación del crecimiento ya que es un modelo jerárquico. Esto quiere decir que de los tres factores en estudio, Peptona de caseina y Peptona de soya tienen una influencia importante en el crecimiento, y el valor de la interacción

.Y~x~ indica x~,

que la presencia de 10s tres componentes es necesaia aunque la variable x3sola

no interviene de manera significativa.

Los resultados anteriores indican la importancia de 10s

tres ingredientes para favorecer la producción de la biomasa.

Diseño Ortogonal Central con Puntos Estrella. Los resultados anteriores indican la necesidad en principio de estudiar y optimizar las

concentraciones de los ingredientes que aportan nitrógeno y carbono. Para esto, cada ingrediente se estudió a dos niveles; 50% menor y mayor con respecto al medio control (punto central, PC)y las distancias de los puntos estrella (a) 1.414 arriba y abajo del punto central

para cada ingrediente. Los ingredientes del medio de cultivo fueron identificados de la , de levadura siguiente forma;peptona de caseina como XI, peptona de soya como ~ 2 extracto

como x 3 y glucosa como x4.

El estudio se &vidi& en dos bloques. En el primero se realizó el diseño factorial completo y en

el segundo los experimentos para los puntos estrella; para ambos casos, siempre se comeron controles (puntos centrales). En las Tablas 4 y 5 se muestran el diseño experimental ortogonai central con puntos estrella y los códigos, concentraciones y distancias de los ingredientes en estudio. Todos estos experimentos se realizaron por triplicado para evaluar la reproducibilidad y confiabiliáad del trabajo experimental así como la variabilidad intrínseca del sistema.

I

T a b l a 4 . D i s e ñ o o r t o g o n a l central con puntos e s t r e l a

P.C.

O b s e r v a c i o n e s 2' -

j

arp I

2

Xi -I Xr -1 X, -1 .&-1

4 -1 -1 -I -1 1 1 - 1

3

4

6

5

-1 -I -I 1 1 -1 1 - 1

7

-1 -1 1 I -1 1 1 - 1

8

9

-1 1 1 -I 1 -1 1 - 1

10 I1

12 13

1 I -I -1 -I 1 1 - 1

1 -1

14 15 16 17820

1 1 1 1 I I 1 -1 -1 I 1 - 1 1 - 1

1 I 1 1

O O

Puntos estrella 21

22

1.41 -1.41 O

O

O

o

O

O O O

U

25

24

O

1.41 O O

O -1.41 O O

(a)

26

O O

O O 1.41 -1.41 O O

27

28

O

O O

O

O

1.41

O

-141

Tabla 5. Códi8oq conctntraciones y distancia del diseño experimeatai código

XI

x2

W).

(sn) 1.48

O

+

2.95 5 10

+a

Distancia

-a

14

1

W)

1s 17.05

2.5 5 7.5 8.53

O. 74 1.25 2.5 3.75 4.26

8.53

5

2.5

1.25

2.5

1.48

2.5 5 7.5

a= 1.414 8

La Tabla 5 muestra que la concentración en el punto central peua el m o r x1 fue de 10 gl-I y los niveles (-1) y (+l) fueron 5 gl-' y 15 g1-', respectivamente, para el &tor

x2 la

concentmción en el pmto dfue de 5 gl" y para los niveles (-1) y (+1)2.5 gl-I y 7.5 @ l . Para el factor x3, la concentración en el punto central fue de 2.5 gl-' y para los niveles (-1) y (+I) 1.25 y 3.75 gl-', respecttvamente. El factor x4, con una concentración en el punto central

de 5 gl-' y para los niveles (-1) y (+l) de 2.5 y 7.5 gl-', respectivamente.

51

T.

p0stexioment.e se reaiizó un diseño experimental ortogonal central con puntos estrella con el medio de cnltivo compIet0 y la Tabia 6 muestra los códigos y los resultados en la

concentnici6n de otlulas después de 12h de cultivo.

T.M. 6. Diserío experimental y biomasa obtenida para cada combinación del medio TPYG

1

2 3 4

5 6 7 8 9 10 I1 12 13 14 15 16 17 18 19

20 21 22 23 24 25 26

? = .925

-

-

-

-

-

-

+

+ +

+ + + +

-

+

+ + +

-

+

+ +

+ + -

-

+ + +

+

-

+

+

+ + + +

+a

O

U

O +a

O O O

U

O

O

O

+a

O O O O O

O O O O O

U O

O O

+

O O O

+ +

+

+ + O O O O

O O +a U

O O

0.65 1.o9 0.92 1.42 0.81

1.25 1.10 1.35 0.67 1.19 O.% 1.47 0.89 1.35 1.14

1.52

1.50 1.o2 1.34

0.99 1.37 O. 86 1.60 1.37 1.42 1.40

es la ecuación (6) y en la ecuación (6’)con los valores de los coeficiem&s:

i i

El cálculo de las nuevas concentraciones de los ingredientes en estudio dio corno resultado 1 s

1

siguientes concentmiones en gA; Para x1 1 1.29; para x2 5.43; para x3 3.10 y para x4 5.33, que

1

son concentmciomsmuy semejantes al medio original. Con estos nuevos valores se calculó el

I

crecimiento teórico, dando un valor de p= -1 1.67 mg células en peso seco

i

%r ml. Por ser

ilógico el resuhado,se calculó la nueva matni incluyendo los valores de los qxficientes de t

los datos no signifWivos pero no hay solución única por ser un comportamiento no simétrico.

I

1

Las gráficas de superñcie de respuesta para este experimento (anexo I) indicaron la necesidad de aumentar la coacentración de los ingredientes que aportan nitrógeno, y los valores de los coeficientes obteiT8dos indicaron que los ingredientes más importantes que afectan la obtención de biomasa fueron las peptonas de caseina y de soya (0.211 y 0.126) respectivamente.

Considerando los resultados del primer experimento con el medio TPYG normal y que las fiientes de nitrógeno resuliaron ser significativas en la obtención de biomasa, se programaron I

-

53

?

7--

una sene de experimentos, .definidos como medios M-I, M-2 y M-3. En la Tabla 7 se

muestran las concentraciones de los ingredientes para cada medio y en la tabla 8 las comdas de cada experimento y los resultados obtenidos.

caroentnción ell punto ceatnl gl" Ingredi-

código

P.caseins P.soya

Extmctolevadura GhlCOSi3

XI

x2 x3

x4

Medio

M-1

M-2

M-3

15 10

15 5 2.5 15

5

2.5 5.0

3 10 5

:

!Medio M-l. En el medi M-l. se aumentó en un 50% la con entración de los ingredientes x1y -r: y la concentración de x3 y x4 permanecieron constantes de acuerdo al medio TPYG descrito

en la litemtura. Los resultados de biomasa obtenidos con el medio M-1 se muestran en la Tabla 8 en la columna correspondiente al medio M-l. El análisis estadístico muestra que las variables significativas (PcO.05) corresponden a los ingredientes x1 y x~. II

A partir de los coeficientes obtenidos por la regresión múltiple para el medio M-1, se diseñó la

madz que se resolvió por ecuaciones simultáneas y su resultado debe dar los nuevos valores de concentración de los ingredientes x1 y

x2.

La mat& se diseñó como a continuación se

describe en la ecuación (7):

54

derecha corresponden a los coeficientes y los valores de la matriz

L o s valores de la ma&

izquierda cOrreSpOndena las variables significativas,que en este caso no hay y que se obtienen de la regresión múltiple. El programa que se utilizó para los cálculos h e Statgraphics 6.0. obteniéndose que para esta mat& no hay solución única.

Tabla 8. Diseao facimhl yresdtdosobtcdoscai los medios d&. Luspatos caitrales (O,O,O,O) cmespondeaa los medias de aitcivo M t o s en la Tabla 7 B~nnasa(B I-’)

Factores RUn

XI

1 2 3 4

x3

14

&

+

5

6 7 8 9 IO I1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

x2

+ + + + + + + + +a U

O

O O O O O O O

+ + + +

+ + + +

O O +a o

O

O O O O

O

+

+ &

+

+ + + +

+ + +

+

+

+

O O

O

O

O O O

O +a Q

O O

O O

O

@ ‘o

o

o o

*

MI

M-2

M-3

1.69 1.71 1.81 1.% 2.32 2.37

1.69 1.59 1.74 1.84 2.30 2.10 2.10 2.43 2.84 2.66 2.58 2.23 2.72 2.64 2.90 2.89 2.58 1.80 2.17 1.72 1.64 1.99 2.17 2.30 2.80 2.49

1.88 2.11 2.84 3.10 2.63 2.42 2.98 3.25 2.08 2.97 4.20 3.45 2.49 2.72 4.27 4.11 4.06 3.06 2.93 2.60 3 78

2.56

2.58 2.54 2.58 2.60 2.67 3.18 3.31 3.58 3.76 2.95 2.14 2.89 2.69 2.73 2.77 2.73 2 16 2.58 2.50

2.96

2 93 2 97 3 15 3 12

(*) peso seco después 12h de cuhivo xl peptauide casea r2peptom de soya; x3 extrado de levadura, x4 glucosa

55

Medio M-2. El medio M-2 se diseñó para observar si el factor que limita el crecimiento es la glucosa, ya que la relación carbono/nitrógeno en el

(10-2/10"

medio TPYG difiere de la relación

M)que normaimemte se encuentra en los medios de cultivo (Dunn, 1985).La Tabla

7 muestra las concentraciones en los puntos centrales para el medio M-2 y los resultados del

crecimiento a las 12h se muestra en la Tabla 8.

Para este medio, los ingredientes significativos fueron

(P = 0 . W ) y x2 (P = 0.0273) y el

tratamiento matemático no mostró una solución única para los nuevos valores de las concentraciones de los ingredientes. Las sráficas de superficie de respuesta (anexo 2)

muestran Ia necesidad de aumentar los ingredientes y no se observa un aumento significativo

en Is obtención de biornasa.

Medio M-3. Si la glucosa no parece ser un factor que limita del crecimiento y los ingredientes que aportan el nitrógeno orgánico parece que no satisfacen las necesidades de la bacteria, se

diseñó el medio M-3, en donde se incremento 4 veces la concentración del extracto de levadura (xj) por considerarlo un ingrediente de alta calidad por su aporte en aminoácidos y

otros compuestos como vitaminas y N-acetil-D-glucosamina (Petschow y Talbot, 1990), mientras que las concentraciones de la Peptona de caseina (xi) y la de Peptona de soya ( x ~ se )

) mantuvo constante ai nivel del disminuyeron a la mitad. La concentración de glucosa ( x ~ se medio TPYG originai.

Los resultados obtenidos con este medio se muestran en la Tabla 8 y el análisis estadístico mostró que los ingredientes significativos heron x1 (P

=

0.0006), x3 (P = O.OOOO), x? (P =

0.0445), con menor grado de significancia pero suficiente para ser tomada en cuenta, el

coeficiente de x: (P = 0.062) y la interacción ~1x3(P = 0.050). La ecuación que describe el crecimiento es la (8) y con los valores de los coeficientes en la ecuación (8’).

p= 3.202 + 0.326~1+ 0.501~3- 0 . 2 3 6 ~ 2- 0.2166~:

(8’1

+ 0.167~1~3

Con base en los valores significativos de los ingredientes y a sus coeficientes, se diseñó la

matrh (9) para calcular las nuevas concentraciones de los ingredientes.

I

0.0834

O

O

O

O

-0.236

O

O

0.0834 O

O

O

O

O

O

. (9)

-0.2106

Por ecuaciones simultáneas se resolvió la mat& y se obtuvieron los nuevos valores para los ingredientes que fueron en s/i:

XI=

6.013

x2

=

o

X? =

3.91 1

XJ =

o

3

sustituyendo los valores en la ecuación (8), p toma un valor de

y=- 8.525 que es un valor de crecimiento negativo. Sin embargo, el medio M-3 mostró en las corrl&5

5

y 16 (Tabla 8) del diseño factorial, concentraciones de biomasa mayor a los 4 gíl a las 13

I

Estas corridas corresponden a concentraciones de peptona de caseina (XI) 7.5

s/i; peptona tie

soya (XI) 4.5 g/i; extracto de levadura (x3) 15 g/l y glucosa ( ~ 4 )2.5 y 7.5 gíl. Lo interesante de estas nuevas concentraciones es que no varía la relación en peso de la fuente de carbono y tle

las fuentes de nitrógeno, que para el medio TPYG la relación C:N es de 1:3.5 y para estas corridas la relación C:N es 1:3.6. Con base en estas concentraciones se diseñó un nueta experimento factorial central con puntos estrella, siendo los puntos centrales

Iiis

concentraciones anteriores, pero para la glucosa, la concentración se ajustó a 10 @l. El dise? o factorial se trabajó a niveles de 50% abajo y arriba de los puntos centrales y los puntos estrella a un valor de 1.414. En la Tabla 9 se muestran las concentraciones de los ingredientes para cada comda y las concentraciones de biomasa a las 12 h de cultivo. Este nuevo medio de cultivo se le denominó M-3E

Tabla 9 C d g o , concentracionesde sustrato y obtención de biomasa en el madi0 de cultivo M-3Edesputs de 12 h de fermentación

códtgo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

+

+ + + + + + + i u U

o

+ + + + + + + + O O +a

O O O O

-a

O

O

O O O O

O

O O O

O O O

+ + + +

+ + + + + +

+ + + +

+

+

O O O O +a

O O O O O

O

U

O O O O O O

+a -a O

O O O

3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 3.75 11.25 12.8 2.19 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5

2 2

6 6

2

2

6

6

2 2 6 6 2 2

6

6

4 4 6.82

1.17

4 4

4 4

4 4

4 4

7.5 7.5 7.5 7.5 22.5 22.5 22.5 22.5 7.5 7.5 7.5 7.5 22.5

22.5

22.5 22.5 15 15 15 I5

25.6 4.4

15

I5 15 15

I5 15

5 5 5 5 5 5 5 5 I5 15 . 1s 15 15 I5 15 15 10 10 10

IO 10 IO 17 2.93 10 10 10 10

4 I1 5 33

400

5 70 3.88 464 398 4 83 4 62 6 03 5 02 6 61 3 40 4 79 2.64 5 26 6 71 4 89 5.64 506 5 47 5 80 5 84 3.84 8 6 O1 5 95 5.99 5 86

2,

Para elaborar el análisis estadístico con estos resultados, se realizó el análisis de regresión múltiple cuyo modelo se muestra a continuación Regresión Múltiple variable dependiente: variables independientes:

biomas a [x:l. [ x : ] [x31. . [ x ; ] . [x:-]. [Xy-].[x3-1. 1x4-I. [X-.X'I. [Xi.X?]. [Xl.X,l. [X:.X:J. [x:.x4I * [x3.x41

59

I .

: e l medi: M3E

a j u s t e de; modelo para 1 3 i:)i;rirsa

.--_I_--

v a r i a b l e L ;dependiente

-

cons tante H3E. x: M3E. XI H3E. X ? M3E.X:H3E X-: M3E ..x:H ~ E x?. H3E. X:& M3E.xi M3E.X; H3E.X: M:iE-X: H3E.xl M:IE.X, H3E.x2 M3E.x: MIE.X, H3E.XM3E.x3 M3E.xj

-

. . . .

.

coeficiente

. I _ .

e r i o r .c - d .

.--..---.-

significancia

-.

I

o. l'lf7- 5 o. '>EO: 4 o. '350: 5

6.00816 O . 70671 O . 10401 -0.4223 O . 23741 -0.1319 -0.3570 -0.2144 -0.6120 0.125 -0.0175 O . 15625 -0.07 62 0.01 -0.2725

t-,.-.,lue

3E 3: 5 o. I1 3E 5: 6

O.

O.:.Il3.:i O . 1.113.:5 O . l4134-5 O . :.41325 o. L3C213 o. L362: 3 o . 1.3c213

o. L3f2:

3

0.13c2: 3 o . L5€2. 3

-.----

-.-.-

33 13877 7 . ~:371 I.., 946 -4.4446 2.t.984 -0.9335 -2 5 2 5 8 -1.5173 -4.3304 1.1-766 -0.1647 1. ( - 7 0 7 -0 '1177 0.1 9 4 1 -2.5650

o. O000

o . O000

O . 2936 0.0007 O . 0267 O .3676 O . 0253 O . 1531 O . 0008 0.2605 0.8717 0.1651: O . 4856 0.9264 O . 0235

'R ajustad,a=O.H172 x, peptoar de raeiaa; q peptona de soya; g extracto de ievadws...ir4 g1,ucosa

A partir del análisis anterior y tamando en cuenta las cluiahks signiticativas (P .

=I

II

1

(

r .

4

. I

G

(it

IS

coeficientes de la matiz obtenidos en el análisis de regresión

~2 = -2.37073

, ht .;..ición para cada variable

~3 = -2.18725

~4

= -8.08307

Xn)x distancia + punto central

61

i

i

Tabla 10. Coafcntraciones calculadas para cada ingrediente del medio de cultivo TPYG

Código del ingrediente

ConcmM

calciiladr

cc>

Concentración a utilizar

W)

-o 3562

0.0

23.20 30.20

23.0

tí 37

6.4

30.0

Sustituyendo ualores de los coeficientes en la ecuación (ZO), se tiene la (22):

6.008 + ( .706 xi - 0.422 q + 0.237 x4 - 0.3570 x:

- 0.612x4f - 0.272 ~ 3 x 4

(12)

Sustitupdo las mriablesX,, por los valores obtenidos en la solución de la mat& (21) se obtiene un -:or teórico de p= 11.04 g/i de biomasa.

El análisis estadistico

permite predecir si las concentraciones de los ingredientes son las

adecuadas pata Gbtener bajo las condrciones actuales de estudio la producción optimizada de biomasa de B, rvf4nti.s.Para lo anterior, con el programa de estadística Statgraphics v 6.0, se de superficie de respuesta con los valores de los coeficientes de las obtuvieron las ;~:JGC~S variables que redtaron significativas. En la Figura 6 se observa que las gráficas de superficie presentan un op~timo en la respuesta de biomasa para las interacciones de cada dos ingredientes del me