0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO. Objetivos - Conocer las características generales de las enzimas como catalizadores biológicos. - Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico. - Relacionar los distintos parámetros asociados a la medición de la actividad enzimática que permiten seguir y evaluar la purificación de una enzima (actividad específica, rendimiento y enriquecimiento). Introducción Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción y no se consumen o modifican durante ésta. Sin su presencia, muchas de las reacciones bioquímicas celulares no podrían proceder a la velocidad requerida. El incremento en la velocidad de la reacción se encuentra entre 106 a 1012 veces con respecto a la reacción en ausencia del catalizador. Otra propiedad de las enzimas es su alto grado de especificidad; solamente catalizan la reacción en la que participa un sustrato (especificidad absoluta) o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes (especificidad de grupo). La enzima, al ser una proteína, tiene una estructura geométrica característica y la porción de la enzima que específicamente une o reacciona con el sustrato se denomina centro catalítico o sitio activo. Para muchas enzimas sus residuos de aminoácidos son suficientes para efectuar la catálisis, para otras es necesario que exista un cofactor, ya que en ausencia de éste no se cataliza la reacción. El cofactor es un ión metálico como el Fe2+, Zn2+, Mo2+. Para otras reacciones se necesita una coenzima, es decir una molécula orgánica con características no proteicas, que generalmente se sintetiza a partir de vitaminas. La coenzima funciona como un cosustrato cuando se une transitoriamente al sitio activo de la enzima, de tal forma que se libera al medio durante cada ciclo catalítico. Éste es el caso de las deshidrogenasas que trabajan con el NAD+, como la enzima que nos ocupará en ésta sección experimental. Cuando la coenzima se une fuertemente a la enzima, ya sea por medio de enlaces covalentes o interacciones no covalentes, se le da el nombre de grupo prostético. Diseño de un ensayo enzimático Durante el aislamiento y purificación de una enzima, es necesario realizar un ensayo para determinar la cantidad y pureza de la enzima, así como evaluar las características cinéticas de la enzima. Para el diseño de un ensayo enzimático se requiere conocer la reacción que se analiza, es decir: A) cuales son las especies que se requieren (sustrato, la o las coenzimas, el o los cofactores, entre otros); B) la estequiometría completa, y C) los efectos del pH, temperatura y fuerza iónica sobre la actividad de la enzima. Adicionalmente a lo anterior, debe de estar disponible un método para identificar y monitorear cualquier cambio físico, químico o biológico que ocurre durante la conversión del sustrato a producto. Se pueden utilizar distintas técnicas para determinar los cambios en las concentraciones de sustrato o producto como la espectrofotometría, la fluorometría, la titulación ácido-base y el conteo radiactivo. La elección de alguna de ellas depende esencialmente de las características estructurales del sustrato y/o producto, así como de la química de la reacción. 1

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Si un ensayo enzimático involucra el seguimiento de la concentración del sustrato o producto durante un intervalo de tiempo, el ensayo se denomina cinético. Por otro lado, cuando se realiza la determinación de la concentración del sustrato o producto a un solo tiempo, se denomina ensayo a tiempo fijo. En lo posible se recomienda realizar ensayos temporales de reacción, ya que cualquier desviación de la linealidad puede detectarse inmediatamente. Los cambios en la linealidad de la reacción pueden deberse a una o varias causas, el decremento en la concentración de sustrato, la desnaturalización de la enzima y a la inhibición causada por el producto de la reacción. Pero, hay que aclarar que la velocidad inicial de una reacción ocurre en los primeros minutos de la reacción, una relación lineal que se mantiene cuando el consumo de sustrato no va más allá del 5% de la concentración inicial. Por tanto, cuando se realiza un estudio sobre la actividad enzimática, es fundamental que las velocidades que se obtengan sean las iniciales. Lactato deshidrogenasa de mamífero. El nombre científico de la lactato deshidrogenasa o LDH es L-lactato: NAD+ oxidoreductasa (EC 1.1.1.27). Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneración del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad física intensa, cuando la tensión de oxígeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversión de lactato a piruvato (Figura 3.1). Pero lo contrario ocurre cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0, entonces el piruvato es convertido a lactato con la concomitante conversión de NADH a NAD+. La regeneración del NAD+ permite que el flujo de la vía glucolítica continúe. La actividad de la enzima decrece en el sentido de Piruvato →Lactato cuando la demanda de energía cesa o hasta que los niveles de lactato llegan a ser altos e intolerables.

Figura 3.1. Reacción que cataliza la lactato deshidrogenasa. La reducción del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de una coenzima. La LDH es un tetrámero de subunidades con un peso molecular de 35 kDa cada una. Hay dos tipos de subunidades, la H que predomina en el corazón y la M que predomina en el músculo y el hígado. Las subunidades se pueden asociar formando 5 tipos de tetrámeros con estequiometrías distintas: H4, H3M1, H2M2, H1M3 y M4. Todos estos tienen actividad de LDH, pero tienen diferentes afinidades por el lactato o el piruvato. Las enzimas que catalizan la misma reacción pero difieren en su estructura son llamadas isoenzimas. En la práctica se determinará la actividad de la LDH de músculo esquelético de bovino, enzima que contiene casi exclusivamente subunidades M, esto es la isoenzima M4. En está parte del protocolo se medirá a diferentes tiempos la reacción en el sentido de Piruvato →Lactato, utilizando como fuente de enzima las fracciones que fueron obtenidas durante el protocolo de purificación de la LDH de la sección II del manual. El ensayo de actividad está basado en la detección del cambio de absorción del NADH y el NAD+. El NADH es una molécula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+ no. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras se detectará como una disminución en la absorbancia a 340 nm, debido a que en la reacción el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+. 2

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Material biológico. Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3 Fracción PA Fracción PB Material y equipo Celdas de plástico Tubos de microfuga Parafilm 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta de 200-1000 µL 1 Micropipeta de 20-200 µL 1 Micropipeta de 2-10 µL 1 caja de puntas de 1000 µL para micropipeta 1 caja de puntas de 200 µL para micropipeta 1 Vórtex Espectrofotómetro (por grupo)

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 4. Todas las celdas se mantienen en el hielo. Después adicionar a una de la celdas 50 µL de 4 mM NADH e inmediatamente agregar 10 µL de la muestra de enzima diluida. 5. Se tapa la celda con parafilm y se agita por inversión dos veces y se lee inmediatamente la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm. Consideraciones: si la absorbancia inicial es menor de 0.4 es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas y hacer una dilución mayor de la enzima, si no hay cambio en la absorbancia entonces diluir menos la muestra. 6. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1). El ensayo de actividad se realizará a temperatura ambiente, por lo que una vez adicionada la enzima hay que mantener la celda dentro del espectrofotómetro. Tabla 3.1. Lecturas de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificación de proteínas Tiempo (min)

F3 Dilución

F__ Dilución

F___ Dilución

F____ Dilución

F____ Dilución

0.5 1.0 1.5 2.0

Reactivos 1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo, puede usarse el amortiguador de fosfatos para su disolución. Verificar que la absorbancia a 340 nm sea mayor de 1.0, si no es así volver a pesar y medir.

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

Desarrollo experimental.

5.0

Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa. Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fracción 3, que es la fracción que usarán para obtener los parámetros cinéticos de la enzima. Para obtener las curvas de actividad determinarán la dilución óptima de enzima para realizar los ensayos. Una vez que concluyan con esa fracción y dependiendo del tiempo que hayan consumido de la sesión, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad a la fracción 1 y/o la fracción purificada A o B. Las mezclas de reacción se realizarán directamente en las celdas de plástico. Se usará agua para ajustar a 0 el espectrofotómetro. 1. Descongelar la proteína y mantenerla a 4°C en un recipiente con hielo. Hacer una primera dilución de la fracción 3, se recomienda 1:10. 2. Se etiquetan 5 celdas. 3. A cada una de las celdas se les añadirán los siguientes componentes: 515 µL 100 mM Amortiguador de fosfatos 29.3 µL 10 mM Piruvato 210.7 µL H2O

3

pendiente Actividad (mmolmin-1mg-1)

7. Realizar una gráfica de Absorbancia vs Tiempo (minutos) para cada una de las diluciones de cada una de las fracciones y obtener la pendiente de la recta. 8. Para calcular la actividad de la enzima se utiliza la siguiente ecuación:

Actividad = donde:

⎛ Abs ⎞ m⎜ ⎟ * Vol. ensayo (mL ) * F ⎝ min ⎠ = mmol min −1 mg −1 −1 ε M cm −1 * b (cm ) * mg proteína

(

)

m: es la pendiente de la recta (∆Abs/∆t) en unidades de abs / min ε: es el coeficiente de extinción molecular para el NADH, 6.22 x 103 M-1 cm-1. 4

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm Vensayo: es el volumen total del ensayo. F: es el factor de dilución para la enzima

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

•

9. Con los datos de actividad y los obtenidos en la práctica de purificación de proteínas llena la Tabla 3.2. 10. Recuerda que para obtener el dato de la actividad específica hay que multiplicar la actividad enzimática por los mg totales de proteína en la fracción. Tabla 3.2. Tabla de purificación de la LDH de músculo esquelético de bovino. Procedimiento

Homogeneizado (F1 o F0) Sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio 45% (F2) Botón obtenido de la pp con sulfato de amonio 70% (F3) Primera Fracción que salió de la cromatografía* (FPA) Segunda Fracción que salió de la cromatografía* (FPB)

Volumen de la fracción (mL)

•

Proteína Actividad Actividad Veces de total en la enzimática específica purificación fracción (mmol min-1mg-1) mmolmin-1mg-1total (mg) de la fracción 1

Rendimiento

• • • •

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190. Localización QP514.2 Kopperschläger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49. Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización QP514.2 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233. QH345 L43 Pardo-Vázquez JP. Cap 10. Cinética enzimática. En Bioquímica de Laguna. El Manual Moderno, SA de CV., 2002, pP185 Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localización QP514.2

100

Anotar cual cromatografía se realizó, ¿de intercambio iónico o de afinidad?. 11. Analizar los resultados.

Cuestionario 1. ¿Por qué se usó H2O como blanco para calibrar el espectrofotómetro en la práctica? 2. Menciona los pasos que deben seguirse para obtener la fórmula que se propone para calcular la actividad de la enzima. 3. ¿Cuáles son las diferentes unidades en que se puede reportar la actividad de una enzima? 4. Proponga un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de realizar una curva temporal de aparición de productos. 5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.1 menciona cual fue el paso en el que la proteína se enriqueció más. ¿Por qué? 6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad ¿en qué pasos de la purificación se eliminan más contaminantes?. 7. ¿Cuál es la utilidad de realizar una tabla de purificación en la que se toma en cuenta la actividad de la enzima?

Referencias

5

6

PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA característicos de una enzima, aunque dependen de las condiciones en las que se llevó a cabo la reacción, ya que hay que recordar que la enzima es una proteína que responde modificando su estructura y carga eléctrica cuando los componentes de la solución cambian.

Objetivos: - Determinar la concentración de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidad máxima. - Entender el significado de los parámetros cinéticos Vmax y Km. - Calcular los parámetros cinéticos de la reacción catalizada por la lactato deshidrogenasa utilizando diferentes gráficos de la ecuación linealizada de Michaelis-Menten. - Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa - Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parámetros cinéticos de la enzima.

Una manera para obtener los valores de Km y Vmax de una enzima también llamados parámetros cinéticos de una enzima, es graficando los valores de velocidad contra la concentración de sustrato. Este método tiene la desventaja de que se grafica una curva y no una línea recta por lo que la interpolación es difícil. Otra manera, es la de utilizar alguna de las expresiones matemáticas que producen una línea recta como son la de Eadie-Hosftie, la de Hanes o la más popular la de Lineaweaver-Burk y que es la ecuación que a continuación se muestra:

Introducción El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener varios factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato de la enzima y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros. Curva de velocidad en función de la concentración de sustrato. Tanto en una reacción catalizada por una enzima como en una reacción química, se espera que la velocidad de la reacción de conversión de sustratos a productos, sea directamente proporcional a la concentración de los reactantes que participan en la reacción, es decir si se duplica la concentración de cualquiera de los sustratos la velocidad de la reacción también se duplica. A una reacción así se denomina reacción de segundo orden y se representa como una línea recta con pendiente positiva y diferente de cero. Pero en una reacción que es catalizada por una enzima, sólo a concentraciones bajas del o los sustratos se obtiene una reacción de segundo orden. A concentraciones altas de sustrato la velocidad es independiente de la concentración de sustrato, debido a que no hay más enzima que lleve a cabo la reacción. La reacción a concentraciones altas de sustrato se llama reacción de orden cero y también se representa como una línea recta pero con pendiente casi igual a cero. En resumen, en una reacción catalizada por una enzima la variación en la concentración del o los sustratos presenta diferentes órdenes de reacción. Para un gran número de enzimas la gráfica que se produce se puede describir mediante la expresión matemática de una hipérbola rectangular. Como en cualquier expresión matemática se expresan en ella la relación entre las variables junto a 1 o más constantes. El trabajo pionero de Michaelis y Menten y Bringgs y Haldane llevó a describir la ecuación de la hipérbola rectangular, ahora conocida como ecuación de Michaelis-Menten, con ella es posible predecir el comportamiento de la enzima en condiciones experimentales diferentes. Entonces, la ecuación se describe así:

V max [s ] Km + [s ] Donde las dos variables de la ecuación son la velocidad (v) y la concentración de sustrato (s). Mientras que las dos constantes son la Km y la Vmax. La Km es llamada la constante de Michaelis-Menten. El valor de Km de una enzima para un sustrato específico es la concentración del sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad máxima. La Vmax es la velocidad teórica máxima de una reacción. A concentraciones muy altas de sustrato el valor de la velocidad se aproxima al de la velocidad máxima de la reacción, pero nunca se llega a ésta. Los valores de Km y Vmax son

Como se observa en el ejemplo anterior, las formas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten son expresiones matemáticas simples y aunque cada una tiene sus problemas de interpretación son útiles para obtener los valores de Km y Vmax. Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas. Muchos compuestos tóxicos como antibióticos, pesticidas o herbicidas son inhibidores de enzimas que son responsables de reacciones vitales para la célula. La interacción de un inhibidor y la enzima no es siempre la misma, ya que depende de la naturaleza química del inhibidor así como de la reacción química que cataliza la enzima. Para dilucidar el tipo de interacción entre ambas moléculas se recurre a determinar el efecto del inhibidor en las constantes cinéticas de la enzima. Inhibidores competitivos. Son moléculas que tienen una similitud estructural y química al sustrato de la enzima. Debido a lo anterior el inhibidor se puede unir al sitio activo de la enzima. Pero como el inhibidor no es idéntico al sustrato, la enzima no es capaz de convertir el inhibidor a producto. El inhibidor simplemente bloquea el sitio activo, por regla no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se encuentren al mismo tiempo en el sitio activo. Si se adiciona más sustrato y el inhibidor es reversible, el aumento en la concentración de sustrato reduce la inhibición. El inhibidor afecta exclusivamente el valor de la Km de la reacción catalizada por la enzima (Figura 3.2).

v=

7

Figura 3.2. Efecto de los inhibidores sobre los parámetros cinéticos de una enzima.

8

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Reactivos Inhibidor no competitivo. El inhibidor no se une al sitio activo de la enzima sino a un sitio alejado del sitio activo y ocasiona un cambio conformacional en el sitio activo de la enzima. Un inhibidor no competitivo puro es aquel en el que sólo se altera la capacidad de unir al sustrato. La mayor parte de los inhibidor son inhibidores mixtos es decir no sólo se afecta la unión del sustrato sino también la conversión del sustrato a producto. Debido a lo anterior, los inhibidores mixtos alteran tanto el valor de la Vmax como el de la Km de la enzima (Figura 3.2). Inhibidor acompetitivo. Es un inhibidor que no es capaz de unirse a la enzima libre, es decir sólo se une al complejo Enzima-Sustrato. Lo anterior puede deberse a que la unión del sustrato expone o crea sitios de acceso o unión para el inhibidor, en el o fuera del sitio activo. Una vez que el inhibidor se une la enzima se previene la formación de producto. El inhibidor acompetitivo altera tanto la Km como la Vmax de la enzima. Sin embargo, a diferencia de la gráfica que se produce con un inhibidor de tipo no competitivo mixto, las curvas a diferentes concentraciones de inhibidor son paralelas en este último. En la práctica se determinarán las constantes cinéticas, Km y Vmax, de la lactato deshidrogenasa de músculo de bovino, para la reacción en el sentido de piruvato a lactato, manteniendo constante la concentración de enzima, el pH y la temperatura de reacción. También se determinará el tipo de inhibición que un ácido carboxilico produce en la actividad de la enzima, el oxamato (Figura 3.3) a través de medir la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentración de inhibidor su efecto en las constantes cinéticas de la reacción catalizada por la enzima.

− − − −

1 M Amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM Piruvato de sodio 10 mM Oxamato de sodio 4 mM NADH. Reactivo que debe de disolverse justo antes de usarlo.

Desarrollo experimental. Efecto de la concentración de sustrato. 1. Numerar las celdas. 2. En una celda de plástico se adicionan el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de acuerdo a lo que se indica en la tabla 3.3. Justo antes de medir se añaden 50 µL de NADH 4 mM y 10 µL de la muestra de enzima diluida, fracción 3 obtenida en la práctica de purificación. Tabla 3.3. Efecto de la concentración de sustrato. Solución 1 *Concentración final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador fosfatos pH 7.0 H2O c.b.p. 815µL (µL)

Material biológico Fracción 3 obtenida en la práctica de purificación.

3

4

5

6

0.09*

0.15*

0.25*

0.36*

0.5*

515

515

515

515

515

515

235.1

232.7

227.8

219.6

210.7

200

10 Mm Piruvato (µL)

4.9

7.3

12.2

20.4

29.3

40

4 mM NADH (µL)

50

50

50

50

50

50

10

10

10

10

10

10

ENZIMA Figura 3.3 Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usará en la práctica, el oxamato.

de

2

0.06*

(1:200) (µL)

3. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces por inversión. 4. Ajustar el espectrofotómetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 340 nm. 5. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.4).

Materiales y equipo 10 celdas de plástico Tubos para microfuga 1 Recipiente para hielo 1 Vaso de precipitados de 25 mL 3 Tubos de ensayo 13x100mm 1 Micropipeta de 1000 µL 1 Micropipeta de 200 µL 1 Micropipeta de 10 µL 1 Micropipeta de 50µL Puntas para micropipeta de diferentes capacidades 1 Vortex Parafilm Espectrómetro (por grupo)

9

10

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato. Piruvato (mM) Tiempo (seg)

0.06

0.09

0.15

0.25

0.36

0.5

30

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. Se adiciona en una celda de plástico los reactivos de acuerdo a los volúmenes y el orden que se encuentra en la Tabla 3.5. 2. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.6). Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor. Tiempo Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM

60 90

(seg)

120

30

150

60

180

90

210

120

240

150

270

180

300

210

6. Obtener la pendiente y calcular la actividad de manera similar al punto 6 de la práctica anterior. 7. Posteriormente se grafican: A) Actividad vs concentración de sustrato (gráfica de Michaelis-Menten); B) La actividad de acuerdo a la ecuación de Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff. 8. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos anteriores. Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Al igual que en la sección anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa a diferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio, compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5).

0.06

0.09

0.15

0.25

0.36

0.5

240 270 300 3. Obtener la pendiente y calcular la actividad enzimática. 4. Realizar los siguientes gráficos: A) Actividad vs concentración de sustrato; B) La gráfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) La curva de acuerdo al método de Hanes-Wolff. 5. Calcular las constantes cinéticas Km y Vmax, con los datos obtenidos de los tres gráficos anteriores. 6. Determinar el tipo de inhibición que oxamato ejerce sobre la LDH. Cuestionario

Tabla 3.5. Composición de medio de reacción para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactato deshidrogenasa. Solución 1 2 3 4 5 6 *Concentración final de piruvato (mM) 100 mM Amortiguador de fosfatos pH

0.06*

0.09*

0.15*

0.25*

0.36*

0.5*

515

515

515

515

515

515

H2O c.b.p. 815µL

235.1

232.7

227.8

219.6

210.7

200

10 mM Oxamato (µL)

27.2

27.2

27.2

27.2

27.2

27.2

10 mM Piruvato (µL)

4.9

7.3

12.2

20.4

29.3

40

4 mM NADH (µL)

50

50

50

50

50

50

10

10

10

10

10

10

7.0

ENZIMA

(1:200) (µL)

11

1. ¿Por qué es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima? 2. Diseña un protocolo diferente al presentado en está sección para determinar la actividad de la lactato deshidrogenasa. 3. ¿Cuál fue el blanco de la reacción? 4. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de primer orden? 5. ¿En que intervalo de concentración la reacción de la LDH muestra un comportamiento de orden cero? 6. ¿Qué orden de reacción es cuando no es de cero o primer orden? 7. ¿Qué significado tiene? 8. Define Km e indica qué unidades tiene. 9. Define Vmax e indica qué unidades tiene. 10. ¿Qué tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta. 11. ¿Cuáles son los inhibidores naturales de la LDH de músculo? 12. ¿Por qué la célula reduce la actividad de la LDH?

12

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Sección 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Referencias • Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localización QP514.2 • Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202233. QH345 L43 • Voet D, Voet JG. 1992. Bioquímica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localización QP514.2 Sitios recomendados para 1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax • http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la página pulsar la tecla kinetics_model.xls, después regresa a la página inicial y contesta las preguntas que se te hacen. • http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm NOTAS Y CÁLCULOS

13