PARTE III Métodos para generar variabilidad

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana

III.-Capítulo 1 Variación somaclonal Cardone, Susana; Olmos, Sofía; Echenique, Viviana 1 Introducción El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genéticos que son sensibles a la disrupción por estreses bióticos y abióticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las células vegetales e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explanto, la inducción de callo, la formación de embriones y la regeneración de plantas. Por esta vía es posible obtener variación, de origen nuclear y/o citoplasmática, que podría ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variación somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no específicas que no generan variación estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresión génica. Dichos cambios, denominados «epigenéticos», son también considerados por algunos autores como variación somaclonal mientras que otros sólo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinación somática e intercambio de cromátidas hermanas, rearreglos génicos somáticos, elementos genéticos transponibles, amplificación y/o metilación del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfológicos (como por ejemplo el hábito de crecimiento, la morfología floral, etc.) son fáciles de evaluar, muchos aspectos de la variación suceden sin manifestarse en cambios morfológicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto génico puede no alterar su actividad biológica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variación debe analizarse a varios niveles. Esta variación depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composición del medio de cultivo y de la vía de regeneración, donde la embriogénesis somática generaría menores alteraciones que la organogénesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparición ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronómico permite utilizar este fenómeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia económica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos ácidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta técnica involucra un balance entre la cantidad de variación inducida y el mantenimiento de los caracteres agronómicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontró resistencia a la oruga militar en un cultivar que reunía otras buenas características, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista práctico no resulta una técnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variación y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresión del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación de plantas. También, en algunos casos, puede representar una fuente rápida y fácilmente accesible de variación para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genéticos limitados y/o de base genética estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variación somaclonal fueron registrados en plantas de reproducción agámica como la caña de azúcar y la papa, pero el fenómeno ha sido ob-

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servado en monocotiledóneas como trigo, maíz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorón (Eragrostis curvula) y en dicotiledóneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparición de variación somaclonal La aparición de la variación somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la vía de regeneración, la composición del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duración del período de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtención de variedades. El nivel de ploidía es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrás (Lolium multiflorum) y en papa se observó que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidías durante el cultivo de tejidos. La explicación más razonable es que los poliploides, con más de dos juegos completos de cromosomas, están «tamponados», y por lo tanto toleran la ganancia o pérdida de cromosomas, pudiendo así cumplir con los requisitos impuestos por la regeneración. En los diploides, la pérdida o la alteración de cromosomas que llevan genes vitales impedirá la regeneración de las plantas, llegando con éxito a esta etapa sólo aquellos explantos que tengan su complemento cromosómico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en híbridos interespecíficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los híbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum,

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donde el cultivo in vitro generó entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenían sólo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecíficos suelen utilizarse como metodología para la obtención de haploides. Explanto. La variación también puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen células con diferente constitución genética, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto, la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variación. Sin embargo, la recuperación de quimeras a partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organogénicos. La utilización de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sería una buena opción si es necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos «seguros». Parecería que el cultivo de meristemas aislados sería la mejor opción para minimizar el riesgo de variación somaclonal. Sin embargo, esto no debería tomarse como regla. Utilizando técnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variación en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecería inducir, en ocasiones, inestabilidad genética, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneración de plantas a partir de explantos tan pequeños. La vía de regeneración también tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los géneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variación observada en cultivos embriogénicos es relativamente menor que

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la que aparece en cultivos organogénicos. Esto probablemente se debe a la gran presión de selección impuesta en la formación de los embriones, mayor que la requerida en la formación de vástagos. Se postula que el gran número de genes requeridos para la iniciación y maduración de embriones cigóticos y somáticos impediría la acumulación de mutaciones deletéreas. Sin embargo, se observaron variantes en plantas de café, apio y caña de azúcar regeneradas a través de embriogénesis somática. En estos casos se observó que algunos fenotipos anormales de embriones somáticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maíz. La mayor parte de la variación obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. La iniciación de un callo puede ser análoga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la inducción de enzimas y productos específicos que se inducen también en situaciones de estrés. Cuando comienza la división celular a partir de tejidos diferenciados, que dará origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosómica. La variación que ocurre en los números cromosómicos en la primera fase de la inducción del callo sería el resultado de fragmentación nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los núcleos intactos (núcleos euploides). La naturaleza del callo también puede afectar el nivel de variación obtenida. Un callo verdadero es una masa de células desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variación. En varias monocotiledóneas, el callo representa, a menudo, una masa de órganos suprimidos o proembriones más que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad genética, como se ha observado en espárrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observó que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales, mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenían los explantos. En ocasiones también fue posible

observar variación en plantas obtenidas por regeneración directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciación celular y formación de callo. Medio de cultivo. El estado físico del medio de cultivo también influye en el nivel de variación obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio sólido o en medio líquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotípica o puede incrementar el número de plantas albinas. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) han sido señalados como inductores de inestabilidad. Ejercen profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de azúcares y en el control de la división celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la inducción de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Si bien el modo de acción herbicida del 2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripción que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo utilizado en gramíneas como inductor de aneuploidías. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciación y este proceso sería el generador de los cambios. La fragmentación nuclear amitótica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas también se reconoce como causa de aneuploidía. Este fenómeno es causado por una relación especial auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (ácido indolacético) y el ANA (ácido naftalenacético) han sido señalados como los responsables de los incrementos en la metilación de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en posición 5 son considerados puntos calientes de mutación, ya que la desaminación de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. Las auxinas naturales y sintéticas tienen una elevada correlación con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.

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Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneración de plantas a partir de protoplastos, realizados en papa, indicaron que la variación en el tipo y concentración de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generaría variación genética. Sin embargo, si el cambio en la composición de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciación de los vástagos, se generan elevados niveles de variación genética. Estos datos sugieren que la fase de callo sería un período sensible en el cual la manipulación hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de manera que las hormonas inducirían la inestabilidad genética sin ser, necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxígeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensión de oxígeno de las células en la superficie del callo es diferente a la de aquellas células que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultaría en la producción de etanol, el cual podría comportarse como un mutágeno. También existen especies de plantas que producen compuestos mutagénicos durante el cultivo. Un efecto similar podría tener la acumulación de metabolitos producidos por las propias células durante el proceso. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podrían afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variación, aumentando la proporción de variantes en cultivos envejecidos y también en plantas obtenidas a través de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maíz, avena, tabaco, triticale y raigrás triploide. La variación puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos. El número óptimo de subcultivos podría estimarse empíricamente luego de realizar pruebas de fidelidad genética en las plantas regeneradas a través de subcultivos subsecuentes. Una observación común es que en los períodos prolongados de cultivo hay una pérdida de totipotencia y que esto sucedería debido a la acumulación

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de mutaciones y a la alteración de los genes que son responsables de la regeneración. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboración con el IBONE, demostró que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relación lineal entre el número de subcultivos y la cantidad de variación obtenida en plantas micropropagadas de paraíso gigante. La variación en este caso se detectó mediante la ténica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002). La deficiencia o exceso de minerales también podría afectar la estabilidad genética in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre, fósforo, nitrógeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genómicos. En la variedad de lino «Stortmont Cyrrus» se detectaron cambios genéticos estables y heredables inducidos por una alta fertilización del suelo con fósforo o con nitrógeno. Varias líneas estables obtenidas, fundamentalmente una llamada «L» y otra llamada «S», denominadas genotrofos, se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. 3 Cambios genómicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algún momento esa capacidad de amortiguación se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subóptimo que podría inducir a mecanismos generadores de cambios genómicos. Las bases metabólicas de la interacción entre el estrés y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrés y del estado de diferenciación de las células en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrés que comprende la pérdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciación que se produce durante la inducción del mis-

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mo provoca en las células una serie de procesos metabólicos que resultan en reordenamientos genómicos que podrían dar lugar a fenotipos alterados. Entre las alteraciones genéticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones génicas, cambios cromosómicos que involucren la estructura o el número de los cromosomas y activación de elementos genéticos transponibles. También existen anomalías, como el intercambio entre cromátidas hermanas o el «crossing over» somático, que pueden alterar su frecuencia de aparición en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Varias hipótesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones estructurales y numéricas, los cambios en la metilación y las mutaciones génicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular común para todos estos eventos mutagénicos. Tal mecanismo podría afectar la expresión génica y la estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteración en los patrones de metilación. Esta hipótesis establece que el estrés inducido por el proceso de cultivo in vitro, al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucleótidos, provoca alteraciones en los patrones de metilación del ADN. Estas alteraciones podrían afectar la expresión de genes específicos, incluyendo elementos transponibles y/ o podrían afectar la estructura de la cromatina de una manera más global, involucrando, por lo tanto, a un gran número de genes. Los cambios en la metilación del ADN podrían estar relacionados con la replicación tardía de la heterocromatina, que, en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosómica. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilación no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrés severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilación encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. Esto podría indicar que la variación en metilación no es una respuesta general a todos los estreses.

El cultivo de tejidos podría representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrés que podría inducir una respuesta única y un perfil particular de mutación. Un posible efector de esta variación en la metilación sería la alta concentración de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las células a crecer en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en ápices de raíz de echalote y también en cultivos de células humanas. Las auxinas podrían ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Se cree, además, que los cambios en los modelos de metilación causados por el cultivo de tejidos no serían aleatorios. En este sentido, en raigrás se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genómico. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromáticas, de manera que parecería que la variación somaclonal no es al azar y que habría loci específicos que tendrían mayor tendencia a la mutación. Los cambios estructurales que no están asociados a cambios en el dosaje génico o a cambios en la regulación suelen pasar desapercibidos fenotípicamente, pero pueden causar infertilidad. Por otra parte ocurren también cambios genómicos que involucran alteraciones en el número de cromosomas, como aneuploidías y poliploidías. La poliploidía es el más común de estos fenómenos y estaría relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploidía puede surgir por segregación desigual en la mitosis o por fragmentación nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el número cromosómico pueden afectar el fenotipo a través de dosajes génicos alterados. En papa, por ejemplo, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploidía o por duplicación cromosómica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotípico. Los cambios pueden ocurrir también en el genoma de los plástidos y las mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauración parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestériles obteni-

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das in vitro. También puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestériles de maíz con citoplasma «T» (susceptibles a Helminthosporium maydis), que condujo a la reversión de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderían con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variación debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramíneas. El análisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras reveló la presencia de deleciones y rearreglos. Si bien parecería que los tejidos somáticos son menos sensibles a la variación, también se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. Como puede apreciarse a través de los casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variación somaclonal. Como se mencionara anteriormente existen, además, variaciones epigenéticas, que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilación del ADN y de amplificaciones génicas, provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. Características tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variación. La comprensión de los mecanismos por los cuales ocurre la variación somaclonal ayudaría a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrés y permitiría definir cómo los mismos actúan en los procesos de evolución (Kaeppler et al., 2000). 4 Niveles de detección de la variación somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variación son numerosos y diversos, y probablemente actúan simultáneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genómicas generadas por cultivo in vitro reviste interés desde un punto de vista práctico, ya que las mismas podrían ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de interés y, desde un punto de vista teórico, ya que posibilitarían realizar estudios

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básicos acerca de la variación y el posible control de la misma. La ocurrencia de variación somaclonal puede detectarse con marcadores fenotípicos, bioquímicos y moleculares. La correlación de dichos marcadores con caracteres agronómicos es un requisito relevante para su implementación en los programas de mejoramiento. Se citan a continuación algunos ejemplos de la utilización de marcadores de varios tipos en la evaluación de la variación somaclonal.. La utilización de marcadores morfológicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigación. El examen visual y la utilización de un analizador de imágenes posibilitaron la diferenciación entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum ¨Río¨. Plantas de (maní) presentaron variaciones epigenéticas en altura, tamaño de hojas, número y peso de semillas. El cultivo in vitro de yemas de ananá dio como resultado plantas que exhibían cambios estables en el tamaño de frutos, tasa de proliferación de vástagos y color y textura de las hojas; el cultivo de tejidos de violeta africana, variedad «Crimson Frost», resultó en un 67% de variación en el color de las flores de las plantas regeneradas. A nivel fisiológico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de células y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs variables, entre otros, tanto para cereales como para plantas frutales. La mayoría de estos estudios se basaron en la implementación de una alta presión de selección durante la etapa de regeneración celular mediante la adición de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneración, tales como inóculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el número y estructura de los cromosomas. De esta manera podrían detectarse translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones. Los cambios cariotípicos constituyen una fuente importante de variación que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosómicos. Por esto

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mismo existen otras técnicas que estiman cambios cariotípicos con mayor eficiencia, como por ejemplo el bandeo cromosómico. Esta técnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4), donde permitió detectar rearreglos importantes en individuos donde el número cromosómico permaneció estable. La hibridación in situ es otra de las técnicas que podría aportar información útil para detectar cambios genéticos estructurales. Entre los marcadores bioquímicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variación en plantas de Populus tremuloides regeneradas a través de callos. Esta variación fue detectada mediante electroforesis en geles de almidón utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones electroforéticos permitieron caracterizar a las plantas fenotípicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otros casos el análisis isoenzimático no permitió detectar variación. El estudio de líneas de callos derivadas de embriones cigóticos y de embriones somáticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimáticos no evidenció la presencia de variación somaclonal en 25 loci analizados. Los patrones isoenzimáticos de líneas isogénicas de Trifolium pratense L. que diferían en su capacidad de regeneración, resultaron idénticos para los sistemas de peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas. Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer información útil acerca de la variación generada in vitro. Sin embargo, se están analizando los productos de genes expresados, cuya regulación puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiológicos. Por otro lado, sólo se transcribe y traduce una pequeña proporción del genoma. Por ello, los métodos de análisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha información, ya que las secuencias de ADN son

esencialmente las mismas en todas las células vivas de la planta, independientemente del estado fisiológico o de desarrollo de las mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad genética debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenológicos de las plantas. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callogénesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad genética en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies, Quercus suber L.y Panax notoginseng. En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfológicas y moleculares, pudiéndose discriminar plantas normales de variantes morfológicas mediante la combinación de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociación, probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor número de cebadores. En Pelargonium x hortorum «Río» el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la detección de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimórficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotípicamente diferentes obtenidas por micropropagación. En otro estudio se observó que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrón de bandas. En este mismo género, la técnica permitió detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicaría que la variación molecular no siempre se expresa a nivel fenotípico y viceversa. Existen otros ejemplos que corroborarían esta afirmación, tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que habían presentado fenotipos florales anormales o el de plántulas micropropagadas de Populus deltoides, donde a través de la utilización de microsatélites se detectaron polimorfismos en plantas

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fenotípicamente normales. Otros marcadores moleculares utilizados con éxito para la evaluación de variación somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas específicas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernáculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col., 1994), tenía un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero además era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que producía menores niveles de un estimulante para la alimentación del insecto. Es decir que mantenía los caracteres agronómicos positivos del cultivar parental, pero tenía un cambio en la producción de un metabolito secundario que confería resistencia a la oruga. 5 La variación somaclonal y su aplicación en el mejoramiento genético de las plantas La base del mejoramiento genético es la optimización de interacciones génicas. Para lograr combinaciones génicas óptimas o superiores se requiere de diversidad genética. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (físicas o químicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridación somática y transformación genética. La variación somaclonal proveería una fuente adicional de variabilidad genética, utilizable en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variación somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera:

√ Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. √ Constituye una forma rápida de generar variabilidad genética, particularmente para cultivos con base genética estrecha y

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que son difíciles de mejorar a través de técnicas tradicionales. √ Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. √ Puede utilizarse para mejorar especies de propagación sexual y vegetativa. √ Las tasas de mutación son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontáneas. La variación somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutación cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutación espontánea de 10-7 – 10-9 mutaciones por par de nucleótidos por generación. √ El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad genética durante el cultivo in vitro permitiría utilizar el fenómeno como estrategia de mejoramiento y permitiría eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad genética, como en la micropropagación, la conservación de germoplasma y la transformación genética. √ El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutágenos químicos o físicos, ya que, en el caso de la variación somaclonal, la mayoría de los cambios deletéreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneración de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:

√ En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernáculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia práctica. √ La escasa regeneración de plantas en cultivos de largo término. Generalmente en estos casos existe pérdida de la capacidad morfogénica. √ La regeneración está limitada a genotipos específicos que pueden no ser de mucho interés para los mejoradores. √ Algunos somaclones son inestables (originados por variación epigenética). √ Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploidía, esterilidad, etc. Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debería cumplir los siguientes requerimientos:

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√ Involucrar caracteres agronómicamente útiles. √ El nivel de expresión del carácter debe superar al de sus progenitores. √ El carácter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronómicos de la variedad que son importantes para el cultivo. √ La variación debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia práctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta más sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva.

etapa de multiplicación de semillas, que permitirá realizar pruebas agronómicas en diferentes ambientes, al menos en dos años distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresión del carácter. El programa finaliza con la etapa de multiplicación de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. Una modificación para la producción de nuevas variedades está basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan células haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gametoclones

5.1 Estrategias para la selección de variantes útiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variación somaclonal comprenden: a) La obtención de plantas por cultivo de células o tejidos, que luego son analizadas para el carácter deseado. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtención de un cultivar por variación somaclonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la producción comercial de variantes disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. plantas regeneradas, aquellas que expresen el carácter de interés. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generación R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta progenies sexuales (en el caso de plantas con metodología tendría la ventaja de permitir este tipo de reproducción), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes además se vuelve a realizar la selección para el carác- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronómico buscado, tratando de man- tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las características favora- diante la exposición al alcaloide colchicina. Las bles de la variedad. En plantas autógamas, evaluaciones a campo se realizan en forma como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluación de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de carácter hasta la generación R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales. tos de las plantas R4 selectas con las líneas b) La selección a nivel celular, selección parentales a fin de determinar, mediante el análisis de segregación, la base genética del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarácter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses bióticos o

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abióticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fúngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneración de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La selección efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Selección directa en un solo paso, donde el agente de selección es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Selección in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas de la MIC (concentración mí- concentraciones de aluminio nima que produce un 100 % ración de callo en el medio de cultivo al que de inhibición). - Selección en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de centración del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tión. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a frecuentes. El primero es un método simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las células sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la torirían, permitiéndo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les. A continuación se citan ejemplos donde estrés serían deletéreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combinó la selección in vitro con la subsinivel de diferenciación tisular hubiesen sido guiente regeneración de plantas: capaces de regenerar plantas tolerantes. La - Producción in vitro de plantas de arroz elección de un método u otro dependerá de un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones tóxicas de aluuna indicación acerca de la reacción del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas observó la aparición de plantas resistentes a de la selección in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles rentes líneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La inducción y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicarían que

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el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones útiles en el genoma de arroz. - Obtención de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. dianthi permitió, luego de dos ciclos de selección, la obtención de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenció considerable resistencia al patógeno en experimentos de campo. La búsqueda de variantes a nivel celular permitiría verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de células, con una inversión menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garantía de que la resistencia manifestada in vitro se expresará a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenómeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenéticos, a la naturaleza quimérica del material, al uso de toxinas no específicas (en el caso de resistencia a enfermedades), a la complejidad del carácter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequía) o a la falla de las células para expresar el carácter cuando se diferencian. En ambos casos (a y b) la obtención de resistencia sólo será posible si ésta existe en la población original (entonces el cultivo serviría sólo para recuperar los genotipos útiles) o bien si surge por variación somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variación somaclonal fue utilizada para la producción de variedades comerciales con caracteres agronómicos superiores en diferentes especies. A continuación se enumera, para cada especie, el carácter agronómico seleccionado y el centro de investigación responsable de dicho logro: en geranio, aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en batata: calidad de raíces y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service, USA); en caña de azúcar: resistencia a estrés y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-

tre, Fiji); en maíz: contenido de triptófano (Molecular Genetic, USA); en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento, respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute, Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary); en mostaza: rendimiento (ICAR, India). Las primeras observaciones de variación en caracteres morfológicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de 1968. Diez años más tarde se informó en detalle la variación obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. También se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del tallo y otras características en alfalfa. En arroz, la variación somaclonal resultó en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parámetros morfológicos, caracteres agronómicos y tolerancia a estreses bióticos y abióticos. Pueden mencionarse además otros ejemplos de variación somaclonal en cultivos agrícolas de interés, como por ejemplo caña de azúcar, donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por áfidos. Paralelamente, también por variación somaclonal, se seleccionó el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por Sclerospora sacchari. En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosómicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar «Russet Burbano», que presentaron resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solana y a la colonización por áfidos que transmitían el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). Se encontró también tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. En sorgo se encontró variación somaclonal estable para altura, número de macollos, mayor producción de granos y mayor número de semillas y tolerancia a suelos ácidos y a sequía. La incidencia de variación somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwán se obtu-

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vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares no habían podido ser mejorados por métodos tradicionales. No obstante, para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagación adicionales, que permitieron combinar ambas características en un somaclon. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variación somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). Se han detectado también caracteres interesantes modificados por esta técnica para

su explotación comercial en ornamentales, como por ejemplo variación en el color de las flores en gerbera, clavel y crisantemo. En gramíneas forrajeras puede citarse variación cromosómica en Festuca arundinacea y pasto llorón (Eragrostis curvula), albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense, cambios en la morfología de planta, forma y tamaño de hoja y espiga, desarrollo floral, vigor, y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea, variación isoenzimática en Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). En el laboratorio de Genética del Dpto.

Figura 3: Obtención de variantes somaclonales de pasto llorón, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formación de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfogénesis. C) Estudio histológico de los mismos callos mostrando células embriogénicas y D) embriones somáticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y también F) organogénesis. G) Plántula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron fértiles (I). J) Cromosomas en el ápice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomíctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variación, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.

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de Agronomía de la UNS se llevó a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorón (Fig.3). Se trabajó con varios cultivares de esta gramínea apomíctica y luego de la evaluación de gran número de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Dicho material está en proceso de registración, y está siendo utilizado en estudios de apomixis. - Dos plantas hexaploides apomícticas a partir de un cultivar tetraploide apomíctico. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula, muy promisorios por sus características forrajeras, que están en proceso de registro. La variación in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de proteínas de la semilla, como las gliadinas. A nivel fenotípico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, número de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de proteína en grano sin reducción del rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, número de macollos, color del grano, tiempo de espigazón, dureza, sensibilidad al ácido abcísico, color de las glumas, entre otros caracteres morfológicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. El único antecedente en nuestro país de búsqueda de variación somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotípica espontánea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosómica, patrón de gliadinas, color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfología de la planta, detectándose sólo una translocación no descripta previamente y un patrón diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta técnica no es efectiva para inducir variación que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996).

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