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Pasos del diagnóstico, enfermedades virales y bacterianas más comunes en L. vannamei •  Jenny Rodríguez Ph. D. •  María Sotomayor M. Sc. •  Fanny Panchana Tlga.

Pasos del Diagnóstico CENAIM - ESPOL

1. Examen macroscópico : signos externos 2. Técnicas de campo : equipo sencillo •  Técnicas de histología rápida •  Técnicas microbiológicas •  Técnicas inmunológicas. Estado de salud 3. Correcto envío de muestras al laboratorio 4. Análisis de laboratorio

Dudas frecuentes Cómo enviar la muestra al laboratório?

Qué información puede obtener a campo

Qué información quiero obtener?

Qué limitante y sensibilidad tiene cada prueba?

Qué prueba pedir?

REMISIÓN DE MUESTRAS AL LABORATÓRIO CENAIM - ESPOL

Muestreo Forma de remitir las muestras En camaronera

Laboratorio

Resultados

Procesamiento

Análisis

Influye

Influyen

Fijación de animales

Preservar células y tejidos

vivos

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MUESTRAS HISTOLOGIA

Sol. Davidson

Formalina neutralizada

Fijación Camarón juveniles - adultos

PL´s sumergir en solución fijadora

Inyectar solución fijadora

Calidad de los reactivos, tiempo de exposición al fijador, velocidad de fijación (proceso), conservación

Muestras para Bacteriología CENAIM - ESPOL

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ENFERMEDADES BACTERIANAS DEL CAMARÓN

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Enfermedades bacterianas

•  El progreso en Acuicultura y la intensificación de cultivos han creado un medio apto para el crecimiento bacteriano. •  Gran cantidad de patógenos bacterianos oportunistas presentes en los cultivos. •  Alto riesgo de enfermedades de etiología bacteriana •  Necesidad de herramientas de detección y diagnóstico

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Enfermedades camarón

Figura 1. Incidencia de algunas patolog� (por an᭼sis de histolog� durante las campa

Enfermedades de tipo Bacteriano Vibriosis (Vibrio spp.) OPORTUNISMO Necrosis del hepatopáncreas NHP Rickettsias Mycobacterias

de muestreo.

Bayot, 2001

Enfermedades Fungales •  Micosis larval •  Fusarium spp. Comensales y Parásitos •  Enfermedad del camarón algodonoso (Cotton Shrimp -Microsporidium spp.) •  Enfermedad por epicomensales (protozoarios,alga filamentosa, algas verde azules) •  Gregarinas, otros

Enfermedades bacterianas

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Enfermedades bacterianas

BACTERIAS LUMINISCENTES Reducción 70% producción de laboratorios. •  Especies: V. harveyi, V. splendidus •  Identificación: Deficiente •  Signos clínicos: Larvas: tienen colonización masiva en los apéndecis, e inicio del tracto digestivo y región oral. Densos cúmulos de bacterias en el hemocele de las larvas moribundas. Infección avanzada: colonización del intestino medio y hepatopáncreas (septicemia general) Larvas con luminiscencia. •  Diagnóstico: Aislamiento de la bacteria de larvas moribundas. Identificación ? •  Tratamiento: antibiograma: resistencia

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VIBRIOSIS

•  Síndrome de ZOEA II •  Especies afectadas: P. vannamei y P. stylirostris, •  Signos clínicos: nauplios con apariencia y salud normal, hasta el cambio de Z1,donde come connormalidad y largas cadenas feales son observadas –  Aparece 36-48 horas (Zoea II) –  Interrupción alimentación, evacuación contenido estomaca, nado errático, pérdida normal pigmentación.l –  Letargia, nado errático, muerte por inanición. –  Muerte durante el paso Z1-2

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•  La mortalidad cesa al paso a Z3, survivors continue normal larval development •  Patología interna: atrófia de la glándula digestiva, inflamación del las paredes intestinales. •  Posibles etiologías: toxicidad del agua, bacterias patógenas, patógeno viral (no respuesta antibiótico). •  1997: se determinó como agente a una bacteria intra celular (TEM en HP) •  No se conoce tratamiento

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Vibriosis sistémica

Signos clínicos: alta mortalidad (PL’s, juveniles); camarones moribundos, luminiscencia. Organos afectados: cutícula, hepatopáncreas, órgano linfoide, glándula antenal, hemolinfa, músculo. Diagnóstico presuntivo: Nado errático, en las orillas, letargia, anorexia, coloración del HP alterado, colonización por epibiontes, cromatóforos expandidos, melanizaciones. Altos niveles de bacterias en hemolinfa, alto porcentaje de colonias verdes y o verdes luminiscentes en agar TCBS Diagnóstico confirmatorio: aislación y purificación con medios apropiados Vibrios en TCBS: V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. harveyi, V. penaeicida (VERDES) , identificación por API, rep-PCR. Necrosisis multifocal, inflamación hemocíticas, formación de nódulos en el órgano linfoide, corazón y branquias, etc. Nódulos con bacterias en su interior (histología).

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Vibriosis sistémica

Astillas negras o Black splinter •  Vibriosis crónica •  Infecciones cutícula, branquias •  Lesiones en la cutícula, melanizaciones. •  Regiones ennegrecidas del músculo •  Muerte, o manchas permanentes •  Camarones adultos

Vibriosis sistémica CENAIM - ESPOL

•  Camarón manchado “brown spot dissease” •  Pequeñas lesiones localizadas en tono café o negro, cutícula erosionada. •  Vibrios sp. Aeromonas sp, Siprillum sp, Flavobacterium sp. •  Adultos, stress.

•  Astillas negras, vibriosis sistémica.

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Melanosis externa

VIBRIOSIS Ingreso: Ingestión, exposición, muda

Enfermedad Vibrios en tejido interno

Muda Eliminación Muerte

Septicemia

Tipos y especies de Vibrio potencialmente CENAIM - ESPOL patógenas en agar TCBS TCBS color colonias

Especie

Verdes

V. vulnificus, V. parahaemolyticus

Verdes luminiscentes

V. harveyi, V. parahaemolyticus

Amarillas

V. alginolyticus, V. parahaemolyticus (10%)

Sin crecimiento

V. peneicida

La forma, y el color no sirve para identificación, ni determinación de patogenicidad Roque, 2006

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VIBRIOSIS

•  Síndrome de la Gaviota –  Letargia, inapetencia, movimientos natatorios desorientados. –  Musculatura opaca y blanquecina, lesiones cuticulares en los extremos ventrolaterales. –  Melanización en filamentos branquiales –  Retraso en coagulación de la hemolinfa, pérdida del color azulado. –  Enrojecimiento de periópodos y pleópodos. –  Mortalidades de hasta 100% entre 1-5 días post-infección

Agente causal: Vibrios sp. V. parahaemolyticus

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NHP

•  Hepatopancreatitis necrotizante •  Signos clínicos –  Anorexia, intestino vacío. –  Crecimiento reducido –  Cromatóforos expandidos (pleópodos, urópodos) –  Mortalidad alta (90%) –  HP pálido, túbulos melanizados, textura suave.

Agente : bacteria Gram (-) intracelular, tipo ricketsias y pleomórfica

Diagnóstico confirmatorio: histología, rep-PCR, sondas moleculares

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RICKETSIAS

–  Bacterias Intracelulares. –  Signos clínicos: 1. Juveniles con crecimiento lento y letárgicos. 2. HP atrofiado 3. HP Blanquecino 4. Músculo opaco Agente causal:

Diagnóstico confirmatorio: MET, rep-PCR

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MICOBACTERIOSIS

–  Areas melanizadas, en tejidos como ovarios , músculos, corazón, branquias,etc. –  Lesiones grandes melanizadas en las cutículas.

Agente causal : micobacterias Diagnóstico confirmatorio: histología, tinciones, rap-PCR

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Otras enfermedades causadas por Microorganismos

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•  Micosis Larvaria –  Lagenidium spp.

•  Micosis adulto

- Fusarium

HONGOS

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Alday and Flegel ,1996

Parásitos y Comensales CENAIM - ESPOL

•  Camarón algodonoso,lechoso

Alday and Flegel ,1996

Parásitos y Comensales

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Microsporideos (“Cotton Shrimp”)

Diagnóstico: • Histopatología (H&E), Giemsa y ácido-resistentes. • Análisis en fresco en frotis o impresiones teñidos con giemsa. • Determinación de especies TEM. • PCR para algunas especies. • Reconocibles algunas especies por el tamaño y cantidad de esporas. Esporas refringentes al microscopio, con flagelo. A.duorara, A. nelsoni y Pleistophora infectan al camarón y reemplazan las células del músculo estriado Agnasoma penaei, infecta: gónadas, corazón, hemolinfa, branquias , hepatopáncreas e intestino, las gónadas se alargan con apariencia opaca, las branquias se inflaman y toman color blanco semejantes a un tumor. En camarones muy afectados, la cutícula tiene una coloración negra azulada Tratamiento: no hay tratamiento efectivo. Reportes en jaibas anticoccídicos de pollos o insectos. Control – eliminación de portadores: peces.

Parásitos y Comensales

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GREGARINAS

Protozoarios del grupo Apicomplexa. Géneros reportados: Nematopsis, Cephalolobus, Paraophioidina Diagnóstico: detección al microscopio de trofozoitos o gametocistos en el intestino medio o en sus contenidos. Signos clínicos: los juveniles afectados reducen su crecimiento, elevación del FCA: Aquellos muy infectados > 100 trofozoitos por cm de intestino medio, muestran signos visibles de una cloración amarillenta en el intestino observable a través de la cutícula de abdomen. Lesiones: en severas infecciones de juveniles, anomalías del epitelio y mucosa del intestino medio, perforaciones. En larvas y PLs, los trofozoitos se aprecian en el intestino. Histológicamente se aprecian en el lumen intestinal, reducción del e hiperplasia.

Parásitos y Comensales

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FOULING

Alday and Flegel ,1996

Parásitos y Comensales

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FOULING Alday and Flegel ,1996

Parásitos y Comensales

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GUSANOS PARASITOS HELMITOS

Helicometrina (tremátodo), 2004

Alday and Flegel ,1996

nimia Del Río-

Parásitos y Comensales

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AMYLOODINIUM Amyloodinium, es un dinoflagelado ectoparásito obligatorio

Carpio, 2007

Textura flácida, problemas de muda, melanización en branquias, nado errático, pérdida de aptito, mortalidad.

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Enfermedades virales en peneidos

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DNA Viruses of Penaeid Shrimp

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WSSV ~130 x 350 nm IHHNV 20 nm

BP, MBV, BMN ~75 x 300 nm

HPV 22 nm

RNA Viruses of Penaeid Shrimp PvNV 28 nm

TSV 30 nm

IMNV 40 nm

Scale Bar divisions are 20 nm

YHV/GAV/LOV ~70 x 180 nm

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Histopatología de enfermedades virales y bacterianas más comunes en Penaeus vannamei F. Panchana Laboratorio de Histopatología Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas

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Herramientas del patólogo

•  Signos externos (Observación macroscópica) •  Histopatología convencional •  Técnicas rápidas de histopatología (tínción rápida de branquias y de hemolinfa) •  Otras herramientas: Microscopía electrónica de transmisión (MET), Inmunohistoquímica, Hibridación In Situ, TUNEL (apoptosis).

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Muestreos

•  Se toman animales vivos o moribundos con claros signos externos de enfermedad. Considerar que los animales muertos sufren rápidas alteraciones post-mortem en los tejidos (muestras no idóneas). •  Fijador: Davidson. Si se desea realizar Hibridación in situ para virus de ARN (TSV, IMNV, YHV), se recomienda otro tipo de fijador (RF-fixative).

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Signos externos más comunes observados en camarones enfermos

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Inanición/Letargia Nado errático Coloración roja o lechosa Manchas blancas Necrosis multifocal Deformidades

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Virus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV): Signos externos

Virus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV):  CENAIM - ESPOL Lesiones observadas en cortes histológicos -  Alta variabilidad de tallas en las Signos más comunes: poblaciones -  Reducción o cese total del crecimiento. Tejidos ectodérmicos Los tejidos más afectados:

• Cordón nervioso • Glándula antenal • Epidermis cuticular

Tejidos mesodérmicos • Gónadas • Tejido hematopoyético • Órgano linfoide • Tejidos conectivos

Virus de la Mancha Blanca (WSSV): CENAIM - ESPOL Signos externos

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WSSV en P. vannamei Signos externos

• Coloración rojiza • Manchas blancas • Nado errático • Tejido epitelial • Tejido conectivo • Epitelio intestino

Tejidos más afectados

• Corazón • Branquias • Glándula antenal • Órgano linfoide • Tejido hematopoyético • Órgano mandibular • Órgano Y

Virus del Síndrome de Taura (TSV): CENAIM - ESPOL Signos externos

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Virus del Síndrome de Taura(TSV) Signos más comunes : Altas mortalidades (70% al 80%) Fase aguda.- poca o ninguna inflamación, células necróticas o agrandadas, inclusiones centrales acidófilas. Fase crónica.- Infiltraciones hemocíticas melanizaciones y colonizaciones bacterianas en la cutícula. Portador sano Tejidos afectados: La Necrosis multifocal (lesión tipo perdigón) se presenta en la cutícula y subcutícula del epitelio general del cuerpo, intestino anterior y posterior, branquias y apéndices.

Cambios a observarse en cortes histológicos CENAIM - ESPOL por TSV en Penaeus vannamei

Virus de la cabeza amarilla (YHV) CENAIM - ESPOL

Signos externos • Palidez en el cuerpo (amarillento), incluyendo las branquias y el hepatopáncreas • Cefalotórax inflamado

Cortes de Órganos Linfoides

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Virus de la Necrosis Muscular Infecciosa (IMNV) en fresco

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Virus de la Necrosis Muscular Infecciosa (IMNV) Signos más comunes : Mortalidades moderadas y persistentes. La necrosis muscular se presenta en uno o varios segmentos abdominales.

Corte histológico de músculo

Corte histológico de músculo

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Baculovirus penaei (BP) Caracteristicas Las infecciones siempre son vía oral Desde etapas juveniles: •  Los síntomas no son específicos. En larvas y postlarvas: • Alta mortalidad. • Disminución en el consumo de alimento • Disminución en el crecimiento Tejidos más afectados • Lumen del estómago • Lumen del Intestino. • Tejido del Hepatopáncreas

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Cortes de hepatopáncreas con Hepatopancreatitis necrótica (NHP) Características • Producida por Bacterias Gram negativas intracelulares tipo rickettsia • Mortalidades 20 - 95% Signos más comunes • Intestino vacío • Crecimiento reducido • Cromatóforos expandidos en urópodos y pleópodos • Hepatopáncreas es pálido de estructura suave, túbulos melanizados, ausencia de lípidos y letargia abdominal.

Vibriosis en Penaeus vannamei CENAIM - ESPOL camarones en fresco: Signos externos

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Vibriosis en Penaeus vannamei Signos externos • Coloración abdominal rojiza • Ulceraciones en la cutícula • Apéndices rojizos • Urópodos rosados Características: • Alta mortalidad • La hemolinfa tarda en coagularse • Marcada actividad fagocítica localizada en el músculo, hepatopáncreas y branquias

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Microsporidios:  signos externos e internos

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Microsporidios

Signos externos • Difícil de identificar • Opacidad (color blanquecino) en segmentos abdominales • Cutícula de color azul oscuro,

Signos internos • Músculo necrosado

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Gregarina Signos externos • Difícil de identificar • Presentan un color amarillento en la parte superior del estómago. • Alta mortalidad

Signos internos • Intestino vacío e inflamado • Reducción en crecimiento

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GRACIAS

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