Gaceta de Ciencias Veterinarias Vol 15 N° 1 pp 11-15

2010

Recibido el 28 de enero de 2011 - Publicado el 30 de mayo de 2011

Niveles Séricos de ALT, AST y su Índice en Ratones (NMRI) Inoculados con Veneno de Crotalus durissus cumanensis de Perfiles Electroforéticos Distintos. Serum Levels of ALT, AST and its Rate in Mice (NMRI) Inoculated with Venom from Crotalus durissus cumanensis with Different Electrophoretic Profile 1*

Pérez-Urrieta M, 2 Noriega-Alvarado J, 3Mogollón Saldivia A, 4 Colmenarez C, 5Marín Barico R, 6Alvarez C. 1 PhD, 2Msc del Área de Bioquímica del Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado",3 Área de Toxicología del Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado", 4 PhD del Área de Bioquímica del Decanato de Ciencias Veterinarias, Universidad Centroccidental "Lisandro Alvarado. 5 Médico Veterinario, 6T.S.U del Laboratorio de Toxicología del Decanato de Ciencias Veterinarias de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. [email protected], Telf. 0251-2592423 Fax. 0251-2592404.

RESUMEN El funcionamiento hepático, contempla entre otras cosas el uso de biomarcadores como son las enzimas Fosfatasa Alcalina (FA), Gamma Glutamil Transpeptidasa (GGT), Aspartato Amino Transferasa (AST), Alanina Amino Transferasa (ALT), 5´nucleotidasa y Lactato Deshidrogenasa (LDH). Si se toma en cuenta que las mordeduras de serpientes han sido catalogadas como un problema de salud pública, se plantea como objetivo de esta investigación, determinar las concentraciones séricas de AST, ALT y su relación en ratones inoculados con veneno de dos serpientes Crotalus durissus cumanensis con perfiles electroforéticos distintos en cuanto al numero de bandas. Los resultados no arrojaron diferencia significativa entre el efecto de los dos venenos a nivel de las enzimas estudiadas, sin embargo al comparar con el grupo control los niveles de las transaminasas, en ambos casos, se evidenció que este órgano es susceptible a la acción toxica del veneno de cascabel. Este trabajo representa un aporte para el conocimiento de la toxicidad de los venenos de crotalus en nuestro país; lo cual permite establecer mejores protocolos clínicos en el tratamiento de las mordeduras. Palabras claves: veneno, crotalus, enzimas hepáticas.

ABSTRACT The study of the liver operation includes the use of biomarkers like the Alkaline Phosphatase (AP), Gamma Glutamyltranspetidase (GGT), Alanine Amino Transferase (ALT), Aspatate Amino Transferase(AST), 5´Nucleotidase, and Lactate Deshydrogenase (LDH). Taking in count that the snake bites had been Catalogued a public health problem, the purposed of this investigation was Determinate the sum concentration of AST, ALT and its rate, in mice inoculated With two venoms from Crotalus durissus cumanensis with different Electrophoresis profiles in the numbers of bands. The results didn't show significative different between the effect of the two venoms in the level of the enzymes, however, at comparated with the control group the levels of the transaminases, in both cases, show that the liver is susceptible to the rattle snake venom. This work represents a contribution for the best now of the toxicity of the crotalus venoms in our country, and let establish better protocols for the treatment of the snake´s bites. Clue words: venom, crotalus, liver enzymes.

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Transaminasas (ALT, AST), veneno de

INTRODUCCIÓN

Crotalus. durissus. cumanenses

sistema miniproteanII Bio-RadR®. Se inocularon 60 ratones de la cepa NMRI, divididos en 3 grupos: dos grupos experimentales a los cuales se les inyecto vía intraperitoneal veneno de las serpientes V1 (grupo V1) y de la serpiente V9 (grupo V9), a dosis de 0,75mg/ kg/ratón en 50?l de NaCl al 0,9%, y un grupo control inoculados con 50?l de NaCl al 0,9%. Cada grupo a su vez se subdividió en 4 subgrupos de 5 ratones, para extraer muestras de sangre a las (3, 6, 12 y 24 horas) post inyección del veneno, mediante incisión en la cola. Al suero se le realizaron las siguientes determinaciones enzimáticas: Aspartato Amino Transferasa (AST), Alanina Amino Transferasa (ALT), mediante kit comercial marca INVELAB® en un fotocolorímetro OMEGA IV®. Los resultados de la determinación enzimática se analizaron con Anova para detectar variaciones significativas por efecto del veneno en los distintos tiempos post inoculación y se realizo una comparación de medias para detectar posibles diferencias significativas, todo esto utilizando el programa estadístico SPSSR. [8].

En Venezuela se han descrito una gran cantidad de serpientes venenosas causantes de los accidentes ofidicos; entre ellas la serpiente del género Crotalus, esta implicada en el 30% de los casos de envenenamiento [1]. Los venenos de estos animales tienen como característica principal ser una mezcla de componentes con diversos efectos en la víctima; debido a esto, el cuadro clínico que se presenta en mordeduras por ofidios es de gran complejidad, estos componentes son principalmente proteínas [2], [3], causantes de los daños tisulares, en diferentes tejidos como el cardíaco y el hepático entre otros, [4]. Tomando en cuenta que un marcador bioquímico representa un paso importante en el modelo curativo de cuidado del paciente hacia el pronóstico preventivo y medicina predictiva, la integración de un biomarcador dentro del manejo de la práctica clínica, debe estar determinado por la evolución del desarrollo y regulación de los paradigmas centrados en la validación analítica, calificación clínica, y la evidencia basada en la practica dentro de rigurosos diseños clínicos, metodologías analíticas y evaluación estadística, por esta razón el estudio de casos clínicos y el efecto sobre marcadores fáciles de determinar representan un aporte en la evolución de la medicina clínica [5]. Dentro de los marcadores mas utilizados para evaluar lesiones a nivel del tejido hepático están las transaminasas: Aspartato Amino Transferasa (AST) y Alanina Amino Transferasa (ALT), Gamma Glutamil Transpeptidasa (GGT), Bilirrubina Total y Fraccionada, Fosfatasa Alcalina (FA), Proteínas Totales, Factores de Coagulación, y la relación AST/ALT, todos utilizados como un métodos no-invasivos, que provee información útil en relación a la causa y la severidad de la enfermedad hepática [6] [7]. En base a lo expuesto, se planteó como objetivo de este estudio determinar las concentraciones séricas de AST, ALT y su relación en ratones inoculados con veneno de dos serpientes Crotalus durissus cumanensis con perfiles electroforéticos distintos en cuanto al numero de bandas proteicas.

RESULTADOS La figura 1 muestra el revelado de la electroforesis, el cual sugirió un aproximado de 12 bandas para el veneno de V1 y 7 bandas para el veneno de V9; se observó una banda más intensa en V1, ubicada entre las bandas de 70 y 50 KDa comparando con el patrón de peso molecular, la cual no se manifiesta en el veneno de V9. Posiblemente este apilamiento corresponda a diversas bandas de proteínas que no aparecen en la V9, en su lugar se observo una banda tenue que ocupaba la misma posición en el gel. FIGURA 1. Electroforesis en gel de poliacrilamida (15%) de venenos de Crotalus durissus cumanensis

PM 210 140 100 70 50 35 24 20 15 7

MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizo veneno de serpientes Crotalus durissus cumanensis, pertenecientes al Serpentario del Laboratorio de Toxicología del Decanato de Ciencias Veterinarias a los cuales se le practicó una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS/PAGE: dodecilsulfato/poliacrilamida-gel-electroforesis), en condiciones reductoras, en geles al 15%, usando el

Bolsillo:1 2

3

4

5

6

7

8

9 10

Bolsillos 1: Patrón de peso molecular; 2: veneno V1; 6: veneno V9; 3, 4, 5, 7, 8, 9 y 10: venenos de otras serpientes

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Pérez-Urrieta M, Noriega-Alvarado J, Mogollón Saldivia A, Colmenarez C, Marín Barico R, Alvarez C.

En la Figura 2 se observa un aumento significativo (P< 0,05) en los niveles séricos de AST en los grupos experimentales con respecto al control. Este aumento para el grupo V1 fue progresivo y significativo entre las 3 y 6 horas post-inyección del veneno y altamente significativo (P< 0,01) entre las 12 y 24 horas, con un pico máximo a las 24 horas (1345.5 +/-147.9 U/L). Para el grupo V9 no hubo diferencia significativa a las 3 horas post inoculación, sin embargo fue altamente significativo (P< 0,01) entre las 6 horas y 24 horas post-inoculación, con un pico máximo de elevación de los niveles de AST a las 6 horas (1696.4 +/- 643.0 U/ L). El efecto de los venenos de las serpientes V1 y V9 sobre los niveles de AST, sólo mostraron diferencia significativa entre ellos a las 3 horas post inoculación, aun cuando los niveles de AST bajo efecto del veneno V9 mostraron máxima elevación a las 6 horas y el veneno de V1 a las 24 horas.

índice AST/ALT hubo diferencia significativa en el grupo V1 a todas las horas del estudio con respecto al grupo control y entre las 6 y 12 horas para el grupo V9. A las 3 horas hubo diferencia significativa entre los grupos V1 y V9, lo cual puede ser indicativo de un efecto más severo y extenso del veneno empleado en el grupo V1 sobre el tejido hepático en los ratones inoculados. Figura 3. Niveles Séricos de la Enzima Alanina Amino Transferasa (ALT) En Ratones NMRI Inoculados con Veneno de dos Serpientes Crotalus durissus cumanensis con Distintos Perfil Electroforético (V1 Y V9)

ALT/UL

300

AST U/L

b b

b

b b

a

a

a

a

v1 v9

a

6

12

24

Horas post inyección

Los datos representan la media +/- la Desviación Estándar, n= 5 Letras distintas: Diferencia significativa respecto al control (p