Producción de etanol a partir de jugos henequén (Agave fourcroydes Lem.) y melaza por una mezcla de dos levaduras Resumen En el proceso de fermentación de henequén (Agave fourcroydes Lem.) Se estudió el jugo de hojas, complementado con melaza industrial, el uso de un inóculo compuesto de dos levaduras: Kluyveromyces marxianus (aislado de la planta de henequén) y Saccharomyces cerevisiae (cepa comercial). Se obtuvo una producción de etanol de 5,22 ± 1,087% v / v. Contrario a lo esperado, se observó una disminución en la producción de etanol con el uso de la cepa K. marxianus. Los mejores resultados se obtuvieron cuando una mezcla de 25% K. marxianus y el 75% de S. cerevisiae o S. cerevisiae se usaron con una concentración del inóculo inicial de 3 x 107 células mL-1. Además, fue posible detectar una concentración final de aproximadamente 2 4 g L-1de azúcares reductores que no son metabolizados por las levaduras para la producción de etanol. Estos resultados muestran que aunque el uso de una mezcla de levaduras puede ser de interés para la producción de bebidas alcohólicas, puede ser lo contrario en el caso de la producción de etanol para uso industrial donde la manipulación de dos cepas puede elevar los costos de producción. 1. Introducción El etanol es uno de los combustibles más importantes de fuentes renovables que se encuentran actualmente en la producción a precios competitivos. En Brasil, se obtiene de la caña de azúcar y en los EE.UU. a partir del maíz. Sin embargo, la producción actual no es suficiente para satisfacer la demanda de energía. Otra estrategia consiste en el uso de residuos agrícolas con alto contenido de celulosa y lignina (Olsson et al., 2001; Zacchi et al., 2006). Sin embargo, estos procesos tienen una desventaja en que requieren un paso adicional que es la sacarificación de los materiales lignocelulósicos, una etapa más difícil que la utilización directa de la sacarosa, como en el caso de la caña de azúcar o la sacarificación del almidón de maíz. Para la producción de etanol como una bebida alcohólica, varias materias primas han sido explotadas durante siglos, incluyendo los agaves, que en México se han utilizado para producir bebidas fermentadas y Tequila. En la región de Yucatán, una especie de agave ya ha sido objeto de uso industrial y también se puede utilizar para producir etanol. Henequén (Agave forucroydes Lem.) Es una planta perteneciente a la familia Agavacea la cual pertenece a la región norte de la península de Yucatán y ha sido utilizada desde la época maya, para obtener fibras naturales de sus hojas. Este cultivo ha contribuido a la importancia económica de la región a comienzos del siglo 20, pero su explotación industrial comenzó a declinar en la década de 1980 con el advenimiento de las fibras sintéticas.

Todavía se cultivan hoy en día con una producción de 5000 toneladas de fibra en el año 2005. Para lograr esta producción, se procesaron aproximadamente 250 millones de hojas, produciendo casi 75 millones de litros de un jugo verde esmeralda irritante que contiene metabolitos comunes a los Agavaceas (Blunden et al., 1986; Ding et al., 1989; Sánchez-Marroquín y Hope, 1953). Este jugo ha sido objeto de anteriores estudios debido a su contenido de saponina esteroideos (principalmente heconin y tigonin) y azúcares (producción de alcohol). Su composición química se muestra en la Tabla 1. Los azúcares que pueden ser convertidos en etanol de henequén provienen de polímeros de fructosa con una molécula de glucosa terminal conocida como la inulina y oligofructans y que han sido estudiadas en el agave tequilero (López et al., 2003) y más recientemente en henequén (GarcíaAlbornoz, 2006). Larqué et al. (2004) patentó un proceso de obtención de etanol a partir del jugo del tallo y de las hojas de esta planta, en la que se determinaron los parámetros del proceso de fermentación. En su investigación, sólo se utilizó una levadura (Saccharomyces cerevisiae). Otras levaduras se han aislado de la planta y estudiado para determinar la producción de alcohol de cada una (datos no publicados). Entre estas levaduras, una cepa de Kluyveromyces marxianus (denominada CICY-Ki) dio mayores rendimientos (1,45 g L-1 h-1; Tzec-Gamboa, M. Sc., Tesis, 2006). Esta levadura es conocida por su resistencia a las altas temperaturas y su producción de alcohol (Gough et al., 1996; Kourkoutas et al., 2002) además de ser una fuente importante de proteínas (Ala et al., 2003). TABLA 1 Composición química del jugo de hojas de henequén

Se han comunicado casos en la literatura sobre el uso de co-cultivos para mejorar la fermentación y llevar a cabo dos o más transformaciones en un solo paso (Abouzied y Reddy, 1987). En la industria de las bebidas alcohólicas, el uso de levaduras autóctonas se considera más deseable ya que se adaptan a los sustratos y por lo general producen metabolitos secundarios que son responsables del aroma y el sabor de la bebida, aunque los rendimientos suelen ser muy bajos (Fleet, 2003; Cedeño-

Cruz, 1995). Con henequén, aunque la producción de alcohol a partir de los tallos para derivar en una bebida es comercialmente explotable, sin embargo, esto no es el caso para la producción de etanol como combustible. En investigaciones anteriores llevadas a cabo por nuestro grupo, se encontró que la producción de etanol obtenida a partir de jugo de las hojas fue relativamente baja, 2,72% v / v (Volumen de etanol por volumen de caldo de fermentación) cuando la fermentación se realizó con CICY-Ki, en comparación con 6-8% obtenidos en la industria azucarera mexicana, donde las fermentaciones se llevan a cabo con la levadura S. cerevisiae y melaza como sustrato. Cuando S. cerevisiae se utilizó para fermentar el jugo de hoja de henequén, se obtuvo una producción de etanol de 4-5% v / v. Con estos datos preliminares se propuso una mezcla de estas levaduras para mejorar los rendimientos. También fue posible determinar que el jugo de las hojas de henequén contiene azúcares que pueden ser metabolizadas para producir alcohol, pero sin la concentración suficiente para obtener rendimientos aceptables, por lo tanto, se añadieron melazas industriales. Por lo tanto, las materias primas para la producción de etanol como combustible son dos residuos industriales: jugo de la hoja de henequén producida por la industria de fibras naturales y la melaza producida por la industria azucarera.

2. Métodos 2.1. Extracción del jugo de henequén Para obtener el jugo, las hojas de henequén se recolectaron de las instalaciones de producción en el municipio de Baca, en el estado de Yucatán. En el laboratorio, las hojas se lavaron y se extrajo el jugo haciéndolos pasar por un molino de tres masas en el que las hojas se prensan. Se obtuvo un jugo verde esmeralda el cual después se filtró para eliminar los sólidos en suspensión. Se midió la cantidad de sólidos solubles y azúcares reductores. Posteriormente, el jugo se esterilizó a 121 º C durante 1 hora a una presión de 1 atm para hidrolizar parcialmente la inulina. 2.2. Cepas de levadura La levadura CICY-Ki fue aislada de la base de la hoja de henequén siguiendo los procedimientos clásicos microbiológicos y fue después caracterizada por pruebas fenotípicas y moleculares (Pérez-Brito et al., 2007). La levadura S. cerevisiae se obtuvo en un almacén comercial (marca Safoeno Safmex SA de CV, México). Ambas levaduras se cultivaron en placas de Petri, en YPGA medio que contiene: glucosa (20 g L-1), extracto de levadura (5 g L-1), peptina (10 g L-1) y agar (20 g L-1) y se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad. Los cultivos se recolectaron en agua estéril y se mantuvieron a 4 º C hasta su uso. Se midieron la concentración y la viabilidad de las suspensiones celulares (Por tinción (teñir) con azul de metileno).

2.3. Preparación del inóculo Con el uso de inóculos mezclados, los porcentajes de la proporción CicyKi/Saccharomyces se ajustaron a 0 / 100, 25/75, 50/50, 75/25 y 100 / 0 de cada cepa, manteniendo la misma concentración inicial de 3x 107 ml de células mL-1 en cada caso. El volumen de inóculo fue de 200 ml, y el medio se preparó de la misma forma que los sustratos de las fermentaciones correspondientes. Los inóculos se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad y a 200 rpm durante 24 h. 2.4. Condiciones de fermentación Las fermentaciones se realizaron en frascos de vidrio con un volumen de trabajo de 2 L (incluido el inóculo). El sustrato compuesto por el jugo de las hojas de henequén hidrolizado diluido al 6, 8 y 10 grados Brix (ºBx) con agua destilada. La escala Brix se utiliza en la industria del azúcar y de elaboración de vino para indicar el porcentaje de azúcar en peso en una solución, en nuestro caso los sólidos solubles presentes en el jugo de henequén no eran sólo azúcares, sino también otros compuestos aún no identificados (Ácidos orgánicos, saponinas, entre otros). Era necesario diluir el jugo a medida que la concentración de sólidos solubles varía entre 6 y 12 ºBx aproximadamente según la época del año. (En experimentos preliminares se encontró que 12 ºBx tiene el máximo de sólidos solubles obtenidos en el jugo de henequén de la hoja.) Con el fin de establecer una concentración constante inicial de sólidos solubles, las tres diluciones se complementaron con melaza industrial hasta que se alcanzó 12 ºBx en todos los casos. Se agregó sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a una concentración de 1,5 g L-1. El pH no se ajustó pero se midió como el jugo de henequén siempre tiene un valor de pH de 4,7 ± 0,2. Después de la inoculación, las fermentaciones se incubaron a 35 ± 2 º C en la oscuridad, sin agitación, y se tomaron muestras cada 12 h para vigilar la evolución del proceso de fermentación. La concentración de sólidos solubles de las muestras se midió cada 12 h, y los azúcares reductores se analizaron tanto en el inicio como en la finalización de la fermentación. Los experimentos anteriores confirmaron que la concentración de sólidos solubles se estabiliza en su punto más bajo entre 46 y 48 h, y la formación de espuma también cesa en este punto. Nuestras fermentaciones se realizaron durante un período de 48 h.

2.5. Destilación fraccionada Este proceso se realizó a presión atmosférica usando una columna Vigreux. Tres fracciones fueron recogidas. La primera correspondiente a los compuestos obtenidos a temperaturas comprendidas entre 45 y 77 º C, esto se llamó la cabeza. La segunda fracción se llamó cuerpo y se recogió a temperaturas entre 78 y 85 º C. Por último, la tercera fracción se llamaba cola y se recogió entre 89 y 95 º C. Los volúmenes de cada fracción se registraron.

2.6. Los métodos de análisis La concentración de sólidos solubles (ºBx) se determinó con un refractómetro portátil (Cole-Palmer). Los azúcares reductores fueron analizados por el método DNS (Miller, 1959). Este método colorimétrico prueba para detectar la presencia del grupo carbonilo libre (C=O) en la molécula de carbohidratos. Esto implica la oxidación del aldehído o un grupo funcional de cetona y el ácido 3,5dinitrosalicílico (DNS) se reduce a 3-amino, 5 nitrosalicylic bajo condiciones alcalinas. Las concentraciones de azúcares reductores se calcularon utilizando una curva de calibración y leyendo la absorbancia de las muestras a 550 nm. La concentración de etanol se determinó para todas las fracciones recogidas de la destilación por el método del dicromato (Williams y Reese, 1950). Este método de oxidación química está basado en la oxidación completa del etanol por dicromato en la presencia de ácido sulfúrico con la formación de ácido acético. Dicromato (Cr2O7-2) es de color amarillento y el producto crómico reducido (Cr + + +) es de color verde intenso. Se hizo una curva de calibración con etanol puro a diferentes concentraciones y la absorbancia de las muestras se leyó a 490 nm. La producción (rendimiento) de etanol se calculó como el porcentaje (v / v) de etanol presente en el cuerpo fracción por volumen de caldo de fermentación. 2.7. Análisis estadístico Todas las fermentaciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. El programa estadístico SAS (SAS Institute, 1985, SAS guía de usuario: Estadísticas, versión 5 ed. Gary, NC) fue utilizado para analizar los datos experimentales. Los valores con la misma letra no son significativamente diferentes (p