QUANTA Lite® LKM-1 ELISA

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Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto

Aplicación QUANTA Lite® LKM-1 es un ensayo basado en la técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la detección semicuantitativa de anticuerpos contra LKM-1 en el suero humano. La presencia de anticuerpos contra LKM-1 puede servir, junto con hallazgos clínicos y otras pruebas de laboratorio, como ayuda en el diagnóstico de la hepatitis autoinmune del tipo 2.

Sumario y Explicación de la prueba La hepatitis autoinmune (HAI) es una enfermedad heterogénea de etiología desconocida.1 La hepatitis autoinmune tipo 1 (HAI lupoide) es la más común y se caracteriza por su reactividad con antígenos antinucleares (ANA), antimúsculo liso (SMA) y antiactina. La hepatitis autoinmune tipo 2 (HAI-2) se caracteriza por la presencia de anticuerpos antimicrosomales de hígado o riñón (LKM-1) detectados en secciones de tejido de riñón e hígado de roedor mediante inmunofluorescencia indirecta. La reactividad del LKM-1 se distingue por la tinción del citoplasma del hepatocito y de los túbulos renales proximales, pero no distales. Los pacientes afectados de HAI del tipo 2a suelen ser mujeres jóvenes, con enfermedad severa, bajos niveles de IgA, que responden bien al tratamiento inmunosupresor y dan negativo en el virus de hepatitis C (VHC).1,2 El antígeno más importante al que se dirigen los anticuerpos contra LKM-1 se identificó como citocromo P450 2D6, una proteína microsomal del retículo endoplásmico.3-6 Se conoce la presencia de anticuerpos contra LKM-1 en hasta el 8% de los pacientes con infección crónica por VHC.2,3,7-9 Los epitopos reconocidos en el suero de pacientes con VHC son diferentes a los reconocidos en caso de HAI-2, y puede tratarse de autoanticuerpos producidos durante la infección crónica por VHC antes que de la verdadera HAI del tipo 2.6,7,10,11 Por lo general, los pacientes positivos en LKM-1 y VHC son hombres de mayor edad y sus niveles de anticuerpos contra LKM-1 suelen ser menores que los pacientes con HAI-2a.1,2 Los pacientes que dan positivos en VHC y LKM-1 pueden presentar una situación compleja para los médicos, ya que los tratamientos para VHC y HAI-2 difieren sobremanera.9,11,12 Además de los anticuerpos contra LKM-1, se conocen anticuerpos contra el citocromo P450 2C9 (LKM-2) asociados con la hepatitis inducida por ácido tienílico y anticuerpos contra la uridina difosfoglucuronil transferasas (LKM-3), que se asocian a la infección por hepatitis D.3 Se observan, según algunos estudios, anticuerpos contra el antígeno soluble hepático (SLA) o el antígeno hepático pancreático (LP) en algunos pacientes con HAI que dan negativo en otros autoanticuerpos, por lo que pueden describirse como otro subgrupo de HAI.1

Procedimiento de trabajo El antígeno del citocromo P450 2D6 humano recombinante, parcialmente purificado y de cadena completa se une a los pocillos de la placa de poliestireno en condiciones que preservan el antígeno en su estado original. Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti LKM-1 al antígeno que los recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. El ensayo puede ser evaluado fotométricamente comparando la intensidad de color en las muestras con la de los controles.

Reactivos 1.

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Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con el antígeno del citocromo P450 2D6 humano recombinante, parcialmente purificado (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos humanos anti LKM-1, prediluido, 1.2 ml Control ELISA LKM-1 Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos a citocromo P450 2D6 humano recombinante, prediluido, 1.2 ml Control ELISA LKM-1 Positivo Fuerte, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con anticuerpos a citocromo P450 2D6 humano recombinante, prediluido, 1.2 ml Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampón con Tris, Tween 20 y conservante, 50 ml Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampón con Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección “Metodología” para instrucciones de dilución. Conjugado HRP IgG, con anti- IgG humana de cabra, 1 frasco - color azul conteniendo tampón, estabilizante de proteína y conservante, 10ml Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 ml

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Advertencias 1. 2.

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Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles LKM-1 ELISA positivo fuerte, LKM-1 ELISA positivo débil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.13 Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos.

Precauciones 1. 2. 3. 4.

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9.

Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar lugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de técnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. El sellado incompleto de la bolsa “zip-lock” que contenga tiras sin usar y desecante provocará la degradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de un conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para este producto para evitar que esto ocurra. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el laboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos.

Condiciones de Almacenaje 1. 2. 3.

Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8°C.

Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento CLSI (NCCLS) H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse.

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Procedimiento Materiales Suministrados 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Microplaca LKM-1 ELISA (12-1 x 8 pocillos), con soporte 1.2 ml control prediluido negativo ELISA 1.2ml control prediluido LKM-1 ELISA Positivo Débil 1.2ml control prediluido LKM-1 ELISA Positivo Fuerte 50ml Diluyente de muestra HRP 25ml Solución de lavado concentrada 40X 10ml Conjugado IgG (cabra) anti IgG humana 10ml Cromógeno TMB 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M)

Material necesario no incluido Micropipetas para 5, 100, 200-300 y 500µl Puntas desechables para micropipeta Tubos para dilución de muestras, 4ml Agua destilada Recipiente de 1L para la solución de lavado reconstituida Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud de onda)

Metodología Antes de empezar 1. 2.

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4.

Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26°C) y agitar. Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución de lavado añadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. El tampón diluido es estable 1 semana a 2-8°C. Preparar una dilución 1:101 de cada muestra a procesar añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente. Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparación. NO DILUIR los controles LKM-1 ELISA positivo débil, positivo fuerte y ELISA negativo. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti LKM-1 usando unidades arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado.

Procedimiento de Ensayo 1.

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TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) ANTES DE EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposición a la humedad. Agregar 100µl de los controles prediluidos LKM-1 ELISA Positivo Débil, LKM-1 ELISA Positivo Fuerte, ELISA Negativo y las muestras prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana. El tiempo de incubación empieza después de la adición de la última muestra. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300µl de solución de lavado a todos pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Es importante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras. Agregar 100µl de Conjugado IgG HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones más asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso 2. Lavado: Repetir el paso 3. Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización que la efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos. Leer la absorbancia (DO) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia.

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Control de Calidad 1.

2.

3.

4.

Los controles LKM-1 ELISA Positivo Débil, LKM-1 ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo ELISA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionan correctamente. El usuario debe notar que debido a que los controles LKM-1 ELISA Positivo Débil, LKM-1 ELISA Positivo Fuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución de especímenes. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararse controles válidos haciendo alícuotas de un “pool” de suero humano que debe almacenarse a < -20°C. Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados a continuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y repetirse. a. La absorbancia del control LKM-1 positivo debe ser superior a la del control LKM-1 positivo débil y la de este debe ser superior a la del control negativo. b. El control LKM-1 positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la del control negativo no debe exceder de 0.2. c. La absorbancia del control LKM-1 positivo débil debe ser superior al doble del control negativo, u oscilar entre 0.25. d. Los controles ELISA negativo y LKM-1 positivo fuerte están pensados para monitorizar problemas de reactivo de magnitud substancial. El control LKM-1 positivo fuerte no puede asegurar precisión alguna en el punto de corte del ensayo. e. El usuario puede referirse al documento CLSI (NCCLS) (National Committee of Clinical Laboratory Standards) C24-A para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio.

Cálculo de Resultados Debe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. La reactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por la densidad óptica promedio del control LKM-1 positivo débil. DO Muestra Valor de la Muestra = —————————————————— x Valor ELISA Positivo Débil (unidades) DO ELISA Positivo Débil (unidades) La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente. Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán en el aumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por ejemplo, al doblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una cuantificación más precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de la muestra la última dilución positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.

Interpretación de los Resultados La técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes. La muestra puede clasificarse con un valor negativo, equívocos o positivo según la tabla siguiente. Unidades Negativo 25 Las muestras calificadas como equivocas deben ser analizadas de nuevo antes de informarlas. 1. 2.

3. 4.

5.

Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos IgG contra el citocromo P450 2D6 humano recombinante y sugiere la posibilidad de hepatitis autoinmune tipo 2. No es posible evaluar el estado de anticuerpos en un espécimen con niveles dudosos de IgG LKM-1. Si los resultados continúan siendo dudosos luego de repetidas pruebas, el resultado se debe comunicar como dudoso o se debe tomar otra muestra. Un resultado negativo indica que no existen anticuerpos IgG contra LKM-1 o que el nivel es inferior al mínimo negativo del ensayo. Se entiende que los especímenes que presentan valores de DO superiores al rango de lectura del lector de la placa son mayores que la DO más alta mensurable, dividida por la DO positiva débil y multiplicada por 25, o bien se pueden volver a diluir para repetir el ensayo y obtener un valor calculado. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientes resultados se obtuvieron con el kit INOVA QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgG no puede correlacionarse con un punto final”.

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Limitaciones del Procedimiento 1. 2. 3. 4. 5.

6. 7.

Un resultado negativo de LKM-1 no descarta la presencia de hepatitis autoinmune tipo 2. Un resultado negativo de anticuerpos contra LKM-1 no descarta su presencia, dado que la concentración del anticuerpo puede ser inferior al límite de detección del ensayo. Un resultado positivo de la prueba sólo indica la presencia de anticuerpos contra el citocromo P450 2D6 humano recombinante y no necesariamente la existencia de hepatitis autoinmune tipo 2. El diagnóstico de hepatitis autoinmune tipo 2 requiere la consulta de otra documentación del paciente: datos demográficos, presentación clínica y otras pruebas de diagnóstico. Pueden detectarse anticuerpos contra LKM-1 en unos pocos pacientes como consecuencia de la infección por VHC; luego, no tiene por qué ser consecuencia de la HAI-2. Los especímenes positivos en LKM-1 se deben someter a pruebas para detectar la posible infección por VHC. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.

Valores Esperados La incidencia de hepatitis autoinmune tipo 2 se estima en cinco a 30 casos por millón. La enfermedad es más común entre los 2 y los 14 años, y más frecuente en mujeres que en hombres (8:1).14,15

Rango Normal Se sometió a prueba un panel de 194 especímenes recolectados a partir de 151 adultos y 43 niños con el conjunto QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Un espécimen dio resultado dudoso fronterizo (20.7 unidades). Los 193 restantes se interpretaron como negativos. Excluyendo el espécimen dudoso, la especificidad fue del 100% (193/193). El valor medio para esta población fue de 6.3 unidades; la mediana, de 5.7 unidades; y el valor más alto, de 20.7 unidades. La edad de los individuos iba de uno a 75 años.

Características específicas Estudios clínicos En el primer estudio, se reunió y sometió a prueba un panel de 84 especímenes clínicamente definidos en un sitio clínico externo. Los detalles de los especímenes sometidos a la prueba y los resultados del estudio se resumen en la Figura 1. QUANTA Lite® LKM-1 ELISA demostró una sensibilidad del 100% (22/22) con los especímenes que eran positivos para hepatitis autoinmune tipo 2, positivos para IFA LKM-1 y negativos para VHC. Se conoce que los niveles de reactividad del LKM-1 son bajos en el caso de pacientes positivos para VHC. QUANTA Lite® LKM-1 ELISA detectó que el 70% (14/20) de un grupo seleccionado de especímenes LKM-1, IFA+/VHC+ daban positivo en dicho ensayo. QUANTA Lite® LKM-1 ELISA fue específico en un 100% (34/34) de los 34 especímenes positivos para IFA, LKM-1, pero que clínicamente no eran positivos para HAI-2 ni para VHC. Además, tres pacientes LKM-2 y cinco pacientes LKM halotano positivos dieron negativos en el ensayo QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. Un segundo estudio externo examinó un panel compuesto por cuatro pacientes con HAI-2 documentada (edades: 2, 2, 4 1/2 y 6 años) y 41 especímenes con otras enfermedades autoinmunes y hepáticas. Los cuatro primeros se interpretaron como positivos. Tres especímenes positivos para VHC fueron positivos para ELISA LKM-1 y IFA, y uno dio positivo sólo con ELISA LKM. Tres especímenes positivos para VHC fueron positivos para IFA LKM-1 y ELISA, y uno dio positivo sólo con ELISA LKM. Consulte el apartado de “reactividad cruzada” para comprobar otros especímenes sometidos a la prueba. Figure Figura11 QUANTA LITE LKM-1 ELISA Especímens Clínico 140 120

U N I D A D E S

100 80 60 40 20 0

LKM-1 Positivo Autoimmune Hepatitis 2 positivo VHC negativo n=22

LKM-1 Positivo VHC positivo n=20

LKM-1 Positivo - NO Autoimmune Hepatitis 2 -VHC negativo n=34

LKM-2 Positivo n=3

LKMHalotano positivo n=5

El estudio interno reunió y sometió a prueba un panel combinado de 79 especímenes de laboratorios de referencia y especímenes de nuestro archivo. Los resultados de la prueba con QUANTA Lite® LKM-1 ELISA e IFA LKM-1 se resumen en la Tabla 1. Tabla 1 n=79 LKM-1 IFA POS EQ NEG QUANTA LITE® POS 41 1 1 LKM-1 ELISA EQ 0 0 0 NEG 5 7 24 Coincidencia general = 91.5% (65/71) [se excluyen los resultados dudosos] 5

Estudio de reactividad cruzada Se evaluaron especímenes de varios grupos clínicos para estudiar la posible reactividad cruzada con QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. El resultado se presenta en la Tabla 2. Tabla 2: Estudio de reactividad cruzada Grupo de pacientes n= Pos Eq. Neg VHC * 40 5** 0 35 LKM-2 3 0 0 3 LKM halotano 5 0 0 5 Antígeno soluble hepático (SLA) 5 0 0 5 Hepatitis autoinmune tipo 1 15 0 1 14 Enfermedad de Crohn 6 0 0 6 Colitis aguda 1 0 0 1 Cirrosis (una alcohólica y una sin especificar) 2 0 0 2 Cirrosis biliar primaria 1 0 0 1 Crioglobulinemia 3 0 0 3 Esteatohepatitis no alcohólica 1 0 0 1 Pancreatitis postobstructiva 1 0 0 1 Enfermedad celíaca 1 0 0 1 Escleroderma 1 0 0 1 Enfermedad de Addison (pos. suprarrenal) 1 0 0 1 Anticuerpo contra las células de los islotes (ICA) 2 0 0 2 Ácido glutámico descarboxilasa (GAD) 2 0 0 2 AMA 8 0 0 8 SMA 3 0 0 3 TPO 9 0 0 9 Sm 1 0 0 1 RNP 1 0 0 1 SS-A 1 0 0 1 SS-B 1 0 0 1 Scl-70 1 0 0 1 Jo-1 1 0 0 1 Ribosoma P 1 0 0 1 Cromatina 1 0 0 1 PCNA 1 0 0 1 ANA/ADN 9 0 0 9 Centrómero 1 0 0 1 * Especímenes positivos para VHC (no seleccionados para reactividad con IFA LKM-1) ** 4/5 son positivos con IFA LKM-1

Precisión y Reproducibilidad El rendimiento dentro del ensayo se evaluó probando un total de doce veces seis especímenes: un negativo, un dudoso, un positivo fronterizo, un positivo débil, un positivo moderado y un positivo fuerte. El resultado se presenta en la Tabla 3. Tabla 3 Sera 1 Sera 2 Sera 3 Sera 4 Sera 5 Sera 6 Mean 61.7 13.5 4.9 12.9 43.6 66.2 S.D. 2.6 0.8 0.3 0.4 0.8 2.8 C.V.% 4.2 5.8 5.3 3.2 1.8 4.3 El rendimiento entre ensayos se evaluó sometiendo a prueba 10 especímenes, que incluían muestras de negativos y de positivos débiles, moderados y fuertes, hasta seis veces en tres días: dos ensayos al día, uno por la mañana y otro por la tarde. Los resultados, resumidos en la Tabla 4, muestran un CV de un 5% o menos en todos los especímenes con valores de prueba iguales a 5.5 o mayores. Tabla 4 Sera 1 Sera 2 Sera 3 Sera 4 Sera 5 Sera 6 Sera 7 Sera 8 Sera 9 Sera 10 Mean 58.0 3.2 65.8 5.1 50.2 46.9 4.4 48.5 44.2 5.4 S.D. 1.4 0.7 2.7 0.7 1.2 2.4 0.8 2.2 2.2 0.8 C.V.% 2.3 22.7 4.1 14.1 2.5 5.1 17.6 4.5 4.9 14.2 La reproducibilidad entre laboratorios se evaluó a partir de la comparación de los resultados obtenidos en el panel desconocido formado por 20 miembros en el segundo sitio clínico externo y los resultados obtenidos con anterioridad en INOVA Diagnostics. El análisis de regresión demuestra una excelente coincidencia con un valor R2 de 0.99.

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Linealidad Las diluciones de tres especímenes demostraron que el ensayo mostraba una buena linealidad cuando se realizaron las pruebas para diluciones de 1:50 a 1:51.200 (Figura 2). Figura 2

ENSAYO DE LINEALIDAD TM QUANTA LITE LKM-1 ELISA

y = -9.6737x + 75.098 2

R = 0.988

Unidades

100.0 90.0 80.0 70.0

y = -11.896x + 103.04 2

R = 0.9878

60.0 50.0 40.0 30.0

y = -12.163x + 75.67

20.0

R = 0.9976

2

1:1600

1:800

1:400

1:200

1:100

1:50

Dilution

Referencias 1. 2. 3.

4. 5. 6. 7.

8. 9.

10. 11.

12.

13. 14. 15.

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