QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA

708720

Para Diagnóstico In Vitro Complejidad de CLIA: Alto

Aplicación El kit QUANTA LiteTM H. pylori IgA es una prueba de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) para la detección cualitativa de anticuerpos IgA contra H. pylori (Helicobacter pylori) en suero humano. Esta prueba sirve para ayudar en el diagnóstico de la infección por H. pylori en pacientes adultos a partir de los 18 años de edad con signos y síntomas clínicos de enfermedad gastrointestinal. La prueba QUANTA LiteTM H. pylori IgA debe realizarse e interpretarse junto con la QUANTA LiteTM H. pylori IgG para la detección de anticuerpos IgG frente a H. pylori.

Sumario y Explicación de la prueba La relación causal entre infección por H. pylori y enfermedad péptica ulcerosa ha quedado demostrada desde que se propuso por primera vez en 1983.1 La infección por H. pylori está presente en más del 95% de los pacientes con úlceras duodenales y en el 80% de los pacientes con úlcera gástrica, y se asocia a carcinoma gástrico y linfoma.2-5 La erradicación del H. pylori reduce la recurrencia de la úlcera.2-5 El tratamiento de la infección por H. pylori se ha recomendado en pacientes con úlceras duodenal o gástrica y recientemente en la dispepsia funcional.5,6 El diagnóstico de la infección por H. pylori incluye métodos invasivos y no invasivos. Entre los métodos invasivos destaca la endoscopia para la observación directa de la mucosa antral y para obtener biopsias para la prueba de la ureasa, las tinciones histológicas (Warthin-Starry) y los cultivos.5,7 El cultivo se considera “la prueba de referencia”, aunque es la menos sensible (sensibilidad del 70%-80%). Las pruebas histológicas y de ureasa tienen sensibilidades y especificidades superiores al 90%.5 Los principales inconvenientes de los métodos invasivos son el riesgo y las molestias para el paciente, el elevado coste y los resultados falso negativos debido a la distribución irregular del H. pylori en el estómago. Entre las pruebas no invasivas se encuentran la prueba del aliento con urea marcada con 14C o 13 C y las pruebas serológicas. La prueba del aliento es sensible y específica, aunque es costosa. La serología es una alternativa económica, sensible y específica frente a las técnicas invasivas y/o costosas como la endoscopia y la prueba del aliento con urea 14C.2,3,5,8,9 En la mayoría de los casos, la detección de anticuerpos frente a H. pylori de la clase IgG permite una determinación exacta de la infección por H. pylori con sensibilidades y especificidades superiores al 90%. Sin embargo, se ha comprobado que entre los pacientes en los que se analizaron los anticuerpos IgG e IgA contra H. pylori, del 2% al 7% eran H. pylori IgG negativos y H. pylori IgA positivos.12,15,16,18 Así, la determinación de tan sólo los anticuerpos IgG puede hacer que se pasen por alto algunos casos ciertos de infección por H. pylori y que pacientes infectados no reciban tratamiento o sean sometidos a exploraciones mucho más costosas y a menudo invasivas. Además de la identificación de algunos pacientes que pueden no haber sido detectados con los análisis de H. pylori IgG, otros estudios que respaldan la utilidad clínica de la determinación de los anticuerpos contra H. pylori IgA son: 1) los resultados que indican valores altos de anticuerpos IgA contra H. pylori junto a valores bajos de pepsinógeno I son factores de riesgo de cáncer gástrico17, 2) después del tratamiento, los valores de anticuerpos IgA posiblemente desciendan con mayor rapidez que los valores de IgG15, 3) la detección de anticuerpos IgA frente a H. pylori puede ser útil en el diagnóstico de individuos sintomáticos con valores de H. pylori IgG dudosos o bajos y 4) la relación entre valores de anticuerpos IgA/IgG contra H. pylori puede estar relacionada con el grado de gastritis crónica asociada a H. pylori .19

Procedimiento de trabajo El antígeno H. pylori, purificado, está unido a la placa de poliestireno en unas condiciones que mantienen el antígeno en su estado nativo. Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los anticuerpos anti H. pylori IgA al antígeno que los recubre. El resto de componentes no unidos se elimina mediante lavado y se añade conjugado anti IgA humana a cada pocillo. Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los anticuerpos presentes. Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. El ensayo puede ser evaluado fotométricamente comparando la intensidad de color en las muestras con la de los controles.

Reactivos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Microplaca ELISA de poliestireno con pocillos recubiertos con antígeno H. pylori purificado, (12-1 x 8 pocillos), envasada en su soporte en una bolsa de aluminio con desecante. Control negativo ELISA, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano ausente de anticuerpos IgA humanos anti H. pylori, prediluido, 1.2 ml Control ELISA H. pylori IgA Positivo Débil, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con IgA anticuerpos anti H. pylori, prediluido, 1.2 ml Control ELISA H. pylori IgA Positivo Fuerte, 1 frasco de tampón conteniendo conservante y suero humano con IgA anticuerpos anti H. pylori, prediluido, 1.2 ml Diluyente de Muestra HRP, 1 frasco color rosado conteniendo tampón con Tris, Tween 20 y conservante, 50 ml Solución de Lavado Concentrada HRP, 1 frasco de concentrado 40x color rojo conteniendo tampón con Tris y Tween 20, 25ml. Referirse a la Sección “Metodología” para instrucciones de dilución. Conjugado HRP IgA, con anti- IgA humana de cabra, 1 frasco - transparente o amarillo pálido, conteniendo tampón, estabilizante de proteína y conservante, 10ml Cromógeno TMB, 1 frasco conteniendo estabilizantes, 10ml Solución de Parada HRP, Acido Sulfúrico 0.344 M, 1 frasco, incolora, 10 ml

1

Advertencias 1. 2.

3.

4. 5. 6.

7. 8.

Aviso: Este producto contiene cloramfenicol al 0.02% en el Diluyente de muestras, controles y conjugado considerado en el estado de California como causante de cáncer. Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los controles H. pylori IgA ELISA positivo fuerte, H. pylori IgA ELISA positivo débil y ELISA negativo deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.10 Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de dichas azidas metálicas. El Conjugado HRP contiene diluido un producto químico venenoso y corrosivo que puede ser tóxico si se ingiere. Para impedir quemaduras, evitar el contacto con piel o ojos. El Cromógeno TMB contiene un irritante. Puede ser dañino si es inhalado, ingerido o absorbido por la piel. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con piel y ojos. La Solución de parada HRP consiste de una solución diluida de ácido sulfúrico. Evitar exposición a bases, metales, u otros compuestos que puedan reaccionar con ácidos. El ácido Sulfúrico es venenoso y corrosivo, puede ser tóxico si ingerido. Para impedir quemaduras, evitar contacto con piel y ojos. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminación de residuos.

Precauciones 1. 2. 3. 4.

5.

6. 7. 8.

9.

Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro. La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. Un lavado incompleto o ineficiente y una eliminación insuficiente de líquido de los pocillos puede dar lugar a una pérdida de precisión y/o un fondo elevado. La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros dispositivos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados en comparación con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio de validar sus procedimiento automatizado y comprobar que produce resultados dentro de los límites aceptables. Existe una variedad de factores que influyen en la realización del ensayo. Esto incluye la temperatura inicial de los reactivos, la temperatura ambiente, la exactitud y reproducibilidad de técnica de pipeteo, la calidad de la técnica de lavando, el fotómetro que se utiliza para medir los resultados, y los tiempos de incubación durante el ensayo. Es necesario un exquisito cuidado y un trabajo consistente para obtener resultados exactos y reproducibles. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo. El sellado incompleto de la bolsa “zip-lock” que contenga tiras sin usar y desecante provocará la degradación del antígeno que se apreciará en un empeoramiento de la precisión de resultados. Pueden observarse absorbancias inaceptablemente bajas tras dos o más usos separados de un conjugado HRP. Es importante seguir todas las recomendaciones de manipulación específicas para este producto para evitar que esto ocurra. La contaminación química del conjugado HRP puede ocurrir como resultado de una limpieza o secado inadecuados del equipo o instrumentos. Residuos de productos químicos comunes en el laboratorio como formalina, lejía, etanol, o detergente causan la degradación del conjugado HRP con el tiempo. Enjuague bien todo equipo o instrumentos después de usar dichos productos.

Condiciones de Almacenaje 1. 2. 3.

Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8°C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. Las tiras sin utilizar deben volverse a guardar en la bolsa de aluminio que contiene desecantes cerrándola herméticamente y almacenándola a 2-8ºC. La solución de lavado diluida es estable 1 semana a 2-8°C.

Recolección de Muestras Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas. Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento NCCLS H18-A recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse. No se recomienda utilizar muestras que han sido congeladas y descongeladas repetidamente.

Procedimiento Materiales Suministrados 1 1 1 1 1 1

Microplaca H. pylori IgA ELISA (12-1 x 8 pocillos) con soporte 1.2 ml control prediluido ELISA negativo 1.2ml control prediluido H. pylori IgA ELISA Positivo Débil 1.2ml control prediluido H. pylori IgA ELISA Positivo Fuerte 50ml Diluyente de muestra HRP 25ml Solución de lavado concentrada 40X

2

1 1 1

10ml Conjugado IgA (cabra) anti IgA humana 10ml Cromógeno TMB 10ml Solución parada HRP (Ácido Sulfúrico 0.344M)

Material necesario no incluido Micropipetas para 5, 100, 200-300, y 500µl Puntas desechables para micropipeta Tubos para dilución de muestras, 4ml Agua destilada Recipiente de 1L para la solución de lavado reconstituida Lector de microplacas capaz de medir densidades ópticas a 450nm (y a 620nm para lecturas de doble longitud de onda)

Metodología Antes de empezar 1. 2.

3.

4.

Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26°C) y agitar. Diluir la solución de lavado HRP 1:40 añadiendo el contenido del envase con concentrado a 975 ml de agua destilada. Si no va a utilizar toda la placa, puede preparar una cantidad menor de solución de lavado añadiendo 2.0 ml del concentrado a 78ml de agua destilada para cada 16 pocillos que vayan a utilizarse. El tampón diluido es estable 1 semana a 2-8°C. Preparar una dilución 1:101 de cada muestra a procesar añadiendo 5 µl de muestra a 500 µl de diluyente. Las muestras diluidas deben ser utilizadas dentro de las 8 horas de su preparación. NO DILUIR los controles H. pylori IgA ELISA positivo débil, positivo fuerte y ELISA negativo. La determinación de la presencia o ausencia de anticuerpos anti H. pylori IgA usando unidades arbitrarias requiere dos pocillos para cada uno de los tres controles y uno o dos pocillos para cada muestra. Se recomienda que las muestras se hagan por duplicado.

Procedimiento de Ensayo 1.

2.

3.

4.

5. 6. 7. 8.

TODOS REACTIVOS DEBEN ESTAR A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) ANTES DE EMPEZAR EL ENSAYO. Ponga el número necesario de tiras en el soporte. Devolver inmediatamente las tiras sin utilizar a la bolsa de aluminio y sellarla firmemente para minimizar la exposición a la humedad. Agregar 100µl de los controles prediluidos H. pylori IgA ELISA Positivo Débil, H. pylori IgA ELISA Positivo Fuerte, ELISA Negativo y las muestras prediluidas a los pocillos. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una superficie plana. El tiempo de incubación empieza después de la adición de la última muestra. Lavado: Aspirar el contenido de cada pocillo. Agregar 200-300µl de solución de lavado a todos pocillos y aspirar. Repetir esta secuencia dos veces más para un total de tres lavados. Invertir la placa y golpearla suavemente en material absorbente para eliminar cualquier fluido residual tras el último lavado. Es importante que cada pocillo esté completamente vacío después de cada paso de lavado. Mantener la misma secuencia para la aspiración que la usada para la adición de muestras. Agregar 100µl de Conjugado IgA HRP a cada pocillo. El conjugado debe pipetearse en las condiciones más asépticas posibles y siguiendo buenas técnicas de laboratorio. Aspirar solamente la cantidad de conjugado necesaria para el ensayo. PARA EVITAR CUALQUIER CONTAMINACIÓN POTENCIAL MICROBIANA Y/O QUÍMICA, NUNCA DEVOLVER EL CONJUGADO SIN USAR A SU RECIPIENTE ORIGINAL. Incubar los pocillos 30 minutos como en el paso 2. Lavado: Repetir el paso 3. Agregar 100µl de Cromógeno TMB a cada pocillo e incubar 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. Agregar 100µl de Solución de parada a cada pocillo. Mantener la misma secuencia y temporalización que la efectuada en la adición de Cromógeno. Agitar suavemente la placa para mezclar bien los pocillos. Leer la absorbancia (OD) de cada pocillo a 450nm en un plazo máximo de una hora. Si se desea seguir el método de lectura bicromática puede utilizarse 620 nm como longitud de onda de referencia.

Control de Calidad 1.

2.

3. 4.

Los controles H. pylori IgA ELISA Positivo Débil, H. pylori IgA ELISA Positivo Fuerte y Control Negativo ELISA deben procesarse con cada lote de muestras para asegurar que todos reactivos y procedimientos funcionan correctamente. El usuario debe notar que debido a que los controles H. pylori IgA ELISA Positivo Débil, H. pylori IgA ELISA Positivo Fuerte y ELISA Negativo son prediluidos, no controlan procedimientos asociados con dilución de especímenes. Pueden añadirse controles adicionales según las directivas o requisitos del laboratorio. Pueden prepararse controles válidos haciendo alícuotas de un “pool” de suero humano que debe almacenarse a < -20°C. Para considerar válidos los resultados deben considerarse satisfechos todos los criterios especificados a continuación, si alguno de ellos no se cumple la prueba debe considerarse inválida y repetirse. a. La absorbancia del control H. pylori IgA Positivo debe ser superior a la del control H. pylori IgA positivo débil y la de este debe ser superior a la del control negativo. b. El control H. pylori IgA positivo fuerte debe tener una absorbancia mayor que 1.0 mientras que la del control negativo no debe exceder de 0.2. c. La absorbancia del control H. pylori IgA positivo débil debe ser superior al doble del control negativo, u oscilar entre 0.25. d. Los controles ELISA negativo y H. pylori IgA positivo fuerte están pensados para monitorizar problemas de reactivo de magnitud substancial. El control H. pylori IgA positivo fuerte no puede asegurar precisión alguna en el punto de corte del ensayo. e. El usuario puede referirse al documento NCCLS (National Committee of Clinical Laboratory Standards) C24-A11 para una guía adicional acerca de buenas prácticas de laboratorio.

3

Cálculo de Resultados Debe determinarse en primer lugar el promedio de densidades ópticas de cada juego de duplicados. La reactividad para cada muestra se calcula dividiendo la densidad óptica promedio de la muestra por la densidad óptica promedio del control H. pylori IgA positivo débil. DO Muestra Valor de la Muestra = —————————————————— x Valor ELISA Positivo Débil H. pylori IgA (unidades) DO ELISA Positivo Débil H. pylori IgA (unidades) La reactividad de la muestra está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente. Mientras que los aumentos y disminuciones en la concentración de anticuerpos del paciente se reflejarán en el aumento o disminución correspondiente de la reactividad, los cambios no son proporcionales (por ejemplo, al doblarse la concentración de anticuerpo no se dobla la reactividad). Si se deseara una cuantificación más precisa de la cantidad de anticuerpo, puede informarse como el título de anticuerpo de la muestra la última dilución positiva de una serie de diluciones seriadas de la muestra.

Interpretación de los Resultados La técnica ELISA es muy sensible y es capaz de detectar pequeñas diferencias entre poblaciones de pacientes. Los valores presentados a continuación son sólo valores sugeridos. Cada laboratorio debe establecer su propio rango normal basado en su propia metodología, controles, equipo y población de pacientes. La muestra puede clasificarse con un valor negativo, (negativo para anticuerpo IgA anti H. pylori), equivoco, o positivo (anticuerpo IgA anti H. pylori detectado)según la tabla siguiente. Unidades Negativo 0.0 – 20.0 Equivoco 20.1 – 24.9 Positivo >25 Las muestras calificadas como equívocas deben ser analizadas otra vez antes de ser informadas. 1.

2.

3.

4.

5.

La prueba QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA debe realizarse e interpretarse junto con el QUANTA LiteTM H. pylori IgG ELISA para la detección de anticuerpos IgG para H. pylori. Algunas muestras pueden ser negativas para anticuerpos contra H. pylori IgA y positivas para anticuerpos contra H. pylori IgG, mientras que otras pueden ser positivas para anticuerpos contra H. pylori IgA y negativas para anticuerpos contra H. pylori IgG. No se dispone de datos de rendimiento e interpretación suficientes para las muestras positivas para anticuerpos contra H. pylori IgA y negativas para anticuerpos contra H. pylori IgG, por lo que está indicado un seguimiento adicional. Un resultado positivo sólo indica exposición inmunológica previa a H. pylori. No permite distinguir entre una forma de infección activa por H. pylori y otra inactiva. La infección activa se valora por cultivo del material de biopsia, por la prueba del aliento con urea 14C o por otros métodos de detección de la ureasa. En una muestra con valores dudosos de H. pylori IgA no se puede evaluar el estado de los anticuerpos. Si los resultados siguen siendo dudosos después de repetir la prueba, este resultado se comunicará como dudoso o bien se obtendrá una nueva muestra. Un resultado negativo indica ausencia de anticuerpos IgA frente a H. pylori o niveles inferiores al límite de detección de la prueba. Es posible que en las muestras obtenidas en etapas demasiado precoces de la infección primaria no haya niveles detectables de anticuerpos IgA. Si se sospecha una infección primaria, deberá obtenerse otra muestra en un plazo de 4-6 semanas, que se estudiará junto a la muestra original en el mismo análisis. Se sugiere que los resultados informados por el laboratorio incluyan la afirmación “Los siguientes resultados se obtuvieron con el kit INOVA Quanta Lite H. pylori IgA ELISA. Los valores obtenidos con kits de diferentes fabricantes pueden variar y no pueden intercambiarse entre ellos. La magnitud de los niveles informados de IgA no puede correlacionarse con un punto final”.

Limitaciones del Procedimiento 1. 2. 3.

4. 5. 6.

7. 8. 9. 10. 11.

12.

La presencia de inmunocomplejos u otros agregados de inmunoglobulinas en la muestra del paciente puede producir un aumento de uniones inespecíficas y causar falsos positivos en este ensayo. Esta prueba sirve para ayudar al diagnóstico de la infección por H. pylori en individuos con síntomas de enfermedad gastrointestinal y no está pensada para pacientes asintomáticos. Esta prueba se puede usar como complemento de la detección de anticuerpos contra H. pylori IgG, pero no en sustitución de ella. No deben comunicarse los resultados de la H. pylori IgA en una muestra sin que vayan acompañados de los resultados de la H. pylori IgG correspondiente. Un resultado negativo de H. pylori IgA no descarta la presencia de H. pylori, ya que muchas personas con infección pasada o presente por H. pylori pueden ser negativas para H. pylori IgA. Un anticuerpo contra H. pylori IgA negativo no descarta la presencia de H. pylori, ya que es posible que la concentración de anticuerpos se halle debajo del límite de detección de la prueba. Se pueden obtener resultados negativos cuando se han obtenido las muestras en etapas muy precoces de la infección, antes de la aparición de anticuerpos detectables. Si se sospecha infección por H. pylori, deberán obtenerse nuevas muestras 4-6 semanas más tarde, que se analizarán en paralelo con la primera muestra. Un resultado positivo no nos permite distinguir entre infección activa y colonización por H. pylori. Una prueba positiva sólo indica la presencia del anticuerpos contra H. pylori y no indica necesariamente la presencia de enfermedad gastrointestinal. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras pruebas serológicas. Esta prueba no se ha comprobado en pacientes menores de 18 años. En la bibliografía se encuentran referencias sobre la posibilidad de que anticuerpos contra especies de Pseudomonas presenten reactividad cruzada con H. pylori. No se ha evaluado la eficacia de este análisis en sueros que contienen anticuerpos antipseudomonas. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.

4

Valores Esperados Se ha calculado que casi un 50% de la población mundial está infectada por el H. pylori. En los países en vías de desarrollo, el 50% o más de la población está infectada por el H. pylori a los 10 años, mientras que en los países desarrollados la infección infantil es poco frecuente. La prevalencia en suero de anticuerpos contra H. pylori IgG aumenta a un ritmo aproximado del 0.5%-1% al año, a medida que aumenta la edad (es decir, que se alcanza una seroprevalencia aproximada del 60% en el grupo de edad de 60 años).3,7,13,14 Se ha demostrado también que los individuos afectados producen anticuerpos IgA contra el H. pylori. Se ha comprobado que un pequeño número de pacientes (2%-7%) son positivos para anticuerpos contra H. pylori IgA y negativos para anticuerpos contra H. pylori IgG.12,15,16,18 La capacidad de QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA para detectar anticuerpos contra H. pylori IgA se evaluó mediante la comparación con una prueba ELISA para H. pylori IgA disponible en el mercado y mediante la evaluación de muestras de pacientes clínicamente definidas. Los resultados del ELISA para H. pylori IgA del mercado se determinaron siguiendo las instrucciones del prospecto dadas por el fabricante.

Rango Normal Un grupo de 120 muestras procedentes de individuos sanos asintomáticos (edades entre 17-75 años, mediana de 35), se analizaron con el QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA. Se comprobó que de las 120 muestras, el 9% (11/120) eran positivas para H. pylori IgA. Después de descartar las muestras con resultados positivos o dudosos para H. pylori IgG, el 2.8% (3/105) fueron positivas para anticuerpos contra H. pylori IgA (y negativas para anticuerpos contra H. pylori IgG). Esto da una especificidad calculada del 97.1% (102/105) [ IC95% = 91.9-99.4].

Características de Eficacia Específicas Se comparó la eficacia de la prueba QUANTA Lite™ H. pylori IgA ELISA con un preparado comercial de H. pylori IgA ELISA. Se analizaron con ambas pruebas 145 muestras enviadas para análisis de anticuerpos contra H. pylori, 8 para EQAS (programa de evaluación externa de la calidad) y 100 muestras de individuos sanos asintomáticos. De las 253 muestras, 130 fueron positivas y 91 negativas con ambos métodos. Tabla 1:

QUANTA Lite™ H. pylori IgA ELISA

+ +/– –

H. pylori IgA ELISA Comercial + +/– – 130 5 6 % coincidencia de positivos: 91.5% (130/142) 9 1 4 % coincidencia de negativos: 90.1% (91/101) 3 4 91

Muestras del estudio Con el kit QUANTA Lite H. pylori IgA ELISA se analizaron en total 111 muestras de suero archivadas, recogidas de pacientes con infección por H. pylori demostrada por una combinación de métodos de UBT, CLO, histología y métodos de cultivo. Tabla 2:

Método de referencia + QUANTA Lite™ H. pylori IgA ELISA + 100 +/– 8 – 3 Sensibilidad (sin excluir la equiv.) = 90.1% (100/111), [IC 95% =83.0%-94.9%]

Estudio de reactividad cruzada Se realizó un estudio de adsorción para evaluar la reactividad cruzada de antígenos bacterianos con la prueba QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA de INOVA. En resumen, sueros con diferentes niveles de anticuerpos frente a H. pylori se adsorbieron con antígenos de H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus o E. coli y muestras de sueros no tratados y tratados se analizaron en la prueba de H. pylori IgA. Todas las muestras seropositivas para H. pylori continuaron siendo seropositivas cuando se absorbieron con antígenos distintos del H. pylori. El porcentaje de inhibición medio fue del 82% al utilizar el antígeno H. pylori y del 10% al utilizar antígenos obtenidos de otros microorganismos. Se analizó también la reactividad cruzada provocada por la presencia de anticuerpos antinucleares (3 sueros), factor reumatoide (3 sueros), microglobulina beta-2 (3 sueros) o B. burgdorferi (11 sueros), demostrándose que no afectaba a la especificidad de QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA de INOVA.

Interferencia Para determinar si la presencia de concentraciones altas de bilirrubina, hemoglobina, colesterol o triglicéridos en muestras de suero interfiere con el QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA, se realizaron dos estudios. En el primero se analizaron 6 muestras de suero (4 H. pylori positivas y 2 negativas) con y sin la adición de bilirrubina (40x el nivel normal) o hemoglobina (66x el nivel normal). En un segundo estudio se enfrentaron sueros positivos para H. pylori con sueros que contenían niveles altos de colesterol (3), triglicéridos (1) o bilirrubina (2). Aunque los niveles altos de bilirrubina, hemoglobina o colesterol no parecen interferir en el análisis, los niveles altos de triglicéridos sí que muestran cierta interferencia.

5

Reproducibilidad/Precisión La eficacia intra-análisis se evaluó analizando 12 veces 6 muestras, una negativa, una dudosa, una positiva límite, una positiva baja, una positiva moderada y una positiva alta. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Eficacia intra-análisis del QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA Suero 1 Suero 2 Suero 3 Suero 4 Suero 5 Suero 6 Media 52.8 57 40.84 15.9 7.00 29.6 D.E. 2.15 2.18 0.72 1.2 0.68 1.19 C.V.% 4.74 3.8 1.77 7.56 9.72 4.03 La eficacia inter-análisis se evaluó analizando 13 muestras, negativas, positivas bajas y positivas moderadas y altas, un total de 6 veces durante 3 días. Se analizaron dos veces al día, una por la mañana y una por la tarde. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Eficacia inter-análisis de QUANTA LiteTM H. pylori IgA ELISA Suero 1 Suero 2 Suero 3 Suero 4 Suero 5 Suero 6 Suero 7 Suero 8 Suero 9 Suero 10 Suero 11 Suero 12 Suero 13

Media 53.7 D.E. 1.25 C.V.% 2.3

6.1 0.25 4.1

54.7 3.8 6.9

53 3.94 7.4

17.5 1.65 9.5

19.1 0.87 4.6

43.4 1.46 3.4

49.4 1.97 4.0

31.1 1.53 4.9

5.8 0.35 6.0

26.7 1.38 5.2

28.9 2.48 8.6

36.7 2.51 6.9

Referencias 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

18.

19.

Marshall BJ: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii 1273-1275, 1983. Walsh JH and Peterson WL: The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15):984-991, 1995. Blaser MJ: Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: 386-94, 1992. The Eurogast Study Group. An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857):1359-62. NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease. JAMA 272-65-69, 1994. Malfertheiner P, et.al.: Current European concept in the management of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9:1-2, 1997. Hirschl AM, et. al.: Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of antiHelicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168:763-766. Bourke B, Jones N, and Sherman P: Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15:1-13, 1996. Patel P, et. al.: Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet. 346:1315-1318, 1995. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition National Committee for Clinical Laboratory Standards: Internal quality Control: Principles and definitions; Approved Guideline, NCCLS Document C24-A, Vol 11(6), 1991. Kosunen T, et. al.: Diagnostic value of decreasing IgG, IgA and IgM antibody titers after eradication of Helicobacter pylori. Lancet 339:893-895, 1992. Megraud F, et. Al.: Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27:1870-1873, 1989. Veldhuyzen SJO, et. al.: Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169:4347, 1994. Veenendaal RA: Long term serological surveillance after treatment of Helicobacter pylori infection. Gut 32:1291-1294, 1991. Jaskowski TD, et. al.: Immunoglobulin A antibodies to Helicobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 35(11): 2999-3000, 1997. Aromaa A, et. al.: Circulating Anti-Helicobacter pylori Immunoglobulin A antibodies and low serum pepsinogen 1 level are associated with increased risk of gastric cancer. Am. J. Epidem. 144(2):142-149, 1996. Granberg C, et. al.: Diagnosis of Helicobacter pylori Infection by Using Pyloriset EIA-G and EIA-A for Detection of Serum Immunoglobulin G (IgG) and IgA Antibodies. J. Clin. Microbiol. 31(6): 1450-1453, 1993. Futagami S: Systemic and local immune responses against Helicobacter pylori urease in patient with chronic gastritis: distinct IgA and IgG productive sites. Gut 43:168-175, 1998.

6

Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 628720ESP

888-545-9495 November 2009 Revision 5

7