REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Lic. en Bioquímica Lic. en Biotecnología Microbiología de los Alimentos 2016

• Desarrollada por Kary Mullis en 1986 • Técnica in vitro que permite amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN, la cual se encuentra flanqueada por 2 secuencias de ADN conocidas • Se basa en el mecanismo de replicación in vivo de ADN: El ADN bicatenario se desenrolla pasando a monocatenario, duplicándose y volviéndose a enrollar.

Pasos para realizar una PCR 1) Extracción del ADN deseado 2) Preparación de la mezcla de reacción (Master mix) 3) Separación de master mix en alícuotas y agregado del ADN de interés 4) Amplificación en Termociclador 5) Electroforesis en gel de agarosa 6) Observación en transiluminador UV

Extracción de ADN Existen distintos métodos para extracción de ADN. Técnica A: Enriquecimiento de bacteria en medio de cultivo

Ansada

Resuspender en 150µl de Triton X-100 en buffer TE

Hervir a baño de agua a 100°C 15 minutos

ADN listo para PCR

Tomar 50 µl del sobrenadante y colocar en tubo nuevo

Centrifugar a 12000 rpm 5 minutos

Técnica B: Kit comercial de extracción QIAamp

Componentes de la Master Mix H2O ultrapura Buffer Mg+2

dNTPs Primer forward Primer reverse ADN polimerasa

+ ADN de interés

Termociclador

Preparación de Master mix Reactivos

Solución stock

Solución de trabajo

Buffer

10 x

1x

dNTPs

2,5 mM

0,1 mM

MgCl2

25 mM

1,5 mM

Iniciador a

100 pmol/ml

2 pmol/ml

Iniciador b

100 pmol/ml

2 pmol/ml

Taq pol

5 U/ml

0,02 U/ml

ADN templado

Volumen en la mezcla (ml)

2

H2O ultrapura Volumen final

50

Pasos durante la amplificación 1) Desnaturalización inicial

92 – 94°C

2) Ciclos: - Desnaturalización - Unión o annealing - Extensión

92 - 94°C 55 – 61°C 72 – 74°C

3) Extensión final 72 – 74°C

Importancia de los controles Control Positivo: ADN diana que se sabe amplifica el gen buscado. Permite verificar que este correcto el procedimiento. Control Negativo: Componentes de Master mix sin ADN. Permite ver que no haya contaminación.

Cuidados a tener en cuenta

Trazas de ADN contaminante podrían servir como ADN molde, llevando a la amplificación de un fragmento incorrecto (FALSOS POSITIVOS). Para evitarlo es fundamental: • Trabajar en condiciones de asepsia • Lugar de trabajo bien limpio, trabajar con guardapolvo, guantes • Material que se utiliza debe estar esterilizado • Preferible si es material nuevo • Evitar corrientes de aire

Zonas de trabajo Recomendable: zonas de trabajo físicamente separadas y dotadas de material adecuado. • • •

Zona de preparación de la muestra: Extracción y purificación del material genético. Zona de PCR: preparación de master mix y muestras. Zona post-PCR: donde se realiza la amplificación de ADN.

Revelado Los fragmentos de PCR se revelan mediante electroforesis en gel de agarosa.

Gel de agarosa y buffer de corrida TAE o TBE

Visualización

Siembra 5 µl de muestra + 2 µl de azul de bromofenol

Conceptos básicos • • •

•

Especificidad: Generación de un único producto de amplificación. Eficiencia: Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos. Fidelidad: Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia (menor número de errores, mayor fidelidad). Sensibilidad: Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias

Aplicaciones En Microbiología: • Identificación de microorganismos por presencia de una secuencia especifica del gen 16S ARNr u otros genes específicos de especie • Selección de clones que posean genes asociados a virulencia, resistencia a antibióticos, etc. • Establecer relación entre cepas durante brotes o estudio epidemiológicos En otras áreas: • Identificación de genes para diagnostico y medicina legal • Investigación de modelos de expresión

Ventajas • A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable • Rapidez en el diagnostico • Mayor sensibilidad que los cultivos • Se puede amplificar ADN de cualquier organismo, vivo o muerto • El fragmento obtenido se puede clonar, secuenciar y analizar

Desventajas • Se pueden reproducir partes del genoma cuya secuencia se conoce y consta de 20 a 40 pb de longitud • Se necesitan “PRIMERS” específicos • La enzima ADN polimerasa puede tener errores al sintetizar • Puede contaminarse con otro ADN • Reactivos costosos

Tipos de PCR Nested PCR Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Ventajas: brinda alta sensibilidad y especificidad Desventajas: no permite cuantificar la muestra

PCR multiplex PCR en la cual se amplifica simultáneamente dos o más secuencias. Para lo cual se combinan dos o más pares de cebadores en el tubo de la mezcla junto con los demás reactivos.

RT- PCR Variante de PCR en donde una hebra de ARN mensajero es transcripta a ADN complementario (ADNc) usando la enzima retrotranscriptasa, y el resultado se amplifica como una PCR tradicional.

Aplicaciones en el laboratorio de Microbiología

Sensibilidad de la técnica nestedPCR para el gen yadA

Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos de amplificación obtenidos por nested-PCR cuando distintas concentraciones de Y. enterocolitica W1024 fueron inoculadas en chorizo de puro cerdo. (a) ADN extraido mediante el protocolo desarrollado por Kapperud y modificado en el presente trabajo, (b) ADN extraído mediante el reactivo PrepMan Ultra. Línea M: marcador de peso molecular de 100pb; C (-): control negativo.

PCR múltiplex para la determinació n de la presencia de genes de virulencia

1 2 3 4 5

Electroforesis en gel de agarosa para ver los fragmentos de PCR multiplex de Yersinia enterocolitica para los genes Inv y yst. 1: Cepa 51, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 2: Cepa 52, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 3: Cepa 53, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 4: Cepa 64, B4/O:3: Inv: 558pb

6 7

8 9 10

5: Marcador de peso molecular 6: Cepa 68, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb 7: Cepa de referencia, W1024, B2/O:9: Inv: 558pb ; yst: 192pb 8: Cepa de referencia, MCH700, B4/O:3: Inv: 558pb ; yst: 192pb

9: Control negativo 10: Marcador de peso molecular

Resistencia a ATM de Helicobacter pylori El mecanismo de resistencia a Cla esta asociado a mutaciones puntuales en la región peptidiltransferasa del gen 23s RNAr principalmente en las posiciones 2142 y 2143 en las cuales una guanina o citocina reemplazan una adenina. ACGGAAAGACC ACGGGAAGACC ACGGAGAGACC

Amplificación fragmento 450 pb

WT A2142G A2143G

Corte con enzima BsaI

S CLA R CLA R CLA

Corte con enzima MboII

Bibliografía, dónde buscar? • US National Library of Medicine. National Institute of Health http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

• Science Direct http://www.sciencedirect.com/ • Biblioteca electrónica de Ciencia y Tecnología. Argentina http://www.biblioteca.mincyt.gob.ar/