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Relación entre coste, calidad y precio del análisis de Legionella Míriam Monedero Boado Responsable Microbiología Laboratorio Dr. Oliver Rodés

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ANÁLISIS DE LEGIONELLA El laboratorio Dr. Oliver Rodés lleva realizando análisis de Legionella desde el año 1991 (los primeros se realizaron para Balnearios). El método no ha cambiado sustancialmente, los medios de cultivo son iguales así como los tratamientos de las muestras. Sí que se han introducido más controles de aseguramiento de la calidad en todo el proceso de análisis, desde la toma de muestra hasta la emisión del resultado final.

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LEGIONELLA - Legislación • Real Decreto 865/2003 de 4 de julio por el que se establecen loscriterios higiénico-sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. • Decret 352/2004 de 27 de juliol, pel qual s’estableixen les condicions higienicosanitàries pèr a la prevenció i el control de la legionel·losi.. Qué instalaciones tienen un mayor grado de probabilidad e proliferación y dispersión de Legionella.

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ANÁLISIS - Toma de muestras Se realiza en un determinado punto de toma de muestra, en un determinado momento, bajo unas determinadas condiciones. No hablamos del agua, por ejemplo, de todo un edificio, para ello se debería realizar un muestreo en el espacio y en el tiempo. Sí se realiza, como se especifica en la legislación, un control de los puntos terminales a lo largo de todo el año.

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ANÁLISIS - Toma de muestras Para la recogida de muestra se sigue el punto b del Anexo 6 del RD. Se recoge de la forma “más desfavorable”, ya que se rasca el grifo, ducha o punto de toma de muestra con una torunda para recoger las incrustaciones o posible material sedimentado que pudiera servir de reservorio a la bacteria.

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ANÁLISIS Transporte y Conservación de muestras Según se especifica en la Norma ISO 11731: Parte 1 (1998) Tanto la temperatura de transporte como la de conservación tiene que ser controladas. Márgenes especificados por la Norma: Tª de Transporte: Tª de conservación:

6 a 18ºC / máx. 2 días 6 a 18ºC / máx. 5 días

Como en cualquier muestra de microbiología, es preferible que el inicio del análisis sea lo más inmediato posible.

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ANÁLISIS Concentración de la muestra Difícil conocer a priori si la muestra se tiene que concentrar o no. EL resultado se tiene que analizar y expresar en 1 L de muestra. La concentración se puede realizar por centrifugación o filtración. EL resultado que se obtenga dependerá de la elección de uno u otro método.

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ANÁLISIS Concentración de la muestra - Problemas • Muestras que contienen mucho material sedimentable. El filtro se colmata. Posibles soluciones: – Filtración de un volumen menor o no concentración de la muestra. – Utilización de mayor número de filtros. – Utilización de mayor volumen de reactivo de elución.

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ANÁLISIS Concentración de la muestra - Problemas • Muestras, aparentemente transparentes, poco turbias, y que no contiene material sedimentable apreciable. Se les han adicionado productos que mantienen los sólidos en suspensión para evitar la formación de sedimento en las instalaciones. Estos productos crean una capa en el filtro que puede impedir la filtración del litro de muestra.

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ANÁLISIS Concentración de la muestra - Problemas Posibles soluciones: – Filtración de un volumen menor o no concentración de la muestra. – Utilización de mayor número de filtros. – Utilización de mayor volumen de reactivo de elución.

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ANÁLISIS Concentración de la muestra - Problemas Estas dificultades en la filtración tienen las siguientes consecuencias: • Mayor inversión de tiempo en la filtración; la expresión de resultados se modifica. • Utilización de un mayor número de filtros. • Mayor volumen de reactivo de elución, que implica la modificación en el límite de cuantificación de la muestra Por tanto, de entrada, ya es difícil calcular el coste directo en cuanto a material y tiempo de análisis.

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ANÁLISIS Elución del concentrado - Problemas Una vez concentrada la muestra en el filtro, se tienen que eluir para desprender los microorganismos de los filtros. Factores que influyen en una “buena” elución: • Composición de los filtros: Los filtros de nylon y policarbonato dan mejores recuperaciones que los de ester de celulosa (más utilizados en los laboratorios de microbiología). Si se utiliza la Norma ISO 11731: Parte 2 los filtros de esteres de celulosa dan recuperaciones superiores. Son diferentes filtros para diferentes técnicas de recuento.

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ANÁLISIS Elución del concentrado

• Forma de elución: La Norma permite agitación por vortex o sonicación. Da mejores resultados la sonicación. Es más estandarizable.

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ANÁLISIS - Cultivo La Norma especifica tres métodos iniciales en paralelo para analizar la muestra (tratamientos diferentes para intentar eliminar microbiota): – Por siembra directa. – Con adición de ácido (pH= 2,2) – Con tratamiento por calor (Tª 50ºC) De una muestra hemos pasado a tres muestras.

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ANÁLISIS Cultivo – incubación / Lecturas Se inician a partir del cuarto día de incubación y se prosigue cada dos días hasta el día 10. Esto implica un grado de atención y control del análisis superior a otras técnicas microbiológicas. El realizar tantas lecturas permite detectar la presencia de colonias sospechosas antes de que la posible flora acompañante enmascare las morfologías o el número de colonias sea tan elevado que el recuento sea prácticamente imposible.

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ANÁLISIS Cultivo – incubación / Lecturas Presencia de microbiota acompañante: • Puede crecer con anterioridad a la colonia de Legionella. • No permite la visualización de las colonias de Legionella o su correcto aislamiento. Las morfologías coloniales están mezcladas o superpuestas.

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ANÁLISIS Cultivo – incubación / Lecturas

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ANÁLISIS Cultivo – incubación / Lecturas Posibilidades: • Se podría emitir un resultado de No detectado. • Los diferentes tratamientos me darán algún resultado? • En el caso de querer conocer el recuento se tienen que realizar más diluciones, que implica: necesidad de más tiempo para la emisión de un resultado y un aumento del consumo de medios de cultivo. Hay que volver a sembrar placas con los tres tratamientos o en su defecto con aquellos en los que la flora acompañante no permita la diferenciación o aislamiento morfológico.

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ANÁLISIS Cultivo – incubación / Lecturas – Por ejemplo, el tratamiento por calor suele eliminar mucha microbiota acompañante pero los recuentos para Legionella son notablemente más bajos que con los otros dos tratamientos. – Se realizarán diluciones con los otros dos tratamientos.

• Análisis de la muestra directa realizando también los tres tratamientos (a posteriori?).

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S.O.S

Como puede verse, esta técnica es de todo menos “poco compleja”!!!!.

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ANÁLISIS Confirmación de morfologías La confirmación de las colonias sospechosas de ser Legionella se tiene que hacer de cada morfología, de cada tratamiento y de un número representativo de colonias (para Legionella spp. la Norma ISO indica 3 colonias como mínimo).

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ANÁLISIS Confirmación de morfologías Técnico: es importante que el técnico que realiza la analítica esté familiarizado con las morfologías coloniales de Legionella, así seleccionará solamente aquellas colonias sospechosas de ser Legionella y sobre las que haremos las pruebas de confirmación. La morfología colonial de Legionella puede ser tan específica que, dentro de una misma especie, la diferencia de serogrupo puede dar lugar al crecimiento de una morfología diferenciada, pero no siempre. Sólo la experiencia del técnico puede dar con estas diferencias, “sutiles” muchas veces, para evitar así confirmaciones innecesarias o, lo que sería peor, confirmaciones no realizadas.

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ANÁLISIS Confirmación de morfologías • La confirmación para determinar la presencia o no de Legionella spp, se realiza por crecimiento de las colonias sospechosas en medio BCYE (Cys+) y un medio sin cisteina ( BCYEcys-,agar sangre, agar nutritivo). • La confirmación de la presencia de Legionella pneumophila se realiza por técnicas de inmunofluorescencia o aglutinación en latex.

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ANÁLISIS Confirmación de morfologías – Norma ISO La última frase de la Norma ISO11731:1 en el punto de expresión de resultados dice: “El propósito de esta Norma es demostrar la presencia o ausencia de organismos confirmados como Legionella en la muestra. Expresar la confirmación de la presencia (o ausencia) de L. pneumophila y la presuntiva presencia (o ausencia) de otras especies de Legionella.” (traducción) Que se puede interpretar como la obligación de confirmar todas las colonias sospechosas de ser Legionella spp. como Legionella pneumophila, y no solo un número determinado de colonias. Esto obligaría a confirmar, en muchos casos cientos de colonias y la realización del análisis sería inviable. Muchos laboratorios optan por validar rangos de confirmación (rangos de recuento y cuántas colonias se tienen que confirmar de cada rango); pero no deja de ser diferente de lo que se puede interpretar en esta frase. Por lo tanto cada laboratorio gastará más o menos tiempo y material de confirmación cuantas más o menos colonias confirme.

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CALIDAD No hay que olvidar que a toda técnica hay que añadir los controles de calidad de los medios de cultivo y reactivos, y de la propia técnica analítica, que sirven para garantizar los resultados y que siempre implican un coste adicional; pero, sin los que no se podría dar un resultado fiable.

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Porqué hablar de costes Excusa para hablar de los problemas de esta técnica: Empezando por que siempre se recupera menos de lo que hay en la muestra: hay pérdidas en la concentración, hay pérdidas en la elución, hay pérdidas en los tratamientos. Relación del precio del análisis con la experiencia de los laboratorios y también de los medios de cultivo utilizados. Dificultad de establecer un precio a priori, porque dependerá de la muestra.

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC Estudio realizado con cuatro casas comerciales (A, B, C y D). Se especifican los resultados obtenidos para cada casa comercial y una de ellas está repetida ya que después del primer estudio revisaron su formulación, y se volvió a estudiar su medio de cultivo (C).

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC Directo (ufc / placa) A C 239 54 232 33 >200 11 190 37 >200 48 175 60 >200 56 163 48 231 43 123 53

Ácido (ufc / placa) A C 118 21 180 22 (235) 2 125 19 (272) 22 121 36 173 23 90 19 144 9 117 14

Calor (ufc / placa) A C 18 1 46 2 12 0 25 0 15 0 37 1 17 0 13 0 5 0 2 0

Recuento (ufc / L) A C 2,4e+05 5,4e+04 2,3e+05 3,3e+04 >2,2e+05 1,1e+04 1,9e+05 3,7e+04 >2,2e+05 4,8e+04 1,8e+05 6,0e+04 2,0e+05 5,6e+04 1,6e+05 4,8e+04 2,3e+05 4,3e+04 1,3e+05 5,3e+04

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC 6 5 4 3

A C

2 1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

30

MEDIOS DE CULTIVO GVPC Directo (ufc / placa)

Ácido (ufc / placa)

Calor (ufc / placa)

Recuento (ufc / L)

A

D

A

D

A

D

A

D

>200

94

174

37

11

5

>2,0e+05 9,4e+04

54

17

64

5

9

0

7,1e+05

1,7e+04

72

41

77

36

2

1

3,4e+05

1,6e+04

95

22

91

18

4

0

2,0e+05

4,4e+04

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC 6 5 4 3

A D

2 1 0

1

2

3

4

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC

Directo (ufc / placa)

Recuento (ufc / L)

A

B

C*

A

B

C*

71

49

155

7,1e+03

4,9e+03

1,6e+04

38

41

33

3,8e+03

4,1e+03

3,3e+03

86

74

195

8,6e+03

7,4e+03

2,0e+04

66

54

109

6,6e+03

5,4e+03

1,1e+04

57

73

86

5,7e+03

7,3e+03

8,6e+03

60

1,0e+03

10

6,0e+03

36

11

67

3,6e+03

1,1e+03

6,7e+03

19

7

43

1,9e+03

7,0e+02

4,3e+03

85

58

161

8,5e+03

5,8e+03

1,6e+04

117

91

175

1,2e+04

9,1e+03

1,8e+04

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC

5 4 3

A B

2

C*

1 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

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MEDIOS DE CULTIVO Los precios de tarifa del medio de cultivo dependiendo de la casa comercial son: MEDIO

Nº Placas

A

B

C*

D

GVPC

20

34,55

35,06

34.80

25.97

BCYE (cys+)

10

16,50 (15,73) (15,20) (13,12)

20

(33,00) 31,46

30,40

26,24

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MEDIOS DE CULTIVO Conclusiones 1. El medio A es el que da los recuentos más elevados. 2. El medio B se acerca a los resultados obtenidos por el medio A, pero las morfologías coloniales que crecen son de un mayor diámetro y su descripción no es tan clara.

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MEDIOS DE CULTIVO GVPC 3. Una vez modificado el medio C, éste pasa a dar el mejor recuento. Sin embargo, el tiempo de incubación que se necesita para el medio A es menor que para el medio C. Las colonias del medio C son más pequeñas y tardan entre 2 y 4 días más que el medio A en poder diferenciarse morfológicamente. Si existe mucha microbiota acompañante, ésta suele crecer antes que Legionella y podría enmascarar su presencia.

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MEDIOS DE CULTIVO Conclusiones 4. No todos los medios de cultivo podrían utilizarse para todas las muestras. El medio de cultivo C* funcionaría bien para muestras con poca microbiota acompañante, pero el medio A funciona mejor en muestras con más microbiota acompañante. 5. Los precios de los medios de cultivo son muy variables. Clara influencia en el coste del análisis.

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CONCLUSIONES Hay una dificultad evidente en establecer un precio para el análisis de Legionella. Este depende claramente del tipo de muestra y del grado de contaminación que tiene. La diferencia del precio de los medios de cultivo que se utilizan representan una dificultad adicional. Comprobar las recuperaciones que se obtienen con los medios de cultivo comercializados.

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Agradecer al personal de la Unidad de Microbiología el trabajo que han realizado.