REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD RAFAEL URDANETA FACULTAD DE INGENIERÍA ESCUELA DE INGENIERÍA QUIMICA

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DETERMINACIÒN DE LA CAPACIDAD DE REMOCIÒN DE GASOIL POR UN CONSORCIO MICROALGAL PROVENIENTE DE LA ISLA DE TOAS, MUNICIPIO ALMIRANTE PADILLA, ESTADO ZULIA.

Trabajo Especial de Grado presentado ante la Universidad Rafael Urdaneta para optar al título de: INGENIERO QUÍMICO.

Autores: Br. CINTHIA DURAN Br. ISIS SANGUINO

Tutor:

Maracaibo, octubre de 2014.

Dra. Laugeny Díaz

DEDICATORIA

A Dios.

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A nuestros padres, hermanos y familiares cercanos.

A nuestros amigos.

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AGRADECIMIENTO.

La realización de un trabajo especial de grado es una experiencia única, en la que se comparten momentos y vivencias con un gran número de personas, que directa

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o indirectamente participan en la investigación realizada. Por ello, quisiéramos mostrar nuestro agradecimiento a todas las personas que han intervenido:

ER S E R A nuestra tutora, la profa. Dra. Laugeny Díaz Borrego, por habernos ofrecido este S O Hpuertas del laboratorio, gracias por habernos tema de investigación y abierto las C E EdeRla biorremediación del medio ambiente, así como la iniciado en el D tema investigación científica, campo desconocido por nosotras.

A la Ing. Desiree Alburgue,

por habernos prestado su colaboración y apoyo

excepcional desde el inicio de este trabajo, incluyendo los momentos experimentales más pesados, sabemos que hemos ganado una amiga.

A la profa. MSc. Alexandra Vera por habernos ayudado en la realización de los análisis de DQO, así como el suministro de reactivos utilizados en este parámetro.

A todo el equipo de investigación del Laboratorio de Microorganismos fotosintéticos del departamento de Biología, profesores y tesistas, pese a que éramos estudiantes de otra universidad y de otra carrera, siempre estuvieron dispuestos a aclarar cualquier duda y prestarnos su colaboración en lo que necesitáramos a nivel experimental. Por ello, siempre tendrán nuestro cariño y aprecio.

En general, agradecemos a La Universidad del Zulia por habernos permitido el uso de sus instalaciones para la ejecución de la fase experimental de este trabajo.

INIDICE GENERAL

RESUMEN

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ABSTRACT

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Pág.

INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 13

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CAPÍTULO I .......................................................................................................... 16

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1.1. Planteamiento del problema ........................................................................................ 16 1.2. Objetivos ......................................................................................................................... 19

1.2.1. Objetivo general .................................................................................... 19 1.2.2. Objetivos específicos ............................................................................ 19 1.3. Justificación .................................................................................................................... 19 1.4. Delimitación .................................................................................................................... 21

1.4.1. Delimitación espacial ............................................................................ 21 1.4.2. Delimitación temporal ........................................................................... 21 1.4.3. Delimitación científica ........................................................................... 21 CAPITULO II ......................................................................................................... 22 2.1. Antecedentes ................................................................................................................. 22 2.2. Bases Teóricas. ............................................................................................................. 26

2.2.1. Generalidades sobre el gasoil. ............................................................. 26 2.2.2. El gasoil como contaminante. ............................................................... 28 2.2.3. Los microorganismos. ........................................................................... 29 2.2.4 Las microalgas. ...................................................................................... 29 2.2.4. Biodegradación. .................................................................................... 42 2.2.5. Biorremediación. ................................................................................... 44 2.2.6. Biodegradación de hidrocarburos por consorcios microbianos. ............ 47

2.3 Sistema de variables. ..................................................................................................... 52

CAPITULO III ........................................................................................................ 53 3.1.

Tipo de investigación.................................................................................................. 53

3.2.

Diseño de investigación. ........................................................................................... 54

3.3 Técnicas de recolección de datos ................................................................................. 55

S O D A medios 3.4.1 Indicador del escalamiento del consorcio microalgal empleando V R E para el crecimiento de cultivo artificiales y condiciones fisicoquímicasS óptimas E R microbiano. ..................................................................................................... 56 S O Hdel gasoil en el crecimiento, producción de C 3.4.2 Indicadores delE efecto ER bioquímica del consorcio microalgal mediante pigmentos D y composición técnicas estandarizadas de laboratorio........................................................... 58

3.4 Instrumentos de recolección de datos. ......................................................................... 56

3.4.3. Indicadores del porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del gasoil por el consorcio microalgal empleando el método gravimétrico, se utilizó el siguiente instrumento. ................................................................................. 63 3.5 Fases de la investigación. .............................................................................................. 64

3.5.1 Fase I: Escalamiento del consorcio microalgal empleando medios de cultivo artificiales y condiciones fisicoquímicas óptimas para el crecimiento microbiano. ..................................................................................................... 65 3.5.2 Fase II: Evaluación el efecto del gasoil en el crecimiento, producción de pigmentos y composición bioquímica del consorcio microalgal mediante técnicas estandarizadas de laboratorio........................................................... 70 3.5.3 Fases III: Cuantificación del porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del gasoil por el consorcio microalgal empleando el método gravimétrico. ................................................................................................... 80 Análisis Estadístico ............................................................................................... 83 CAPITULO IV ........................................................................................................ 85 4.1 Escalar el consorcio microalgal empleando medios de cultivo artificiales y condiciones fisicoquímicas óptimas para el crecimiento microbiano. .............................. 85 4.2 Evaluar el efecto del gasoil en el crecimiento, producción de pigmentos y composición bioquímica del consorcio microalgal mediante técnicas estandarizadas de laboratorio. ............................................................................................................................. 88

4.2.1 Efecto del gasoil sobre el crecimiento microalgal del consorcio (densidad celular). ........................................................................................................... 88 4.2.2 Efecto del gasoil sobre la producción de pigmentos del consorcio microalgal. ...................................................................................................... 98 4.2.3 Efecto del gasoil sobre la composición bioquímica del consorcio microalgal. .................................................................................................... 102

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CONCLUSIONES. ............................................................................................... 112

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RECOMENDACIONES ....................................................................................... 114

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 115

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ANEXOS ............................................................................................................. 127

INDICE DE TABLAS

Tabla 2.1 Productos generalmente obtenidos del refinado (Ortega, 2012) ........... 27 Tabla 2.2 Propiedades del gasoil (Martín y Salas, 2004) ...................................... 27

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Tabla 2.3 Determinación de la capacidad de remoción de gasoil por un consorcio

ER S E R S Zulia. ..................................................................................................................... 52 O H C E R E Tabla 3.1 Condiciones D fisicoquímicas y medios de cultivo del consorcio microalgal. microalgal proveniente de la Isla de Toas, Municipio Almirante Padilla, Estado

.............................................................................................................................. 57 Tabla 3.2 Densidad celular (cel/mL) ...................................................................... 58 Tabla 3.3 Bacterias asociadas (UFC/mL) .............................................................. 59 Tabla 3.4 Clorofila Total (µg/mL) ........................................................................... 59 Tabla 3.5 Carotenoides totales (µg/mL) ................................................................ 60 Tabla 3.6 Carbohidratos totales (µg/mL) ............................................................... 61 Tabla 3.7 Lípidos totales (µg/mL) .......................................................................... 62 Tabla 3.8 Proteínas totales (µg/mL) ...................................................................... 62 Tabla 3.9 Hidrocarburos Totales (%M/V) .............................................................. 63 Tabla 3.10 Demanda química de Oxigeno ............................................................ 64 Tabla 3.11 Diseño experimental de biorremoción de gasoil por parte del consorcio microalgal. ............................................................................................................. 71

Tabla 3.12 Curva patrón expresada en µg/ µL ...................................................... 76 Tabla 3.13 Curva patrón ........................................................................................ 78 Tabla 3.14 Curva patrón (mg/ µL). ........................................................................ 79

S O D Tabla 4.2 Densidad celular de la microalga Oocystis sp. x10 (cel/mL) A................ 92 V R SE E Tabla 4.3 Densidad celular la microalga Chlorella sp. x10 (cel/mL) ..................... 93 R S O H C E Tabla 4.4 Bacterias asociadas x10 (UFC/mL)...................................................... 96 R DE Tabla 4.1 Densidad celular total x106 (cel/mL) ...................................................... 89 6

6

8

Tabla 4.5 Clorofila Total (µg/mL) ........................................................................... 99 Tabla 4.6 Carotenoides totales (µg/mL) .............................................................. 101 Tabla 4.7 Carbohidratos totales (µg/mL). ........................................................... 103 Tabla 4.8 Lípidos totales (µg/mL) ........................................................................ 104 Tabla 4.9 Proteínas totales (µg/mL) .................................................................... 106 Tabla 4.10 Hidrocarburos totales (HCT) (%m/v) ................................................. 108 Tabla 4.11 Demanda química de Oxigeno (DQO) (%m/v) .................................. 110

INDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Resultado del análisis de ANOVA para la densidad total de la microalga Chlorella sp realizado por el programa SPSS 15.0 ............................................. 128

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Anexo 2. Resultado del análisis de ANOVA para la densidad celular de la

R E S E Anexo 3. Resultado del análisis de ANOVAR para la densidad celular total del S HO C consorcio microalgal realizado por el programa SPSS 15.0 ............................... 129 E DER

microalga Oocysti sp realizado por el programa SPSS 15.0. .............................. 128

Anexo 4. Resultado del análisis de ANOVA para clorofila total realizado por el programa SPSS 15.0 .......................................................................................... 129 Anexo 5. Resultado del análisis de ANOVA para carotenoides totales realizado por el programa SPSS 15.0. ...................................................................................... 130 Anexo 6. Resultado del análisis de ANOVA para bacterias asociadas realizado por el programa SPSS 15.0 ....................................................................................... 130 Anexo 7. Resultado del análisis de ANOVA para proteínas totales realizado por el programa SPSS 15.0 .......................................................................................... 130 Anexo 8. Resultado del análisis de ANOVA para carbohidratos totales realizado por el programa SPSS 15.0................................................................................. 131 Anexo 9. Resultado del análisis de ANOVA para lípidos totales realizado por el programa SPSS 15.0 .......................................................................................... 131

Anexo 10. Resultado del análisis de ANOVA para hidrocarburos totales realizado por el programa SPSS 15.0................................................................................. 131 Anexo 11. Resultado del análisis de ANOVA para pH realizado por el programa SPSS 15.0 ........................................................................................................... 132

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Anexo 12. Resultado del análisis de correlación lineal entre hidrocarburos totales y

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DQO realizado por el programa SPSS 15.0 ........................................................ 132

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Anexo 13. Resultado del análisis de correlación lineal entre clorofila total y

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densidad celular total, realizado por el programa SPSS 15.0 ............................. 132 Anexo 14. Montaje del ensayo de biorremediación. ............................................ 133 Anexo 15. Monitoreo de ensayo de biorremediación. ......................................... 133 Anexo 16. Análisis DQO. ..................................................................................... 134 Anexo 17. Áreas del laboratorio de microorganismos fotosintéticos: cultivo (izquierda), siembra y transcripción de datos (derecha). ..................................... 134 Anexo 18. Equipos y reactivos utilizados durante el trabajo especial de grado. . 135 Anexo 19. Resultados proporcionados por el laboratorio TEAMB, C.A. .............. 136 Anexo 20. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20th edition (Métodos estándar para la examinación de agua y agua residual, edición 20), método 5520 oil and grease (aceites y grasas), secciones C y F. .......... ¡Error! Marcador no definido.

Duran Osorio Cinthia Katherin, Sanguino Vega Isis Angélica. DETERMINACIÒN DE LA CAPACIDAD DE REMOCIÒN DE GASOIL POR UN CONSORCIO MICROALGAL PROVENIENTE DE LA ISLA DE TOAS, MUNICIPIO ALMIRANTE PADILLA, ESTADO ZULIA. Universidad Rafael Urdaneta. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ingeniería Química. Estado Zulia, Maracaibo Venezuela, 2014. p 131

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ER S E R Esta investigación se realizó con la finalidad de determinar la capacidad de S O remoción de gasoil por un consorcio microalgal (Chlorella sp. y Oocystis sp) H C E proveniente de la Isla R municipio Almirante Padilla, Estado Zulia. Donde, E de Toas, se escaló dichoD consorcio, empleando un medio de cultivo compuesto por Algal 8 RESUMEN

mM (16 mL/mL) y Nitrofoska (0,5 mL/mL), renovados aproximadamente cada 10 días y en condiciones fisicoquímicas óptimas para el crecimiento microbiano, tales como: fotoperíodo luz: oscuridad 12:12 h (4klux), agitación manual diaria y temperatura de 30 ± 2° C en condiciones asépticas. Luego de haber realizado el escalamiento, se procedió a diluir la biomasa en el medio de cultivo hasta obtener una densidad celular (dc) de 2x106cel/mL para un volumen de 7200 mL, que fue distribuido en fiolas de vidrio con capacidad de 500 mL para los tratamientos con 0,% (control) 0,25%, 0,5% y 1% de gasoil por volumen de biomasa. Posteriormente, se evaluó el efecto del gasoil en el crecimiento mediante el monitoreo de las microalgas del consorcio, iniciando los tratamientos con una dc aproximada de 2x106 cel/mL, en una proporción aproximada de 5:1, a su vez se registraron los cambios de pH del medio de cultivo durante todo el ensayo y conteo de bacterias asociadas, producción de pigmentos (clorofila total y carotenoides totales) y composición bioquímica (carbohidratos totales, lípidos totales y proteínas totales) del consorcio microalgal mediante técnicas estandarizadas de laboratorio. Finalmente, se cuantificó el porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del gasoil por el consorcio microalgal empleando el método gravimétrico. Se obtuvo el siguiente orden de remoción de hidrocarburos: al 0,25% (71,85±0,26 %), 0,5% (68,91±1,38%) y 1% (62,58±2,06 %).El gasoil afectó el crecimiento, la producción de pigmentos y la composición bioquímica microalgal a bajas concentraciones, recomendando su uso en experimentos de biorremediación.

Palabras Claves: consorcio microalgal, gasoil, biorremediación. Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Duran Osorio Cinthia Katerin, Sanguino Vega Isis Angélica. DETERMINATION OF THE REMOVAL CAPACITY OF DIESEL BY A MICROALGAL CONSORTIUM FROM ISLA DE TOAS, ALMIRANTE PADILLA MUNICIPALITY, ZULIA STATE. Universidad Rafael Urdaneta. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ingeniería Química. Estado Zulia, Maracaibo Venezuela, 2014. p 131

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ER S E R In this research was made in order to determinate the removal capacity of diesel by S O a microalgal consortium (Chlorella sp., Oocystis sp.) from Isla de Toas, Almirante H C E Padilla municipality, Zulia State. To develop it, the microalgal consortium was ERculture scaled using anD artificial media, such as a solution of Algal 8 mM (16 mL / l) ABSTRACT

and Nitrofoska (0,5 mL/mL), added approximately every 10 days and following optimal physic-chemical conditions for microbial growth such as light:dark cycles 12:12 h (4klux), daily manual agitation and 30 ± 2 °C temperature in aseptical conditions. After the scaling-up phase, the biomass was diluted until the total cell density (cd) of 2x106 (cells/mL) was reached, with the purpose of obtain a 7200 mL volume, which was distributed in 500 mL glass vials for the treatments with a diesel/biomass proportion of 0% (control), 0,25%, 0,5% and 1%. Subsequently, the diesel effect on growth was evaluated through cd monitoring of the different genera found it, starting all treatments with a 2x106 (cells/mL) total cd with a 5:1 proportion, at the same time, pH, associated bacterias, pigments production (total chlorophyll and total carotenoids) and biochemical composition (total carbohydrates, total lipids and total proteins) were registered during the whole assay, following standards techniques. Finally, the removal percent of total hydrocarbons from diesel by the microalgal consortium was quantified, which was obtain to different treatments in the following removal order: 0,25% (71.85 ± 0.26 %), 0,5% (68.91 ± 1,38 %) and 1% (62.58 ± 2.06 %). Growth, pigments production and biochemical composition were affected by lower concentrations of diesel, therefore, the microalgal consortium could be used in bioremediation experiments.

Key Words: microalgal consortium, diesel, bioremediation. E-mail: [email protected], [email protected]

INTRODUCCIÓN

S O D A a las utilizada. No obstante, la descarga de petróleo y sus productos derivados V R SE ha planteado un corrientes naturales de aguas superficialesR y E subterráneas S O problema de gran relevancia debido a su toxicidad y bioacumulación en las H C E R cadenas tróficas. (Garza, 1998) DE

En la actualidad, no existe fuente energética alguna que no implique un costo ambiental. Los combustibles fósiles continúan siendo la principal fuente de energía

El petróleo se caracteriza, por ser una matriz contaminante que contiene una elevada diversidad de compuestos, por lo que es un sustrato ideal para evaluar el potencial catabólico de cepas o consorcios microbianos de interés en biorremediación (Viñas, 2005).

Gutiérrez y Herrera (2001) definen a la ingeniería ambiental como la rama de la ingeniería química que se basa en el diseño, aplicación, gestión de procesos, productos y servicios tecnológicos para la prevención, control y remediación de problemas de degradación ambiental; para el desarrollo del uso sustentable de recursos naturales en procesos productivos y de consumo, teniendo siempre como prioridad la excelente calidad de vida en nuestro entorno.

En tal sentido, se han desarrollado tecnologías fundamentadas en los procesos biológicos como alternativas viables en la eliminación parcial o total de diferentes contaminantes formados por compuestos orgánicos. Estos procesos utilizan principalmente microorganismos autóctonos del ambiente que se desea remediar para evitar interferir con el balance del ecosistema. De acuerdo con Díaz et al.

(2012), son pocos los trabajos de publicados en Venezuela sobre el uso de consorcios microalgales para la recuperación de ambientes contaminados con

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hidrocarburos derivados del petróleo. Por todo lo anteriormente expuesto, esta investigación se enfocó en la proposición de un paquete tecnológico que incluye microorganismos autóctonos y condiciones de cultivo a escala de laboratorio que potencien la degradación de combustibles,

por lo que el objeto principal de

estudio está basado en la determinación de la capacidad de remoción de gasoil

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por un consorcio microalgal proveniente de la Isla de Toas, municipio Almirante Padilla, Estado Zulia.

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O H C E cultivo artificiales y R condiciones fisicoquímicas óptimas para el crecimiento E D microbiano; así mismo, se evaluó el efecto del gasoil en el crecimiento, producción

Para lograr el cometido, se escaló el consorcio microalgal empleando medios de

de pigmentos y composición bioquímica del consorcio microalgal mediante técnicas estandarizadas de laboratorio y finalmente se cuantificó el porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del gasoil por el consorcio microalgal empleando el método gravimétrico. Es por ella que esta investigación, permitió ampliar los conocimientos existentes sobre la remediación de medios acuáticos contaminados con hidrocarburos en el estado Zulia, utilizando microalgas como agente de remoción.

El cuerpo de este trabajo especial de grado consta de cuatro capítulos, donde, en el capítulo I, se plantea el problema que la originó, así mismo, los objetivos generales y específicos, justificación de la misma y su delimitación.

En el capítulo II, se contempla el marco teórico, donde se exponen los antecedentes de investigaciones anteriores que sirvieron de base para este estudio. Igualmente, se presentan las bases teóricas que comprenden definiciones de términos básicos y cuadro de variables que exponen los indicadores de cada objetivo ejecutado.

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El capítulo III, está conformado por el marco metodológico, el cual consta del tipo y diseño de la investigación, técnicas e instrumentos de recolección de datos y las fases del trabajo especial de grado.

En el capítulo IV, corresponde al análisis de los resultados, conclusiones

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recomendaciones que permitieron concluir satisfactoriamente esta investigación.

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y

CAPÍTULO I EL PROBLEMA

S O D Arealizada. generales y específicos, justificación y delimitación de la investigación V R SE E R S O H C E 1.1. Planteamiento del problema R DE

En este capítulo se plantea el problema de este trabajo de grado, objetivos

Durante décadas no se consideró que la industrialización, además de propiciar el bienestar para la población, producía también una degradación de los sistemas naturales. En la actualidad, no existe fuente energética alguna que no implique un costo ambiental. Los combustibles fósiles continúan siendo la principal fuente de energía utilizada. No obstante, la descarga de petróleo y sus productos derivados a las corrientes naturales de aguas superficiales y subterráneas ha planteado un problema de gran relevancia debido a su toxicidad y bioacumulación en las cadenas tróficas. (Garza, 1998)

En relación a la contaminación acuática, Grimaldo (2009) señala que:

Los derrames de petróleo, cada día son más frecuentes en los océanos dejando estelas de contaminación de efectos a muy largo plazo. La formación de una película impermeable sobre el agua en las zonas de derrame afecta rápida y directamente a las aves y a los mamíferos acuáticos, al impedir el intercambio gaseoso y desviar los rayos luminosos que aprovecha el fitoplancton para llevar a cabo el proceso de fotosíntesis.

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Adicionalmente, la contaminación por petróleo crudo o por petróleo refinado (combustóleo, gasolina, y otros productos obtenidos por refinación fraccionada y procesamiento químico del petróleo crudo) es generado accidental o deliberadamente desde diferentes fuentes. Algunos investigadores refieren que la mayor parte de estos accidentes provienen de derrames de buques-tanques y de las fugas en los equipos de perforación marina; sin embargo, otros consideran que casi el 50% del petróleo que llega a los mares y océanos proviene de tierra firme, del que es arrojado al suelo por las personas en las ciudades y en zonas industriales que luego son arrastradas en las corrientes fluviales hasta terminar en los océanos.

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HO C E zonas acuíferas contaminadas ER aunque se considera que por la importancia de la D actividad petrolera en el país, la cifra es elevada para afluentes dulces y salados. En la República Bolivariana de Venezuela se desconoce la dimensión real de las

Isla de Toas se encuentra localizada al sur del Golfo de Venezuela, y es considerada como la segunda isla de mayor tamaño del Municipio Almirante Padilla del estado Zulia. Esta comunidad isleña, ha venido experimentando un notable incremento en la actividad pesquera y desarrollo turístico-costero. Las embarcaciones constituyen el medio de transporte utilizado como conexión entre la isla y otras localidades, las cuales tienen al Puerto de Lanchas como espacio destinado y orientado al flujo de mercancía y pasajeros. En esta área, frecuentemente se presentan derrames del combustible gasoil debido a los motores fuera de borda empleados en las embarcaciones. Estas acciones antropogénicas afectan directamente a las especies de dicha localidad puesto que contaminan el ecosistema lacustre causando daños a los organismos que habitan en la zona, lo que puede afectar la salud de los pobladores y turistas que visitan la isla (IVIC, 2013).

Afortunadamente, la naturaleza tiene mecanismos de autorregulación; cuando un ecosistema es dañado o perturbado por la presencia de cualquier agente físico, químico o biológico, ésta utiliza mecanismos de recuperación, como bacterias,

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hongos y algunas plantas y algas que pueden degradar a los agentes dañinos. De esta intrínseca capacidad para superar algunos desequilibrios en el ecosistema, surge la biorremediación, la cual es una técnica de descontaminación muy utilizada actualmente. Se basa en el uso de diferentes organismos plantas, levaduras, hongos, microalgas y bacterias para neutralizar sustancias tóxicas, bien

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transformándolas en sustancias de carácter menos toxico o bien convirtiéndolas

ER S E R biodegradables en suelos y aguas residuales. (Gómez et al., 2008). S O H C E R E D Los microorganismos adaptados a ambientes contaminados tienen la capacidad en inocuas para el medio ambiente y la salud humana. Este tipo de tratamiento

puede ser muy efectivo en la eliminación de compuestos orgánicos tóxicos y

de degradar los desechos en productos menos tóxicos, además de concentrar e inmovilizar sustancias tóxicas, metales pesados, minimizar desechos industriales y rehabilitar áreas afectadas con diversos contaminantes. En tal sentido, se han desarrollado tecnologías fundamentadas en los procesos biológicos como alternativas viables en la eliminación parcial o total de diferentes compuestos orgánicos. Estos procesos utilizan principalmente microorganismos autóctonos del ambiente que se desea remediar para evitar interferir con el balance del ecosistema (Araujo et al ,2002).

En los últimos años ha comenzado a implementarse la utilización de microalgas como agentes de biorremoción de contaminantes petrolizados, debido a que éstas proveen de oxígeno y nutrientes a otros microorganismos para potenciar la degradación de materia orgánica. No obstante, las investigaciones aún son escasas; por lo que, este trabajo de investigación permitirá enriquecer la literatura existente sobre este tópico incorporando nuevos aportes al conocimiento de la biotecnología con microalgas en Venezuela.

20

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo general

Determinar la capacidad de remoción de gasoil por un consorcio microalgal

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proveniente de la Isla de Toas, municipio Almirante Padilla, Estado Zulia.

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1.2.2. Objetivos específicos

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1.2.2.1. Escalar el consorcio microalgal empleando medios de cultivo artificiales y condiciones fisicoquímicas óptimas para el crecimiento microbiano.

1.2.2.2. Evaluar el efecto del gasoil en el crecimiento, producción de pigmentos y composición

bioquímica

del

consorcio

microalgal

mediante

técnicas

estandarizadas de laboratorio.

1.2.2.3. Cuantificar el porcentaje de remoción de hidrocarburos totales del gasoil por el consorcio microalgal empleando el método gravimétrico.

1.3. Justificación

La investigación permitió ampliar los conocimientos existentes sobre la remediación de medios acuáticos contaminados con hidrocarburos en el estado Zulia, utilizando microalgas como agente de remoción. Para ello se utilizó un consorcio microalgal aislado de aguas costeras, contaminadas con gasoil, de Isla de Toas y en el laboratorio se simularon los mismos parámetros biológico y fisicoquímicos de dicho ecosistema acuático como lo son: temperatura,

21

fotoperíodos de luz/oscuridad, aireación, suministro de nutrientes, control de pH y salinidad, lo que garantizó el proceso de degradación del combustible gasoil por las microalgas en condiciones aproximadas a la realidad.

Se pudo evaluar el efecto que ejercen los hidrocarburos del gasoil sobre el

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crecimiento, productividad de pigmentos y composición bioquímica (proteínas,

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carbohidratos y lípidos totales) del consorcio microalgal.

HO C E microalgas autóctonas ERcon capacidad de degradación de hidrocarburos, además D de valorar su contribución como productores primarios del ecosistema acuático.

Adicionalmente se pudo enriquecer la escasa literatura sobre el inventario de

Se propuso un paquete tecnológico que incluye: microorganismos autóctonos y condiciones de cultivo a escala de laboratorio que potencien la degradación de combustibles. Además se destacó el papel de microorganismos autóctonos en procesos de biorremoción de contaminantes, lo cual es una alternativa económica y de bajo impacto a los ecosistemas.

La información que se generó con este proyecto servirá para soportar futuras investigaciones destinadas a la búsqueda de una tecnología de biorremediación ex situ para recuperar las aguas costeras Isla de Toas, que sea de bajo costo e impacto al ecosistema lacustre, con la que se beneficiarán aproximadamente 1700 pobladores de la Isla y cientos de turistas que asisten a regularmente a este sitio con fines recreativos.

22

1.4. Delimitación

1.4.1. Delimitación espacial

La investigación se realizó en el Laboratorio de Microorganismos Fotosintéticos

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perteneciente al Departamento de Biología, adscrito a la Facultad Experimental de

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1.4.2. Delimitación temporal

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Ciencias de la Universidad del Zulia.

Se llevó a cabo desde el mes de septiembre del 2013 hasta el mes de agosto de 2014.

1.4.3. Delimitación científica

Se aplicaron conocimientos obtenidos a lo largo de la carrera, en las asignaturas: Ecología y Contaminación, Ingeniería Ambiental, Estadística, Química I, Química II, Química Analítica y Principios de Bioingeniería.

23

CAPITULO II MARCO TEORICO

S O D Aconforman las V conceptos y fórmulas empleadas a lo largo del mismo, los R cuales SE E bases teóricas necesarias para el entendimiento de esta investigación. R S O H C E R DE

En este capítulo se hace una breve explicación de los antecedes que sirvieron de fundamento para este trabajo especial de grado. Igualmente se presentan

2.1. Antecedentes

Díaz-Borrego, Vera, Marín, Aiello-Mazzarri, Briceño, Morales (2012). Efecto del queroseno y de la concentración de nutrientes en el crecimiento de un cultivo mixto de microalgas (Chlorophyta). Artículo publicado en la revista de la Universidad del Zulia. Volumen 3, No 6.

En esta investigación se evaluó el efecto combinado del queroseno y la concentración de nutrientes (Nitrofoska®, NPK) en el crecimiento de un cultivo mixto de microalgas (Coenochloris sp. y Chlorococcum sp.), aisladas de una fosa petrolera. Se realizaron cuatro tratamientos a distintas concentraciones de queroseno y NPK, Q0,5-1; Q0,5-3; Q0,1-1; Q1-3; y se utilizaron dos muestras controles: sin queroseno y a distintas concentraciones de NPK, C-1 y C-3. Los cultivos se evaluaron cada 4 días, midiendo el pH, peso seco, densidad celular, pigmentos e hidrocarburos totales (TPH). Con Q0,5-1 se inhibió el crecimiento de Coenochloris sp. Y Chlorococcum sp. en un 32,99 y 42,29%, respectivamente. Con Q0,5-1, Q0,5-3 y Q1-1 no se afectó la producción de pigmentos, pero si el crecimiento microalgal. La biodegradación de TPH fue de 68% en Q0,5-1 y Q0,5-3 y

del

42,71

y

56,73%

en

Q1-1

y

Q1-3,

respectivamente.

24

La investigación anteriormente descrita, sirvió de referencia para este estudio, debido a que la metodología utilizada fue similar a la empleada en este trabajo, ya que se determinó densidad celular de los cultivos, se realizaron recuentos celulares en cámara Neubaüer de acuerdo a Lobban, C., Chapman, D., Kremer, B. (1988). Se realizaron determinaciones de biomasa (peso seco) (Utting, 1985),

S O D VA

pigmentos (clorofila total (a+b) y carotenoides totales). Adicionalmente, al igual

R

que en este estudio, se determinó el contenido de hidrocarburos totales del

SE E R S

petróleo (HCT) al inicio y al final de las experiencias realizando un análisis

Araujo,

D

Romero,

O

H C E ER

gravimétrico.

Cárdenas,

Angulo,

Morillo,

Navarro,

Méndez

(2002).

Biorremediación de aguas contaminadas con derivados de hidrocarburos utilizando cepas bacterianas autóctonas. Artículo presentado en el XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental Cancún, México.

Se tomaron muestras de agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitán Chico, Edo. Zulia y se lograron aislar 16 cepas bacterianas, las cuales fueron probadas en su capacidad para degradar hidrocarburos, mediante un ensayo de factibilidad utilizando gasoil como única fuente de carbono. Se seleccionaron 07 de las cepas que lograron degradar entre 50 a 70% de los hidrocarburos presentes en el gasoil y se realizaron pruebas de identificación con el propósito de conocer algunas de sus características bioquímicas. Posteriormente, se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se evaluó su capacidad para degradar hidrocarburos a través de un estudio de biotratabilidad en tanques plásticos de 25 L conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inóculo), un aceite lubricante en una concentración de 7000 mg/mL y agua potable hasta un obtener un volumen de 20 L. En 4 de los tanques se instalaron sistemas de aireación inducidos desde el fondo y adicionalmente, se evaluó la incidencia del nitrógeno y fósforo (fertilización). Se determinaron mensualmente los contajes

25

bacterianos, los hidrocarburos totales y el contenido de nitrógeno y fósforo total y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y al final del ensayo. Los resultados indicaron que en los tanques inoculados, fertilizados y aireados se lograron las mayores remociones, hasta un 89 % de los hidrocarburos totales y la transformación de todas las

S O D VA

fracciones presentes en el aceite, demostrando la eficiencia del cultivo bacteriano

R

en la biorremediación de agua contaminada con hidrocarburos.

SE E R S

O H C E estudio de biotratabilidad R en aguas contaminadas con hidrocarburos, donde se E D preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y aisladas del

Esta investigación sirvió como antecedente a este estudio, ya que se realizó un

agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitán Chico, Edo. Zulia. Al igual que en esta investigación, se evaluó su capacidad para degradar hidrocarburos. Así mismo, se determinaron mensualmente los contajes bacterianos, los hidrocarburos totales y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y al final del ensayo.

Acuña, Pucci G., Pucci O., Morales (2010). Biodegradación de petróleo y sus derivados por la comunidad bacteriana en un suelo de la Patagonia Argentina. Artículo publicado en la Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología. Volumen 30. No 1.

El objetivo de este trabajo fue caracterizar una muestra de suelo proveniente de un sistema de biorremediación en actividad y determinar la capacidad de la comunidad bacteriana de biodegradar petróleo y sus destilados, e identificar los principales microorganismos involucrados en el proceso. Para esto se tomó una muestra de suelo por la técnica de lanfarming y se caracterizaron sus propiedades físicas, químicas y microbiológicas; así como el tipo de hidrocarburos que contenía por extracción con Soxhlet y cromatografía en columna de sílica gel. A partir de la

26

muestra se extrajo la comunidad bacteriana, y se determinó su potencial para biodegradar petróleo, sus diferentes fracciones y los destilados comerciales que se obtienen a partir de él.

En este trabajo sirvió de referencia para esta investigación, debido a se utilizaron

S O D microorganismos y medición de densidad óptica, así mismo, seA determinó el V R E potencial de la comunidad bacteriana autóctona E para petróleo, sus Sbiodegradar R S en un suelo de la Patagonia de diferentes fracciones y destilados comerciales O H C E Argentina. R DE métodos indirectos de medición del crecimiento bacteriano por conteo de

Verma, Bhargana, Pruthi (2006). Degradación de lodo petrolizado por bacterias provenientes de Ankleshwar, India. Artículo publicado por La Revista Oficial de la Sociedad Internacional de Biodeterioro y Biodegradación. Volumen 57, edición 4.

Tres cepas bacterianas, Bacillus sp. (SV9), Acinetobacter sp. (SV4) y Pseudomonas sp. (SV7) provenientes de suelos contaminados en Ankleshwar, India, fueron probadas por su habilidad para degradar una mezcla compleja de hidrocarburos del petróleo (tales como alquenos, aromáticos, resinas y asfaltenos), sedimentos, metales pesados conocida como lodos petrolizados. El análisis gravimétrico mostró que Bacillus sp. (SV9) degradó aproximadamente el 59% de los lodos petrolizados en 5 días a 30 °C; mi entras que, Acinetobacter sp. (SV4) y Pseudomonas sp. (SV7) degradaron 37% y 35% respectivamente. Un análisis de cromatografía de gas capilar reveló que después de 5 días la cepa de Bacillus sp. fue capaz de degradar los componentes del lodo petrolizado de cadena entre C12–C30 y aromáticos, más efectivamente que las otras dos cepas. El máximo descenso en la tensión superficial (de 70 a 28,4 mN/m) fue acompañado por una máxima producción de biosurfactante (6,7 g/mL) en Bacillus

27

sp. (SV9), luego de 72 h, colectivamente, estos resultados indican que las cepas evaluadas tienen un considerable potencial para a biorremediación del lodo petrolizado.

El estudio anteriormente descrito, se utilizó como fundamento para esta

S O D suelos contaminados de Ankleshwar, India, las cuales fueron probadas A por su V R E habilidad para degradar una mezcla compleja E de S hidrocarburos del petróleo, R metales pesado conocida como O lodoSpetrolizado. Al igual que en esta H C E investigación, se realizó un análisis gravimétrico para determinar el porcentaje de R DE remoción de hidrocarburos por las tres cepas bacterianas. investigación debido a que se probaron tres cepas bacterianas aisladas de los

2.2. Bases Teóricas.

2.2.1. Generalidades sobre el gasoil.

El gasoil, es un líquido que contiene mayor peso molecular, densidad y menor volatilidad que la gasolina, haciéndolo un líquido viscoso, de color rojizotransparente (Martin y Salas, 2004), forma parte de la fracción intermedia de destilación en el petróleo de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición entre 185-345 °C. La mayoría de los comp uestos de hidrocarburos del gasoil están en un rango C10-C18 (Kung-Hee y Kyoung-Woong, 2004). Su composición viene dada por una mezcla compleja de hidrocarburos, como alcanos cíclicos, normales y ramificados y de compuestos aromáticos (Gallego, Loredo, Llamas, Vazques y Sanchez, 2001), donde las proporciones mayormente encontradas son: parafinas 30% (n-alcanos e isoprenoides), cicloalcanos 45% y aromáticos 25%, a nivel de compuestos aromáticos se han encontrado alquilbencenos y naftenos en mayor proporción (Ortega, 2012).

28

Tabla 2.1 Productos generalmente obtenidos del refinado (Ortega, 2012)

D

R

SE E R S

O

H C E ER

S O D VA

También puede contener uno o más de los siguientes aditivos: antioxidantes, colorantes, desactivadores metálicos, disipadores de la electricidad estática, inhibidores

de

corrosión,

marcadores,

mejoradores

de

flujo,

biocidas,

desodorantes, odorizantes, preparados para la mejora del rendimiento (Martín y Salas, 2004).

Tabla 2.2 Propiedades del gasoil (Martín y Salas, 2004)

Propiedades Composición química Masa molar Estado Poder calorífico Densidad Densidad relativa Número de Metano Número de Octano Número de Cetano Viscosidad (40 ̊C) Temperatura de autoignición Punto de Ebullición Dosadoestiquiométricomasa. DosadoEstiquiométricovoL. Densidad mezcla comb/aire Límites de inflamabilidad PCI mezcla comb/aire Consumo específico habitual superior Consumo específico habitual inferior Emisiones CO2(teóricas) Adaptaciones del motor

Unidades Kg/mol MJ/kg-MJ/m3 Kcal/kg-kcal/m3 Temias/kg-Temias/m3 Kg/m3 cSt ̊C ̊C Kg aire/ kg comb M3 aire/m3comb 3 Kg/m % (vol) MJ/kg g/kwh g/kwh g/kwh sí/no

Gasoil C13,15H24,6 0,1824 Líquido 42,69-35581 10198,28-8500000 10,20-8500 840-890 0,84-0,89 40-60 3,2 200-400 180-370 14,62 10674,686 1,266 0,7-5 2,73 241,21 312,68 270,74 -

29

Este carburante está destinado a la alimentación de motores de encendido por compresión siguiendo el ciclo diesel que equipan los vehículos particulares, industriales, barcos de pesca, grandes navíos, maquinaria de obras públicas, entre otros (Wauquier, 2004). La cantidad de gasóleo Diesel se mide por el índice de cetano (IC). El cetano (n-hexadecano) se inflama muy bien en el motor Diesel y se

S O D VA

le asigna IC=100, el alfa-metilnaftaleno necesita más presión, se inflama con retraso e incompletamente y se le da IC=0 (Primo, 1996).

O

H C E ER

D

2.2.2. El gasoil como contaminante.

R

SE E R S

La contaminación se define como un desequilibro entre la entrada (producción) y la salida (descomposición) de los ecosistemas como consecuencia de una perturbación en el transporte (horizontal) de una materia que no ha sido asimilada por la evolución (Castillo et al. , 2005).

Entre los componentes más dañinos del petróleo y sus derivados, como lo es el gasoil, están los hidrocarburos aromáticos, ya que algunos actúan como venenos agudos, presentando en algunos casos actividad carcinogénica (Botello, 1978).

Según la hoja de datos de seguridad: gasoil ligero de PDVSA-DELTAVEN (2001, p.4), en su sección primera, punto 12, información ecológica: ecotoxicidad / destino ambiental, menciona:

Un análisis ambiental de la incidencia de este producto específico no se ha conducido. Sin embargo, las plantas y los animales pueden experimentar efectos dañinos o fatales cuando están cubiertos con productos derivados del petróleo. Los productos derivados del petróleo normalmente flotan sobre el agua. En medios acuáticos estancados o de fluidez lenta, una capa de estos productos puede cubrir un área de superficie muy grande. Consecuentemente, esta capa puede limitar o

30

eliminar el transporte atmosférico natural del oxígeno en el agua. Con el tiempo, si no se elimina, el agotamiento del oxígeno en el canal puede causar una pérdida de vida marina o crear un ambiente anaeróbico.

S O D A sobre los V Montaño, Sandoval, Camargo y Sánchez (2010, p. 15)R exponen SE E microorganismos lo siguiente: R S O H C E R DEmás primitivos y numerosos que existen en la Tierra, Son los seres 2.2.3. Los microorganismos.

colonizan todo ambiente: suelo, agua y aire, participan de forma vital en todos los ecosistemas y están en interacción continua con las plantas, los animales y el hombre. Son clave para el funcionamiento de los sistemas biológicos y el mantenimiento de la vida sobre el planeta, pues participan en procesos metabólicos, ecológicos y biotecnológicos de los cuales dependemos para sobrevivir y enfrentar los retos del futuro. Estos retos son gigantescos para la continuidad de la vida, en particular, para satisfacer la demanda de alimentos y medicamentos y resolver problemas ecológicos y de contaminación ambiental. Dicho de otra manera, parte de la actividad biológica esencial que permite la vida depende de los microorganismos.

2.2.4 Las microalgas.

Bajo el término de microalga se incluyen aquellos microorganismos unicelulares capaces de llevar a cabo la fotosíntesis. En esta categoría quedan agrupadas las cianobacterias (conocidas tradicionalmente como algas verdeazuladas) junto con algas eucariotas (tradicionalmente algas verdes, rojas y doradas) (Ruiz, 2011).

Los organismos que componen el fitoplancton poseen pigmentos fotosintéticos, que le permiten mediante la energía solar y la presencia de materiales

31

inorgánicos, elaborar sustancias orgánicas. Esta función recibe el nombre fotosíntesis y es exclusiva de los vegetales que poseen clorofila (Mazparrote, 1977).

Las clorofilas son verdes y se disuelven en disolventes de las frasas. Las más

S O D nm; y la clorofila b que absorbe una longitud de onda entre 460A nm y 640 nm V R (Mazparrote, 1977). SE E R S O H C E R Estas se pueden E Ddeterminar mediante las ecuaciones de Jeffrey y Humphrey comunes son la clorofila a, que absorbe una longitud de onda entre 430 nm y 660

(1975):

Cloro ila a

=

∗

Cloro ila b

=

∗ !, "

Cloro ila total

,

∗ ,

∗ VE

(Ec. 2.1)

∗#,#!

∗ VE

(Ec. 2.2)

= Cloro ila a + Cloro ila b

(Ec. 2.3)

Dónde:

A665= lectura de la absorbancia a 665 nm. A649= lectura de la absorbancia a 649 nm. VE= volumen del tubo de vidrio para proceder a la lectura en el espectofotómetro. VM= volumen de la muestra a evaluar.

32

Los carotenoides son pigmentos con una coloración amarilla o anaranjada y, absorben en la gama de 400-500 nm y actúan como receptores de luz en regiones del espectro donde las clorofilas no tiene absorción (Mazparrote, 1977).

Se pueden determinar mediante la ecuación propuesta por Strickland y Parsons (1972):

S O D VA

ER S E &'()*+,)-.+/ *)*'0+/ = ∗ VE R S HO C E DER 12 ∗3

Dónde:

(Ec. 2.4)

VM: Volumen de la muestra de cultivo utilizado. DO: Densidad óptica. VE: Volumen del extracto medido (normalmente 2,5 mL)

Según Brenan y Owende (2010), las microalgas son en general organismos fotoautótrofos, es decir, obtienen la energía de la luz proveniente del Sol y se desarrollan a partir de materia inorgánica. Sin embargo, algunas especies son capaces de crecer empleando materia orgánica como fuente de energía o de carbono. Según esto, la producción de microalgas se divide en:

a. Fotoautótrofa.

Las algas obtienen la energía del Sol y el carbono de compuestos inorgánicos (sales). Son a las que nos referiremos principalmente en este trabajo.

33

b. Fotoheterótrofa.

Obtienen la energía del Sol y emplean compuestos orgánicos como fuente de carbono.

c. Mixotrófica.

S O D VA

ER S E R Muchas algas son capaces de crecerS bajo procesos tanto autótrofos como O H de energía es tanto la luz como la materia heterótrofos, de manera que la fuente C E orgánica. El carbono DEloRobtienen por tanto de compuestos orgánicos y de CO2. Algunas de estas algas son la Spirulina platensiso la Chlamydomonas reinhardtii.

d. Heterótrofa.

Los compuestos orgánicos proporcionan tanto la energía como la fuente de carbono. Es decir, existen en efecto algas que pueden desarrollarse bajo ausencia de luz, como por ejemplo Chlorella protothecoides. La producción fotoautótrofa de algas (para uso distinto al energético) es actualmente la única técnica y económicamente viable a gran escala.

2.2.4.1 Composición bioquímica de las microalgas.

La composición bioquímica de las microalgas (contenidos de proteínas, carbohidratos y lípidos) puede modificarse alterando las condiciones ambientales como: concentración de nutrientes, temperatura, intensidad luminosa, así como el estado fisiológico: edad de la población, densidad de la población, desarrollo autotrófico o heterotrófico (Becker, 1986).

34

El contenido de proteínas en las algas puede variar de un 30 a un 65% de su peso seco (Becker, 1986). El valor nutricional de las proteínas está determinado por el contenido y proporción de los aminoácidos estos no varían entre las diferentes especies de microalgas, por lo tanto las diferencias en la calidad nutricional de las microalgas, en la mayoría de los casos no está relacionada con la composición de

S O D VA

los aminoácidos (Webb y Chu, 1983).

R

SE E R S

La composición de carbohidratos, en términos de azúcares específicos, puede

O H C E encuentra en concentraciones R mayores, seguido por galactosa, manosa y ribosa. E D Mientras que las proporciones relativas pueden ser significativas, la estructura del

variar considerablemente entre las especies de algas. Generalmente la glucosa se

azúcar es igualmente importante. Los azúcares pueden presentarse como monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos o polisacáridos. El tipo y los enlaces específicos de un polisacárido determinan si los azúcares que lo componen podrán ser digeridos por el organismo a alimentar (Brown, Jeffrey y Garland, 1989). Han sido pocos los análisis detallados sobre la composición de los carbohidratos de las microalgas (Whyte, 1987). Existen diferencias en la naturaleza de los polisacáridos encontrados en los diferentes grupos de microalgas. Los polisacáridos de las diatomeas contienen principalmente crisolaminarina y mananos (Mykelstad, 1974), en cambio los fitoflagelados contienen glucanos, principalmente glucosa y galactosa (Whyte, 1987); mientras que las microalgas rojas acumulan grandes cantidades de polisacáridos sulfatados (Dubinsky et al., 1983).

La fracción lipídica puede dividirse en dos grupos principales: los lípidos polares (que incluyen glicolípidos y fosfolípidos) y los lípidos neutros (que incluyen a los triglicéridos, diglicéridos, hidrocarburos, alquenonas, esteroles y pigmentos) (Brown et al., 1989). La mayoría de los lípidos microalgales son lípidos polares, que son componentes de membranas; y los triglicéridos que son una reserva de

35

ácidos grasos para la división celular, energía metabólica, mantenimiento de la membrana, síntesis y una amplia variedad de funciones fisiológicas. Los triglicéridos pueden llegar a constituir hasta el 80% del total de lípidos en microalgas eucariotas. Las cantidades relativas de cada clase de lípido en las células microalgales pueden cambiar considerablemente con variaciones de las

S O D VA

condiciones de cultivo (Abalde, Cid, Fidalgo, Torres y Herrero, 1995).

R

SE E R S

La relación C:N para las microalgas varía entre 6 y 9 dependiendo de las

O H C E general, la siguiente, propuesta DER por Grobbelaar (2004):

especies. Como fórmula molecular de las microalgas se puede emplear, a modo

C106H181O45N16P

Figura 2.1. Formula molecular de las microalgas propuesta por Grobbelaar (2004).

De donde se deduce que un kilogramo de microalgas contendría:

- 523,9 g de carbono - 74,5 g de hidrógeno - 296,5 g de oxígeno - 92,2 g de nitrógeno - 12,76 g de fósforo

Un estudio de Ras y Landon (2011) da el siguiente contenido en un kilogramo de algas en masa seca:

− 367 g de carbono − 61 g de nitrógeno

36

− 8,1 g de fósforo − 6,6 g de potasio

A partir de lo que se puede deducir el grado de variabilidad en la composición de las microalgas estudiadas. El mismo estudio emplea un factor de conversión entre

S O D VA

5,1 y 7,7 109 células/g DQO y un valor de 1,33-1,43 g DQO/g SSV

R

SE E R S

El tamaño de las algas eucariotas varía entre 0,5–30 µm, mientras que las

O H C E comparación resultante Rentre las aproximadamente 250.000 especies de plantas E D verdes existentes en el planeta y los varios millones estimados de especies

cianobacterias pueden llegar a medir hasta 200 µm. Cabe destacar la

diferentes de microalgas (Markou y Georgakakis, 2011).

2.2.4.2 Técnicas de producción microalgal.

Ronsón (2010) señala que las microalgas pueden ser producidas de acuerdo con una gran variedad de métodos, desde los estrechamente-controlados por métodos de laboratorio, a métodos menos predecibles en tanques al aire libre. El cultivo al interior permite controlar la iluminación, temperatura, nivel de nutrientes, contaminación por depredadores, y microalgas competitivas, mientras que en los sistemas de cultivo al aire libre, aunque más baratos, hacen que sea muy difícil el crecimiento de cultivos de microalgales específicos durante períodos prolongados.

a. Cultivo discontinuo o “Batch”

Este es un sistema cerrado o masivo, de volumen limitado, en el que no hay entrada o salida de ningún tipo de sustrato, es decir, los recursos son finitos. La densidad celular microalgal aumenta constantemente hasta el agotamiento de

37

algún factor limitante, mientras que otros componentes nutritivos disminuyen en el medio de cultivo con el tiempo, o algún tipo de metabolito se acumula hasta alcanzar un nivel toxico. Cuando la tasa de crecimiento disminuye hasta valores próximos a cero, los cultivos están en fase estacionaria. En los cultivos en batch, propiedades de las células, como el tamaño, la composición de nutrientes

S O D VA

internos, y la función metabólica varían considerablemente (Ronsón y Medina, 2002).

R

SE E R S

O H C E decrecimiento (adaptación, R exponencial y estacionaria), ajustándose por lo general E D a una función logística (Schanz y Zahler, 1981). A este tipo de cultivo batch

En estos cultivos la población microalgal va pasando por las distintas fases

(estático o cerrado) en su proceso no se le adiciona ningún tipo de sustrato, ni es retirado algún volumen. Siendo un sistema cerrado puede precisar la incorporación de gases. La población se divide activamente hasta que de acuerdo con Liebing por la ley del mínimo, existirán condiciones en las cuales le es imposible multiplicarse a la población; como es el caso de la disminución de nutrientes, acumulación de metabolitos y materia orgánica hasta alcanzar niveles tóxicos (Ronsón, 2010).

b. Cultivo continuo.

En cultivos continuos, los nutrientes son potencialmente infinitos: los cultivos se mantendrán en un punto elegido en la curva de crecimiento mediante la adición regulada demedio de cultivo fresco. En la práctica, un volumen de medio de cultivo fresco se agregará automáticamente a una velocidad proporcional a la tasa de crecimiento de las microalgas, mientras se retira un volumen igual de cultivo (Ronsón, 2010). Este método de cultivo microalgal permite el mantenimiento de cultivos muy cerca de la tasa de crecimiento máximo, porque nunca el cultivo permanece sin nutrientes. Existen dos variantes principales en los sistemas de

38

cultivo continuo: quimiostatos y turbidostatos (Fogg y Thake, 1987). Los quimiostatos se caracterizan por que el medio es introducido en el cultivo a una tasa constante. La concentración en el medio de un nutriente limitante determinará la densidad de celular en cultivo, y el flujo o tasa de dilución determinara la tasa de crecimiento. En los turbidostatos la densidad de la población escontrolada por un

S O D VA

fotosensor de manera que se mantiene un nivel preestablecido de todos los nutrientes que son añadidos en exceso (Tempest, 1978).

R

SE E R S

O H C E microalgas en función Rde la concentración de nutrientes y de la salinidad E D (Fábregas, Herrero, Cabezas y Abalde, 1986). En este tipo de cultivo se puede modificar la composición bioquímica de las

c. Cultivo Semi-continuo

En un sistema semi-continuo una porción del cultivo es retirada (tasa de renovación) y sustituida por medio fresco a intervalos de 24 h tiempo en que nuevamente crece la población antes retirada, repitiendo el procedimiento. La técnica de cultivo semicontinuo prolonga el uso de cultivos en tanques por la recolección periódica parcial. Con esta técnica es posible mantener elevadas tasas de división celular. Por lo tanto, a pesar de que la producción es continua, la concentración de substrato y microorganismos no es constante a lo largo del tiempo (Ronsón, 2010). El sistema semicontinuo es una alternativa a los sistemas continuos especialmente indicada en el caso de microalgas sometidas a periodos circadianos de luz y oscuridad, ya que la sincronización de la división celular que se produce en estas condiciones no hace recomendable el cultivo continuo. Si los ciclos de renovación se hacen coincidir con los ciclos circadianos, la biomasa obtenida posee características de homogeneidad y estabilidad que difiere de los cultivos continuos. Propuso se el termino ciclostato para denominar a este tipo de

39

cultivos sometidos a ciclos de luz y oscuridad y diferenciarlos de los quimiostatos estándar (Novio, 2006).

d. Cultivo Fed-batch

S O D A V volumen alguno, por lo que el volumen del cultivo se incrementa con el tiempo. R E S para la producción de E Este tipo de cultivos es el que se utiliza industrialmente R S O levadura de pan y penicilina (Ronsón, 2010). H C E R DE

En este tipo de cultivos el sustrato se añade de forma constante, pero no se retira

2.2.4.3. Parámetros del crecimiento de cultivos microbianos.

Para la comprensión de los parámetros de crecimiento en cultivos microbianos se debe conocer el comportamiento de los microorganismos, esto se logra realizando una curva de crecimiento explicada a continuación:

Curva de crecimiento.

El crecimiento de microorganismos (bacterias o microalgas) ha adquirido una considerable importancia, luego de que se demostrara que su medida constituía una técnica de estudio de la fisiología de los mismos (Des abbayes et al. ,1989). Dicho crecimiento, sobre un medio líquido es exponencial, y la determinación cuantitativa se puede representar en una curva en la que se distinguen las siguientes fases (Granados y Villaverde, 2003): La fase de adaptación (1), que corresponde al tiempo que se separa la siembra del inicio de la fase siguiente. Su duración es muy variable, está en función de la edad del inóculo, de su volumen, de las condiciones de adaptación, entre otros (Des Abbayes et al., 1989). La fase

40

exponencial (2), donde los microorganismos se duplican a velocidad constante y exponencial, la actividad metabólica es máxima y la sensibilidad a los agentes externos es óptima. Seguida por la fase estacionaria (3), en esta etapa, el número de células que nacen es igual al que muere y por último la fase de muerte (endógena) (4), en esta fase las condiciones de medio se vuelven adversas y las

S O D VA

bacterias mueren (Granados y Villaverde, 2003).

cé lu la s/ m L.

O

H C E ER

D

R

SE E R S

Tiempo

.

Figura 2.2 Fases de a curva de crecimiento, células/m vs tiempo (Granados y Villaverde, 2003)

El crecimiento celular, se puede determinar mediante el método de conteo celular utilizando la cámara de Neubaüer (Romo, 2002), la cual permite obtener un promedio de células presentes en sus divisiones influenciadas por el factor de dilución empleado. Se aplica la siguiente formula:

D = C * 104 * fd

Dónde:

(Ec. 2.5)

41

D: Densidad celular (cel/mL). C: Promedio aritmético de las células contadas por subdivisión. fd: Factor de dilución.

Habiendo descrito la curva de crecimiento para un microorganismo se exponen los

S O D VA

parámetros de crecimiento en cultivos microbianos a continuación:

a. Luz

O

H C E ER

D

R

SE E R S

Es factor fundamental en todo cultivo microalgal, tanto por sí misma como por sus interacciones con otros parámetros. La radiación utilizable fotosintéticamente cae dentro del rango del espectro visible (400 – 700 nm). Representa la fuente de energía para la fotosíntesis, y tanto la intensidad luminosa como el fotoperíodo afectan al crecimiento y metabolismo microalgal (Lips y Avissar, 1986). La intensidad luminosa influye sobre el esquema de síntesis macromolecular a partir del CO2 fijado fotosintéticamente (Konopka y Schnur, 1980). En la naturaleza las microalgas están sometidas a períodos de luz/oscuridad y muchos ciclos fisiológicos de estos organismos fluctúan en un ciclo de 24 horas (diario) (Sournia, 1974). La adaptación de las microalgas a variaciones extremas en la intensidad de luz, es decir, luz y sombra, es un fenómeno muy conocido y caracterizado por cambios en el contenido intracelular de pigmentos, generalmente acompañados por cambios en la respuesta fotosintética y en la composición bioquímica. La introducción de un ciclo celular es un importante adelanto, ya que el ciclo día/noche es quizá el factor cíclico ambiental más importante en la mayoría de los sistemas (Whitton y Potts, 2000).

42

b. Temperatura.

La temperatura es fundamental para el crecimiento microalgal, ya que responde continuamente a la temperatura ambiental. La temperatura celular se iguala a la temperatura del medio de cultivo, en contraste con otros parámetros del medio

S O D afecta la naturaleza del metabolismo, los requerimientos nutricionales A y la V R E una relación entre la composición de la biomasa (Abalde et al., 1995). Existe S E R S apreciada principalmente en el temperatura y la actividad biológicaO microalgal, H C cuando aumenta la temperatura, dentro de un E aumento de la tasa deR crecimiento DE rango óptimo, por encima del cual el crecimiento disminuye, a veces bruscamente, como el pH. Además de afectar a las reacciones celulares, la temperatura también

hasta llegar a cero si continua el aumento de la temperatura (Richmond, 1986).

c. Nutrientes.

El nitrógeno después del carbono, es cuantitativamente el elemento que tiene mayor contribución a la materia seca y composición bioquímica de las células microalgales (Flores y Herrero, 1994). Se ha demostrado que se produce gran variabilidad tanto en el crecimiento como en la composición bioquímica, debido a las variaciones en la concentración de nitrógeno (Boussiba y Richmond, 1980).

En microorganismos capaces de sintetizar polisacáridos extracelulares, el exceso de flujo de carbono (por ejemplo, en condiciones de insuficiencia de nitrógeno) parece originar compuestos extracelulares como producto del metabolismo del sobreflujo. Se ha encontrado que el agotamiento de nitrógeno estimula la liberación de EPS en cianobacterias como Limnothrix sp. y Oscillatoria sp., y en el caso de Cyanothecela síntesis de carbohidratos pertenecientes a las fracciones intracelular, capsular y soluble, representan una cantidad de exopolisacáridos cuatro veces más alta en los cultivos limitados con nitrógeno, en comparación con

43

los controles, este comportamiento no parece seguir una regla general (Ortega, Fuenmayor, Briceo y Morales, 2004). Por otro lado, la deficiencia de nitrógeno bloquea la formación de proteínas (De Philippis, Sili y Vicenzini, 1996), así como la reducción del contenido de pigmentos y la tasa fotosintética. Igualmente, trabajos con CalothrixPCC 7601, Synechococcus sp., y Synechocystis sp., demostraron

S O D VA

que la fuente de nitrógeno alteraba el contenido de ficobiliproteínas de estas cianobacterias (Jonte, 2003).

d. Agitación.

O

H C E ER

R

SE E R S

D Otro parámetro necesario para los medios de cultivo microalgales es la agitación, cuando están satisfechos los requerimientos nutritivos y las condiciones ambientales son adecuadas. Este parámetro constituye el requisito más importante para la obtención de altos rendimientos de biomasa microalgal (Richmond y Becker, 1986). El movimiento del agua implica una serie de efectos positivos que se traducen en una estimulación general del metabolismo celular (Raven, 1988), asegurando una distribución homogénea de las células y los nutrientes dentro del cultivo, evitando la formación de gradientes minerales alrededor de las células durante los períodos de metabolismo activo. Mejora la distribución

de

la

luz

en

las

células

asegurando

que

permanezcan

fotosintéticamente activas, evitando el efecto de ensombrecimiento, y/o reduce los efectos fotoinhibitorios y evitando que las células sedimenten en el fondo del recipiente de cultivo y previene la estratificación térmica (Baker y Hereon, 1994).

2.2.4. Biodegradación.

Castillo et al. (2005, p 366) establece la siguiente premisa sobre la biodegradación:

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Los compuestos orgánicos son inestables y los microorganismos pueden obtener como productos finales CO2 y CH4, en anaerobiosis y CO2 en aerobiosis, además de H2O y NH3. La mineralización de un compuesto orgánico es la degradación total del mismo, es decir cuando se generan los productos finales descritos anteriormente. Por el contrario, un compuesto es recalcitrante cuando no se transforma en absoluto. Por otro lado, se da cometabolismo cuando el microorganismo modifica la estructura del compuesto pero no obtiene energía del proceso ni incorpora ninguna parte de la molécula original. Hay algunos microorganismos que pueden obtener energía a partir de compuesto, aunque ninguno de ellos pueda degradarlo independientemente, este fenómeno se denomina metabolización por un consorcio (sintrofia). A veces la presencia de un compuesto fácilmente asimilable aumenta la degradación del compuesto xenobiotico. Otras veces, la presencia de un segundo sustrato impide la utilización del compuesto. Que ocurra una cosa u otra depende del microorganismo, del compuesto a degradar y de las condiciones ambientales, este fenómeno se denomina utilización de un segundo sustrato o cosustrato.

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2.2.4.1. Fundamento bioquímico de la biodegradación.

Maroto y Rogel (2001, p. 297) exponen:

El fundamento bioquímico de la biodegradación se basa cadena respiratoria, o transportadora de electrones de las células, se van a producir una serie de reacciones de óxido-reducción cuyo fin es la obtención de energía. La cadena la inicia un sustrato orgánico (compuestos hidrocarburados) que es externo a la célula y que actúa como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula acaba degradando y consumiendo dicha sustancia. Los aceptores más comúnmente utilizados por los microorganismos son el oxígeno, los nitratos, el hierro (III), los sulfatos y el dióxido de carbono. Cuando el oxígeno es utilizado como aceptor de electrones la respiración microbiana se produce en condiciones aerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo aerobio; sin embargo, si utiliza los sulfatos o el dióxido de carbono se produce en condiciones

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reductoras o anaerobias, y los procesos de biodegradación serán de tipo anaerobio.

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Figura 2.3 Esquema de las reacciones de degradación aerobia y anaerobia (Maroto y Rogel, 2001).

2.2.5. Biorremediación.

La biorremediación es una tecnología que utiliza el potencial metabólico de los organismos para transformar contaminantes orgánicos en compuestos más simples poco o nada contaminantes (Glazer y Nikaido, 1995) y por lo tanto, reciclar materiales orgánicos y separar iones inorgánicos. Los organismos deben estar presentes en suficiente cantidad y diversidad (Castillo et al., 2005). Dicho potencial, se puede utilizar para limpiar terrenos o aguas contaminadas. Su ámbito de aplicabilidad es muy amplio, pudiendo considerarse como objeto cada uno de los estados de la materia (Atlas y Unterman, 1999).

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Figura 2.4 Actividades microbianas en el proceso de biorremediación. (Sánchez y Rodríguez, 2003) El proceso de biorremediación puede clasificarse de acuerdo al organismo que efectúe la degradación del compuesto xenobiótico (Marivela, Guerrero, López, Sánchez y Toledo, 2002).

a. Fitorremediación.

Consiste en el uso de plantas verdes para contener, remover o neutralizar compuestos orgánicos, metales pesados o radio nucleídos. Un ejemplo de la fitorremediación la constituye el uso de la especie Thlaspicaurulencens en suelos contaminados con zinc y cadmio (Lombi, Zhao, Dunham y McGrath, 2001).

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b. Biorremediación animal.

Existen animales que actúan como agentes descontaminantes, ya que pueden desarrollarse en medios con fuerte toxicidad y poseen en su interior microorganismos capaces de retener los metales pesados (Atlas y Unterman, 1999).

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c. Biorremediación microbiana.

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La utilización de microorganismos que transforman diferentes compuestos nocivos en otros de menor impacto ambiental ha experimentado un gran desarrollo reciente. Aunque las bacterias son las más empleadas en el proceso de biorremediación, también se han empleado otros microorganismos como hongos, algas, cianobacterias y actinomicetes para la degradación de compuestos tóxicos (Torres, 2003).

La biorremediación presenta ventajas sobre otras técnicas alternativas para eliminar compuestos contaminantes como son los tratamientos fisicoquímicos, ya que es un proceso natural para destruir contaminantes orgánicos, los productos formados son generalmente inocuos, la relación coste/efectividad es menor comparada con otras tecnologías y puede ser ejecutada in situ, por consiguiente, Castillo et al. (2005) clasifica la biorremediación microbiana según el lugar donde se efectué la biorrecuperación en los siguientes tipos:

a. Biorremediación in situ.

Se refiere al tratamiento de compuestos tóxicos en el lugar donde se ha producido la contaminación. A su vez hay dos tipos de técnicas de biorremediación in situ:

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•

Bioaumento o biomagnificación: adición de microorganismos naturales o manipulados genéticamente al medio

•

Bioestimulación: Modificación del medio para reforzar el crecimiento de los microorganismos. Normalmente se adicionan nutrientes, oxigeno, etc.

b. Biorremediación ex situ.

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HO C E realizar o completar su descontaminación. El tratamiento se efectúa en un DER En los procesos ex situ el material contaminado es trasladado a otro lugar para

biorreactor donde se realiza el proceso en forma controlada, es decir se suministran nutrientes, se inoculan los microorganismos deseados, se mantiene una aireación continua y se controla el pH y la temperatura, en los valores adecuados para el crecimiento de los microorganismos (Aguado, 2010).

2.2.6. Biodegradación de hidrocarburos por consorcios microbianos.

La biodegradación es resultado directo de como el metabolismo de los microorganismos, utilizan el residuo orgánico como sustrato (es decir, el residuo sirve como fuente de carbono y energía para los organismos vivos). Los microorganismos más utilizados en el tratamiento de biorremediación, son las bacterias, no obstante, hongos y microalgas pueden ser igualmente utilizados (Baker y Hereon, 1994).

Muchos microorganismos poseen la capacidad enzimática necesaria para degradar hidrocarburos del petróleo. Algunos microorganismos degradan alcanos (normales, ramificados y parafinas cíclicas), otros aromáticos y otros ambos (Atlas y Unterman, 1999). Leahy y Cowell (1990) ordenaron algunos hidrodarburos del petróleo según su susceptibilidad decreciente a la biodegradación de la siguiente

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manera: n-alcanos>alcanos ramificados>aromáticos con bajo peso moléculas> alcanos cíclicos.

A menudo, los alcanos normales en el rango de C10 a C20, suelen ser más susceptibles a ser degradados, al igual que los compuestos aromáticos de bajo

S O D xileno (compuestos con toxicidades muy elevadas) (Ortega, 2012). A Estructuras V R más complejas (como los alcanos ramificados) E suelen SEser más resistentes a la R Sorganismos pueden degradarlas y las biodegradación, significando que menos O H C E tasas de biodegradación son menores que las de las estructuras más simples R DE (Atlas, 1995).

peso molecular (Amellal , Portal y Berthelin, 2001), como el benceno, tolueno y

En la biodegradación de hidrocarburos por cultivos mixtos de bacterias se presentan dos posibilidades, las cuales pueden ser la utilización de consorcios definidos y consorcios no definidos (Viñas, 2005), siendo los definidos aquellos formados por una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí (Foght et al. ,1999) Un Consorcio Microbiano es una asociación natural de dos o más poblaciones microbianas, de diferentes especies, que actúan conjuntamente como una comunidad en un sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades de los demás. La asociación refleja estilos de vida sinérgicos o sintróficos (que significa "comiendo juntos") en el que el crecimiento y el flujo cíclico de nutrientes se conduce más efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales (López, Domínguez y García, 2007).

Aunque la mayoría de los estudios de biorremediación han sido conducidos en microcosmos empleando bacterias, en la actualidad algunas investigaciones indican que la interacción microalga-bacteria resulta beneficiosa para la remoción de petróleo (Abed y Koster, 2005). Las bacterias generalmente se encuentran en

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relaciones simbióticas con las microalgas que les proveen de oxígeno y nutrientes para degradar la materia orgánica, mientras que las microalgas se benefician de esta degradación al obtener nutrientes inorgánicos para su crecimiento (Riquelme y Avendaño, 2003). En los ambientes acuáticos las microalgas presentes están asociadas a bacterias; sin embargo, no se sabe a ciencia cierta si estas bacterias

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son asociativas, promotoras de crecimiento, simbiontes o simplemente coexisten

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con las microalgas. Se cree que muchas de estas bacterias son promotoras del

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crecimiento en microalgas (De-Bashan y Bashan, 2003).

O H C E Igualmente, la población R de bacterias asociadas a las microalgas se puede E D determinar mediante la ecuación (APHA, AWWA, y WEF, 1998): 456 78

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