Revista Cubana de Química ISSN: 0258-5995 [email protected] Universidad de Oriente Cuba

Sánchez Álvarez, K.; Quintana Cantillo, A.; Álvarez Delgado, Y.; López Larraburo, L. VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MUESTRAS DE FACTOR DE TRANSFERENCIA Revista Cubana de Química, vol. XXI, núm. 1, 2009, pp. 68-73 Universidad de Oriente Santiago de Cuba, Cuba

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VALIDACIÓN DEL ENSAYO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MUESTRAS DE FACTOR DE TRANSFERENCIA K. Sánchez Álvarez, A. Quintana Cantillo, Y. Álvarez Delgado, L. López Larraburo

"

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Ciudad de la Habana

z Resumen La validación de un método analítico es indispensable para determinar si es adecuado para proporcionar datos verdaderos y reproducibles. Según las más recientes directivas establecidas por las regulaciones nacionales e internacionales, la validación no sólo debe aplicarse a los procesos de fabricación, sino también a sus métodos de análisis y control, siendo éste un requisito indispensable para la realización de los registros sanitarios de los medicamentos. En este trabajo se presentan los resultados de la validación del método de determinación de la concentración de carbohidratos en muestras de Factor de Transferencia, utilizando el método de la Antrona. Se demostró, que el ensayo es lineal y exacto en el rango de 10-80 µg de carbohidratos. Se obtuvieron coeficientes de variación inferiores al 10 % para la repetibilidad y la precisión intermedia, y se determinó que el límite de cuantificación es de 9,46 µg/mL de carbohidratos. Además, se demostró que concentraciones de proteínas de hasta 1,5 mg/mL no interfieren en los resultados del ensayo. Palabras clave: validación, método analítico, carbohidratos, Factor de Transferencia, Antrona. z

Abstract

The validation of an analytical method is necessary to determine if it is adequate to provide truly and reproducible data. According to the most recently nationals and internationals regulations, validation is not only useful to the manufacture processes, but to the control and analysis method, which is an indispensable characteristic to take in account for the presentation of the Site Master File of a pharmaceutical product. In the present work, we show the results of the validation of the carbohydrate concentration determination method in Transference Factor samples, using the Antrona technique. We demonstrated that this assay is lineal and precise in a range from 10 to 80 µg of carbohydrates. We also obtained variations coefficients about 10 percent for repeatability and intermediate precision and a quantification limit of a 9.46 µg/mL for carbohydrates. In addition, we demonstrated that proteins concentrations until 1.5 mg/mL do not show interference with the assays results. Key words: validation, analytical method, carbohydrates, Transference Factor, Antrona.

z

Introducción

El Extracto Dializable de Leucocitos (EDL) con actividad de Factor de Transferencia (FT), ha sido obtenido a partir de diferentes fuentes animales /1-4/, también de linfocitos de pacientes con amigdalitis crónica /5/, y en algunos casos ha sido producido a partir de personas sanas del

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contexto familiar del paciente /6, 7/. La efectividad clínica de esta preparación ha quedado ampliamente demostrada /8-10/ en nuestro país. Estas células provienen de donantes voluntarios de sangre sanos, en los que se demuestra la ausencia de marcadores virales y otros contaminantes potenciales de la sangre.

Como en toda producción de medicamentos diseñada de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), es imprescindible lograr el control del producto en diferentes estadíos de elaboración, con el objetivo de detectar cualquier desviación de las especificaciones de calidad. Según las normativas establecidas por las regulaciones nacionales e internacionales, referentes a la correcta fabricación y control de calidad de los medicamentos, la validación no sólo debe aplicarse a los procesos de fabricación, sino también a sus métodos de análisis y control, siendo éste un requisito para tener en cuenta en la presentación de los registros sanitarios de los medicamentos /11-15/. Como criterios para la validación de una técnica de cuantificación como ensayo de control de la calidad de un producto farmacéutico, se consideran: su precisión (repetibilidad y precisión intermedia), exactitud, límite de detección y cuantificación, especificidad y linealidad /15/. En este trabajo se describe la metodología seguida para la evaluación de dichos parámetros durante la validación de la técnica de la Antrona en la determinación de carbohidratos presentes en el EDL, y que puede ser aplicada para la validación de cualquier otro ensayo de cuantificación similar a éste. z

Materiales y métodos

Obtención de las preparaciones de Factor de Transferencia La obtención del FT se realizó a partir de leucocitos de donantes de sangre sanos que, después de purificados, fueron inducidos con virus Sendai, para la producción de Interferón Alfa Leucocitario Humano (Interferón) /16/. Los leucocitos se sometieron a un proceso de ruptura de tres ciclos de congelación (– 20 °C) y descongelación a 37 °C, y ruptura ultrasónica a 100 watt/min, durante tres ciclos de quince segundos cada uno. El producto obtenido se dializó contra solución buffer salina fosfatada (PBS), por una membrana de 10 000 Da de exclusión molecular, bajo ligero vacío, 24 horas, y a una temperatura entre 2 y 8 °C. El dializado fue esterilizado por filtración.

Determinación de la concentración de carbohidratos Para determinar la concentración de carbohidratos, se utilizó el método de la Antrona /17/. Como material de referencia, se empleó un patrón de glucosa, y la absorbancia fue determinada a 620 nm.

Estudio de interferencia de proteínas Se realizaron tres curvas patrones, y se añadió a cada punto de la curva una solución de albúmina bovina (SAB), hasta obtener mezclas con 0,5 mg/mL; 1 mg/mL y 1,5 mg/mL de concentración de proteínas. Las tres curvas obtenidas se compararon con la curva patrón normal. La concentración de carbohidratos de cinco lotes de Ingrediente Farmacéutico Activo (IFA) de FT, fue calculada utilizando las cuatro curvas patrones y los valores obtenidos con cada una de ellas, comparados entre sí.

Validación del método El método de determinación de la concentración de carbohidratos mediante la Antrona, es un método de cuantificación en los productos farmacéuticos, que pertenece a la categoría II, según lo definido en las normativas internacionales /15/, por lo que los parámetros por evaluar son: linealidad, exactitud, precisión (repetibilidad y precisión intermedia), y límite de cuantificación. Linealidad: Se analizaron tres curvas de concentraciones de 10, 20, 40, 60 y 80 µg/mL, con dos réplicas por punto, y se calculó la pendiente y el intercepto de la curva promedio. Los límites de confianza para estos parámetros se determinaron analizando cinco curvas patrón. Exactitud: Se cuantificó la concentración de carbohidratos de una muestra de IFA, y se le asignó el valor promedio de sus réplicas. Posteriormente, se hizo una mezcla de esta IFA y de una solución de concentración conocida, (material de referencia de glucosa), de forma que las concentraciones finales fueran: M+50 µg, M+70 µg y M+90 µg. Para confirmar que la exactitud fue satisfactoria, se determinó la normalidad de los datos mediante la prueba de Kolmogorov – Smirnov, si existía homogeneidad de varianza entre los datos,

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mediante la prueba de Levene, y se aplicó la prueba t Student para comparar el recobrado medio y la concentración esperada, calculando el valor de T experimental, según la fórmula:

texp = (100 − R) ⋅ n

CV

donde R- recobrado medio, n- número de observaciones, CV- coeficiente de variación. Precisión: Se determinó la repetibilidad por el análisis sextuplicado de una muestra; y la precisión intermedia, con el análisis por triplicado de una muestra, por dos analistas en dos días diferentes. En ambos casos, se calculó la media, desviación estándar y coeficiente de variación. Límite de cuantificación (Lc): Se determinó por análisis repetidos de 10 blancos del ensayo, mediante la ecuación Lc = K * Sbl/b, donde K= 10 para límite de cuantificación (debido a que el método es instrumental), S bl es la desviación estándar de las lecturas del blanco, y b corresponde a la pendiente de la curva de calibración. z Resultados

y discusión

La validación de un método analítico es el proceso mediante el cual queda establecido, por estudios experimentales, que la capacidad del método satisface los requisitos para la aplicación analítica deseada. Ésta se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan.

La comparación de la concentración de carbohidratos de las cinco muestras, calculadas utilizando las cuatro curvas obtenidas, indicó que no existían diferencias entre los resultados (p < 0,05), según el análisis de varianza de clasificación simple aplicado. Esto indica, que las concentraciones de proteínas utilizadas no interfieren con los resultados de la determinación de carbohidratos.

Linealidad En la figura 1 se muestran los gráficos de las tres curvas patrones ensayadas para determinar la linealidad del método. Como puede observarse, las tres curvas son muy similares, presentando puntos de unión entre ellas. Los puntos de las curvas con menos coincidencia corresponden a las menores concentraciones de analito, lo cual se explica, ya que estos puntos se encuentran cerca del límite de cuantificación del ensayo. Al evaluar la linealidad del método, se obtuvo un valor de coeficiente de correlación de 0,999, superior a 0,990; por lo que se cumple con el criterio establecido /11, 14, 15/. La curva modelo obtenida, tuvo una pendiente de 0,009 y un intercepto de -0,005.

Estudio de interferencia de proteínas

Para establecer los límites de confianza de la pendiente y el intercepto, se tomaron cinco curvas de calibración, y se determinó la absorbancia media para cada una de las concentraciones estudiadas. El análisis de regresión realizado dio como resultado, que la curva a la cual se ajustan los datos obtenidos tiene una pendiente de 0,009 3 y un intercepto de -0,009 2. Los límites de confianza de estos parámetros son para la pendiente: 0,009 0 y 0,009 4 (inferior y superior) y para el intercepto -0,03 y 0,012 (límite inferior y superior).

El procesamiento estadístico indicó, que el valor del intercepto no tiene significación estadística dentro de la regresión, por lo que las ecuaciones correspondientes pueden expresarse sólo en función del valor de la pendiente. La prueba de hipótesis sobre la igualdad de las curvas obtenidas indicó la existencia de coincidencia entre los coeficientes de regresión de todas las rectas obtenidas.

El procesamiento estadístico indicó, que el valor del intercepto no tiene significación estadística (p= 0,252), por lo que la ecuación correspondiente puede expresarse solo en función del valor de la pendiente (Absorbancia= 0,0093 • Concentración de glucosa). El Coeficiente de correlación de esta curva fue 0,999 6.

A continuación se presentan los resultados obtenidos en la validación del método de Antrona, empleado para la determinación de la concentración de carbohidratos en muestras de Factor de Transferencia.

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Fig. 1 Gráfico de las curvas ensayadas para determinar la linealidad del método de determinación de la concentración de carbohidratos mediante el método de la Antrona. Leyenda: Curva 1 (patrón): Círculo. Curva 2: Cuadrado. Curva 3: Triángulo.

Exactitud Para determinar la exactitud de la técnica, se prepararon diferentes concentraciones a partir de un patrón de glucosa, de concentración conocida (2 mg/mL), incorporando cantidades crecientes del mismo a una muestra de IFA. Se determinaron las concentraciones recuperadas, y sus por cientos respectivos. Se demostró que los resultados obtenidos eran normales (p > 0,05 en la prueba de Kolmogorov-Smirnov), y que existía homogeneidad de varianzas (p= 0,69 en la prueba de Levene). Esto permitió calcular los valores medios del por ciento de recuperación (tabla 1), y calcular el por ciento de recobrado total en función de estos valores. Este resultado fue utilizado para calcular el valor de t experimental (t = 0,897). El valor de t tabular (t = 4,303) fue determinado para α = 0,05 y 2 grados de libertad, ya que el valor medio del

recobrado fue determinado utilizando los recobrados para las tres concentraciones estudiadas. Al ser el valor de la t experimental menor que el valor tabular, se puede afirmar que no existe diferencia significativa entre los valores reales y los esperados, por lo que la exactitud del método es correcta.

Precisión intermedia Este estudio comprendió la variación de diferentes réplicas de una muestra (IFA) en un mismo ensayo (repetibilidad) y el ensayo de esa misma muestra, pero variando las condiciones. En este caso, se estudiaron los efectos día y analista (precisión intermedia). En cada uno se calcularon la media, desviación estándar y el coeficiente de variación. El coeficiente de variación (CV) para la repetibilidad, como medida de la variabilidad intraensayo, fue 3,6 %, y para la precisión intermedia

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8 %. El criterio de aceptación CV ≤ 10 %, para ambos medidores de la precisión se cumplió satisfactoriamente, aunque debe destacarse que

existieron diferencias significativas entre los resultados obtenidos por los dos analistas en días diferentes (figura 2).

Fig. 2 Valores de absorbancia determinados por dos analistas en días diferentes para la determinación de la precisión del método de determinación de la concentración de carbohidratos, mediante el método de la Antrona, en muestras de referencia de concentración conocida.

Límite de cuantificación La absorbancia media del blanco, determinada en diez ensayos, fue 0,066, y su desviación estándar 0,008 5, por lo que el límite de cuantificación del ensayo resultó ser 9,46 µg /mL. Este valor es inferior al del menor punto de la curva de calibración, por lo que se cumplió satisfactoriamente el criterio de aceptación de la técnica (Lc ≤ 10 µg/mL).

 Conclusiones Los resultados del estudio de validación del método de la Antrona para la determinación de carbohidratos en el IFA del Factor de Transferencia, indican que el ensayo es lineal en el rango de 10 a 80 µg/mL de carbohidratos, demostrándose con el valor de R2 de 0,999. Se demostró, además, que el método posee buena exactitud, ya que no hay diferencias significativas entre el contenido de carbohidratos determinado por la técnica con relación a la concentración

esperada de las mezclas analizadas. La precisión del mismo es buena, con valores inferiores al 10 %, tanto para la repetibilidad (3,6 %) como para la precisión intermedia (8 %), y el límite de cuantificación determinado fue de 9,46 µg/mL de carbohidratos. Todos los resultados demuestran que este método es adecuado, y proporciona datos verdaderos y confiables del comportamiento del proceso de obtención del FT. Por otra parte, la comparación de los mismos con los criterios de aceptación establecidos, evidencia que la validación de la técnica resultó satisfactoria y, por tanto, la misma puede ser utilizada en la cuantificación de la concentración de carbohidratos presentes en los lotes de IFA de FT. Los rangos obtenidos para los diferentes parámetros analizados son muy similares a los reportados por otros autores en la validación de otras técnicas analíticas /18, 19/.

TABLA 1. RESULTADOS OBTENIDOS DE LOS ENSAYOS PARA LA DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD DEL ENSAYO MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN PORCENTUAL ENTRE LOS VALORES DE CONCENTRACIÓN DE CARBOHIDRATOS ESPERADOS, Y LOS OBTENIDOS PARA TRES CONCENTRACIONES DIFERENTES DE ANALITO

DS: Desviación estándar de la media del porcentaje de recobrado. CV: Coeficiente de variación.

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Bibliografía 1. L.L. Huang, W. Zhi-fang, S. Cheng-Zhi. “Nature and antigenspecific activities of transfer factor against herpes simplex virus type 1”. Leukocyte Dialysates and Transfer Factor. Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor. V. Mayer and J. Borvák: 234-45 (1987).

8. M.C. García, M. Cuza, A. Sánchez, A. Abdo. “Factor de Transferencia y extractos bacterianos en asmáticos con infecciones respiratorias recurrentes”. Rev Alerg Asma Inmunol Pediatr; 7/4:124 (1998). 9. M.A. Cruz y cols. “Evolución clínica de pacientes tratados con Factor de Transferencia”. Revista Cubana Hematología; 20/3:1-7 (2004).

2. G.B. Wilson, C. Poindexter, J.D. Fort, K.D. Ludden. “Specific pathogen free and standard commercial chickens as models for evaluating xenogenic transfers of cell-mediated immunity”. Leukocyte Dialysates and Transfer Factor. Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor. V. Mayer and J. Borvák: 257-74 (1987).

10.F.A. Rodríguez, M.E. Serrano, S.G. Flores, M. Orea. “El efecto terapéutico del Factor de Transferencia en el tratamiento de pacientes con dermatitis atópica grave”. Rev Alerg Asma Inmunol Pediatr; 11/1: 9-11 (2002).

3. W. Zhi-fang, M. Ji-fang, W. Guo-hua, Y. An-gang, G. Fuyuang. “Antigen-dependent activities and physico-chemical characterization of specific goat’s transfer factor to human gastric adenocarcinoma”. Research and Aplication of Transfer Factor and DLE. Proceedings of the Sixth International Workshop on Transfer Factor. Xue Yuan Press: 17-23 (1989).

12.Internacional Conference of harmonization. “Guideline on Validation of Analytical Procedures: Methodology (Q2B)”. Federal Register 27463-27467 (1997).

4. Q. Haiyan, W. Zhifang, S. Chengzhi. “Affinity chromatography and activity assay of HSV-1 specific goat transfer factor”. Research and Aplication of Transfer Factor and DLE. Proceedings of the Sixth International Workshop on Transfer Factor. Xue Yuan Press: 207-15 (1989). 5. A.N. Matz, V.I. Pozdnjakov, S. Buchwald, N.P. Perepechkina. “Transfer factor preparation in the therapy of experimental herpetic keratitis”. Leukocyte Dialysates and Transfer Factor. Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor: 225-33 (1987). 6. T. Fujisawa, Y. Yamaguchi, H. Saitoh. “Randomized control study of adyuvant immunotherapy with transfer factor on primary non-small cell carcinoma of the lung. The results of 3 to 8 years follow-up”. Leukocyte Dialysates and Transfer Factor. Proceedings of the Fifth International Symposium on Transfer Factor. V. Mayer and J. Borvák: 436-50 (1987). 7. A. Mrázová, J. Pekárek, K. Cech. “Some experiences with the use of commercial preparation transfer factor and a specific anti-cancer transfer factor in some tumor patients”. Research and Aplication of Transfer Factor and DLE. Proceedings of the Sixth International Workshop on Transfer Factor. Xue Yuan Press: 405-8 (1989).

11.CECMED. Regulación No. 41-07. “Validación de Métodos Analíticos” (2007).

13.C. Desain. “Master Method Validation protocols. Documentation Basics”. BioPharm (1992). 14. “International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use”. ICH final Draft Guideline. November 6 (1996). 15.S.O. Krause. “Development and validation of analytical methods for biopharmaceuticals, part I: development and optimization. BioPharm International; 17/10: 52-61 (2004). 16.K. Cantell, S. Hirvonen, H.L. Kauppinen, G. Myllylä. “Production of interferon in human leukocytes from normal donors with the use of Sendai virus”. Methods in Enzymology, 78. Academic Press: 29-38 (1981). 17.M.F. Chaplin, J.K. Kennedy. “Proteoglycans. In: Carbohidrate analysis: a practical approach”. IRL Press Washintong Eds: 135-6 (1998). 18.L. Borg, J. Kristiansen, J.M. Christensen, K.F. Jepsen et.al “Evaluation of accuracy and uncertainty of ELISA assays for the determination of interleukin-4, interleukin-5, interferongamma and tumor necrosis factor-alpha”. Clinical Chem. Lab. Med., 40/5: 509-19 (2002). 19. B. Acevedo, Y. Perera, M. Ruiz, G. Rojas et.al “Development and validation of quantitative ELISA for the measurement of PSA concentration”. Clin. Chim. Acta, 317/1: 55-63 (2002).

Vol. XXI, Nº 1, 2009

73